CN110412154B - 一种芪龙胶囊多成分液质定量测定方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法及其应用，通过HPLC‑ESI‑MS/MS分析方法，同时测定芪龙胶囊中芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷6个成分的含量，该方法简单、快捷，灵敏度高，专属性好，可为芪龙胶囊的质量控制提供参考依据。该方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点，对药材成分含量分析更具有效，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种芪龙胶囊多成分液质定量测定方法及其应用
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种芪龙胶囊多成分液质定量测定方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
芪龙胶囊由黄芪、地龙、丹参、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁八种药材经精工制作而成的中药复方制剂，现已证明其含有多种生物活性物质，具有良好的益气活血、化瘀通络的疗效，用于缺血性中风(脑梗塞)恢复期，症见半身不遂，口舌歪斜，语言不清，偏身麻木，舌有瘀斑和瘀点。
中药及其复方是在中医理论指导下进行应用研究的，其成分复杂，发挥药效的部位往往不是单一成分，而是群体疗效，所以任何一种单一成分都是无法反应中药及其复方的整体疗效的。因此，对中药及其复方进行宏观地综合分析将成为必然的趋势。
目前针对芪龙胶囊的有效成分分析的研究较少，胶囊中的化合物成分较为复杂且不完全明确，芪龙胶囊质量标准仅利用对复方中的黄芪甲苷进行了含量测定。然而，如前所述，中药药效的产生是多种化学成分协同作用的结果，因此中药的质量控制也应选择多个化学成分作为检测指标。芪龙胶囊成分较为复杂，单一成分作为指标成分具有一定的局限性。由于芪龙胶囊由多味中药配伍精制而成，成分相对复杂，同时加工过程中药用辅料的使用，造成其化学成分组成更为复杂。因此筛选能够指示该胶囊整体质量变化情况的多种化学成分并建立一套针对所述多种化学成分进行定量检测的方法存在较大难度。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法及其应用。本发明通过研究发现，芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷六种成分药理活性高，含量丰富，作为混合标准品能够很好的指示芪龙胶囊整体质量变化情况。因此，针对上述六种成分建立一套基于HPLC-ESI-MS/MS的定量检测方法，该方法具有操作简便、耗时短、选择性高、灵敏度高、专属性好、重复性好等优点。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法，检测成分是芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷，具体测定方法包括：
(1)取芪龙胶囊粉末，加入甲醇超声提取，离心取上清，得溶液A；向残渣中加水，水浴加热后离心取上清，得溶液B，混合溶液A和溶液B，即得供试品溶液；
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱-质谱分析，采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈。
优选的，所述步骤(1)中称取芪龙胶囊粉末加入甲醇后超声0.8-1.2h后于3500-4500r/min离心8-12min，离心后获取上清溶液A，向残渣中加入三蒸水，混均后于65-75℃水浴1.8-2.2h，3500-4500r/min离心8-12min，得到上清溶液B；溶液A与溶液B混合后加入流动相稀释4-6倍(优选为5倍)，过滤，得供试品溶液；
优选的，所述芪龙胶囊粉末：甲醇的比为(180-220)mg：(4-6)mL(优选为200mg：5mL)；
优选的，所述溶液A与溶液B按照(4-6)：(6-8)体积比混合；有利于后续待测成分的富集和检测；
优选的，所述流动相为初始流动相(含0.1％甲酸的水溶液：乙腈＝8:2，v/v)；
优选的，所述步骤(2)对照品溶液制备方法如下：取减压干燥至恒重的芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷标准品，加入甲醇制成对照品溶液；
优选的，所述步骤(2)中色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.3-0.5mL/min(优选为0.4mL/min)，柱温度为25-40℃(优选为35℃)；进样量10μL；
优选的，所述步骤(2)中梯度洗脱程序如下：0-2.0min，流动相B 20-20％；2.0-4.5min，流动相B 20-40％；4.5-5.5min，流动相B 40-95％；5.5-9.0min，流动相B 95-95％；9.0-9.1min，流动相B 95-20％；9.1-12.5min，流动相B 20-20％；
优选的，所述步骤(2)中质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；
本发明的第二个方面，提供上述定量测定方法在芪龙胶囊质量评价中的应用。
