CN112595787A - 一种血浆中芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种血浆中芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的检测方法及应用。针对药物在机体内的药物代谢动力学性质进行研究对于明确药物安全性具有重要的意义。现有研究通常针对单一成分的药物动力学变化进行研究，而中药复方具有多组分协同的特点，本发明提供了一种血浆中多组分含量的检测方法，同时测定芪龙胶囊中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷三个入血成分的含量，从选择性、精密度、稳定性、加样回收率和基质效应等方面验证了方法学的可靠性，并将该方法成功应用于大鼠灌胃芪龙胶囊的药物动力学研究，探索通过研究有效成分的药动学特征，进一步佐证芪龙胶囊质量标准制定的合理性。

Description

一种血浆中芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的检测方法及 应用

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种血液样品中芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的含量检测方法及所述方法在芪龙胶囊质量控制领域的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

芪龙胶囊由黄芪、地龙、丹参、当归、赤芍、川芎、红花、桃仁八种药材经精工制作而成的中药复方制剂，现已证明其含有多种生物活性物质，具有良好的益气活血、化瘀通络的疗效。中成药通常由多种中草药配伍而成，其中的活性成分具有协同或拮抗作用。单味药材中的一种有效成分在体内的药物动力学变化过程已有大量研究，而复方中药经配伍后，多组分的药物动力学研究鲜有报道，芪龙胶囊有效成分的生物分析方法也未见报道，提供一种芪龙胶囊多组分药物动力学研究具有重要意义。发明人以往的研究中，针对芪龙胶囊中多成分液质定量方法展开了研究，提供了针对芪龙胶囊样品本身的液质检测方法。然而，生物样品中芪龙胶囊有效成分的检测方法与上述研究存在诸多不同，血液样品基质复杂，并且样品含量更低，这些因素都给血液样品的检测带来了研发难度。而中药有效成分在进入人体血液后才能发挥疗效，微量的有效成分如何在复杂的基质条件下检测成为难题，因此建立定量测定方法对有效成分入血后的药物动力学研究至关重要。

发明内容

针对上述研究背景，本发明目的在于一种血液样品中芪龙胶囊有效成分检测的方法。芪龙胶囊的有效成分主要为皂苷类和水溶性化合物，芍药苷具有扩张血管，抗血栓的作用，苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷具有活血化瘀、通经络的作用，对于芪龙胶囊药效的总体效果具有重要的意义。现有文献已利用HPLC-DAD、GC和HPLC-MS/MS对生物样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的含量进行了单体的测定，然而这些研究主要集中在中药单体方面，不足以表征整体方剂的药动学特征，无法为复方中药的质量标准制和评价提供佐证与参考。

为了实现上述技术目的，本发明提供以下技术方案：

本发明首先提供一种血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，所述检测方法将血浆进行梯度洗脱后通过液相-质谱检测芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的含量，所述洗脱程序如下：0-1.5min，B相20-20％；1.5-1.6min，B相20-95％；1.6-3.5min，B相95-95％；3.5-3.6min,B相95-20％；3.6-5.0min，B相20-20％。

本发明选择芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷三种入血成分建立药动学研究，探索通过研究有效成分的药动学特征，进一步佐证芪龙胶囊质量标准的制定合理性。同时，芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的极性较大，且结构类似，在较短的洗脱时间内完成三个色谱峰的分离难度很大。为了更好的表征芪龙胶囊的药动学变化特征，实现对上述三种成分的良好检测效果。本发明着重对样品前处理方法和洗脱程序等进行了优化，还通过调整液相、质谱检测参数实现了三个色谱峰分离度大于1.5的前提下，保证三个色谱峰的对称峰形，并且从选择性、精密度、稳定性、加样回收率和基质效应等方面验证了方法学的可靠性。

基于该检测方法，本领域技术人员可将其应用于芍药苷、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮中任意单体成分血浆含量的测定，也可以应用于芍药苷、苦杏仁苷、毛蕊异黄酮任意两种成分组合的检测。

