CN105467022B - 一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法 - Google Patents
一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；步骤2，药物组用药物处理；步骤3，各组提取总蛋白；步骤4，质谱上样分析。步骤5，生物信息学分析。
Description
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质分析方法在筛选药物中的用途，特别涉及筛选治疗慢性脑供血不足的一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法
背景技术：
养血清脑颗粒是由天士力自主研发用于治疗血虚肝亢所致的慢性脑缺血不足的中药新药。主要通过改善脑膜微循环，增加脑血流量，显著减轻脑缺血引起的神经缺损症状，明显抑制神经细胞凋亡及突触结构改变，对慢性脑缺血的病理改变起到预防和治疗的作用。缺血再灌注损伤引起神经元损伤作为引起慢性脑供血不足主要原因之一，其引起神经细胞损伤的发病机制尚无定论。因此，研究养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足的作用机制及预后靶标蛋白标志物迫在眉睫。
中药制剂有效部位或有效成分进入机体发挥作用，必然会引起从遗传信息到整体功能实现从分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变。调节这些层面的结构与功能的本质是基因，而直接的作用者主要是蛋白质。在对养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足作用机制研究中，现有对神经细胞凋亡相关基因与神经细胞凋亡相关因子等研究，缺乏以蛋白质表达为指标进行相关药物治疗作用机制方面研究。
本方法采用了与人类基因组同源性高(约87％)，基因组信号调控也相似的一种脊椎动物斑马鱼作为模式动物(专有名词)，利用比较蛋白质组相对定量分析的方法筛选出给药前后的差异蛋白质组。尝试从分子结构水平上来揭示中药组方的复杂作用机制，为后续进行蛋白组学生物质控方法开发提供物质基础。
本发明提供一种用于筛选养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足的关键差异蛋白的分析方法。建立基于斑马鱼神经损伤的药效模型，以养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足的神经元保护作用为生物活性指标，应用蛋白组学方法进行筛选斑马鱼神经元损伤的预后标志物。
本方法应用核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ)技术对四组斑马鱼模型蛋白分别进行标记，结合联合纳升液相色谱和串联质谱(nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-LC-MS/MS)分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析，对获得的差异蛋白进行生物信息学分析，并使用同源性分析获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质。
本方法筛选出了33个与神经元损伤相关的差异表达蛋白质，并为斑马鱼神经元损伤的预后提供了可能的生物标志物。
发明内容：
本发明提供一种应用核素标记相对和绝对定量技术对神经损伤进行蛋白标记，并结合联合纳升液相色谱和串联质谱分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析，从而筛选出养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足方面的关键差异蛋白的分析方法。
为此，本发明提供一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法。
本发明所述分析方法，包括以下步骤：
步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；
步骤2，药物组用药物处理；
步骤3，各组提取总蛋白；
用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；
步骤4，质谱上样分析
采用质谱分析数据ProteinPilotTM Software Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析。
同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异。
步骤5，生物信息学分析
采用DAVID生物学功能注释分析，对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，筛选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于GO分析的生物学过程、细胞组分和分子功能方面的富集分析；