本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对样品前处理方法和仪器检测条件等进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
本发明的一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法，通过HPLC-ESI-MS/MS分析方法，同时测定芪龙胶囊中芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷6个成分的含量，该方法简单、快捷，灵敏度高、专属性好、重复性好，可为芪龙胶囊的质量控制提供参考依据。
本发明液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点，对药材成分含量分析更具有效，具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中批次为180510的芪龙胶囊液质图谱；
图2为本发明实施例1中6种有效成分的对照品液质图谱(A：黄芪甲苷，B：丹参酚酸B，C:芍药苷，D:苦杏仁苷，E:毛蕊异黄酮苷，F:丹参酮IIA)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
本发明的一个具体实施方式中，一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法，该方法以芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷为待测成分。上述六种成分药理活性高，含量丰富，作为待测成分能够很好的指示芪龙胶囊整体质量变化情况。
所述定量测定方法，其步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：取芪龙胶囊粉末，加入甲醇超声提取一段时间后，离心取上清，得溶液A；向残渣中加水，水浴加热一段时间后离心取上清，得溶液B，混合溶液A和溶液B，即得供试品溶液；
(2)对照品溶液制备：取减压干燥至恒重的芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷对照品，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)测定：分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪分离，采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈。
本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(1)中称取一定量的芪龙胶囊粉末加入甲醇后超声0.8-1.2h后于3500-4500r/min离心8-12min，离心后获取上清溶液A，其中芪龙胶囊粉末：甲醇的比为(180-220)mg：(4-6)mL。向残渣中加入三蒸水，混均后于65-75℃水浴1.8-2.2h，3500-4500r/min离心8-12min，得到上清溶液B。将溶液A与溶液B按照(4-6)：(6-8)体积比例(优选为5:7)混合后，加入流动相稀释4-6倍(优选为5倍)，经有机系滤膜过滤，得到供试品溶液。
本发明考察了不同溶剂甲醇、乙醇、乙腈加热回流提取和超声提取的方式，结果用甲醇超声提取时成分多且操作简便，甲醇和水提液的混合比例考察了1:1,1:2,2:1,5:7，结果用甲醇提取液：水提取液＝5：7的体积比混合后被测成分峰形好且提取成分丰富，因此实验确定芪龙胶囊的提取路线为甲醇提液和水提液按5：7的体积比混合最佳。
本发明对供试品溶液配制方法的考察：试验比较了加入流动相稀释倍数对样品溶液检测效果的影响，如稀释20倍，10倍，5倍和2倍，结果以初始流动相(含0.1％甲酸的水溶液：乙腈＝8：2)稀释5倍的检测效果为佳。
同时，本发明对色谱条件的选择及优化：考察了流动相中不同盐溶液(乙酸铵和甲酸铵)以及乙酸铵和甲酸铵缓冲液配比(5mM和10mM)、乙酸和甲酸缓冲液配比(0.1％、0.2％和0.3％)对色谱分离效果的影响。试验结果表明：流动相A中不加盐溶液时色谱分离效果较好，基线平稳，峰形对称，分离度较好，且加入0.1％甲酸后可显著增加色谱峰的响应值，因此流动相确定为：A相(0.1％甲酸的水溶液)-B相(乙腈)。调整流动相不同时间洗脱比例之后，各色谱峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于各主要有效成分的检测和分析。
本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(2)中对照品溶液的配制方法如下：精密称取芍药苷标准品0.0100g、丹参酮ⅡA标准品0.0101g、丹参酚酸B标准品0.0102g、苦杏仁苷标准品0.0099g、毛蕊异黄酮苷标准品0.0105g、黄芪甲苷0.0100g置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别配置标准品溶液。
本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(3)中色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量10μL。
本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.4mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.4mL/min。
