CN101957346B - 一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，并采用优选的方法提取经斑马鱼代谢后的药物代谢物，并采用优选的分析方法对代谢物进行分析，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点和一般体内代谢实验所用药量大、劳动强度高的缺点，实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。

Description

一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法

技术领域

本发明涉及一种药物代谢研究方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼快速研究药物代谢的新方法。

背景技术

药物代谢是研究药物在机体作用下发生的化学结构转化特点和规律的一门科学。结构变化包括氧化、还原、分解、结合等方式。经过代谢，其药理作用被减弱和消失。药物代谢研究对药动学、药效学、毒理学及其他生物医学学科发展有重大影响。

药物代谢研究方法常包括体内实验法和体外实验法，体内实验法：动物给药后，在一定时间内将动物处死，取消化道各部分内容物进行分析，并检查血液、尿、粪便、胆汁，检测代谢物的结构变化，研究药物的代谢转化，并推断其在消化道内的代谢过程。体内代谢试验能客观的反应药物在体内的转化，但一般药物用量较大，不利于少量药物的快速代谢研究；有些体内成分含量低微，即使采用现代分析手段有时也难以满足体内复杂体系的检测需求，而加大药量或进一步富集、纯化样本等手段对结果的改善也是有限的；体内代谢劳动强度相对较大，常需多人合作完成。体外实验法：体外肝细胞代谢和胃肠道菌群代谢。肝细胞代谢：取肝匀浆、肝细胞微粒体或细胞色素P450酶与药物共孵育，检查原型成分及其代谢物的种类和含量，是研究肝脏对药物代谢的有效体外方法。胃肠道菌群代谢：粪便温孵法和离体消化道内容物温孵法是研究药物在消化道内代谢的方法。许多药物成分是在消化道菌丛作用下代谢的，特别是肠道内细菌的苷键水解酶或人的粪便孵液与药物在厌氧条件下温孵，检查原型成分及其代谢物的种类和含量，是研究肠内菌对药物代谢的有效方法。体外实验法虽然较有效的模拟了药物在体内代谢的不同环节，有益于富增、制备代谢产物，但脱离了完整的代谢体系对药物的作用，难以体现在体代谢的综合结果；体外实验条件要求相对较高，一般实验室难以进行。因此，建立一种既能体现在体代谢的综合效应，又能实现条件简单，低劳动强度，化合物用量少的高通量代谢研究方法具有重要意义。

斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模繁殖。成体鱼长3～4cm，养殖成本仅为养小鼠的0.1％-1％。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100％，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P.Goldsmith，Curr Opin Pharmacol，4，504-12(2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S.Sumanas and S.Lin，DDT：TARGETS，3，89-96(2004).]。如中国专利200810019040.5公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法，专利200780051025.2公开了一种通过干细胞营养进行的器官的形成和以及酒精损伤器官的再生方法，200310108710.8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病。并且斑马鱼具有药物代谢的P450s相关酶系：目前已克隆到的斑马鱼P450s基因主要包括：Cyp1A、Cyp2K6、Cyp3a65和Cyp3C1、Cyp11a1、Cyp19、Cyp26A1、Cyp26B1和Cyp26D1几个家族的成员，它们与人类相应基因的同源性约为40％～73％[P.Collodi，C.L.Miranda，X.Zhao，D.R.Buhler，D.W.Barnes.Xenobiotica，24(6)，487-493(1994)]。斑马鱼具有完整的代谢器官系统和代谢酶系，以及与哺乳动物相似的系统及基因，为研究人类许多常见疾病的发病机制提供了理想的实验模型，同时也为药物的作用机制、安全性评价及代谢研究提供了理想的实验模型。因此可将它作为具有完整代谢体系的理想模式生物用于药物的代谢研究。国内在这方面的研究尚属空白。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的快速模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，它包括以下步骤：

(1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶液组，空白鱼组、空白药物组和药物鱼组，空白溶液组和药物鱼组斑马鱼数量相等，将受试药物配成所需浓度，加入到药物鱼组的水溶液中，空白对照组加入等量的溶媒，空白鱼组只加等量溶媒不放斑马鱼、空白药物组加溶媒溶解的等量药物不放斑马鱼，在药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h～24h内不同时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2～3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70℃冰箱放置，并取各时间点鱼药液，于-70℃冰箱放置，空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h和24h时同法取样，备用；

(2)取步骤(1)得到的各时间点鱼药液冷冻干燥，残渣加适量溶剂溶解，过0.45μm或0.22μm滤膜或15000转/min离心，取滤液或上清液进行高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取各时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃取液，过0.45μm或0.22μm滤膜或约15000转/min离心，滤液或上清液进行HPLC分析或LC-MS分析。

