CN113009035B - 基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法及应用,属于制药技术、药物筛选领域。所述的方法包括提取中药化学成分,敲出目标成分制备不同组分群,鉴定敲出成分评价敲出效果,量化敲出成分真实还原不同组分群在中药中的比例,确定主要药效组分群。本发明制备并筛选出具有抗白血病效应的青黛提取物敲出组分。为后续的青黛质量控制、抗白血病的药效研究及药物制剂提供基础支持,对于其它药物同样具有借鉴和推广价值。
Description
技术领域
本发明属于制药技术和药物筛选领域,具体涉及一种基于目标敲出成分和定量法结合的中药药效组分辨识或筛选方法,及其在青黛抗白血病中的应用。
背景技术
白血病是造血系统的一种恶性疾病,是导致中国居民死亡的十大恶性肿瘤之一。在传统中医理论指导下,中药复方“当归龙荟丸”和“黄黛片”可有效治疗白血病。上述复方中青黛是抗白血病最为重要的一味中草药,它是爵床科植物马蓝Aphicacanthuscusia(Nees)Bremek、蓼科植物蓼蓝Polygonumtinctonum Ait. 或十字花科植物菘蓝Isatisindigotica Fort.的叶或茎叶经加工制得的干燥粉末或团块,具有清热解毒,凉血消斑,挥火定惊功效。
随着中药现代化领域科研水平和创新能力的不断提升,青黛在抗菌、抗炎、抗肿瘤及治疗新冠肺炎等药理作用方面均有所突破,尤其在抗白血病作用方面,现代药理研究表明靛玉红、色胺酮和异鼠李素对治疗白血病有明显的疗效。而青黛所含成分的复杂性和现阶段药效辨识模式导致青黛提取物或其敲出组分(群)在抗白血病方面研究未能较好地体现敲出组分(群)在青黛(整体)的含量比例和浓度,导致无法准确反映其在整体生物活性的贡献值。
发明内容
为了解决现有的分离分析技术,在高通量、高精度等方面都难以兼顾中医学的整体观和系统观的问题,发明人提供了一种基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法,技术方案如下:
一种基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法,所述的方法包括以下步骤:提取中药化学成分,敲出目标成分制备不同组分群,鉴定敲出成分评价敲出效果,量化敲出成分真实还原不同组分群在中药中的比例,确定主要药效组分群。
进一步的,所述的基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法步骤如下:
中药化学成分的提取:采用超声提取中药中的化学成分,浓缩干燥或冻干成粉末,备用;
目标成分的敲出:将粉末溶解后,采用半制备液相色谱仪进行目标成分敲出,即分离出目标成分,分步收集敲除目标成分外的各馏份;对收集的各馏份进行浓缩和干燥,得到不同组分群样品;
敲出成分的鉴定:采用液相色谱-质谱联用仪对目标敲出成分进行鉴定,确定相应的敲出馏份是否彻底敲出各目标成分;
敲出成分的量化:采用液相色谱仪分析并计算敲出成分的相对含量,以中药提取物为基准,称取各组分群样品,配制成反映各组分群在中药提取物中实际含量的样品溶液;
确定主要药效组分群:对上一步配制的样品溶液进行细胞增殖抑制和凋亡实验,确定中药中最有价值的效应组分群。
进一步的,所述的基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法在青黛中的应用。
所述的应用方法的步骤如下:
青黛提取物的制备:超声提取青黛中的化学成分,超声条件为功率500-1000 W,温度40-60℃,时间50-80 min,次数3-4次;提取液浓缩,条件为转速120-160 r·min-1,水浴加热温度50-80℃,冷却温度-10-0℃;将青黛提取物制备成粉末,备用;
