CN105259262B - 一种快速发现天然产物中低含量活性成分的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种快速发现天然产物中低含量活性成分的方法。该方法通过相对定量将天然药物的全成分划分为高含量成分和低含量成分，采用高分辨色谱峰馏分制备方法直接建立高含量馏分库，并获得相应质谱信息。在敲除这些高含量成分之后对低含量成分进行富集，溶剂浓缩并二次分离之后获得低含量馏分库，同时获得低含量成分质谱信息。在此基础上，分别对高、低含量馏分进行活性筛选。该方法具有快速、精确、自动化程度高、操作简便、成本较低、适用性强等优点，适用于天然产物中低含量活性成分的发现。

Description

一种快速发现天然产物中低含量活性成分的新方法

技术领域

本发明涉及天然产物中化合物提取分离领域，具体涉及一种快速发现复杂天然产物中低含量活性成分的方法。

技术背景

天然药物主要指天然来源的植物(中草药)、动物、微生物、海洋生物及其他生物的具有明确治疗作用的单一成分或多组分药物。

天然药物是现代创新药物发现的重要来源。许多天然来源的化合物已被发现具有多样且独特的生理活性，在此基础上一大批具有特殊治疗作用的药物被开发出来。天然活性物质往往具有结构新颖、活性高、不良反应少的特点，是制药工业中新药研发的重要来源，也是我国研制具有自主知识产权的创新药物的主要源泉(参见：萧伟，陈凤龙；国内外天然药物研究的发展现状和趋势，中草药，2009，11：1681-1687)。

大多数天然产物成分复杂，含量差异悬殊。生药中除了含量较高的成分以外，还含有数量众多、含量较低的成分。这些微量成分不仅在天然药物疗效的发挥中扮演重要角色，同时其结构和生物功能的多样性也为新药研发提供了有价值的信息。许多从天然产物中分离得到的微量成分具有新颖的化学结构和显著的生物学活性，可作为重要的先导化合物，有些还被直接开发成临床药物。例如，抗肿瘤药物紫杉醇和长春新碱、抗疟药物青蒿素等都是从植物中发现的微量成分。此外，随着科研的不断深入，天然产物中高含量的活性成分已越来越多地得到发现和研究，从新的天然资源如海洋生物和研究较少的微量天然产物中寻找新的活性成分是天然药物研发的重要方向之一。

然而从复杂的天然产物中发现新的微量活性成分却相当耗费时间、人力、物力却又低效。传统的对大量复杂天然产物进行提取、分离、反复柱色谱进行纯化的方法常常导致生药中的微量成分在多次柱色谱处理过程中损失，较难获得足够量的高纯度单体进行筛选。为发现更多的微量成分，通常采用加大生药投料量的方式来累积微量成分，但同时也会造成分离工作量的成倍增加和高含量成分的大量干扰，微量活性成分的发现效率依旧难以提高。另有报道将天然产物提取物采用制备型高效液相分离，按时间分段收集馏分，并将各馏分经脱溶剂处理后用于活性筛选。因天然药物成分众多且结构复杂多样，按时间自动化收集的馏分往往是包含2个以上成分的混合物，经初次活性测定后，还需要对显示有活性的馏分进一步分离纯化，制备出单体化合物，即需重复进行样品富集、分离纯化、馏分收集、溶剂去除、样品干燥、活性测试和结构鉴定等步骤来确定活性馏分中的活性成分。更重要的是，馏分中的微量成分很可能因达不到活性起效的浓度而被漏筛。因此，提高从天然产物中发现微量活性化合物的效率，缩短发现时间，降低发现成本，是天然药物活性成分研究和开发亟需解决的问题之一。

CN103487531A公开了一种适用于复杂天然产物高通量筛选的化合物库高效制备方法，该方法能够快速、精确、自动化地制备指纹图谱中各指纹峰对应的馏分，所制备样品纯度高，馏分不易含有共洗脱成分。但该方法由于未将复杂天然产物中的高、低含量成分区别对待，在基于全成分色谱指纹图谱的馏分制备过程中，当高含量成分的制备量达到活性筛选的起效浓度时，而低含量成分由于制备量较低，往往尚未达到起效浓度而难以被发现。因此该方法不能有效地解决低含量活性成分的发现难题。