最后，本发明提供将上述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芪龙胶囊质量控制领域的应用。

该检测方法具备良好的检测灵敏度和准确性，应用于芪龙胶囊药物代谢性质的研究对于药物安全性评价、临床用药指导及开发可能的药物联用方式都具有重要的意义。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1、本发明的芪龙胶囊三种入血成分的含量测定方法，通过HPLC-ESI-MS/MS分析方法，同时测定芪龙胶囊中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷三个入血成分的含量，该方法简单、快捷，灵敏度高、专属性好、重复性好，将该方法应用于药物动力学研究，通过分析多组分在体内吸收的特征，验证其对质量标准的制定与评价具有重要意义。

2、本发明液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点，对药材成分含量分析更具有效，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为优化色谱条件后得到的色谱质谱图；

其中，A为苦杏仁苷、B为芍药苷、C为毛蕊异黄酮苷。

图2为芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的平均药-时曲线图；

其中，A为苦杏仁苷、B为芍药苷、C为毛蕊异黄酮苷。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

正如背景技术所介绍的，芪龙胶囊具有良好的益气活血效果。然而目前尚缺乏芪龙胶囊生物分析方法的相关研究，无法为该复方药物的质量标准控制提供参考。为了解决如上的技术问题，本发明提出了血液样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法。

本发明第一方面，提供一种血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，所述检测方法将血浆预处理得到血浆样本，进行梯度洗脱后通过液相-质谱检测芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的含量，所述洗脱程序如下：0-1.5min，B相20-20％；1.5-1.6min，B相20-95％；1.6-3.5min，B相95-95％；3.5-3.6min,B相95-20％；3.6-5.0min，B相20-20％。

本发明首先根据目标检测物的极性特点，针对梯度洗脱程序进行了考察，首先设置梯度洗脱程如下：0-1.5min，乙腈20-20％；1.5-1.6min，乙腈20-95％；1.6-3.5min，乙腈95-95％；3.5-3.6min,乙腈95-20％；3.6-5.0min，乙腈20-20％。

本发明研究过程中发现毛蕊异黄酮存在与其他目标物难以分离、峰形不佳的情况，针对该情形，本发明根据图谱的色谱峰数量及峰的分离情况对其进行优化，最终确立的洗脱梯度程序：0-1.5min，乙腈20-20％；1.5-1.6min，乙腈20-95％；1.6-3.5min，乙腈95-95％；3.5-3.6min,乙腈95-20％；3.6-5.0min，乙腈20-20％。基于本发明优化后的方法，三种目标物分离情况良好，特别是对于毛蕊异黄酮苷具有更好的检测灵敏度、准确性及回收效果。

常见血液样本包括全血、血浆、血清或血细胞样本。本发明提供的检测方法适用于血浆及血清样本，进一步的，本发明还提供所述血浆的预处理方法：向待测血浆中加入乙腈(含内标)涡旋离心获取上清部分，吹干后加入少量乙腈溶液进行复溶得到所述血浆样本。

上述技术方案中，所述内标为克拉霉素，所述克拉霉素内标工作液的浓度为0.5～1.0ng·mL^-1.

具体的实施方案中，所述克拉霉素内标工作的配制方法如下：精密称取克拉霉素10.05mg，置于10.0mL容量瓶，加乙腈溶液溶解并定容至刻度，即得克拉霉素储备液浓度为1.005mg·mL^-1，以乙腈溶液为溶剂进行逐步稀释，最终得到浓度为0.75ng·mL^-1的克拉霉素内标工作液。

上述技术方案中，所述血浆与乙腈的体积比为1:3～5.