青黛不同组分群的制备:精密称取青黛提取物粉末,加入N,N-二甲基甲酰胺,超声10-20 min溶解,冷却至室温,用N,N-二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸体积比为(4-6):(3.9-5.5):(0.1-0.5)定容,微孔滤膜过滤,收集滤液;运用半制备液相色谱仪对滤液中的目标成分靛玉红、色胺酮和异鼠李素进行敲出,分别收集目标敲出成分靛玉红馏份,目标敲出成分色胺酮和异鼠李素馏份,目标敲出成分色胺酮、异鼠李素和靛玉红馏份,及相应的敲出靛玉红的馏份,敲出色胺酮和异鼠李素的馏份,敲出靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份;并对收集的各馏份进行浓缩和干燥,即可得到不同组分群样品;其中,色谱条件为采用Shim-packGISS C18色谱柱,流速为3-5 mL·min-1,检测波长为260-300 nm,上样量为 3-6 mL;洗脱条件为以0.1%-0.5%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。
青黛提取物敲出组分的鉴定:采用液相色谱-质谱联用仪对目标敲出成分进行鉴定,确定相应的敲出馏份是否彻底敲出各目标成分;其中,液相色谱的条件为InetrSustainSwift C18色谱柱,流速为0.5-1.5 mL·min-1,检测波长为260-300 nm,进样量为20-30 μL,洗脱条件为以0.1%-0.5%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱;质谱参数:ESI+,离子扫描参数:100-1000 m/z,干燥气为氮气:10-20 L·min-1,温度:300-400 ℃,雾化气压力:40-60psig,毛细管电压:3000-4000 V。
量化青黛提取物敲出组分:采用液相色谱仪,分析并计算得到各敲出成分相对青黛提取物的含量比;以青黛提取物为基准,按含量比称取各组分群样品,配制成反映各组分群在青黛提取物中真实含量的样品溶液;其中,液相色谱的条件为InetrSustain SwiftC18色谱柱,流速为0.5-1.5 mL·min-1,检测波长为260-300 nm,进样量为20-30 μL,洗脱条件为以0.1%-0.5%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。
主要药效组分群的确定:对上一步配制的样品溶液进行白血病细胞增殖抑制和凋亡实验,确定青黛中最有价值的抗白血病主要效应组分群。
进一步的,所述的基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法在青黛主要药效组分群制备中的应用。
所述的应用方法包括以下步骤:
青黛提取物粉末的制备:超声提取青黛中的化学成分,超声条件为功率700 W,温度50℃,时间60 min,次数3次;提取液浓缩,条件为转速140 r·min-1,水浴加热温度65℃,冷却温度-4℃;将青黛提取物制备成粉末,备用;
青黛提取物敲出组分的制备:运用半制备液相色谱仪对目标成分靛玉红、色胺酮和异鼠李素进行分离,收集不含靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份;其中,色谱条件:采用Shim-pack GISS C18色谱柱,流速为3 mL·min-1,检测波长为290 nm,上样量为 4 mL;洗脱条件:以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。
进一步的,所述的青黛主要药效组分群在制备抗白血病药物中的应用。
区别于现有技术,上述技术方案的优点在于:
(1)本发明的方法通过体现各药效组分群在中药中的真实含量,准确反映了各药效组分群的实际药效。
(2)本发明采用了“成分敲出”策略和“定量法”,制备和筛选具有抗白血病效应的青黛提取物敲出组分,为后续的青黛质量控制、抗白血病的药效研究及药物制剂提供基础支持,对于其它药物同样具有借鉴和推广价值。
附图说明
图1为具体实施方式所述的青黛提取物敲出组分的制备及辨识示意图
图2为具体实施方式所述的青黛提取物与青黛三种加标溶液半制备液相色谱图,其中,图a为青黛提取物样品,图b为色胺酮加标溶液,图c为异鼠李素加标溶液,图d为靛玉红加标溶液。
图3为具体实施方式所述的青黛提取物敲出组分的馏份收集示意图
图4为具体实施方式所述的青黛提取物敲出组分的离子流图和二级质谱图