作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，其中步骤(1)中的空白溶液组，空白鱼组、空白药物组和药物鱼组均平行设3个组，保证实验的科学性。

作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，步骤(1)中药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，取鱼体，并在这些时间点取鱼药液。采用连续时间间隔点取样可以充分明确药物的代谢方式和代谢特点，为指导药物的临床用药和药物剂型的选择提供科学依据。

作为优选方案，其中步骤(1)所述的溶媒为水或者是含有0～1％二甲基亚砜助溶剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性，使药物均匀分散于水溶中。

作为优选方案，以上所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，步骤(2)根据被分析药物的性质，根据相似相溶原则选择溶剂溶解或萃取受试药物，如药液残渣加甲醇溶解，斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用溶剂萃取药物成分，离心取上清或合并萃取液，氮气吹干，残渣加溶剂溶解。

本发明考察了将药液减压回收至干及直接冷冻干燥两种方法，结果表明将药液直接冻干可最大限度的减少样品处理过程的损失及误差，实验结果更准确，因此步骤(2)将各时间点鱼药液冷冻干燥，然后过滤或离心处理后上高效液相色谱HPLC分析或高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析。

本发明所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，作为优选方案，其中步骤(2)采用Agilent 1100型系列高效液相色谱仪或采用灵敏度高的Waters Alliance 2695-ZQ 2000高效液相色谱-质谱联用仪来测定斑马鱼水溶液中药物和斑马鱼体内组织中药物的含量和结构的变化情况，具有灵敏度高，检测限低的优点。

作为优选方案，本发明所述的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，筛选的受试药物可为化学药品、中药及其提取物、中药复方及其提取物、天然药物，或它们的组合物，作为进一步的优选方案，所述的受试药物为丹参酮类化合物、丹参药材或含有丹参的中药复方、中成药等。

丹参为一种良好的心血管用药，具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神功效，主治月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛，临床在心血管用药上非常广泛，含有中药丹参的中药复方药物多达上百种，丹参中起药效的物质主要有菲醌类的隐丹参酮、丹参酮IIA或丹参酮I，这些活性成分是丹参起药效的物质基础，因此研究隐丹参酮、丹参酮IIA或丹参酮I的代谢情况可以有效了解丹参或是含有丹参中药复方等药物的体内代谢情况。

与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同，斑马鱼的体积较小，口服或注射给药方式很困难，因此，步骤(1)中本发明将受试药物溶解于斑马鱼所生活的水中，斑马鱼会自主连续的从溶液中吸收受试药物并在体内进行代谢，药物的代谢物也会随着斑马鱼的排泄物被连续的排到水中，这样就可通过分析溶液中药液的成分变化来掌握药物的部分代谢信息；斑马鱼成体鱼长约3～4cm，其体内血液量极微量，难以实现采血，通过取血来分析血样的可行性存在问题，而对整体鱼内成分进行分析也能掌握药物在鱼体内的变化情况，这样，就能通过定时取样分析药物在斑马鱼体内及体外的变化规律来较为全面的探索斑马鱼对药物的代谢情况，此法简单可行。

有益效果：本发明提供的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法和现有技术相比具有以下优点：

本发明提供的用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法，选用斑马鱼作为药物代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法，保证实验结果的准确性，尤其是对药物给药方式的优选、药物经斑马鱼代谢后提取方法和分析方法的优选，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，实验结果准确度高，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点，且能克服一般体内代谢实验所用药量大、劳动强度大的缺点，且实验方法可重复性强，尤其是所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。

