CN114487316A - 一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析方法 - Google Patents

一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析方法，属于药物分析技术领域，该方法成功应用于大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊水提物后血浆中5种成分的药代动力学研究，并建立各自的药‑时曲线，阐明了药代动力学参数，为阐明其物质基础提供了重要的参考依据。

Description

一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析 方法
技术领域
本申请涉及一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析 方法，属于药物分析技术领域。
背景技术
复方西羚解毒胶囊由金银花、连翘、桔梗、荆芥穗、牛蒡子、甘草、淡竹 叶、薄荷脑、薄荷油、淡豆豉、羚羊角、水牛角浓缩粉、冰片组成。该方是在 《温病条辨》中经典方剂“银翘散”的基础上增加了羚羊角、水牛角粉、冰片 衍化而来。其中，羚羊角具有平肝息风的作用，用于高热疗效显著，水牛角具 有清热，凉血的作用，可用于寒温疫热入血分，冰片可以通诸窍，散郁火。因 此，衍生方在“银翘散”辛凉解表的基础上更添退热效果，用于治疗外感风热， 发热、头痛，咳嗽音哑，咽喉肿痛。复方西羚解毒胶囊多样化的药理作用，源 于其多样性的化学成分。
中药口服后进入体内到发挥生物效应，经历了吸收、分布、代谢、排泄 (ADME)的过程，在此过程中能吸收进入血液，并能达到一定血药浓度的化 合物才能发挥药理作用，研究这些成分的药物代谢动力学可以揭示复方成分在 体内的动态变化，宏观、定量的反应多成分间的协同作用的ADME属性，构 建中药化学成分和药理作用之间的桥梁，揭示其作用机制。
前期研究表明，复方西羚解毒胶囊化学成分非常复杂，但只有一部分成分 能够吸收入血且能达到一定血药浓度而发挥生物学效应。这些成分是什么，其 药代动力学行为如何，尚无相关报道，因此，对复方西羚解毒胶囊提取物灌胃 给药后大鼠药动学行为进行研究，从而为该药药理作用机制研究提供参考是非 常有必要的。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代 动力学的分析方法，该方法成功应用于大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊水提物 后血浆中5种成分的药代动力学研究，并建立各自的药-时曲线，阐明了药代 动力学参数，为阐明其物质基础提供了重要的参考依据。
根据本申请的一个方面，提供了一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内 药代动力学的分析方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制
精密称取芒柄花素、甘草素、异甘草素、甘草酸、牛蒡子苷元和葛根素对 照品适量，用甲醇溶解，分别配置成单一对照品储备液；再精密量取各储备液 适量，用甲醇稀释，配制成系列对照品溶液；
(2)内标溶液的配制
精密称取葛根素适量，以甲醇溶解并定容，稀释至3μg/mL，作为内标溶 液；
(3)复方西羚解毒胶囊提取物的制备
取复方西羚解毒胶囊粉末，超声提取三次，滤过，合并续滤液，旋蒸浓缩， 冷冻干燥，得干浸膏；
(4)给药与采样
a.取大鼠于眼眶后静脉丛取血，置于肝素化的EP管中，离心分离血浆后 作为空白血浆样品；
b.取大鼠随机分组，每只分别灌胃给予复方西羚解毒胶囊样品；给药后各 组每只大鼠于眼眶后静脉丛取血置于肝素化的EP管中，离心分离血浆后冷冻 保存；
(5)样品处理
取大鼠血浆，加入内标溶液，再加入混合溶剂，混匀，涡旋、超声后离心， 取上清液置于EP管中，分两次加入混合溶剂，超声溶解残渣，合并两次溶液， 置于EP管中，加入甲醇，超声溶解残渣，离心后取上清液进样进行液相色谱- 质谱测定；
(6)方法学考察
其包括质控样品的制备、专属性考察、绘制标准曲线、计算准确度与精密 度、稳定性考察、回收率和基质效应以及数据处理与统计分析；