同时，本发明试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为35℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为35℃。
各有效成分质谱参数见表1。
表1 芪龙胶囊中有效成分质谱参数
Figure BDA0002112150510000071
本发明同时对质谱条件进行优化，采用API4000型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测结果如表1所示，各有效成分均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。
在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了30min的色谱图。结果表明12min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择12.5min作为分析时间。
本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)中梯度洗脱方式为：0-2.0min，流动相B20-20％；2.0-4.5min，流动相B 20-40％；4.5-5.5min，流动相B 40-95％；5.5-9.0min，流动相B 95-95％；9.0-9.1min，流动相B 95-20％；9.1-12.5min，流动相B 20-20％。
本发明的又一具体实施方式中，上述中质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
本发明的又一具体实施方式中，采用克拉霉素和黄芩苷作为内标化合物。
本发明采用HPLC-ESI-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，尤其是含量较低的成分比如说丹参酚酸B和丹参酮ⅡA，无法实现定量分析，然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷，用常规液相方法分离6个成分耗时长，分离较难，检测限高。不利于试验的进行。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1一种芪龙胶囊多成分液质定量测定方法，包括如下步骤：
第一步：
对混合标准品溶液的制备，分别精密称取芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷的对照品适量；
在本实施例中，精密称取芍药苷标准品0.0100g、丹参酮ⅡA标准品0.0101g、丹参酚酸B标准品0.0102g、苦杏仁苷标准品0.0099g、毛蕊异黄酮苷标准品0.0105g、黄芪甲苷0.0100g置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别配置标准品溶液。-20℃保存，备用。
第二步：
取芪龙胶囊粉末，加入甲醇超声提取一段时间后，离心取上清，得溶液A；向残渣中加水，水浴加热一段时间后离心取上清，得溶液B，混合溶液A和溶液B，即得供试品溶液；
在本实施例中，称取400mg的芪龙胶囊粉末加入10mL甲醇后超声1h后于4000r/min离心10min，离心后获取上清溶液A，。向残渣中加入三蒸水，混均后于70℃水浴2h，4000r/min离心10min，得到上清溶液B。将溶液A与溶液B按照5:7体积比混合后，加入流动相稀释5倍，经有机系滤膜过滤，得到供试品溶液。
第三步：
分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪分离，采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈。
在本实施例中，色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量10μL。各有效成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为：0-2.0min，流动相B 20-20％；2.0-4.5min，流动相B 20-40％；4.5-5.5min，流动相B 40-95％；5.5-9.0min，流动相B 95-95％；9.0-9.1min，流动相B 95-20％；9.1-12.5min，流动相B 20-20％。
质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
第四步：
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对线性关系、定量限、精密度、重复性、稳定性以及加样回收率，其中
线性关系及定量限：取混合对照品储备液适量，加50％甲醇稀释成8个浓度的系列混合对照品溶液，按照上述液质联用方法进样分析。以各待测成分质量浓度(X)为横坐标，以检测成分峰面积和内标物质峰面积比值(Y)为纵坐标，得回归方程，及相关系数，结果表明6种成分在相应的范围内线性关系良好。配制混合对照品溶液，倍比关系稀释，进样分析，按待测成分信噪比S/N＝10计算最低定量限，结果见表2；
表2
Figure BDA0002112150510000101
精密度：取混合对照品溶液低、中、高三种水平为50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，连续进样6次，测得芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷的峰面积RSD均＜3.7％，结果表明精密度良好；