本发明针对天然药物中的微量活性成分，在将全成分划分为高低含量成分的基础上，结合色谱峰敲除技术和高纯度馏分制备手段，快速、自动化、选择性地富集低含量馏分，使低含量成分达到能够进行筛选的有效浓度，从而显著提高复杂天然产物中微量活性成分发现的灵敏度、精确度及筛选效率，有利于活性成分的快速发现。

发明内容

针对天然药物中成分含量差异悬殊的情况，本发明建立了一种适合天然药物中低含量活性成分快速发现的方法。

本发明首先建立天然药物提取物的常规液相色谱分析方法，建立全成分色谱指纹图谱；然后，将提取物中各成分根据其相对含量划分为高含量成分和低含量成分，基于指纹图谱采用高分辨色谱峰馏分制备方法建立高含量成分馏分库，并对敲除高含量成分后的流出液(包含低含量成分)进行富集、浓缩，经二次高分辨色谱峰馏分制备获得低含量馏分库；采用串联质谱检测器同步获取高、低含量馏分库的质谱信息进行化合物鉴定；进而开展对高、低含量馏分的活性测试和量效关系考察，实现对天然药物中微量成分的活性评价。

该方法快速、精确、自动化程度高、操作简便、成本较低、适用性强，适用于天然产物中微量活性成分的发现。

本发明包括以下内容：

一种快速发现天然产物中低含量活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相应的提取物；

(2)采用常规液相色谱系统与自动组分收集系统联用，建立上述分析对象的全成分色谱指纹图谱条件；

(3)高低含量成分的划分：采用面积归一化法，将各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积，分别与各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积的总和相比，得到各活性成分的相对含量。并将各活性成分的相对含量按照从低到高的顺序排序，选择合适的标准将全成分划分为高含量成分和低含量成分；

(4)高含量馏分库的建立：

运行步骤(2)中的色谱指纹图谱条件，通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置，使组分收集系统的程序根据上述设置，自动、精确地收集各指纹峰；单次进样直接收集高含量成分获得高含量馏分库；

低含量馏分库的建立：

敲除高含量成分之后对低含量成分进行富集，样品经回收溶剂后再次进样，自动、精确收集指纹图谱中的每一个色谱峰(馏分)；

(5)采用串联质谱检测器同步获取高、低含量馏分库的质谱信息进行化合物鉴定；

(6)对每个馏分进行脱溶剂处理，以备后续筛选。

本发明包括以下内容：

(1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相应的提取物。所述的提取物是采用高、中、低极性或不同酸碱性溶剂分别提取天然来源的研究对象所得到的或经初步分离得到的混合物。

(2)采用高效液相色谱进行样品的色谱表征和优化，建立该提取物的指纹图谱。

建立全成分指纹图谱的液相色谱的色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤20mm、粒径≤5μm；流速为0.5-10mL/min，分析时间≤3h；优选的，色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤10mm、粒径≤5μm；流速为1～5mL/min，分析时间≤2h；更优选的，色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤5mm、粒径≤5μm；流速为1～2mL/min，分析时间≤2h。

(3)高、低含量成分的划分：具体实施方法可以根据高效液相色谱或质谱响应采用面积归一化法、标准曲线法、内标法以及标准加入法进行定量分析。按照测量参数可以分为峰面积法或峰高法分析化合物的含量。将化合物的含量按照从低到高排序，将全成分划分为高含量成分和低含量成分；

(4)高含量成分馏分库的制备：运行(2)中的指纹图谱色谱分析条件，通过软件设置高含量目标峰的起始时间和结束时间以及收集位置，使组分收集系统的程序根据上述设置，自动、精确地收集高含量目标峰。可根据馏分的体积适当调整收集容器的大小。单次进样收集高含量目标成分色谱峰(馏分)，对每个馏分进行脱溶剂处理，获得高含量成分馏分库。

(5)低含量成分馏分库的制备：重复数次(4)，将高含量目标峰以外的流出液，即敲除高含量目标峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根据低含量馏分实际浓度的需要，可选择重复2～5次或更多次，收集的混合液经脱溶剂处理后，再次进样，运行指纹图谱色谱分析条件，对照全成分色谱图和富集后的低含量成分色谱图中每个色谱峰的出峰顺序，对所有低含量成分色谱峰进行编号，按照上述馏分收集程序的设置方法，重新设置低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集低含量成分指纹图谱中的每一个色谱峰(馏分)，对每个馏分进行脱溶剂处理，获得经过富集的低含量成分馏分库。