(7)药代动力学研究
将步骤(4)得到的血浆样品按照步骤(5)进行处理，采用与步骤(5) 同条件的液相色谱-质谱进行分析，计算各时间点各成分的血浆样品浓度，采 用DAS 2.0软件，采用统计矩模型分析，计算药动学参数。
可选地，步骤(3)超声提取中复方西羚解毒胶囊粉末与水的质量比为1:10， 冷冻温度为-20℃，冷冻时间为12h，干燥时间为48h。
可选地，步骤(4)的步骤a和步骤b中离心转速均为8000rpm，离心时 间均为10min，步骤b中冷冻温度为-20℃。
可选地，步骤(5)中混合溶剂由甲醇和乙腈组成，体积比为2：1。
可选地，步骤(5)中液相色谱-质谱的条件为：
(1)液相系统条件
流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液，流速为0.4mL/min；梯度洗脱程序为：0～13 min，21％乙腈；13～14min，21％～42％乙腈；14～32min，42％乙腈；
(2)质谱系统条件
电喷雾离子源，负离子模式；扫描范围m/z 50～1700；毛细管电压3500V； 毛细管出口电压175V；干燥气体积流量8L/min；干燥器温度300℃；雾化器 压力35psig；用提取离子色谱图进行积分，使用标准曲线法对各待测成分进行 含量测定。
可选地，步骤(6)中质控样品的制备步骤为：
取步骤(1)制备的对照品溶液，吹干溶剂，分别加入大鼠空白血浆和内 标溶液，再按照步骤(5)方法处理样品，即制得高、中、低浓度的质控样品。
可选地，步骤(6)中专属性考察步骤为：
取大鼠的空白血浆，除不加内标溶液外，其与按照步骤(5)中方法处理， 再按照步骤(5)同条件的液相色谱-质谱方法测定，得到空白血浆样品色谱图； 取混标溶液适量，吹干溶剂，加入大鼠空白血浆，其余按照步骤(5)中方法 处理，测定得到相应色谱图；取大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊提取物后4h 的血浆，按照步骤(5)中方法处理，测定得到给药后血浆样品色谱图；
步骤(6)中稳定性考察步骤为：按照步骤(6)中质控样品制备中的方法 制备高、中、低三个浓度的质控样品，每个浓度平行制备6份，分别考察其室 温稳定性、冻融稳定性和长期稳定性。
可选地，步骤(6)中绘制标准曲线步骤为：
取步骤(1)下混标系列溶液，吹干溶剂，分别加入大鼠空白血浆和内标 溶液，其余按照步骤(5)中方法处理样品；再按照步骤(5)同条件的液相色 谱-质谱进行测定，以血浆中被测物的浓度为横坐标，被测物与内标物的在提 取离子色谱图中峰面积比值为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线，计算回 归方程及线性范围。
可选地，步骤(6)中准确度与精密度的步骤为：
按照步骤(6)中质控样品制备中的方法制备高、中、低三个浓度的质控 样品，每种样品浓度平行制备6份，连续测定3天，测定峰面积，根据标准曲 线计算浓度，计算其精密度和准确度。
可选地，步骤(6)中回收率和基质效应步骤为：
按照步骤(6)中质控样品制备中的方法制备高、中、低三个浓度的质控 样品，测定各化合物及内标的峰面积；
取大鼠空白血浆，加入混合溶剂，混匀，涡旋、超声和离心后，取上清液 置于EP管中，分两次加入混合溶剂，超声溶解残渣，合并两次溶液，置于EP 管中，分别加入步骤(1)中的混标溶液适量，再加入内标溶液，吹干溶剂， 加入甲醇溶解，离心，取上清液，得到高、中、低浓度的基质效应考察样品， 测定峰面积；
以质控样品测得的峰面积除以混标溶液测得的峰面积的相对比值作为待 测化合物的回收率；以基质效应考察样品测得的峰面积除以混标溶液测得的峰 面积的相对比值作为待测化合物的基质效应。
优选地，步骤(6)中使用的混合溶剂与步骤(5)中的混合溶剂相同。
可选地，计算大鼠给药后各时间点各成分的血浆样品浓度，采用DAS 2.0 软件，选用统计矩模型分析，计算药动学参数。
本申请的有益效果包括但不限于：
1.根据本申请的复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析 方法，该方法成功应用于大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊水提物后血浆中5种 成分的药代动力学研究，并建立各自的药-时曲线，阐明了药代动力学参数， 为阐明其物质基础提供了重要的参考依据。