使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质，以evalue<0.001作为卡值。以筛选出治疗神经元损伤的预后蛋白标志物；
使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路。
其中，步骤1采用吗替麦考酚酯作为中枢系统神经毒性诱导剂，诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型。并选择模型组、空白组、模型给药组和空白给药组四组对照。每组选用30-150尾斑马鱼，
(1)本方法所用的斑马鱼为Albino品系，由杭州环特生物科技有限公司提供。在加入诱导药物的同时加入养血清脑颗粒。
(2)实验分组为：
⑴斑马鱼神经损伤模型组；
(2)养血清脑颗粒药物处理1000μg/ml组；
⑶空白溶剂对照组；
⑷空白模型药物处理500-1500μg/ml组。
(3)造模的判定：
由于空白对照组斑马鱼脊神经细胞凋亡较少，凋亡细胞荧光信号弱；吗替麦考酚酯诱导的模型组斑马鱼脊神经细胞凋亡非常明显(如图1所示)。可根据荧光信号的强弱来判断模型是否成功。
判定过程如下：
–药物处理结束后，对斑马鱼进行荧光染色；
–染色结束后，每组随机挑选10尾斑马鱼在显微镜下观察并拍照；
–利用图像处理软件进行图像分析，计算神经凋亡细胞染色强度(S)，进行定量分析，统计学处理结果用表示，表1所示；
表1凋亡细胞荧光强度(Mean±SD)
其中，步骤2所述药物处理，方法如下：
药物处理：
除空白组外其余各组均用0.25-0.4μM吗替麦考酚酯造神经损伤模型。选用AB系1d的胚胎斑马鱼，用0.25-0.4μM吗替麦考酚酯和药物同时处理12-24h，药物样品分别用0.1-0.3％DMSO溶解至所需浓度。
优选处理方法：除空白组外其余各组均用0.25μM吗替麦考酚酯造神经损伤模型。选用AB系1d的胚胎斑马鱼，用0.25μM吗替麦考酚酯和药物同时处理24h，药物样品分别用0.1％DMSO溶解至所需浓度。
其中，步骤3，各组提取总蛋白；方法如下：
蛋白质提取
分别对上述四组斑马鱼加入300-800μl裂解液(含1mM PMSF-苯甲基磺酰氟化物)于离心管中碾磨，置于冰上裂解10-20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min。
裂解后，在0-4℃下10,000-15,000rpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于-80℃。
蛋白质的酶解
用超滤方法将上述蛋白溶液替换成蛋白溶解液，并用bradford方法定量。每组分别取30-80ug加入1％SDS(十二烷基硫酸钠)1uL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质＝1：50的比例加入trypsin-胰蛋白酶，35-40℃酶解过夜。
iTRAQ化学标记
使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；空白组用114标记，空白给药组用115标记，模型空白组用116标记，模型给药组用117标记。
先于114、115、116、117各管标记试剂中加入70μL乙醇，混匀，分别加入各管样品中，室温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。
高效液相色谱仪高pH反相色谱分离
将混合标记好的样品100μg用50μL流动相A进行溶解，并采用高效液相色谱仪250×4.6mmC18反相柱进行液相分离，提取总蛋白；每分钟一管组分收集，在6％-35％有效梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干燥备用。
色谱条件
(1)流动相：
A相，2％ACN-98％H2O(氨水调pH 10.0)；
B相：98％ACN-2％H2O(氨水调pH 10.0)。
(2)溶剂梯度：
5％-8％B，1min；8％-32％B，25min；32％-95％B，27min；95％，31min；95％-5％B，32min；
(3)柱温：45℃；
(4)流速：0.7mL/min；
(5)检测波长：214nm。
其中，步骤4所述质谱上样分析，方法如下
取上述样本，溶解于流动相A(1.9％ACN/98％H2O/0.1％FA)合并为10个组分，10,000-15,000r离心2-5min。取上清液并采用Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOFTM5600质谱仪检测。
(1)色谱条件：
液相：Eksigent Nano LC 2D plus；
富集柱：自制C18，5um，ID100um，20mmLength；
分离柱：自制C18，3um，ID75um，120mmLength；
流动相：A相，1.9％ACN-98％H2O-0.1％FA；
B相，98％ACN-1.9％H2O-0.1％FA；
洗脱条件：5％-12％B，5min；12％-22％B，21min；22％-32％B，31.5min；32％-90％，36min；90％-5％B，40min；流速：330nl/min；
(2)质谱条件：
数据采集时间：40min，喷雾电压：2.3KV；毛细管温度：23.92℃；碰撞能量：45eV；采集质量范围：350-1250Da。