上述技术方案中，所述离心速率为13500-14500r/min，离心时间为8-12分钟。

上述技术方案中，所述氮吹的温度为15-25℃。

上述技术方案中，所述复溶乙腈溶液浓度为20-40％，体积为40-50μL。

上述技术方案中，所述复溶后还包括重复涡旋及离心的步骤。

优选的，所述液相的流动相如下：流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈。

同时，本发明对色谱条件的选择及优化：考察了流动相中不同盐溶液(乙酸铵和甲酸铵)以及乙酸铵和甲酸铵缓冲液配比(5mM和10mM)、乙酸和甲酸缓冲液配比(0.1％、0.2％和0.3％)对色谱分离效果的影响。试验结果表明：流动相A中不加盐溶液时色谱分离效果较好，基线平稳，峰形对称，分离度较好，且加入0.1％甲酸后可显著增加色谱峰的响应值，因此流动相确定为：A相(0.1％甲酸的水溶液)-B相(乙腈)。调整流动相不同时间洗脱比例之后，各色谱峰的保留时间适中，且基线平稳，不易漂移，同时提高了色谱图的分离度，有效避免了色谱图的拖尾现象，有利于各入血成分的检测和分析。

优选的，液相参数如下：色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.2-0.5mL/min(进一步优选为0.3mL/min)，柱温度为25-40℃(进一步优选为35℃)；进样量5μL。

本发明考察了柱温为25℃、35℃、40℃对色谱分离影响，结果表明在三个不同柱温下，色谱柱对色谱峰的分离效果相似，但当柱温较高时，柱压较低，有利于样品进样HPLC分析和色谱柱的正常使用，为方便常规实验条件，选择35℃作为最终优化的色谱柱柱温。

考察了来自三个不同厂家的色谱柱在同一色谱条件下的分离效果，色谱柱分别为Phenomenex Luna C18(4.6mm×150mm，5μm)、Inertsil ODS-3(4.6mm×150mm，5μm)和CAPCELL PAK C18(2.0mm×150mm，5μm)。结果显示，在同一色谱条件下，CAPCELL PAK C18(2.0mm×150mm，5μm)的分离效果最佳、峰形对称且大部分色谱峰达到基线分离，并且基线平稳，因此最终选择CAPCELL PAK C18色谱柱用于血浆样品的色谱分离。

本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.3mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.3mL/min。

优选的，所述质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：550℃；气帘气：10psi；雾化气：50psi；辅助气：55psi。

各入血成分和内标化合物的质谱参数见表1。

表1芪龙胶囊三种入血成分和内标化合物的质谱参数

本发明同时对质谱条件进行优化，采用API4000型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测参数如表1所示，各有效成分均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。

在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了10.0min的色谱图。结果表明5.0min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择5.0min作为分析时间。

本发明采用HPLC-ESI-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，尤其是含量较低的成分比如芍药苷和苦杏仁苷，无法实现定量分析，然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷，用常规液相方法分离3个成分耗时长，分离较难，检测限高。不利于试验的进行。

优选的，所述检测方法中，包括根据内标法计算所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮含量的步骤。

本发明第二方面，提供第一方面所述所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮单体或两种成分检测中的应用。

优选的，所述芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮单体检测还包括上述单体的药物的检测。同样的，所述芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮中两种成分组合的检测，还包括用于同时包含上述两种成分药物的检测。

本发明第三方面，提供第一方面所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芪龙胶囊质量控制领域的应用。

优选的，所述质量控制领域包括但不限于芪龙胶囊药代动力学研究。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例1芪龙胶囊中三种入血成分含量测定方法研究