图5为具体实施方式所述的青黛提取物和混合对照品色谱图,其中,图a为青黛提取物样品,图b为混合对照品。
图6为具体实施方式所述的青黛提取物敲出组分对K562细胞增殖的影响
图7为具体实施方式所述的ABC+和ABC-组分对K562细胞凋亡的影响
具体实施方式
为了确保真实反映青黛提取物或其敲出组分(群)在青黛中的抗白血病的作用,发明人提供了一种高通量、高精度的制备、筛选和评价方法,即将成分敲出策略和定量法相结合,辅助色谱和质谱技术。本方法包括三步,实验流程如图1所示。
第一步:青黛提取物粉末的制备。对青黛中的化学成分进行超声提取,浓缩提取液,将青黛提取物制备成粉末,备用。
第二步:青黛提取物敲出组分的制备。一方面,运用半制备液相色谱仪对已明确有抗白血病作用的目标成分(靛玉红、色胺酮和异鼠李素)和阴性样品(除去目标成分外的青黛提取物)进行分离和收集馏份后,对所述青黛提取物敲出组分组合物进行质谱鉴定,反馈以重新调整馏份收集程序直到确定所述组合物均已完成。另一方面,运用定量法对所述组合物进行含量测定,得到其在青黛提取物中的含量占比。
第三步,确定青黛提取物敲出组分抗白血病的主要效应成分。按照各青黛提取物敲出组分含量占比,测定不同浓度和不同反应时间下所述组合物对人慢性髓原白血病细胞的增殖抑制作用和细胞凋亡来筛选和评价抗白血病作用主要效应成分。最终,确定最有价值的抗白血病组合物的主要效应成分。
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果,以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
一、青黛提取物样品粉末的制备
精密称取六份青黛粉末各25 g,置于烧杯,量取N,N-二甲基甲酰胺 (DMF)300 ml浸泡30 min,按超声功率700 W,超声温度 50 ℃,超声时间60 min,超声提取次数为三次,收集青黛提取液,过滤,将其转移至旋蒸瓶中,按转速140 r·min-1,水浴加热温度65 ℃,冷却温度-4℃条件进行浓缩,将青黛提取浓缩液置于真空烘箱制备成粉末。
实验得到样品粉末约为2.2 g,计算得率约为1.47%。
二、青黛提取物敲出组分的制备
1、半制备液相色谱定性分析
分别精密称取色胺酮、靛玉红和异鼠李素对照品各10.00 mg,加入DMF适量,超声15 min,冷却至室温,用DMF:甲醇:冰醋酸(体积比为5:4.9:0.1)定容至10 mL,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,备用。
精密称取三份青黛提取物粉末10.00 mg,分别精密移取0.5 mL色胺酮、0.5 mL靛玉红和0.5 mL异鼠李素对照品溶液至10 mL容量瓶中,定容,过滤,即得。
采用Shim-pack GISS C18 (10 mm×250 mm,5 μm) 色谱柱,流速为3 mL·min-1,检测波长为290 nm,上样量为 4 mL。以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱,洗脱程序如表1所示。
表1 梯度洗脱程序
按色谱条件进行测定,记录半制备色谱图,结果如图2a所示。色胺酮、异鼠李素、靛玉红三种目标成分加标后,色谱峰高均有所增加,从而确定各目标成分出峰保留时间,如图2b、2c、2d所示。色胺酮、异鼠李素和靛玉红的保留时间分别为65.5 min、66.2 min和85min。
2、青黛提取物敲出组分的收集、浓缩和干燥
精密称取青黛提取物样品粉末200.00 mg加入DMF适量,超声15 min,冷却至室温,用DMF:甲醇:冰醋酸(体积比5:4.9:0.1)定容至10 ml,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,即得。
设置馏份收集器的半峰宽2 sec、斜率0 uV/sec、水平-4500 uV、馏份收集体积13mL和响应 1 sec,按表2中程序收集馏份。
表2 馏份收集程序