质谱鉴定
(1)采用质谱分析数据ProteinPilotTM Software Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析。报告置信度在95％以上的蛋白质，一级误差为10ppm，二级误差为20ppm。
(2)同时用m/z 114、115、116、117报告离子的峰面积积分进行相对定量分析。以m/z 116为对照，按114∶116、115∶116、117∶116的比值，选择p≤0.05的结果进行报告；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异。
以下为本发明相关术语的解释
iTRAQ:核素标记相对和绝对定量技术；是今年来最新开发的一种蛋白定量研究技术。iTRAQ试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段进行精确的鉴别和定量。
iTRAQ试剂：是一种小分子同重元素化学物质，包括三部分：一端是报告部分，另一端是肽反应部分，中间是平衡部分。其中，报告部分质量分别为：114Da、115Da、116Da、117Da；肽反应部分：将报告部分与肽N端及赖氨酸侧链连接，几乎可以标记样本中所有蛋白质。平衡部分：质量为31Da、30Da、29Da、28Da，使得四种iTEAQ试剂分子量均为145Da，保证iTRAQ标记的同一肽段m/z相同。
Bradford法：是根据蛋白质与考马斯亮蓝染料相结合的原理设计，用于蛋白定量的一种方法。
Nano LC-MS/MS：联合纳升液相色谱和串联质谱；
斑马鱼模型：本次实验所用斑马鱼模型为野生型AB系转基因斑马鱼；
吗替麦考酚酯：吗替麦考酚酯是一种用于器官移植的免疫抑制剂，临床研究表明吗替麦考酚酯会诱发神经毒性。能够特异性地抑制淋巴细胞嘌呤从头合成途径中次黄嘌呤核苷酸脱氢酸(1MPDH)的活性，因而具有强大的抑制淋巴细胞增殖的作用，可用作斑马鱼神经元损伤的化学诱导剂。
人同源蛋白质：与人不同的物种中具有相同或相似功能的蛋白质或具有明显序列同源性的蛋白质。
差异表达蛋白质：两组模型获得总蛋白通过iTRAQ技术相对定量鉴定筛选后获得的蛋白。
低丰度蛋白质：指在总蛋白提取物中含量很少的蛋白。
NCBInr数据库：美国国立生物技术信息中心数据库
DAVID：The Database for Annotation,Visualization and IntegratedDiscovery，数据库注释、可视化和综合评价数据库。
Gene Ontology：基因本体是一个在生物信息学领域中广泛使用的本体。它主要包括三个分支:生物过程、分子功能和细胞组件。
KEGG:是基因组破译方面的数据库。在后基因时代一个重大挑战是如何使细胞和有机体在计算机上完整的表达和演绎，让计算机利用基因信息对更高层次和更复杂细胞活动和生物体行为作出计算推测。
E-value:E期望值这个数值表示你仅仅因为随机性造成获得这一alignment结果的可能次数。这一数值越接近零，发生这一事件的可能性越小。
本发明通过使用养血清脑颗粒对上述本发明的方法进行了验证，结论是
1.通过4标iTRAQ结合2D-LC-MS/MS分析，在4组样品中共同鉴定到蛋白质1993种，报告置信度均在95％以上。
2.以116为对照，以差异表达倍数大于或等于1.5倍(即Ratio>＝1.5或Ratio<＝0.50)作为差异表达阈值。114/116组中筛选出差异表达蛋白质107个。
本发明通过DAVID生物学功能注释分析，共筛选出与神经元损伤相关蛋白33个。见表2。富集分析结果见附图2。通过对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对获得了四组与人同源性较好的4组特异性差异蛋白。结果见表3。
表2：与神经元损伤相关的33个差异表达蛋白质。
表3.斑马鱼神经组织与人同源的4组差异蛋白质
本发明还提供用上述分析方法筛选药物，所述筛选药物，通过上述分析方法中步骤2的药物组使用实验药物进行实验，获得的结果如果和阳性药物相同，即认为该药物具有和阳性药物相同的药效。为本发明的筛选方法如下：
步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；
步骤2，药物组分别用被试药物和阳性药物进行药物处理；
步骤3，各组提取总蛋白；
用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；
步骤4，质谱上样分析
采用质谱分析数据ProteinPilotTM Software Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析。
同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异。
以上本发明的技术方案中，使用iTRAQ技术对酶解后蛋白进行标记处理后进行质谱分析，可以替换成使用双相电泳分离分析(2-DE)、差异荧光凝胶电泳分析(2-DIGE)等方法对总蛋白进行分离后进行酶切后再进行质谱分析。
以上本发明的技术方案中，高效液相色谱仪RPRP分离中，色谱仪和色谱条件可以替换为：
仪器：使用普通高效液相色谱仪；如(Agilent 1200；Agilent 1100等)
色谱柱：选择250×4.6mmC18填料任意品牌的反相色谱柱；