重复性：按照供试品制备方法制备同一批样品(批号：20180510)的供试品6份，按照液质联用方法进样分析，测得各成分峰面积，结果芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷的峰面积RSD分别为1.3％、2.6％、2.1％、2.1％、2.8％、2.5％，结果表明重复性良好。
稳定性：取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样检测，结果芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷的峰面积RSD分别为2.7％、3.1％、3.2％、2.7％、2.5％、1.5％，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好；
加样回收率：精密称取已知含量的芪龙胶囊内容物(批号：20180510)6份，每份0.4g，精密加入混合对照品储备液含芍药苷1.5mg/mL、丹参酮ⅡA35g/mL、丹参酚酸B0.3mg/mL、苦杏仁苷20g/mL、毛蕊异黄酮苷140g/mL、黄芪甲苷0.27mg/mL，按照供试品溶液制备方法得到溶液，进样检测分析。结果芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷、黄芪甲苷的平均加样回收率分别为100.88％，100.32％，104.87％，105.51％，102.97％，101.75％，RSD分别为4.07％，1.53％，2.51％，4.01％，4.89％，3.39％。
第五步：
分别取13批芪龙胶囊，按照供试品溶液制备方法得到溶液，进样检测，通过计算回归方程计算含量，定量方法选用内标法定量，克拉霉素和黄芩苷均是内标化合物用来消除离子化影响的，结果见表3：
表3 13批次芪龙胶囊中6种有效成分的含量测定结果(μg/400mg)
Figure BDA0002112150510000121
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种芪龙胶囊的多成分液质定量测定方法，其特征在于，检测成分是芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷和黄芪甲苷，具体测定方法包括：
(1)取芪龙胶囊粉末，加入甲醇超声提取，离心取上清，得溶液A；向残渣中加水，水浴加热后离心取上清，得溶液B，混合溶液A和溶液B，即得供试品溶液；取减压干燥至恒重的芍药苷、丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮苷及黄芪甲苷标准品，加入甲醇制成对照品溶液；
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱-质谱分析，采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈，色谱柱为CAPCELLPAK C18；流动相流速为0.4mL/min，柱温度为35℃；进样量10μL；梯度洗脱程序如下：
0-2.0min，流动相B占20％→20％；2.0-4.5min，流动相B占20％→40％；4.5-5.5min，流动相B占40％→95％；5.5-9.0min，流动相B占95％→95％；9.0-9.1min，流动相B占95％→20％；9.1-12.5min，流动相B占20％→20％；
质谱条件为：离子源：电喷雾ESI；扫描方式：多反应监测MRM；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：450℃；气帘气：10psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。
2.如权利要求1所述的定量测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中称取芪龙胶囊粉末加入甲醇后超声0.8-1.2h后于3500-4500r/min离心8-12min，离心后获取上清溶液A，向残渣中加入三蒸水，混均后于65-75℃水浴1.8-2.2h，3500-4500r/min离心8-12min，得到上清溶液B；溶液A与溶液B混合后加入流动相稀释4-6倍，过滤，得供试品溶液。
3.如权利要求1所述的定量测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中称取芪龙胶囊粉末加入甲醇后超声0.8-1.2h后于3500-4500r/min离心8-12min，离心后获取上清溶液A，向残渣中加入三蒸水，混均后于65-75℃水浴1.8-2.2h，3500-4500r/min离心8-12min，得到上清溶液B；溶液A与溶液B混合后加入流动相稀释5倍，过滤，得供试品溶液。
4.如权利要求2所述的定量测定方法，其特征在于，所述芪龙胶囊粉末：甲醇的质量体积比为180-220mg：4-6mL。
5.如权利要求2所述的定量测定方法，其特征在于，所述芪龙胶囊粉末：甲醇的质量体积比为200mg：5mL。
6.如权利要求2所述的定量测定方法，其特征在于，所述溶液A与溶液B按照4-6：6-8体积比混合。
7.如权利要求2所述的定量测定方法，其特征在于，所述溶液A与溶液B按照5:7体积比混合。
8.权利要求1-7任一项所述定量测定方法在芪龙胶囊质量评价中的应用。
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