按目标成分靛玉红(A)、色胺酮(B)和异鼠李素(C),分别逐步敲出A、BC、ABC,得到目标敲出成分A+、BC+、ABC+及相应样品A-、BC-、ABC-。如图3所示,共收集到41组馏份。将其分五段收集,Ⅰ段为1~16号馏份、Ⅱ段为17、18号馏份、Ⅲ段为19~22号馏份、Ⅳ段为23~25号馏份和Ⅴ段为26~41号馏份。
经色谱定性分析,Ⅱ段为目标敲出成分BC+(色胺酮和异鼠李素),Ⅳ段为目标敲出成分A+(靛玉红),Ⅱ段和Ⅳ段为目标敲出成分ABC+(色胺酮、异鼠李素和靛玉红),Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅴ段为相应的样品A-(敲出靛玉红的馏份),Ⅰ+Ⅲ+Ⅳ+Ⅴ段为相应的样品BC-(敲出色胺酮和异鼠李素的馏份),Ⅰ+Ⅲ+Ⅴ段为相应的样品ABC-(敲出靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份)及Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ+Ⅴ段为基准样品D(包含1-41号馏份)。
运用半制备色谱制备得到的目标成分A+、BC+、ABC+及其相应的样品A-、BC-、ABC-,和基准样品D的得率分别为9.4%、0.30%、10.43%、40.625%、58.33%、37.5%和68.37%。
3、青黛提取物敲出组分的鉴定
为了确定青黛提取物敲出组分(群)是否均彻底敲出各目标成分,采用液相色谱-质谱联用仪对青黛提取物敲出组分进行鉴定。液相色谱条件为InetrSustain Swift C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 色谱柱,流速为1 mL·min-1,检测波长为290 nm,进样量为20 μL,按表1梯度洗脱。四级杆-飞行时间质谱仪的质谱参数:ESI+;离子扫描参数:100-1000 m/z;干燥气为氮气:10 L·min-1;温度:350 ℃;雾化气压力:40 psig;毛细管电压:3500 V。
结果如图4所示。A-样品提取离子流图和二级质谱图中存在色胺酮(质荷比249.0659)和异鼠李素(质荷比317.0656);BC-样品提取离子流图和二级质谱图中存在靛玉红(质荷比263.0815);ABC-样品提取离子流图和二级质谱图中不存在色胺酮(质荷比249.0659)、靛玉红(质荷比263.0815)和异鼠李素(质荷比317.0656)。实验结果表明,确定完成青黛提取物敲出组分的制备。
4、量化青黛提取物敲出组分
分别精密称取色胺酮、靛玉红和异鼠李素对照品各10.00 mg,加入DMF适量,超声15 min,冷却至室温,用DMF:甲醇:冰醋酸(体积比5:4.9:0.1)定容至10 mL,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,备用。
精密称取青黛提取物样品粉末200.00 mg加入DMF适量,超声15 min,冷却至室温,用DMF:甲醇:冰醋酸(体积比5:4.9:0.1)定容至10 ml,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,即得。
按表1梯度洗脱,记录高效液相色谱图,结果如图5所示。图5a青黛提取物样品中色胺酮、异鼠李素和靛玉红的峰面积分别为:1569442、1230418 和6313001。图5b三个对照品混合物中色胺酮、异鼠李素和靛玉红的峰面积分别为:148273、22634和13941514。采用归一化法计算青黛提取物敲出组分含量。
以样品D(10.00 mg;100%)为基准,得到青黛提取物敲出组分的质量及含量占比,分别为A+(1.104 mg;11.04%)、BC+(0.0562 mg;0.562%)、ABC+(1.1602 mg;11.602%);A-(8.896 mg;88.96%)、BC-(9.944 mg;99.44%)、ABC-(8.840mg;88.40%)。
三、确定青黛提取物的主要效应组分群
1、助溶剂种类及浓度范围的选择