(6)对每个馏分进行脱溶剂处理：可采用氮吹、加热或真空离心干燥等方式进行快速脱溶剂处理，以备后续筛选。

(7)液相色谱-组分收集系统同步联接质谱检测器，液相流出液在线分流后进入质谱检测器，同时获得高、低含量色谱峰各自对应的质谱信息，对收集得到的各馏分进行纯度检测、结构推测和成分鉴定。

(8)制备的高、低含量馏分库样品可用于多种模型的高通量筛选，因各馏分化合物的量不一致，可设计高、中、低三个给药浓度进行给药，即将每个馏分样品不同倍数稀释成高、中、低三个浓度分别测试，根据活性测定值并结合与浓度的关系来评判样品有无活性。

本发明包括以下内容：

(1)以一种天然来源的植物、动物、微生物、海洋生物或中药复方等为对象，制备相应的提取物。所述的提取物是采用高、中、低极性或不同酸碱性溶剂分别提取天然来源的研究对象所得到的或经初步分离得到的混合物。

(2)采用高效液相色谱进行样品的色谱表征和优化，建立该提取物的指纹图谱。

建立全成分指纹图谱的液相色谱的色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤20mm、粒径≤5μm；流速为0.5-10mL/min，分析时间≤3h；优选的，色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤10mm、粒径≤5μm；流速为1～5mL/min，分析时间≤2h；更优选的，色谱条件可以是：分离采用的色谱柱内径≤5mm、粒径≤5μm；流速为1～2mL/min，分析时间≤2h。

(3)高、低含量成分的划分：具体实施方法可以根据高效液相色谱或质谱响应采用面积归一化法、标准曲线法、内标法以及标准加入法进行定量分析。按照测量参数可以分为峰面积法或峰高法分析化合物的含量。将化合物的含量按照从低到高排序，将全成分划分为高含量成分和低含量成分；

(4)高含量成分馏分库的制备：运行(2)中的指纹图谱色谱分析条件，通过软件设置高含量目标峰的起始时间和结束时间以及收集位置，使组分收集系统的程序根据上述设置，自动、精确地收集高含量目标峰。可根据馏分的体积适当调整收集容器的大小。单次进样收集高含量目标成分色谱峰(馏分)，对每个馏分进行脱溶剂处理，获得高含量成分馏分库。

(5)低含量成分馏分库的制备：重复数次(4)，将高含量目标峰以外的流出液，即敲除高含量目标峰后的低含量成分的混合液，收集于同一容器。根据低含量馏分实际浓度的需要，可选择重复2～5次或更多次，收集的混合液经脱溶剂处理后，再次进样，可以选择同上述的指纹图谱色谱分析条件，也可以通过调整洗脱时间、压力、温度等，重新设置指纹图谱色谱分析条件，从而提高高低含量成分色谱峰的洗脱效率。对照全成分色谱图和富集后的低含量成分色谱图中每个色谱峰的出峰顺序，对所有低含量成分色谱峰进行编号，按照上述馏分收集程序的设置方法，重新设置低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集低含量成分指纹图谱中的每一个色谱峰(馏分)，对每个馏分进行脱溶剂处理，获得经过富集的低含量成分馏分库。

(6)对每个馏分进行脱溶剂处理：可采用氮吹、加热或真空离心干燥等方式进行快速脱溶剂处理，以备后续筛选。

(7)液相色谱-组分收集系统同步联接质谱检测器，液相流出液在线分流后进入质谱检测器，同时获得高、低含量色谱峰各自对应的质谱信息，对收集得到的各馏分进行纯度检测、结构推测和成分鉴定。

(8)制备的高、低含量馏分库样品可用于多种模型的高通量筛选，因各馏分化合物的量不一致，可设计高、中、低三个给药浓度进行给药，即将每个馏分样品不同倍数稀释成高、中、低三个浓度分别测试，根据活性测定值并结合与浓度的关系来评判样品有无活性。