2.根据本申请的复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析 方法，考察了复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内主要成分同时测定的专属 性、精密度、准确度、回收率、基质效应及稳定性等，方法学结果表明，建立 的分析方法有较好的灵敏度、准确度和精密度，均符合生物样品测定要求，测 定结果准确可靠，可有效评价复方西羚解毒胶囊5个组分在生物体内的药动学 过程。
3.根据本申请的复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析 方法，本实验采用LC-MS/MS法测定复方西羚解毒胶囊口服给药后各时间点血 浆中甘草素、异甘草素、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元的含量，方法灵敏度 高、快速、简单、准确、出峰时间短，在30分钟内出峰完毕，重现性好，可 用于大鼠血浆中甘草素、异甘草素、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元的定量。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部 分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不 当限定。在附图中：
图1为本申请实施例涉及的专属性考察相关色谱图，其中(1)为空白血 浆样品、(2)为含对照品的血浆样品、(3)为大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊 取物后4h的血浆样品的EIC色谱图；A：甘草素、异甘草素；B：甘草酸；C： 牛蒡子苷元；D：芒柄花素。
图2为本申请实施例涉及的大鼠灌胃给药复方西羚解毒胶囊后芒柄花素、 甘草素、异甘草素、甘草酸、牛蒡子苷元平均血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无 特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产 品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。本专利中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析方法 一、材料
1.1实验仪器
Agilent超高效液相系统(配备1290infinityⅠⅠ二元泵、1290infinityⅠⅠ 自动进样器、1290infinityⅠⅠ柱温箱；美国Agilent公司)；Agilent G6530 Q TOF 质谱仪(配备电喷雾离子源；美国Agilent公司)；BSA224S-CW万分之一电子 天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，XS105十万分之一电子天平(梅特勒-托 利多集团)，PS-60AL超声波清洗器(山东东岳国际经贸合作股份有限公司)， GTR22-1型高速低温离心机(北京时代北利离心机有限公司)。
1.2药品与试剂
复方西羚解毒胶囊(批号：1802005)为山东宏济堂制药集团股份有限公 司生产。芒柄花素(批号：200328-161026，纯度100％)、葛根素(内标物， 批号：110752-201816，纯度95.4％)，购自中国食品药品检定研究院；甘草素 (批号：102561，纯度98.5％)、牛蒡子苷元(批号100686，纯度98％)、甘草 酸(批号：102574，纯度98.5％)购自江苏永健医药科技有限公司；异甘草素 (批号：Y-008-181216，纯度98％)，购自成都瑞芬思生物科技有限公司。MS级乙腈购自Thermo Fisher Scientific公司。屈臣氏纯净水购自屈臣氏集团(香 港)有限公司。甲酸为分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.3实验动物