附图说明

图1隐丹参酮药液0h时隐丹参酮提取离子流图

图2隐丹参酮质谱图

图3隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后中隐丹参酮提取离子流图

图4隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内隐丹参酮提取离子流图

图5隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内隐丹参酮质谱图

图6隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后脱氢产物丹参酮IIA提取离子流图

图7隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内脱氢产物丹参酮IIA提取离子流图

图8隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内脱氢产物丹参酮IIA质谱图

图9隐丹参酮药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内脱氢产物丹参酮IIA的羟基化产物质谱图

图10隐丹参酮药液经斑马鱼作用18h后隐丹参酮的羟基化产物离子流图

图11丹参酮IIA药液0h时丹参酮IIA提取离子流图

图12丹参酮IIA质谱图

图13丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后中丹参酮IIA提取离子流图

图14丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内丹参酮IIA提取离子流图

图15丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后斑马鱼体内丹参酮IIA质谱图

图16丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后丹参酮IIA羟基化产物离子流图

图17丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后丹参酮IIA羟基化产物质谱图

图18丹参酮IIA药液经斑马鱼作用18h后斑马鱼体内丹参酮IIA羟基化产物质谱图

图19丹参酮IIA药液经斑马鱼作用24h后羟基化丹参酮IIA脱氢产物离子流图

图20丹参酮IIA药液经斑马鱼作用18h后斑马鱼体内羟基化丹参酮IIA脱氢产物离子流图

图21丹参酮IIA药液经斑马鱼作用18h后斑马鱼体内羟基化丹参酮IIA脱氢产物质谱图

图22丹参酮I药液0h时丹参酮IIA提取离子流图

图23丹参酮I质谱图

图24丹参酮I药液经斑马鱼作用24h后中丹参酮I提取离子流图

图25丹参酮I药液经斑马鱼作用18h后斑马鱼体内丹参酮I提取离子流图

图26丹参酮I药液经斑马鱼作用18h后斑马鱼体内丹参酮I质谱图

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例一用模式生物斑马鱼研究丹参中隐丹参酮的代谢

1.材料与仪器

受试药物：丹参中隐丹参酮化合物

配制方法：称取相当于隐丹参酮1～2mg溶于10ml二甲亚砜(DMSO)中，加1000ml乐百氏纯净水，摇匀。

动物：斑马鱼，由南京大学模式生物研究所提供。

试剂：乙腈、甲酸为色谱纯(德国，Merck公司)，二甲基亚砜(DMSO，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水乐百氏纯净水。

仪器：Agilent 1100型系列高效液相色谱仪，包括G1311A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器；Chemstation 6.01色谱工作站(美国，Agilent公司)。Waters Alliance 2695-ZQ 2000液相色谱-质谱联用仪，包括双高压泵，自动进样器，柱温箱，电喷雾离子化接口，2695型液相色谱仪，Masslynx 4.0色谱工作站(美国，Waters公司)。METTLER TOLEDO AB135-S分析天平(瑞士，METTLERTOLEDO公司)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。LABCONCO冷冻干燥机(美国，LABCONCO公司)，TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

2.实验方法

2.1给药与取样方法：

取斑马鱼，分别置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12组，每组5条鱼。其中1组为1％DMSO纯净水(空白鱼组)，其它为隐丹参酮1％DMSO纯净水溶液(药物鱼组)。同时设空白溶液组(1％DMSO纯净水)和空白药物组(1％DMSO隐丹参酮纯净水溶液)。药物鱼组分别于斑马鱼暴露药液后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70℃冰箱放置。并取各时间点鱼药液8mL(各3份)，分别混合，于-70℃冰箱放置。空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h，24h时同法取样。

2.2样品处理：

药液处理：将不同时间点鱼药液各8mL，冷冻干燥，残渣加1mL甲醇溶解，过0.22μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

斑马鱼体处理：取各时间点斑马鱼平行组间混合，剪碎，称取1g，加5mL生理盐水匀浆，3500r/min离心10min，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮气吹干，残渣加1mL甲醇溶解制成1g鱼/mL的溶液，过0.22μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

2.3分析条件：

液相条件：色谱柱：Zorbax Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm，Agilent)和C18预柱(4.6×12.5mm ID，5μm)；柱温：25℃；流动相：A为乐百氏纯净水(与质谱联用时改为0.05％甲酸水)，B为乙腈，A十B＝100％，采用梯度洗脱：0～5min，45％B，5～10min，45～50％B，10～30min，50～90％B，30～35min，90～100％B；流速：1.0mL/min；检测波长270nm；记录时间35min；进样量为20μL。

质谱条件：毛细管电压2.50kV，锥孔电压30V，干燥气流速350L/h，离子源温度120℃，辅助气温度350℃；离子检测方式：全扫描检测(SCAN)，离子极性：正离子(positive)，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)，扫描范围：100-800m/z。

3.实验结果

采用HPLC-MS法检测丹参中隐丹参酮经斑马鱼作用后的代谢产物。发现24h内斑马鱼药液中隐丹参酮或斑马鱼体内中的隐丹参酮发生羟基化、脱氢代谢产物(具体实验结果见表1)。结果与已有隐丹参酮代谢研究文献报导一致：丹参中隐丹参酮在动物体内的代谢途径主要为脱氢和羟基化，基中脱氢产物丹参酮IIA是隐丹参酮的主要代谢产物，[Sun JH，Yang M，Han J，Wang BR，Ma XC，Xu M，Liu P，Guo DA.Rapid Commun Mass Spectrom，21(14)，2211-2226(2007)]，表明采用本发明提供的用模式生物斑马鱼研究中药丹参代谢实验结果准确可靠，实验方法可行。且实验检测结果表明，斑马鱼药液中隐丹参酮或斑马鱼体内中的隐丹参酮在4h始能检测到代谢产物丹参酮IIA，可为临床剂型和临床用药提供科学依据。如将丹参酮类化合物制备成口服或静脉注射给药制剂提供参考依据。