相对于传统方法，本发明具有以下优点：

1、本发明区别对待复杂天然产物中的高、低含量成分，能够有效避免筛选过程中对微量活性成分的遗漏，提高从复杂天然产物中发现微量活性成分的效率。

天然产物成分复杂，且含量差异较大。很多时候，微量成分由于达不到起效浓度而被忽略，所以将高含量成分和低含量成分按同一个水平进行活性筛选，显然是不合适的。本发明首先将全成分划分为高含量成分和低含量成分，结合色谱峰敲除技术和馏分富集手段实现对含量差异悬殊样品中微量成分的化合物库构建，使低含量成分得以凸显，达到能够进行筛选的有效浓度，降低在活性筛选过程中高含量成分对微量成分的干扰，显著提高了从复杂天然产物中发现微量活性成分的灵敏度、准确度及筛选效率，对微量成分的发现、研究、开发更具有针对性和普适性。

2、本发明的低含量成分制备方法具有快速、成本低、操作简便、自动化程度高等优点。

本方法通过采用液相色谱-组分收集系统分别对高、低含量馏分进行高效自动化、精确收集，且馏分的制备与馏分的质谱分析同步衔接；高含量成分的敲除、低含量成分的富集和馏分库的构建整个过程，在软件控制下24小时内即可获得高通量筛选所需的样品量，较传统的低含量成分样品的分离制备过程大大缩短时间、人力和物力。

附图说明

图1：不同色谱条件下的全成分色谱指纹图谱

图2：丹参酮高、低含量成分划分示意图

图3：丹参酮高含量成分敲除前、后的色谱图

图4：丹参酮低含量馏分库色谱图以及活性筛选结果图

图3由(A)、(B)、(C)三部分组成：(A)丹参酮全成分色谱图；(B)丹参酮类敲除高含量成分后合并高含量馏分的分析色谱图；(C)丹参酮类敲除高含量成分后富集低含量成分的分析色谱图。

图4由(A)、(B)两部分组成：(A)62个馏分281nm下色谱图；(B)62个馏分三个浓度梯度的中浓度诱导荧光素酶的活性图。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例来描述本发明，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例为本发明具有代表性的实施方案的举例说明，仅仅是示例性的说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：丹参提取物中激活Nrf2-ARE通路的微量活性成分快速筛选

1、仪器和材料

高效液相系统为Agilent 1100HPLC system(Agilent，德国)；四级杆质谱检测器(Agilent，德国)，具电喷雾离子源(ESI)、双高压泵、脱气机、盘式自动进样器、柱温箱和DAD检测器；Sovall Evolution RC型高速冷冻离心机(KENDRO，美国)；旋转蒸发仪(Büchi，瑞士)；LABCONCO冷冻干燥仪；BP 211D十万分之一电子天平(Sartorius，德国)；溶剂蒸发工作站(Gene Vac EZ-2)。

超净台(美国Thermo公司，Thermo Scientific 1300A2型)；CO₂培养箱(美国Thermo公司，series 2Water Jacket)；立式超低温保存箱(海尔公司，DW-86L386)；离心机(美国Thermo公司，Fresco17)；酶标仪(BioTek公司，Synergy 2型)；电热恒温水浴锅(国华电器有限公司，HH-4数显恒温水浴锅)；电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；液氮罐(国产)；多用途旋涡混合器(美国Scientific Industries)；细胞培养耗材、微量移液器购于美国Thermo公司。

药材：丹参(陕西商洛)，经鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。

试剂：色谱纯乙腈(Merck，德国)，色谱纯甲酸(98％；Merck，德国)，超纯水(Millipore，美国)，分析纯甲醇和乙醇(汉邦科技公司，南京)。

293T/17细胞(源于美国ATCC细胞库)；感受态细胞DH5α；氨苄；SDS；Tris-base；Glycine；Yeast Extract；Tryptone；琼脂粉；氯化钠(分析纯)；二甲基亚砜(DMSO)；t-BHQ；Lipofectamine 3000、Opti-MEM(Invitrogen)；高纯度质粒小提中量试剂盒(天根生化科技有限责任公司)；Glo Lysis Buffer、Steady-Glo luciferase Assay system(Promega公司)；荧光素酶报告基因检测试剂盒；β-半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒。