雄性Wistar(230-250g)大鼠，SPF级，购自济南朋悦实验动物繁育有限 公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003。大鼠于光暗周期为12h环境下饲养， 并保持室内温度25±1℃，湿度50±10％，给予清洁级普通大鼠饲料饲养。实 验前12h禁食，不禁水。
二、方法
2.1对照品溶液的配制
精密称取芒柄花素、甘草素、异甘草素、甘草酸、牛蒡子苷元、葛根素对 照品适量，用甲醇溶解，配置成单一对照品储备液。再精密量取各对照品储备 液适量，以甲醇作为稀释液经过一系列稀释后，配制系列对照品溶液，见表1。 精密称取葛根素适量，以甲醇溶解、定容，并稀释至3μg/mL，作为内标溶液。
表1对照品溶液浓度
Figure BDA0003456565290000081
Figure BDA0003456565290000091
2.2给药与采样
复方西羚解毒胶囊提取物制备：取复方西羚解毒胶囊粉末100g，用10倍 量的纯化水超声提取三次，每次1h，滤过，合并续滤液，旋蒸浓缩，-20℃下 放置12h后冷冻干燥48h，得干浸膏50g。
取SD大鼠30只，于眼眶后静脉丛取血，置于肝素化的EP管中，8000rpm 离心10min分离血浆，作为空白血浆样品。
取SD大鼠84只，随机分为14组，每组6只，按照浸膏粉2.0g/kg体重的 剂量灌胃给予复方西羚解毒胶囊样品(4.0g/kg体重)。给药后各组分别于 10min、30min、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h， 每只大鼠于眼眶后静脉丛取血1.5mL置于肝素化的EP管中，8000rpm离心 10min分离血浆，于-20℃保存。
2.3样品处理
取大鼠血浆800μL，加入内标溶液10μL，再加入甲醇-乙腈2:1的混合溶 剂4mL，混匀，涡旋30s，超声2min，12000rpm离心10min，取上清液置 于10mL EP管中，45℃下N2吹干，分两次加入甲醇-乙腈2:1的混合溶剂， 每次400μL，超声2min溶解残渣，合并两次溶液，置于1.5mL EP管中，45℃ 下N2吹干，加入甲醇100μL，超声2min溶解残渣，12000rpm离心10min， 取上清液进样5μL进行LC-MS测定。
2.4LC-MS(液相色谱-质谱)条件
2.4.1液相系统条件
流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液，流速：0.4mL/min；梯度洗脱程序为：0～13 min，21％乙腈；13～14min，21％～42％乙腈；14～32min，42％乙腈。
2.4.2质谱系统条件
电喷雾离子源(ESI)，负离子模式；扫描范围m/z 50～1700；毛细管电压 3500V；毛细管出口电压175V；干燥气(N2)体积流量8L·min-1；干燥器温 度300℃；雾化器压力35psig。实验数据采用Masshunter Qualitative Analysis B.08.00处理。
用提取离子色谱图(EIC)进行积分，使用标准曲线法对各待测成分进行 含量测定。5个待测成分的提取离子([M–H]-)：m/z 267.0657(芒柄花素)，m/z 255.0657(甘草素)，m/z 255.0657(异甘草素)，m/z 821.396(甘草酸)，m/z 371.1495(牛蒡子苷元)。内标物葛根素的提取离子([M–H]-)：m/z 415.1035。
2.5方法学考察
2.5.1质控样品制备
取“2.1对照品溶液的配制”项下对照品溶液，45℃下N2吹干溶剂，分别 加入大鼠空白血浆800μL，内标溶液10μL，其余按照“2.3样品处理”项下方 法处理样品，即为高、中、低浓度的质控样品。
2.5.2专属性考察
取大鼠的空白血浆，除不加内标溶液外，按照“2.3样品处理”项下方法 处理，按照“2.4LC-MS条件”项下的方法测定，得到空白血浆样品色谱图； 取混标溶液适量，45℃下N2吹干溶剂，加入大鼠空白血浆800μL，其余按照 “2.3样品处理”项下方法处理，测定得到相应色谱图；取大鼠灌胃给予复方 西羚解毒胶囊提取物后4h的血浆，按照“2.3样品处理”项下方法处理，测定 得到给药后血浆样品色谱图。
2.5.3标准曲线