1、标准品溶液的制备，精密称取芍药苷9.98mg、毛蕊异黄酮苷10.02mg和苦杏仁苷10.16mg，分别置于10.0mL容量瓶，加甲醇溶液定容至刻度，即得芍药苷储备液浓度为0.998mg·mL^-1，毛蕊异黄酮苷储备液浓度为1.002mg·mL^-1和苦杏仁苷储备液浓度为1.016mg·mL^-1。芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的质控样品单独称量和配制。所有储备液保存于-20℃备用。用甲醇溶液配制成系列标准工作溶液，其中芍药苷和苦杏仁苷的浓度分别为：50ng·mL^-1,70ng·mL^-1,200ng·mL^-1,300ng·mL^-1,700ng·mL^-1,1000ng·mL^-1,2500ng·mL^-1，毛蕊异黄酮苷的浓度为：10ng·mL^-1,20ng·mL^-1,50ng·mL^-1,100ng·mL^-1,500ng·mL^-1,1000ng·mL^-1,2500ng·mL^-1，保存于4℃备用。芍药苷和苦杏仁苷的质控样品溶液的浓度依次为：100ng·mL^-1,500ng·mL^-1,2000ng·mL^-1，毛蕊异黄酮苷的质控样品溶液的浓度依次为：30ng·mL^-1,200ng·mL^-1,2000ng·mL^-1，保存于4℃备用。即得标准品溶液；

精密称取克拉霉素10.05mg，置于10.0mL容量瓶，加乙腈溶液溶解并定容至刻度，即得克拉霉素储备液浓度为1.005mg·mL^-1。储备液保存于-20℃备用。以乙腈溶液为溶剂进行逐步稀释，最终得到浓度为0.75ng·mL^-1的克拉霉素内标工作液。工作溶液保存于4℃备用。

2、血浆样本溶液制备：取90μL大鼠空白血浆样本，加入10μL标准溶液，轻涡旋，加入乙腈(含内标)，轻涡旋后于离心机离心，精密取出400μL上清溶液，使用氮吹仪吹干，后加入乙腈溶液复溶，轻涡旋并离心，得到血浆样本溶液。

3、精密量取血浆样本溶液，注入高效液相色谱-质谱联用仪分离，采用梯度洗脱，流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈。

在本实施例中，色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.3ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。

各入血成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为：0-1.5min，乙腈20-20％；1.5-1.6min，乙腈20-95％；1.6-3.5min，乙腈95-95％；3.5-3.6min,乙腈95-20％；3.6-5.0min，乙腈20-20％。

质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：550℃；气帘气：10psi；雾化气：50psi；辅助气：55psi。

4、对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对选择性、线性关系、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应以及加样回收率，其中：

(1)选择性：本实施例考察内源性干扰的选择性实验：分别取6只大鼠的空白血浆100μL，加入400μL乙腈(含内标)，样品处理并进行测定；另取90μL上述空白血浆，加入10μL芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的混合标准溶液(250ng·mL^-1)，轻涡旋后加入400μL乙腈(含内标)，样品处理并进行测定；取大鼠在灌胃芪龙胶囊后0.5h的血浆100μL，加入400μL乙腈(含内标)，样品处理并进行测定；另取90μL上述空白血浆，加入10μL的混合标准溶液(芍药苷和苦杏仁苷：5ng·mL^-1；毛蕊异黄酮苷：1ng·mL^-1)，轻涡旋后加入400μL乙腈(含内标)，样品处理并进行测定。

本实施例考察外源性干扰的选择性实验：取50％乙腈进样HPLC测定；另取90μL空白水溶液，加入10μL的混合标准溶液(芍药苷和苦杏仁苷：5ng·mL^-1；毛蕊异黄酮苷：1ng·mL^-1)，轻涡旋后加入400μL乙腈(含内标)，样品处理并进行测定。

结果显示，芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷在电喷雾离子源、正离子模式下响应良好，芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷保留时间分布为2.19、1.48和3.05分钟。由图1可以看出，血浆中内源性物质对芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的测定无干扰。在芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的MRM通道中，未检测到其它化合物。

(2)线性关系及定量限：取混合标准品适量，加50％甲醇稀释成8个浓度的系列混合标准品溶液，按照上述液质联用方法进样分析。以各待测成分质量浓度(X)为横坐标，以检测成分峰面积和内标物质峰面积比值(Y)为纵坐标，得回归方程，及相关系数，结果表明三种入血成分在相应的范围内线性关系良好。配制混合标准品溶液，倍比关系稀释，进样分析，按待测成分信噪比S/N＝10计算最低定量限(LLOQ)，结果见表2；