2、实验部分

2.1.丹参药材提取物的制备

丹参药材粉碎，过40目筛，称取150g药材粉末，以10倍量乙酸乙酯(1500ml)超声提取2h，冷却，过滤。合并滤液减压回收，真空冷冻干燥，制备得到提取物冻干粉，保存于密闭的干燥器中。

2.2.高、低含量馏分库的制备

HPLC-UV条件：分析型色谱柱：Agilent ZorBax SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。

半制备型色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱(9.4mm×250mm，5μm)；

流动相：A相为0.02％甲酸-水，B相为乙腈；

梯度洗脱程序：

0-5min，25％B；

5-25min，25-45％B；

25-40min，45-50％B；

40-43min，50-55％B；

43-48min，55％B；

48-65min，55-65％B；

65-70min，65-70％B；

70-90min，70-100％B；

90-100min，100％B。

流速分别为：0.5mL/min和2mL/min。

进样量分别为10μL和20μL，检测波长281nm。

收集的容器包括2mL、8mL和20mL等不同规格试管。

本实验收集高含量成分色谱峰的6个馏分，

本实验收集低含量成分色谱峰的62个馏分，用溶剂蒸发工作站进行离心干燥处理6-8h。干燥后的样品即可用于活性测试。

将全色谱图中各色谱峰对应成分在样品色谱图中显示的峰面积，代入丹参酮II A的标准曲线，计算各成分在丹参药材中的含量。丹参酮IIA标准曲线的计算采用最小二乘法，进样8个梯度浓度，每个浓度重复进样3次，以浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，得到分析物浓度和峰面积之间的线性关系。

利用面积归一化法，将各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积，分别与各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积的总和相比，计算各活性化合物的相对含量。并将各活性化合物的相对含量按照从低到高的顺序排序，划分高低含量成分，确定高含量目标成分色谱峰。

自动组分收集器包括自动进样系统、自动馏分收集系统和LEAP Shell-PAL软件操作系统三个部分。

根据色谱指纹图谱中各色谱峰的起始时间和结束时间，编写控制程序软件，将液相色谱与自动微量组分收集系统联用，根据丹参酮类高、低含量成分划分结果将各高含量目标成分与其余的馏分分别收集。

一次进样可收集高含量丹参酮成分色谱峰(馏分)；

重复三次进样，收集高含量目标峰以外的流出液，得到富集的低含量丹参酮成分的混合液。该样品经旋蒸、真空离心干燥快速回收溶剂后再次进样，运行上述指纹图谱色谱分析条件，对照全成分色谱图和富集后的低含量成分色谱图中每个色谱峰的出峰顺序，对所有低含量成分色谱峰进行编号，按照同上述馏分收集程序的设置方法，重新设置低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集指纹图谱中的每一个色谱峰(馏分)，得到丹参酮低含量馏分。

收集的各馏分经脱溶剂处理，供后续筛选使用。

馏分制备的同时，液相流出液分流到质谱检测器，同步获取各馏分的质谱、分子量等信息，建立各馏分对应的质谱信息库。

2.3.活性筛选即荧光素酶报告基因检测

293T细胞瞬时转染含有ARE启动子序列的荧光素酶报告基因，以lip 3000作为转染试剂，铺板后24h转染，转染24h后用无血清培养基给药，用含1％DMSO的1mL无血清的DMEM培养基溶解色谱峰馏分样品，作为高浓度样品；从高浓度样品中取出250μL，加入250μL无血清DMEM培养基(含1％DMSO)，混匀，作为中浓度样品；再从高浓度样品吸取100μL，加入400μL无血清DMEM培养基(含1％DMSO)中，混匀，作为低浓度样品。配药结束后，每孔加入100μL，设置三个复孔，18h后进行检测。用细胞裂解液摇床裂解15min，采用荧光素酶活性测试系统进行检测。

2.4.质谱条件

TOF/MS条件：电喷雾离子源参数：干燥气流速(N2Drying gas flow-rate)：10.0L/min；干燥气温度(Drying gas temperature)：330℃；雾化气压力(Nebulizer)：241kPa(35psig)；毛细管电压(Capillary voltage)：3000V；裂解电压(Fragmentor)：120～420V；skimmer voltage，60V；octapole DC 1，37V；octapole radio frequency，250V。数据采集和分析分别由Agilent MassHunter Acquisition软件(Agilent，美国)和AppliedBiosystems/MDS-Sciex Analyst QS软件(Frankfurt，德国)完成。