取“2.1对照品溶液的配制”项下混标系列溶液，45℃下N2吹干溶剂，分 别加入大鼠空白血浆800μL，内标溶液10μL，其余按照“2.3样品处理”项下 方法处理样品。按照“2.4LC MS条件”项下方法对样品进行LC-MS测定，以 血浆中被测物的浓度为横坐标，被测物与内标物的在EIC色谱图中峰面积比值 为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线，计算回归方程及线性范围。
2.5.4准确度与精密度
按照“2.5.1质控样品制备”中的方法制备高、中、低三个浓度的质控样品， 每种样品浓度平行制备6份，连续测定3天，测定峰面积，根据标准曲线计算 浓度，计算其精密度和准确度。
2.5.5稳定性
按照“2.5.1质控样品制备”项下方法制备高、中、低三个浓度的质控样品， 每个浓度平行制备6份。
室温稳定性：将高、中、低质控样品室温密封放置24h，测定并计算浓度。
冻融稳定性：将质控样品置于-20℃下24h，然后于37℃水浴中解冻， 待完全融化后重新置于-20℃下24h，如此重复冻融3次，考察其稳定性。
长期稳定性：将质控样品置于-20℃下1个月，考察其稳定性。
2.5.6回收率和基质效应
按照“2.5.1质控样品制备”项下方法制备高、中、低浓度质控样品，每 个浓度平行制备6份，测定各化合物及内标的峰面积。
取大鼠空白血浆800μL，加入甲醇-乙腈2：1的混合溶剂4mL，混匀， 涡旋30s，超声2min，12000rpm离心10min，取上清液置于10mL EP管中，45℃下N2吹干，分两次加入甲醇-乙腈2：1的混合溶剂，每次400μL，超声 2min溶解残渣，合并两次溶液，置于1.5mL EP管中，45℃下N2吹干，分别 加入“2.1对照品溶液的配制”项下混标溶液适量，再加入内标10μL，45℃下 N2吹干，45℃下N2吹干，加入甲醇100μL，超声2min溶解残渣，12000rpm 离心10min，取上清液，得到高、中、低浓度的基质效应考察样品，测定峰面 积。
以质控样品测得的峰面积除以混标溶液测得的峰面积的相对比值(％)作 为待测化合物的回收率；以基质效应考察样品测得的峰面积除以混标溶液测得 的峰面积的相对比值(％)作为待测化合物的基质效应。
2.6数据处理与统计分析
计算大鼠给药后各时间点各成分的血浆样品浓度，采用DAS 2.0软件，选 用统计矩模型分析，计算药动学参数。
三、结果
3.1方法学考察
3.1.1专属性
在选定的色谱条件下，葛根素的保留时间为4.6min，甘草素的保留时间为19.8min，甘草酸的保留时间为22.2min，异甘草素的保留时间为25.4min，牛 蒡子苷元的保留时间为26.7min，芒柄花素的保留时间为26.9min。内源性物质 对所测定成分无干扰，方法专属性良好，结果见图1。
3.1.2绘制标准曲线
各化合物的标准曲线回归方程及线性范围见表2。所有标准曲线的相关系 数(γ)均大于0.99，说明各化合物在规定范围内线性关系良好。
表2各待测化合物的内标校正曲线的线性范围和回归方程
Figure BDA0003456565290000131
3.1.3准确度与精密度
各化合物在高、中、低浓度下，日内和日间精密度(RSD)值均小于15％， 各化合物在高、中、低浓度下的相对回收率(RR)均处于85％～115％之间， 说明该方法的精密度和准确度均良好，详见表3。
表3各待测化合物的精密度与准确度(n＝6)
Figure BDA0003456565290000132
3.1.4稳定性
实验结果表明各化合物在室温条件下存放一天，准确度在在89.53％～ 110.93％之间，在冻融稳定性试验中的准度在93.95％～105.86％之间，在-20℃ 长期存放条件下，准确度在95.90％～108.80％之间，表明各化合物均具有良好 稳定性，结果见表4。
表4各待测化合物的稳定性(n＝6)
Figure BDA0003456565290000141
3.1.5回收率和基质效应
如表5所示，各化合物的回收率在88.95％以上，符合生物样品检测萃取 回收率的要求。基质效应试验表明，加入标样的血浆峰面积和标准品峰面积无 明显差异，5个目标成分均无基质效应。
表5各待测化合物的回收率和基质效应(n＝6)
Figure BDA0003456565290000151
3.2药代动力学研究