表2芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的标准曲线和最低定量限

精密度与准确度：连续三日测定芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的最低定量下限、低、中、高浓度的质控样本，每日各个浓度平行测定六份，根据测定值及理论值计算准确度、日内精密度及日间精密度，结果见表3。芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷含量的相对标准偏差均低于12.67％，准确度为95.75-113.10％。

表3芍药苷、杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的准确度和精密度

加样回收率和基质效应：A：取90μL空白大鼠血浆，加入10μL质控标准溶液，轻涡旋后加入400μL乙腈(含内标)，处理样本。将复溶后的上清液取5μL用于HPLC-ESI-MS/MS分析。

B：取90μL空白大鼠血浆，加入400μL乙腈(含内标)，处理样本。向复溶后的上清液加入10μL质控标准溶液，轻涡旋后取5μL混合液用于LC-MS/MS分析。

C：取90μL水溶液，加入400μL乙腈(含内标)，处理样本。向复溶后的上清液加入10μL质控标准溶液，轻涡旋后取5μL混合液用于LC-MS/MS分析。

计算A组分析物的峰面积与B组相应浓度下的峰面积的比值，以得到分析物的回收率；计算B组分析物的峰面积与C组相应浓度下的峰面积的比值，以得到分析物的基质效应。

结果显示，芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的平均回收率均在103.3％-135.9％，表明该处理方法具有较高的提取回收率。质控样本的基质效应为96.7％-133.6％，变异系数小于18％，表明该分析条件下，基质效应可忽略，具体结果见表4。

表4芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的回收率和基质效应

稳定性：本发明采用质控样本(低浓度质控、中浓度质控、高浓度质控)进行稳定性实验，每个浓度平行6份，分为质控样本的稳定性和质控溶液的稳定性考察。

质控样本的稳定性：将质控样本于-20℃放置30天，考察芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的长期冷冻的稳定性；质控血浆样本经历三次冷冻-解冻循环(-20℃至室温)，考察芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的冻融稳定性；将质控样本在室温(23℃)放置4.0h候进行样本处理，考察芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷在提样过程中的稳定性(Bench-topstability)；将处理后的样本放置于自动进样器(10℃)中12.0h，考察芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷在自动进样器中的稳定性。

质控溶液的稳定性：将质控溶液于-20℃放置30天，考察芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷在溶液中的长期冷冻的稳定性。

结果显示，芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷样品的长期冷冻保存、三次冷冻-解冻循环、Bench-top及自动进样器稳定性考察结果显示，其准确度偏差均小于20.0％，具体见表5。表明芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷样品在处理和测试期间稳定。

芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷溶液的长期冷冻保存稳定性考察结果显示，其准确度偏差均小于20％，具体见表6。表明芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷溶液在处理和测试期间稳定。

表5芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的样品稳定性

表6芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的溶液稳定性

本发明方法针对准确度、精密度、回收率及稳定性考察时，需要针对高、中、低浓度的样品均进行考察。基于表3-表6的结果可以看出，毛蕊异黄酮低浓度组加样浓度更低，相比芍药苷和苦杏仁苷低了一个数量级，这意味基于本发明的方法能够检测更低浓度的毛蕊异黄酮苷，并且检测精度及灵敏度良好。

实施例2

本实施例中，提供一种采用实施例1中所述检测方法对血浆样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷进行检测的方法，所述检测方法包括以下步骤：