表1丹参中隐丹参酮经斑马鱼作用后的代谢产物鉴定

实施例二用模式生物斑马鱼研究丹参中丹参酮IIA的代谢

1.材料与仪器

受试药物：丹参中丹参酮IIA化合物

配制方法：称取相当于丹参酮IIA 1～2mg溶于10ml二甲亚砜(DMSO)中，加1000ml乐百氏纯净水，摇匀。

动物、试剂、仪器：同实施例一。

2.实验方法

2.1给药与取样方法：

取斑马鱼，分别置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12组，每组5条鱼。其中1组为1％DMSO纯净水(空白鱼组)，其它为丹参中丹参酮IIA 1％DMSO纯净水溶液(药物鱼组)。同时设空白溶液组(1％DMSO纯净水)和空白药物组(1％DMSO丹参酮IIA纯净水溶液)。药物鱼组分别于斑马鱼暴露药液后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70℃冰箱放置。并取各时间点鱼药液8mL(各3份)，混合，-70℃冰箱放置。空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h，24h时同法取样。

2.2样品处理：

药液处理：将不同时间点鱼药液各8mL，冷冻干燥，残渣加1mL甲醇溶解，过0.45μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

斑马鱼体处理：取各时间点斑马鱼平行组间混合，剪碎，称取1g，加5mL生理盐水匀浆，3500r/min离心10min，上清液用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，氮气吹干，残渣加1mL甲醇溶解制成1g鱼/mL的溶液，过0.45μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

2.3分析条件：同实施例一。

3.实验结果

采用HPLC-MS法检测丹参中丹参酮IIA经斑马鱼作用后的代谢产物。发现24h内斑马鱼药液中丹参酮IIA或斑马鱼体内中的丹参酮IIA的羟基化、脱氢代谢产物(具体实验结果见表2)。结果与已有丹参酮IIA代谢研究文献报导一致：丹参酮IIA在动物体内的代谢途径主要为羟基化和脱氢[Sun JH，Yang M，Han J，Wang BR，Ma XC，Xu M，Liu P，Guo DA.RapidCommun Mass Spectrom，21(14)，2211-2226(2007)；Li P，Wang GJ，Li J，Hao HP，and Zheng CN.J.of Mass Spectrom，41(5)，670-684(2006)；Li P，Wang GJ，Li J，Hao HP，Zheng CN.Chromatogr.A，1104(1-2)，366-369(2006)]。进一步表明本发明提供的用模式生物斑马鱼研究中药丹参中丹参酮类化合物代谢实验结果准确可靠。且实验检测结果表明，斑马鱼药液中丹参酮IIA或斑马鱼体内中的丹参酮IIA在12h始能检测到羟基化产物代谢产物，可为临床剂型和临床用药提供科学依据。如将丹参酮类化合物制备成口服或静脉注射给药制剂提供参考依据。

表2丹参酮IIA经斑马鱼作用后的代谢产物鉴定

实施例三用模式生物斑马鱼研究丹参中丹参酮I的代谢。

1.材料与仪器

受试药物：丹参中丹参酮I化合物

配制方法：称取相当于丹参酮I1～2mg溶于5ml二甲亚砜(DMSO)中，加1000ml乐百氏纯净水，摇匀。

动物、试剂、仪器：同实施例一。

2.实验方法

2.1给药与取样方法：

取斑马鱼，分别置于含有30mL溶液的棕色瓶中，平均分成12组，每组5条鱼。其中1组为0.5％DMSO纯净水(空白鱼组)，其它为丹参中丹参酮I 0.5％DMSO纯净水溶液(药物鱼组)。同时设空白溶液组(0.5％DMSO纯净水)和空白药物组(0.5％DMSO丹参酮I纯净水溶液)。药物鱼组分别于斑马鱼暴露药液后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70℃冰箱放置。并在各时间点取鱼药液8mL(各3份)，分别混合，-70℃冰箱放置。空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h，24h时同法取样。

2.2样品处理：

药液处理：将不同时间点鱼药液各8mL，冷冻干燥，残渣加1mL甲醇溶解，过0.45μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

斑马鱼体处理：取各时间点斑马鱼平行组间混合，剪碎，称取1g，加5mL生理盐水匀浆，加3～4倍量甲醇或乙腈除蛋白，3500r/min离心，上清液氮气吹干，残渣加1mL甲醇溶解制成1g鱼/mL的溶液，过0.45μm滤膜，滤液进样20μL进行HPLC-MS分析。