流动相：A相：2％ACN-98％H2O(氨水调pH 10.0)；B相：98％ACN-2％H2O(氨水调pH10.0)。
溶剂梯度：5％-8％B，2min；8％-32％B，24min；32％-95％B，26min；95％，33min；95％-5％B，35min；
柱温：40-50℃；
流速：0.5-0.8mL/min；
检测波长：210-220nm。
以上本发明的技术方案中，质谱上样分析中，富集柱：可以选择任意品牌C18，5um，ID100um，20mmLength；分离柱：可以选择任意品牌C18，3um，ID75um，120mmLength；流速：300-350nl/min
质谱条件：喷雾电压：2.0—2.5KV；毛细管温度：20-25℃；碰撞能量：40-50eV；采集质量范围：350-1250Da。
本发明使用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，筛选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于GO分析的生物学过程、细胞组分和分子功能方面的富集分析。目的为鉴定出这些蛋白在哪几类生物学过程或分子功能上显著富集(p＜0.1)，从而从整体上把握鉴定蛋白质与预期功能分布之间的吻合度，还可以获得与某些特定功能相关的蛋白质分子。
本发明使用NCBI的blast工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质。以evalue<0.001作为卡值。以筛选出养血治疗神经元损伤的预后蛋白标志物。
本发明使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路。有利于阐明筛选出的蛋白作为养血治疗神经元损伤的预后标志物的合理性。
本发明的有益效果
该方法利用了蛋白质组学中同位素标记的相对和绝对定量技术(iTRAQ)，相比于传统蛋白质组学中所运用的定性及定量方法，具有精确度更好、可靠性更高、可操作性更强的优势。经过反复实验研究发现，尤其适用于对低丰度蛋白质的研究，可同时支持4种或8种样品，并能够通过同位素标记有效而准确地把握各差异蛋白的动态变化。
利用本方法鉴定出了养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足方面，与斑马鱼神经元损伤相关的33个差异表达蛋白质，并且建立了一套iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术，有效筛选出特异性、差异性靶标蛋白的可行方法。为斑马鱼神经元损伤的预后提供了可能的生物标志物，更好的阐明了其治疗疾病的作用机制。具有模型可靠，可控可评，稳定性好等特点，为后续蛋白组学生物质控的分析方法和全面控制中药质量的现代质量标准打下基础。具体表现为：
(1)应用蛋白组学相对蛋白定量技术确定了与斑马鱼神经元损伤相关的33个差异表达蛋白质，并建立了应用iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术筛选特异性差异蛋白方法。
(2)本方法中，每个实验组别选用100尾斑马鱼，可有效的避免个体差异带来的影响，具有试验结果准确、稳定和可靠的特点。
(3)应用iTRAQ技术联合Nano LC-MS/MS技术进行差异蛋白的筛选，iTRAQ试剂对总蛋白的覆盖率可达98％以上，具有精确度好、可靠性高、可操作性强的特点，可做到对低丰度蛋白质的准确定量。
(4)应用生物信息学方法对33个与神经元相关的差异蛋白进行生物学功能注释分析、与人同源性分析以及与神经组织功能相关通路分析，获得4组养血治疗神经元损伤的预后标志物。
(5)本方法以整体模式动物斑马鱼构建神经元损伤药效模型，利用比较蛋白质组学相对定量分析的方法筛选出给药前后的差异蛋白质组，并进行疾病预后标志物的筛选。从分子层面揭示中药组方的复杂作用机制。
(6)本方法可以用于其它中药制剂复杂作用机制研究的参考。
本发明中首次使用斑马鱼作为模式动物用于养血清脑颗粒治疗疾病作用机制研究，需要进行保护，另外本实验筛选出的与斑马鱼神经元损伤相关的33个差异表达蛋白质以及通过生物学功能注释分析、与人同源性分析以及与神经组织功能相关通路分析，获得4组靶标蛋白养血治疗神经元损伤的预后标志物需要进行保护。
附图说明
图1斑马鱼药效模型评价指标，图中反色荧光点为斑马鱼凋亡神经细胞
图2差异表达蛋白质的生物学过程富集分布图a).生物学过程；b).细胞组分；c).分子功能。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
仪器与试药
超速低温离心机为Beckman公司产品；高效液相色谱仪：型号：RIGOL3220(北京普源精电)；色谱柱：C18反相柱(Agela，C18色谱柱，250×4.6mm i.d.，填料颗粒直径：5μm)；天津博纳艾杰尔；Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOF 5600质谱仪和串级质谱数据分析使用ProteinPilot 4.2软件均为ABI公司产品。