从DMF、二甲基亚砜(DMSO)和聚氧乙烯蓖麻油(CrEL)三种溶剂中选择最优的细胞增殖抑制实验的助溶剂。按表3所示,以D为基准(10 mg),分别称取A+(1.104 mg)、BC+(0.0562 mg)、ABC+(1.1602 mg);A-(8.896 mg)、BC-(9.944 mg)、ABC-(8.840mg)各三份,移取100 μL三种溶剂和完全培养液逐级溶解,配置浓度范围为100 ug·mL-1至1000 ug·mL-1,通过倒置荧光显微镜观察细胞生长状况,确定最优助溶剂为DMF。
考察助溶剂的细胞毒性,确定助溶剂DMF的最优浓度。DMF的浓度范围为0、0.1%、0.2%及1%。通过CCK8 法测定细胞增殖抑制率,DMF浓度范围超过0.1%时,对人慢性髓原白血病细胞K562细胞具有细胞抑制。
实验结果表明,溶剂DMF能较好的溶解目标成分及青黛提取物敲出组分,并且对细胞毒性较小。考虑细胞实验涉及溶剂属亲水性,而D溶解性最差,因此以D为考察对象,最终细胞增殖抑制实验的最大浓度为100 mg·L-1。
2、细胞增殖抑制和凋亡实验
细胞培养:人慢性髓原白血病细胞K562细胞置于10%胎牛血清,0.1% 双抗试剂(100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素)和90% RPMI-1640 培养基体系中,温度37 ℃、含5%的 CO 2 恒温培养箱中培养,取对数生长期的细胞进行实验。
采用CCK8法测定青黛提取物敲出组分对K562细胞增殖抑制作用。空白组(只加完全培养基)、正常细胞组(以1.5×104个细胞/孔接种于96孔培养板中,分别加入不同浓度样品及CCK8),阴性对照组(加入1.5×104个细胞/孔和 0.1%DMF)。每组设三个复孔,铺孔后放置于CO 2培养箱培养48 h,每孔加入10 μL CCK8,孵育2 h,450 nm波长下测定各孔吸光度。记录结果,按以下公式计算细胞增殖抑制率。
结果如图6所示,随着浓度增加,A-、BC-、ABC-对K562细胞增殖抑制作用较强,而A+、BC+、ABC+对K562细胞增殖抑制作用不显著,主要由于青黛提取物样品中色胺酮、异鼠李素含量较小和靛玉红溶解性差,致使目标成分未达到其抑制浓度范围。以D浓度为100 mg·L-1时,其余样品浓度如表3所示,该浓度即为各组分在青黛中的实际含量。反应24 h时,各阴性样品抑制作用强度为ABC->A->BC->D,随着时间增加,当反应48 h时,抑制作用变为ABC->D>A->BC-。结果表明,D具有较强的时间依赖。将ABC-和ABC+进一步进行细胞凋亡实验,结果如图7所示,ABC-对K562的抑制作用和凋亡作用较强,表明除了靛玉红、色胺酮和异鼠李素,可能存在水溶性较好的抗白血病效应成分,确定其为最有价值的抗白血病组合物的主要效应成分。
表3 青黛提取物敲出组分对细胞的抑制效果
注:* P<0.05,** P<0.01
实施例2
青黛提取物粉末的制备:超声提取青黛中的化学成分,超声条件为功率700 W,温度50℃,时间60 min,次数3次;提取液浓缩,条件为转速140 r·min-1,水浴加热温度65℃,冷却温度-4℃;将青黛提取物制备成粉末,备用;
青黛提取物敲出组分的制备:运用半制备液相色谱仪对目标成分靛玉红、色胺酮和异鼠李素进行分离。色谱条件:采用Shim-pack GISS C18色谱柱,流速为3 mL·min-1,检测波长为290 nm,上样量为 4 mL;洗脱条件:以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱。洗脱程序如表1所示。如图3所示,收集0.33 min至 57.5 min、64.01至75.0 min和82.01min至130.0 min的不含靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份(ABC-)。
将收集到的ABC-馏分浓缩干燥,制成粉末,然后配制成88.400mg·L-1的溶液,考察其对不同白血病细胞的抑制效果。结果表明,ABC-可以有效抑制K562、人白血病细胞NOMO-1、热类原巨核细胞白血病细胞UT-7、人急性淋巴母细胞型白血病细胞CCL-120.1、人肥大细胞白血病细胞CHMAS。