2.3分析条件：同实施例一。

3.实验结果

采用HPLC-MS法检测丹参中丹参酮I经斑马鱼作用后的代谢产物。在24h内斑马鱼药液中丹参酮I或斑马鱼体内中仅发现丹参酮I原型成份(具体实验结果见表3)，未发现丹参酮I的代谢产物。实验结果与文献报导一致[Sun JH，Yang M，Han J，Wang BR，Ma XC，Xu M，Liu P，Guo DA.Rapid Commun Mass Spectrom，21(14)，2211-2226(2007)]，丹参酮I在动物体内以原型存在，不会发生转化，也说明本发明提供的用模式生物斑马鱼研究中药丹参中丹参酮类化合物代谢实验结果准确可靠。同样也能为临床剂型和临床用药提供科学依据。

表3丹参酮I经斑马鱼作用后的代谢产物鉴定

通过以上实验结果表明，本发明提供的用模式生物斑马鱼研究药物体内代谢可行性强，能客观准确反应如丹参酮类化合物、丹参或是含有丹参的中药复方药物在体内的代谢情况，能为临床研究药物的代谢情况，指导临床用药和药物剂型的选择提供科学依据。

斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100％，所以本发明选用斑马鱼作为药物体内代谢研究的对象，通过优化的实验分组方法，药物溶解方法优化，药物给药方式的优选，尤其是药物代谢后提取方法和分析方法的优选，能客观的反应药物在体内的真实代谢情况，能克服一般体外代谢实验难以体现在体代谢综合结果的缺点，实验结果准确度高，且实验方法可重复性强，所需受试药物量少，劳动强度低，工作效率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用模式生物斑马鱼研究丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I代谢的新方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取斑马鱼的成体鱼放入盛有水的容器里，分为空白溶液组、空白鱼组、空白药物组和药物鱼组，空白溶液组和药物鱼组斑马鱼数量相等，将受试药物配成所需浓度，加入到药物鱼组的水溶液中；空白对照组加入等量的DMSO纯净水溶液，空白鱼组只加等量的DMSO纯净水溶液，不放斑马鱼；空白药物组加DMSO纯净水溶液溶解的与药物鱼组中药物等量的药物，不放斑马鱼；在药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h～24h内不同时间点将鱼取出，用纯净水迅速洗涤2～3次，处死，去除鱼鳍和鱼磷，称重，于-70℃冰箱放置，并取各时间点鱼药液，于-70℃冰箱放置，空白溶液组，空白鱼组和空白药物组于0h和24h时同法取样，备用，以上所述的药物为丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I；

(2)取步骤(1)得到的各时间点鱼药液冷冻干燥，残渣加适量甲醇溶解，过0.45μm或0.22μm滤膜或15000转/min离心，取滤液或上清液进行高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析；取各时间点斑马鱼鱼体剪碎，称重，匀浆，匀浆液加甲醇或乙腈除蛋白，或匀浆液离心后直接用乙酸乙酯萃取丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I成分，离心取上清或合并萃取液，氮气吹干，残渣加溶剂溶解，过0.45μm或0.22μm滤膜或约15000转/min离心，滤液或上清液进行LC-MS分析；

所述的高效液相色谱与质谱联用LC-MS分析条件为：

液相条件：色谱柱：Zorbax Extend-C18，规格为4.6mm×250mm，5μm，Agilent和C18预柱，规格为4.6×12.5mm ID，5μm；柱温：25℃；流动相：A为0.05％甲酸水，B为乙腈，A十B＝100％，采用梯度洗脱：0～5min，45％B，5～10min，45～50％B，10～30min，50～90％B，30～35min，90～100％B；流速：1.0mL/min；检测波长270nm；记录时间35min；进样量为20μL；

质谱条件：毛细管电压2.50kV，锥孔电压30V，干燥气流速350L/h，离子源温度120℃，辅助气温度350℃；离子检测方式：全扫描检测，离子极性：正离子，离子化方式：气动辅助电喷雾离子化，扫描范围：100-800m/z。

2.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼研究丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I代谢的新方法，其特征在于，步骤(1)中药物鱼组的斑马鱼暴露于药液后0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，18h，24h时间点将鱼取出，并取鱼药液，所述的药物鱼组中的药物为丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I。

3.根据权利要求1所述的用模式生物斑马鱼研究丹参中隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I代谢的新方法，其特征在于，步骤(2)采用Waters Alliance 2695-ZQ2000高效液相色谱-质谱联用仪。

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