将血浆样品按照“2.3样品处理”项下方法处理，采用“2.4LC-MS条件” 项下的方法进行分析，计算各时间点各成分的血浆样品浓度，采用DAS 2.0软 件，采用统计矩模型分析，计算药动学参数，结果见表6。平均血药浓度-时间 曲线见图2。
表6大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊后各成分的血浆药动学参数(X±SD, n＝6)
Figure BDA0003456565290000152
上述内容表明，本实验采用LC-MS/MS法测定复方西羚解毒胶囊口服给药 后各时间点血浆中甘草素、异甘草素、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元的含量， 方法灵敏度高、快速、简单、准确、出峰时间短，在30分钟内出峰完毕，重 现性好，可用于大鼠血浆中甘草素、异甘草素、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷 元的定量。
大鼠灌胃给药后，甘草素、异甘草素、甘草酸、芒柄花素、牛蒡子苷元均 能较快吸收入血，Tmax均为1h，药-时曲线呈现多峰现象，但第2个峰的峰 值浓度明显低于第1个峰值浓度。表明该5个化合物在体内吸收均较快，可能 存在肝肠循环[9-11]。异甘草素平均消除半衰期为2.74h，说明异甘草素在体内 消除较快，甘草素、甘草酸、牛蒡子苷元、芒柄花素平均消除半衰期分别为 5.17h、5.25h、7.04h、6.32h，消除速率中等。
综合分析结果可知，甘草酸在复方西羚解毒胶囊中含量最高，且可以快速 吸收入血，具有中等消除速率，另外，据文献报道甘草酸具有极其显著的抗炎、 抗病毒、抗变态反应、抗肿瘤活性，是复方西羚解毒胶囊中的主要有效成分之 一。甘草素、异甘草素、芒柄花素是复方西羚解毒胶囊中3个含量较高的黄酮 类化合物，可以快速吸收入血，且具有抗炎、抗溃疡、抗艾滋病病毒、抗肿瘤 等多种药理活性，是复方西羚解毒胶囊中一类重要有效成分。牛蒡子苷元来源 于牛蒡子的单环氧木质素类化合物，具有抗炎、抗免疫调节、抗病毒、抗肿瘤 活性，是复方西羚解毒胶囊中的另一主要有效成分。
综上所述，本研究对复方西羚解毒胶囊中5种主要成分进行了药物代谢动 力学研究，为阐明其物质基础提供了重要的参考依据。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体 实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说， 本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复方西羚解毒胶囊多组分在大鼠体内药代动力学的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的配制
精密称取芒柄花素、甘草素、异甘草素、甘草酸、牛蒡子苷元和葛根素对照品适量，用甲醇溶解，分别配置成单一对照品储备液；再精密量取各储备液适量，用甲醇稀释，配制成系列对照品溶液；
(2)内标溶液的配制
精密称取葛根素适量，以甲醇溶解并定容，稀释至3μg/mL，作为内标溶液；
(3)复方西羚解毒胶囊提取物的制备
取复方西羚解毒胶囊粉末，超声提取三次，滤过，合并续滤液，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得干浸膏；
(4)给药与采样
a.取大鼠于眼眶后静脉丛取血，置于肝素化的EP管中，离心分离血浆后作为空白血浆样品；
b.取大鼠随机分组，每只分别灌胃给予复方西羚解毒胶囊样品；给药后各组每只大鼠于眼眶后静脉丛取血置于肝素化的EP管中，离心分离血浆后冷冻保存；
(5)样品处理
取大鼠血浆，加入内标溶液，再加入混合溶剂，混匀，涡旋、超声后离心，取上清液置于EP管中，分两次加入混合溶剂，超声溶解残渣，合并两次溶液，置于EP管中，加入甲醇，超声溶解残渣，离心后取上清液进样进行液相色谱-质谱测定；
(6)方法学考察
其包括质控样品的制备、专属性考察、绘制标准曲线、计算准确度与精密度、稳定性考察、回收率和基质效应以及数据处理与统计分析；
(7)药代动力学研究