1、配置标准品溶液及内标工作液：精密称取芍药苷9.98mg、毛蕊异黄酮苷10.02mg和苦杏仁苷10.16mg，分别置于10.0mL容量瓶，加甲醇溶液定容至刻度，即得芍药苷储备液浓度为0.998mg·mL^-1，毛蕊异黄酮苷储备液浓度为1.002mg·mL^-1和苦杏仁苷储备液浓度为1.016mg·mL^-1。芍药苷、毛蕊异黄酮苷和苦杏仁苷的质控样品单独称量和配制。所有储备液保存于-20℃备用。用甲醇溶液配制成系列标准工作溶液，其中芍药苷和苦杏仁苷的浓度分别为：50ng·mL^-1,70ng·mL^-1,200ng·mL^-1,300ng·mL^-1,700ng·mL^-1,1000ng·mL^-1,2500ng·mL^-1，毛蕊异黄酮苷的浓度为：10ng·mL^-1,20ng·mL^-1,50ng·mL^-1,100ng·mL^-1,500ng·mL^-1,1000ng·mL^-1,2500ng·mL^-1，保存于4℃备用。芍药苷和苦杏仁苷的质控样品溶液的浓度依次为：100ng·mL^-1,500ng·mL^-1,2000ng·mL^-1，毛蕊异黄酮苷的质控样品溶液的浓度依次为：30ng·mL^-1,200ng·mL^-1,2000ng·mL^-1，保存于4℃备用。即得标准品溶液。

精密称取克拉霉素10.05mg，置于10.0mL容量瓶，加乙腈溶液溶解并定容至刻度，即得克拉霉素储备液浓度为1.005mg·mL^-1。储备液保存于-20℃备用。以乙腈溶液为溶剂进行逐步稀释，最终得到浓度为0.75ng·mL^-1的克拉霉素内标工作液。工作溶液保存于4℃备用。

2、血浆预处理

获取待测目标的血浆样本，取100μL血浆样本加入400μL乙腈(含内标)，后于13500-14500r/min离心8-12分钟，离心后获取上清溶液A，使用氮吹仪(15-25℃)氮气吹干，后加入40-50μL的20-40％乙腈溶液复溶，轻涡旋并于13500-14500rpm离心8-12分钟，得到血浆样本溶液。

3、血浆样本检测

将上述血浆样本溶液通过液相-质谱进行检测，所述液相色谱柱为CAPCELL PAKC18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.2-0.5mL/min(优选为0.3mL/min)，柱温度为25-40℃(优选为35℃)；进样量5μL；

所述液相洗脱程序如下：0-1.5min，流动相B 20-20％；1.5-2.0min，流动相B 20-40％；2.0-2.1min，流动相B 40-95％；2.1-3.5min，流动相B 95-95％；3.5-3.6min，流动相B95-20％；3.6-5.0min，流动相B 20-20％；

所述质谱条件为离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：550℃；气帘气：10psi；雾化气：50psi；辅助气：55psi。

通过内标法进行定量计算所述待测血浆样品中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的含量。

实施例3

本实施例中，提供实施例1中所述检测方法在芪龙胶囊三种入血成分药代动力学研究中的应用，包括如下步骤：

1、选择雄性Wistar大鼠(体重250.0-300.0g，清洁级)，由山东大学实验动物中心提供，许可证号为No.SYXK 2013-0001。动物实验经山东大学伦理委员会批准，同时符合动物实验基本准则(NIH1985年修订版，编号为85-23)。

将大鼠(n＝6)按照芪龙胶囊内容物剂量8.75g·kg^-1灌胃给药，芪龙胶囊内容物用生理盐水溶液溶解。大鼠灌胃前12.0h及给药后2.0h禁食，期间可以自由饮水。在给药前及给药后0h，0.08h，0.25h，0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，3.0h，4.0h，6.0h，8.0h，13.5h和24.0h，从大鼠静脉窦取全血200μL，置于肝素化的EP管中。全血样品收集后，立即以3,000rpm离心10.0分钟，取上层血浆，置于-20℃冰箱保存待测。