iTRAQ试剂盒：iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit(Applied Biosystems)；蛋白浓度检测试剂盒(Bradford公司)；Tris(BBI公司)；NaF(Fluka公司)；组织裂解液所用苯甲脒(Benzamidine)和4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)购自Sigma公司；亮抑酶肽(Leupeptin)和抑肽酶(Aprotinin)购自上海生物工程公司。丙酮、氨水均购自北京化工厂；ACN、FA均购自sigma公司。
本发明选择斑马鱼为Albino品系(由杭州环特生物科技有限公司提供)；用吗替麦考酚酯诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型；吗替麦考酚酯是一种用于器官移植的免疫抑制剂，临床研究表明吗替麦考酚酯会诱发神经毒性。
斑马鱼神经元损伤模型建立与蛋白抽提
实验斑马鱼为Albino品系，由杭州环特生物科技有限公司提供；用吗替麦考酚酯诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型；在加入诱导药物的同时加入养血清脑颗粒。
实验分组为：⑴斑马鱼神经损伤模型组；⑵药物处理1000μg/ml组；⑶溶剂对照组；⑷正常药物处理1000μg/ml组，每组100尾斑马鱼，药物处理结束后，收集斑马鱼于-80℃保存。
分别对上述四组蛋白中分别加入300-800μl裂解液(含1mM PMSF)于离心管中碾磨，置于冰上裂解10-20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min。裂解后，在0-4℃下10,000-15,000rpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于-80℃。
蛋白质酶解
对上述四组蛋白用超滤方法将蛋白溶液替换成蛋白溶解液，并用bradford方法定量。每组分别取50ug加入1％SDS(体积为1uL)充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质＝1：50的比例加入胰蛋白酶，35-40℃酶解过夜；
iTRAQ化学标记
空白组用114标记，空白给药组用115标记，模型空白组用116标记，模型给药组用117标记；先于114、115、116、117各管标记试剂中计入70μL乙醇(试剂盒自带)，混匀，分别加入各管样品中，室温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。
高效液相色谱仪高pH反相色谱分离
采用高效液相色谱仪250×4.6mmC18反相柱进行LC蛋白质分离；流动相中A：2％ACN-98％H2O(氨水调pH 10.0)；流动相B：98％ACN-2％H2O(氨水调pH 10.0)；溶剂梯度：5％-8％B，1min；8％-32％B，25min；32％-95％B，27min；95％，31min；95％-5％B，32min；柱温：45℃；流速：0.7mL/min；检测波长：214nm。组分收集：每分钟一管，在6％-35％有效梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干燥备用。
质谱上样分析
取上述样本，溶解于A液(1.9％ACN/98％H2O/0.1％FA)合并为10个组分，12,000r离心3min，取上清采用Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOFTM 5600质谱仪检测。
色谱条件：液相：Eksigent Nano LC 2D plus；富集柱：自制C18，5um，ID100um，20mmLength；分离柱：自制C18，3um，ID75um，120mmLength；流动相：A：1.9％ACN-98％H2O-0.1％FA；B：98％ACN-1.9％H2O-0.1％FA；洗脱条件：5％-12％B，5min；12％-22％B，21min；22％-32％B，31.5min；32％-90％，36min；90％-5％B，40min；流速：330nl/min；
质谱条件：数据采集时间：40min，喷雾电压：2.3KV；毛细管温度：23.92℃；碰撞能量：45eV；采集质量范围：350-1250Da。
质谱鉴定
质谱分析数据用ProteinPilotTM Software Beta对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白，报告置信度在95％以上的蛋白质，同时用m/z 114、115、116、117报告离子的峰面积积分进行相对定量分析，以m/z 116为对照，按114∶116、115∶116、117∶116的比值，选择p≤0.05的结果进行报告；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异。
通过4标iTRAQ结合2D-LC-MS/MS分析，在4组样品中共同鉴定到蛋白质1993种，报告置信度均在95％以上，以116为对照，114/116组差异表达蛋白质107个，117/116组差异表达蛋白质33个。以差异表达倍数大于或等于1.5倍(即Ratio>＝1.5或Ratio<＝0.50)作为差异表达阈值。从114/116组差异表达蛋白中功能注释的结果中可知，33个蛋白质与脑及中枢神经组织相关.