将步骤(4)得到的血浆样品按照步骤(5)进行处理，采用与步骤(5)同条件的液相色谱-质谱进行分析，计算各时间点各成分的血浆样品浓度，采用DAS 2.0软件，采用统计矩模型分析，计算药动学参数。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(3)超声提取中复方西羚解毒胶囊粉末与水的质量比为1:10，冷冻温度为-20℃，冷冻时间为12h，干燥时间为48h。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(4)的步骤a和步骤b中离心转速均为8000rpm，离心时间均为10min，步骤b中冷冻温度为-20℃。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(5)中混合溶剂由甲醇和乙腈组成，体积比为2:1。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(5)中液相色谱-质谱的条件为：
(1)液相系统条件
流动相为乙腈-0.1％甲酸溶液，流速为0.4mL/min；梯度洗脱程序为：0～13min，21％乙腈；13～14min，21％～42％乙腈；14～32min，42％乙腈；
(2)质谱系统条件
电喷雾离子源，负离子模式；扫描范围m/z 50～1700；毛细管电压3500V；毛细管出口电压175V；干燥气体积流量8L/min；干燥器温度300℃；雾化器压力35psig；用提取离子色谱图进行积分，使用标准曲线法对各待测成分进行含量测定。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(6)中质控样品的制备步骤为：
取步骤(1)制备的对照品溶液，吹干溶剂，分别加入大鼠空白血浆和内标溶液，再按照步骤(5)方法处理样品，即制得高、中、低浓度的质控样品。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(6)中专属性考察步骤为：
取大鼠的空白血浆，除不加内标溶液外，其与按照步骤(5)中方法处理，再按照步骤(5)同条件的液相色谱-质谱方法测定，得到空白血浆样品色谱图；取混标溶液适量，吹干溶剂，加入大鼠空白血浆，其余按照步骤(5)中方法处理，测定得到相应色谱图；取大鼠灌胃给予复方西羚解毒胶囊提取物后4h的血浆，按照步骤(5)中方法处理，测定得到给药后血浆样品色谱图；
步骤(6)中稳定性考察步骤为：按照步骤(6)中质控样品制备中的方法制备高、中、低三个浓度的质控样品，每个浓度平行制备6份，分别考察其室温稳定性、冻融稳定性和长期稳定性。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(6)中绘制标准曲线步骤为：
取步骤(1)下混标系列溶液，吹干溶剂，分别加入大鼠空白血浆和内标溶液，其余按照步骤(5)中方法处理样品；再按照步骤(5)同条件的液相色谱-质谱进行测定，以血浆中被测物的浓度为横坐标，被测物与内标物的在提取离子色谱图中峰面积比值为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线，计算回归方程及线性范围。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(6)中准确度与精密度的步骤为：
按照步骤(6)中质控样品制备中的方法制备高、中、低三个浓度的质控样品，每种样品浓度平行制备6份，连续测定3天，测定峰面积，根据标准曲线计算浓度，计算其精密度和准确度。
10.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤(6)中回收率和基质效应步骤为：
按照步骤(6)中质控样品制备中的方法制备高、中、低三个浓度的质控样品，测定各化合物及内标的峰面积；
取大鼠空白血浆，加入混合溶剂，混匀，涡旋、超声和离心后，取上清液置于EP管中，分两次加入混合溶剂，超声溶解残渣，合并两次溶液，置于EP管中，分别加入步骤(1)中的混标溶液适量，再加入内标溶液，吹干溶剂，加入甲醇溶解，离心，取上清液，得到高、中、低浓度的基质效应考察样品，测定峰面积；
以质控样品测得的峰面积除以混标溶液测得的峰面积的相对比值作为待测化合物的回收率；以基质效应考察样品测得的峰面积除以混标溶液测得的峰面积的相对比值作为待测化合物的基质效应。
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