3、实验结果

3.1.丹参药材提取物的色谱表征

丹参药材提取物的色谱条件优化：采用柱长250mm的常规分析型色谱柱进行分析，实验采用梯度程序洗脱，并对洗脱程序、洗脱时间、流动相的pH值等条件进行优化，确定合适的色谱条件(图1A)。将上述分析条件经方法转化后，应用于直径9.4mm的半制备型色谱柱，获得基本一致的分离效果，各色谱峰基本达到基线分离(图1B)。采用直径9.4mm的半制备型色谱柱比直径4.6mm的分析型色谱柱上样量可提高10倍以上，一次性收集的高含量馏分样品足以用于细胞水平的活性筛选。

3.2.丹参提取物高低含量的划分

经液质分析，丹参脂溶性提取物成分复杂，含有的丹参酮类成分数量众多。因丹参酮类成分的结构相似，分子量范围在280Da-315Da，分子量大小比较接近，本实验以丹参酮II A为对照品，采用“一测多评”的方法计算测定各成分在丹参药材中的含量。结果显示分析物浓度和峰面积之间有良好的线性关系，标准曲线的相关系数r2大于0.999，丹参酮II A的标准曲线方程为y＝59115x+9.3087。

利用面积归一化法计算各化合物相对含量，并将化合物的相对含量按照从低到高排序，以相对含量(％)为纵坐标，作出下图(图2)。结合丹参提取物全成分液相分析色谱图和各化合物相对含量的数据分析，其中6个色谱峰的相对含量和其他色谱峰的相对含量相比有比较明显的差别，这6个色谱峰的相对含量依次为：2.62％、3.76％、6.69％、15.05％、15.70％、22.61％，这6个色谱峰的相对含量之和高达66％；而其余色谱峰的相对含量均小于2.5％，它们相对含量的总和只占总含量的34％。于是本实验中我们以2.5％作为划分的标准，将相对含量大于2.5％的6个峰所对应的的成分归为高含量成分，其余峰所对应的成分归为低含量成分。

3.3.丹参酮类高、低含量馏分库的建立

3.3.1基于指纹图谱采用高分辨色谱峰馏分制备方法，单次进样，直接制备得到含有6个高含量色谱峰馏分的高含量成分馏分库，并对敲除高含量成分后的流出液(包含低含量成分)进行三次富集、浓缩，经二次高分辨色谱峰馏分制备获得含有62个低含量色谱峰馏分的低含量馏分库。

高含量成分馏分库的制备方法：

采用半制备型色谱柱，运行2.2中的HPLC-UV条件，按照3.2所述高低含量成分划分结果，根据色谱指纹图谱中6个高含量色谱峰的起始时间和结束时间，编写控制程序软件，将液相色谱与自动微量组分收集系统联用，最终本实验收集高含量成分色谱峰共6个馏分；

低含量成分馏分库的制备方法：

由于低含量成分在液相色谱中的响应较低，想要一次性制备足够的低含量成分达到进行后续筛选的要求比较困难。所以结合高含量成分敲除技术和低含量成分富集手段进行低含量成分馏分库的制备。

采用半制备型色谱柱，运行2.2中的HPLC-UV条件，重复上述高含量成分馏分库的制备方法，重复三次进样，将6个高含量目标峰以外的流出液收集于同一容器，得到富集的低含量丹参酮成分的混合液，该过程即实现高含量成分的敲除。分别取少量敲除前后的样品进行液相分析，分析色谱图如图3所示。

丹参提取物全成分色谱分析图如图3A所示，图中星号标识的为6个高含量成分；6个单次进样收集的高含量目标峰馏分，将其混合后所得样品的色谱分析图如图3B所示；敲除高含量目标峰后富集的低含量馏分，其富集样品的色谱分析图如图3C所示；我们发现敲除6个高含量成分后低含量成分的色谱峰得到凸显。

富集的低含量丹参酮成分的混合液经旋蒸、真空离心干燥快速回收溶剂，复溶后再次进样，运行上述指纹图谱色谱分析条件，并对照全成分色谱图中低含量成分的前后出峰顺序，对富集后的所有低含量成分色谱峰进行编号，如图4(A)。按照同上述馏分收集程序的设置方法，重新设置低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集指纹图谱中的每一个色谱峰(馏分)，得到丹参酮低含量馏分。最终本实验收集低含量成分色谱峰共62个馏分。