生物信息学分析
通过生物信息学方法，使用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，获取与这批差异表达蛋白质所有相关的功能信息。也对差异表达蛋白质进行了基于Gene Ontology(GO)的生物学过程，细胞组分和分子官能团进行了富集分析；选择KEGG的通路数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质。以E-value<0.001作为卡值。同时使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路。
Claims (6)
1.一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；
步骤2，药物组用药物处理；
步骤3，各组提取总蛋白；
用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；
步骤4，质谱上样分析
采用质谱分析数据ProteinPilotTMSoftware Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析；同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异；
步骤5，生物信息学分析
采用DAVID生物学功能注释分析，对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，筛选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于GO分析的生物学过程、细胞组分和分子功能方面的富集分析；
使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质，以evalue<0.001作为卡值；以筛选出治疗神经元损伤的预后蛋白标志物；
使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路；
其中，步骤1采用吗替麦考酚酯作为中枢系统神经毒性诱导剂，诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型，并选择模型组、空白组、模型给药组和空白给药组四组对照，每组选用30-150尾斑马鱼；
其中，步骤2所述药物处理，方法如下：除空白组外其余各组均用0.25-0.4μM吗替麦考酚酯造神经损伤模型；
其中，步骤3，各组提取总蛋白；方法如下：
蛋白质提取：分别对上述四组斑马鱼加入300-800μl裂解液于离心管中碾磨，置于冰上裂解10-20min，超声2-5min，再置于冰上裂解10-20min，裂解后，在0-4℃下10,000-15,000rpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于-80℃，
蛋白质的酶解：用超滤方法将上清液制备为蛋白溶解液，并用bradford方法定量，每组分别取30-80μg加入1％十二烷基硫酸钠1μL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质＝1：50的比例加入trypsin-胰蛋白酶，35-40℃酶解过夜，化学标记：选择使用iTRAQ，双相电泳分离分析、差异荧光凝胶电泳分析方法对酶切后的蛋白进行标记；
使用高效液相色谱仪对各蛋白进行分离：其中的高效液相色谱仪选自：Agilent 1200；Agilent 1100；
色谱柱：选择250×4.6mmC18填料任意品牌的反相色谱柱；
流动相：A相：2％ACN-98％H2O，氨水调pH 10.0；B相：98％ACN-2％H2O，氨水调pH 10.0；
溶剂梯度：5％-8％B，2min；8％-32％B，24min；32％-95％B，26min；95％，33min；95％-5％B，35min；
柱温：40-50℃；
流速：0.5-0.8mL/min；
检测波长：210-220nm。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2所述药物处理方法，选用AB系1d的胚胎斑马鱼，用0.25-0.4μM吗替麦考酚酯和药物同时处理12-24h，药物样品分别用0.1-0.3％DMSO溶解至所需浓度。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，所述化学标记，选择使用iTRAQ进行化学标记，各管标记试剂中加入70μL乙醇，混匀，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；室温反应一小时，标记后混合四组标记好的样本；冻干备用。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，所述高效液相色谱仪为：高pH反相色谱仪；分离方法如下：将混合标记好的样品100μg用50μL流动相A进行溶解，并采用高效液相色谱仪250×4.6mmC18反相柱进行液相分离，提取总蛋白；每分钟一管组分收集，在6％-35％有效梯度内，共30组分；将30个馏分，真空干燥备用；其中，高效液相色谱仪色谱条件
(1)流动相：
A相，2％ACN-98％H2O，氨水调pH 10.0；
B相：98％ACN-2％H2O，氨水调pH 10.0；
(2)溶剂梯度：
5％-8％B，1min；8％-32％B，25min；32％-95％B，27min；95％，31min；95％-5％B，32min；
(3)柱温：45℃；
(4)流速：0.7mL/min；
(5)检测波长：214nm。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，步骤4所述质谱上样分析，方法如下：取各样本，溶解于流动相A合并为10个组分，10,000-15,000r离心2-5min，取上清液并采用Eksigent液相-AB SCIEX TripleTOFTM5600质谱仪检测；其中液相的色谱条件：
液相：Eksigent Nano LC 2D plus；
富集柱：自制C18，5μm，ID100μm，20mmLength；
分离柱：自制C18，3μm，ID75μm，120mmLength；
流动相：A相，1.9％ACN-98％H2O-0.1％FA；
B相，98％ACN-1.9％H2O-0.1％FA；
洗脱条件：5％-12％B，5min；12％-22％B，21min；22％-32％B，31.5min；32％-90％，36min；90％-5％B，40min；流速：330nl/min；
其中质谱条件：数据采集时间：40min，喷雾电压：2.3kV；毛细管温度：23.92℃；
碰撞能量：45eV；采集质量范围：350-1250Da，
质谱鉴定：采用质谱分析数据ProteinPilotTMSoftware Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析；同时用m/z报告离子的峰面积积分进行相对定量分析。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，其中，质谱上样分析中，富集柱：选择C18，5μm，ID100μm，20mmLength；分离柱：选择C18，3μm，ID75μm，120mmLength；流速：300-350nl/min；质谱条件：喷雾电压：2.0-2.5kV；毛细管温度：20-25℃；碰撞能量：40-50eV；采集质量范围：350-1250Da。
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