将ABC-粉末与适量助剂淀粉、玉米浆、硬脂酸镁混合,过筛,在合适的容器中均匀混合,把得到的混合物制粒压片,即可制成药片,可用于抗白血病的治疗。
需要说明的是,尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述,但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此,基于本发明的创新理念,对本文所述实施例进行的变更和修改,或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域,均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于目标成分敲出的中药药效组分辨识的方法在青黛中的应用,其特征在于,所述的应用方法的步骤如下:
青黛提取物的制备:采用N,N-二甲基甲酰胺超声提取青黛中的化学成分,超声条件为功率500-1000 W,温度40-60℃,时间50-80 min,次数3-4次;提取液浓缩,条件为转速120-160 r·min-1,水浴加热温度50-80℃,冷却温度-10-0℃;将青黛提取物制备成粉末,备用;
青黛不同组分群的制备:精密称取青黛提取物粉末,加入N,N-二甲基甲酰胺,超声10-20 min溶解,冷却至室温,用N,N-二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸体积比为(4-6):(3.9-5.5):(0.1-0.5)定容,微孔滤膜过滤,收集滤液;运用半制备液相色谱仪对滤液中的目标成分靛玉红A、色胺酮B和异鼠李素C进行敲出,分别收集目标敲出成分靛玉红馏份A+,目标敲出成分色胺酮和异鼠李素馏份BC+,目标敲出成分色胺酮、异鼠李素和靛玉红馏份ABC+,及相应的敲出靛玉红的馏份A-,敲出色胺酮和异鼠李素的馏份BC-,敲出靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份ABC-;并对收集的各馏份进行浓缩和干燥,即可得到不同组分群样品;其中,半制备色谱的色谱条件为采用Shim-pack GISS C18色谱柱,流速为3-5 mL·min-1,检测波长为290 nm,上样量为 3-6 mL;洗脱条件为以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱,梯度洗脱程序如下:
设置馏份收集器的半峰宽2 sec、斜率0 uV/sec、水平-4500 uV、馏份收集体积13 mL和响应 1 sec,按如下程序收集馏份:
青黛提取物敲出组分的鉴定:采用液相色谱-质谱联用仪对目标敲出成分进行鉴定,确定相应的敲出馏份是否彻底敲出各目标成分;所述的液相色谱的条件为InetrSustainSwift C18色谱柱,流速为0.5-1.5 mL·min-1,检测波长为290 nm,进样量为20-30 μL,洗脱条件为以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱,洗脱程序与青黛不同组分群的制备步骤相同;质谱参数:ESI+,离子扫描参数:100-1000 m/z,干燥气为氮气:10-20 L·min-1,温度:300-400 ℃,雾化气压力:40-60 psig,毛细管电压:3000-4000 V;
量化青黛提取物敲出组分:采用液相色谱仪,分析并计算各敲出成分相对青黛提取物的含量比;以青黛提取物为基准,按含量比称取各组分群样品,配制成反映各组分群在青黛提取物中真实含量的样品溶液;所述的液相色谱条件为InetrSustain Swift C18色谱柱,流速为0.5-1.5 mL·min-1,检测波长为290 nm,进样量为20-30 μL;洗脱条件为以0.1%冰醋酸-甲醇为流动相进行梯度洗脱,洗脱程序与青黛不同组分群的制备步骤相同;
主要药效组分群的确定:对上一步配制的样品溶液进行白血病细胞增殖抑制和凋亡实验,确定青黛中最有价值的抗白血病主要效应组分群,即敲出靛玉红、色胺酮和异鼠李素的馏份。
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