3.3.2CN103487531A的丹参高通量筛选的化合物库的制备

其中，申请人以该方法进行了丹参高通量筛选的化合物库的制备，其具体制备方法包括以下步骤：

(1)粉碎丹参，用乙酸乙酯提取丹参，提取液低温冷冻干燥，制得丹参乙酸乙酯提取物；

(2)采用常规分析型液相色谱系统与自动组分收集系统联用，建立丹参乙酸乙酯提取物的全成分色谱指纹图谱分析方法；

高效液相色谱条件：

半制备型色谱柱：Agilent ZorBax SB-C18column(9.4mm×250mm，5μm)

流速：2ml/min，进样量为20μl；或分析型色谱柱：Agilent ZorBax

SB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速：0.5ml/min，进样量为2μl；

柱温：30℃；流动相：A相为0.1％甲酸水，B相为乙腈；

梯度洗脱程序：

0-10min，7-17％B；

10-12min，17-20％B；

12-14min，20％B；

14-18min，20-21％B；

18-34min，21％B；

34-40min，21-29％B；

40-57min，29-35％B；

57-67min，35-65％B；

67-87min，65-70％B；

87-93min，70-80％B；

93-102min，80-90％B；

102-110min，90-100％B；

检测波长281nm；

(3)运行步骤(2)中的色谱指纹图谱分析条件，进样系统和收集系统均由软件控制，通过软件设置各指纹峰的起始时间和结束时间以及收集位置，编辑组分收集系统的程序，自动、精确收集各指纹峰；

(4)用容器共收集到75个不同色谱峰馏分，针对每个指纹峰，分别运行1～2次馏分收集程序；

(5)所有馏分将由程序按编号收集于特定的位置中，使收集完毕后用真空离心干燥浓缩装置进行低温离心干燥处理，离心时间为3h；

(6)丹参乙酸乙酯提取物所得的75个微量样品干燥后构成了一个供高通量筛选的化合物库。该化合物库能用于不同系统的活性测试，例如：细胞、细胞器、蛋白质水平的快速活性筛选。

3.3.3丹参酮类高低含量馏分库的制备方法与CN103487531A的丹参高通量筛选的化合物库的制备方法的区别

流动相的组成：本方法流动相中的水相采用0.02％甲酸-水，CN103487531A采用0.1％甲酸-水；两者的甲酸含量不同。

洗脱程序：从全成分洗脱而言，本方法的洗脱程序较CN103487531A的程序缩短了分析时间，但同样达到了较好的分离效果。

从洗脱的目的而言，本发明的洗脱程序得到了丹参酮类高低含量馏分库，而CN103487531A只能得到丹参酮类全成分馏分库。

3.4.馏分库的活性筛选

依照上述馏分库的建立方法共收集高含量馏分6个，低含量馏分62个。6个高含量馏分的活性筛选数据以及在丹参药材中含量列于表1。分析发现高含量成分与低含量成分相比在含量上有明显差别，单次进样收集的高含量馏分均可在不同程度激活Nrf2/ARE通路。对低含量馏分库中全部62个馏分分别进行高、中、低三个浓度的活性初筛，选择中浓度活性结果作图，如图4(B)所示。在62个低含量馏分中，诱导荧光素酶的倍数超过2.5倍的有33个馏分，说明这些馏分对Nrf2/ARE通路有一定的激活作用，它们在丹参药材中的含量和不同浓度样品的诱导荧光素酶活性见表2。

本实验共筛选出33个低含量活性馏分，这些活性馏分在丹参药材中的含量均在3‰以下。其中含量小于等于1‰的有24个；含量小于0.5‰的有17个；含量小于0.1‰的有3个。发现的活性成分中，除丹参二醇B、丹参酮IIB等12个化合物有相关活性报道外，另外21个化合物均没有该活性的报道。

中药成分复杂，含量悬殊。在筛选中，某些微量成分因达不到起效浓度而被漏筛。本实验结果显示，本中药复杂体系的微量活性成分的发现方法，可以从天然产物中筛选得到更多微量的活性成分。结合高、中、低三个浓度的活性筛选方式，可以提高筛选的准确性，减少假阳性的筛选结果。