2、取100μL大鼠血浆样本，按照上述芪龙胶囊三种入血成分的含量测定方法，进样HPLC-MS/MS检测。

3、数据处理：芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)通过观察样品的实测数值可得，其余的药动学参数通过DAS软件(version：2.0)的非房室模型(non-compartment mode)计算而得。药时曲线下面积(AUC0-t)用线性梯形面积法计算。

芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的平均药-时曲线如图2，具体药动学参数见表7。由表中数据看出，大鼠灌胃给予芪龙胶囊(8.75g·kg^-1)后，芍药苷于0.5h达峰，其达峰浓度为110.07mg·L^-1；苦杏仁苷于0.5h达峰，其达峰浓度为95.40mg·L^-1；芍药苷于0.25h达峰，其达峰浓度为66.90mg·L^-1。芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的半衰期(T_1/2)分别为1.53h、1.78h和2.66h。结果显示芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷三种成分吸收快，在一小时内达到最大血浆浓度。在以往的药代动力学研究中，芍药苷主要以单体形式口服，其药动学参数显示芍药苷在体内吸收迅速，其半衰期较短。本发明芪龙胶囊中芍药苷具有较长的半衰期，有助于生物活性成分在体内的缓慢消除，并可能降低给药频率以提高患者的依从性，提示芪龙胶囊复方配伍可适当调整赤芍的剂量。这种现象可能与红花能延长胃排空时间有关，使胃中的芍药苷减慢进入小肠。本发明首次观察到苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的药时曲线的双峰，这可能与中药复方的相互作用有关。有研究表明，芍药苷可能是p-糖蛋白的底物，通过竞争性抑制p-糖蛋白与其他皂苷的结合，促进其他皂苷的吸收。同时，芍药根中所含的皂苷更容易被肠道菌群水解，抑制了苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的水解，进而导致吸收为双峰的现象。

表7芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮苷的药动学参数

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述检测方法将血浆预处理得到血浆样本，进行梯度洗脱后通过液相-质谱检测芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的含量，所述洗脱程序如下：0-1.5min，B相20-20％；1.5-1.6min，B相20-95％；1.6-3.5min，B相95-95％；3.5-3.6min,B相95-20％；3.6-5.0min，B相20-20％。

2.如权利要求1所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述血浆的预处理方法：向待测血浆中加入含内标的乙腈涡旋离心获取上清部分，吹干后加入少量乙腈溶液进行复溶得到所述血浆样本。

3.如权利要求2所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述内标为克拉霉素，所述克拉霉素内标工作液的浓度为0.5～1.0ng·mL^-1。

4.如权利要求2所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述血浆与乙腈的体积比为1:3～5；

或，所述离心速率为13500-14500r/min，离心时间为8-12分钟；

或，所述氮吹的温度为15-25℃；

或，所述复溶乙腈溶液浓度为20-40％，体积为40-50μL；

或，所述复溶后还包括重复涡旋及离心的步骤。

5.如权利要求1所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述液相的流动相如下：流动相A相：含0.1％甲酸水溶液，流动相B相：乙腈；

或，液相参数如下：色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.2-0.5mL/min，柱温度为25-40℃；进样量5μL。

6.如权利要求1所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：550℃；气帘气：10psi；雾化气：50psi；辅助气：55psi。

7.如权利要求1所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法，其特征在于，所述检测方法中，包括根据内标法计算所述血浆中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮含量的步骤。

8.权利要求1-7任一项所述所述血液样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮单体或两种成分检测中的应用；

优选的，所述芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮单体检测还包括上述单体的药物的检测；

或，所述芍药苷、苦杏仁苷或毛蕊异黄酮中两种成分组合的检测，还包括用于同时包含上述两种成分药物的检测。

9.权利要求1-7任一项所述血液样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芪龙胶囊质量控制领域的应用。

10.如权利要求9所述血液样本中芍药苷、苦杏仁苷和毛蕊异黄酮的检测方法在芪龙胶囊质量控制领域的应用，其特征在于，所述质量控制领域包括但不限于芪龙胶囊药代动力学研究。

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