表1. 6个高含量馏分在丹参药材中的含量(‰)及荧光素酶活性

表2. 33个微量活性馏分在丹参药材中的含量(‰)以及荧光素酶活性

Claims (1)

1.一种丹参提取物中激活Nrf2-ARE通路的微量活性成分的快速筛选方法，其特征在于：丹参药材提取物的制备

丹参药材粉碎，过40目筛，称取150g药材粉末，以10倍量乙酸乙酯，1500ml，超声提取2h，冷却，过滤，合并滤液减压回收，真空冷冻干燥，制备得到提取物冻干粉，保存于密闭的干燥器中，

高、低含量馏分库的制备

HPLC-UV条件：分析型色谱柱：Agilent ZorBax SB-C18柱，4.6mm×250mm，5μm，

半制备型色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱，9.4mm×250mm，5μm；

流动相：A相为0.02％甲酸-水，B相为乙腈；

梯度洗脱程序：

0-5min，25％B；

5-25min，25-45％B；

25-40min，45-50％B；

40-43min，50-55％B；

43-48min，55％B；

48-65min，55-65％B；

65-70min，65-70％B；

70-90min，70-100％B；

90-100min，100％B，

流速分别为：0.5mL/min和2mL/min，

进样量分别为10μL和20μL，检测波长281nm，

收集的容器包括2mL、8mL和20mL不同规格试管，

收集高含量成分色谱峰的6个馏分，

收集低含量成分色谱峰的62个馏分，用溶剂蒸发工作站进行离心干燥处理6-8h，干燥后的样品即可用于活性测试，

将全色谱图中各色谱峰对应成分在样品色谱图中显示的峰面积，代入丹参酮II A的标准曲线，计算各成分在丹参药材中的含量，丹参酮IIA标准曲线的计算采用最小二乘法，进样8个梯度浓度，每个浓度重复进样3次，以浓度为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，得到分析物浓度和峰面积之间的线性关系，

利用面积归一化法，将各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积，分别与各活性化合物在样品制备色谱图中显示的峰面积的总和相比，计算各活性化合物的相对含量，并将各活性化合物的相对含量按照从低到高的顺序排序，划分高低含量成分，确定高含量目标成分色谱峰，

自动组分收集器包括自动进样系统、自动馏分收集系统和LEAP Shell-PAL软件操作系统三个部分，

根据色谱指纹图谱中各色谱峰的起始时间和结束时间，编写控制程序软件，将液相色谱与自动微量组分收集系统联用，根据丹参酮类高、低含量成分划分结果将各高含量目标成分与其余的馏分分别收集，

一次进样可收集高含量丹参酮成分色谱峰，馏分；

重复三次进样，收集高含量目标峰以外的流出液，得到富集的低含量丹参酮成分的混合液，该样品经旋蒸、真空离心干燥快速回收溶剂后再次进样，运行上述指纹图谱色谱分析条件，对照全成分色谱图和富集后的低含量成分色谱图中每个色谱峰的出峰顺序，对所有低含量成分色谱峰进行编号，按照同上述馏分收集程序的设置方法，重新设置低含量成分的馏分收集程序，自动、精确收集指纹图谱中的每一个色谱峰馏分，得到丹参酮低含量馏分，

收集的各馏分经脱溶剂处理，供后续筛选使用，

馏分制备的同时，液相流出液分流到质谱检测器，同步获取各馏分的质谱、分子量信息，建立各馏分对应的质谱信息库，

活性筛选：即荧光素酶报告基因检测

293T细胞瞬时转染含有ARE启动子序列的荧光素酶报告基因，以lip 3000作为转染试剂，铺板后24h转染，转染24h后用无血清培养基给药，用含1％DMSO的1mL无血清的DMEM培养基溶解色谱峰馏分样品，作为高浓度样品；从高浓度样品中取出250μL，加入到250μL含1％DMSO的无血清DMEM培养基中，混匀，作为中浓度样品；再从高浓度样品吸取100μL，加入到400μL含1％DMSO的无血清DMEM培养基中，混匀，作为低浓度样品，配药结束后，每孔加入100μL，设置三个复孔，18h后进行检测，用细胞裂解液摇床裂解15min，采用荧光素酶活性测试系统进行检测。