CN104133013A

CN104133013A - 一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法

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Publication number: CN104133013A
Application number: CN201410328183.XA
Authority: CN
Inventors: 瞿海斌; 周祥山; 田守生; 王春艳; 沈丽娟; 李民; 张路; 李士栋
Original assignee: Shandong Dong E E Jiao Co Ltd
Current assignee: Shandong Dong E E Jiao Co Ltd
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN104133013B

Abstract

本发明公开了一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法，该方法采用高效液相色谱-串联三重四级杆质谱同时在线检测4味药材10种化合物。本发明通过大量实验优选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，质谱条件及相关化合物参数，经过方法学的考察，本发明提供的复方阿胶浆口服液质量检测方法，稳定性、选择性和重复性好，分析结果可靠；方法灵敏度高，可以较好实现复方阿胶浆口服液的定性、定量分析，从而客观、全面、准确地评价复方阿胶浆口服液的质量，对控制复方阿胶浆口服液的质量和保证临床疗效具有重要意义。

Description

一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法

技术领域

本发明涉及复方中药的质量检测方法，具体的说，涉及一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法。

背景技术

复方阿胶浆口服液由山东东阿阿胶股份公司生产的由阿胶、红参、党参、熟地黄和山楂五味药材经现代工艺加工精制而成一种复方中药口服液，具有补益气血、健脾胃，滋补肝肾的功能，主要用于气血两虚，头晕目眩，心悸失眠，食欲不振及贫血。

复方阿胶浆口服液由下述原料药制成，阿胶5份、红参6份、熟地8份、党参12份、山楂5份，将上述各组分制成本发明药物的制备方法如下：

①按照上述用量称取原料中药材；

②上述原料中药材加适量水提取、浓缩、过滤，备用；

③阿胶加适量水溶化，加入步骤②的药液中，充分混匀，备用。

④在步骤③中加入适量的白糖，加热使溶解，混匀，既得口服液。

步骤③所得混合溶液，还可加入药学上可接受的辅料和/或赋形剂，采用现代工艺还可制成临床可接受的任何剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂等。

作为经典的复方中药口服液，复方阿胶浆不仅用于补血，它还被广泛用于抗癌、抗肿瘤等其他疾病的辅助治疗中。

但是，目前复方阿胶浆口服液的质量标准检测方法仅限于总黄酮、总皂苷等指标，没有针对活性化学成分的定量检测方法，根本不能全面反应产品的质量，仅以此来控制中药复方制剂的质量不是十分合理；且目前市场上同类产品的竞争日益激烈，因此为了维护患者的利益，建立复方阿胶浆口服液中活性成分的检测方法具有重要意义。

基于上述需求，本发明的目的是弥补现有分析方法的不足，提供一种能同时检测复方阿胶浆中四味药材中10种化合物的定量分析方法，该方法可以客观、全面、准确的评价复方阿胶浆口服液的质量，对于控制复方阿胶浆口服液的质量和保证疗效具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法。

复方阿胶浆口服液中含有红参、党参、地黄和山楂等中药成分，以上4味中药中含有绿原酸、党参炔苷、麦角甾苷、黄芩苷、人参皂苷等活性成分。

液相色谱-质谱联用仪是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。为了能高效地同时检测以上不同药材中不同类别的化合物，减少检测的工作量，本发明经过大量实验对流动相组成、流动的洗脱梯度、流速和质谱源参数、化合物参数等进行了筛选。所述质量检测方法能同时检测并定量分析复方阿胶浆中的四味药材10中化合物，能够高效、准确地评价和控制复方阿胶浆的质量。

为了实现以上目的，本发明所提供的复方阿胶浆口服液的质量检测方法是采用高效液相色谱-串联三重四级杆质谱对样品进行分析，样品先去除蛋白，然后采用内标法进行分析，其内标物为柚皮苷和地高辛。

具体的说，本发明所述的复方阿胶浆口服液的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)乙腈沉淀蛋白预处理：用移液管准确移取1-10mL复方阿胶浆口服液样品于离心管中，加入80％甲醇-水40-200μL和内标溶液20-100μL，振荡均匀；加体积为样品体积2-5倍的乙腈，振荡器混匀5-30min，静置，离心；移取上清液0.2-2mL，离心浓缩后加入30％甲醇-水0.2-2mL复溶；离心取上清液进样5μL分析；

(2)高效液相色谱-串联三重四级杆质谱检测：梯度洗脱：进样量5μL，分析时间70分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C18柱，流动相：A相0.01-0.1％甲酸-水，B相0.01-0.1％甲酸-乙腈，流速为0.20-0.80mL/min；然后进入质谱仪检测。

步骤(1)中，所述内标溶液为柚皮苷和地高辛溶液。其中地高辛溶液为低浓度内标液，为含量较低成分的作内标；柚皮苷溶液为高浓度内标液，为含量较高的成分做内标溶液；

柚皮苷和地高辛溶液的配置方法如下：取柚皮苷适量，精密称定，柚皮苷对照品浓溶液加80％甲醇-水稀释制成不同浓度柚皮苷对照品稀溶液；取地高辛适量，精密称定，地高辛对照品浓溶液加80％甲醇-水稀释制成不同浓度地高辛对照品稀溶液。

其中，柚皮苷溶液的浓度范围为0.02-0.5mg/mL；优选0.2mg/mL；地高辛溶液的浓度范围为0.02-0.2mg/mL；优选0.05mg/mL。

优选的，所述乙腈的用量为样品体积的3倍。

步骤(1)中，所述静置是在4℃冰箱静置10-24h；

步骤(1)中，所述离心的条件如下：4℃，2500rpm，10-30min；

优选的，步骤(1)如下进行：用移液管准确移取2mL复方阿胶浆口服液样品于15mL离心管中，加入80％甲醇-水80μL和柚皮苷和地高辛内标溶液各40μL，振荡均匀；加乙腈6mL，振荡器混匀10min，于4℃冰箱静置12h；4℃，2500rpm离心20min；移取上清液0.5mL，离心浓缩后加入30％甲醇-水1mL复溶；离心取上清液进样5μL分析；

步骤(2)中，流动相的流速为0.50mL/min；

步骤(2)中，柱温为30℃；

作为优化的色谱条件，本发明提供的复方阿胶浆口服液的质量检测方法，以上步骤(2)中，线性梯度洗脱程序为：0分钟流动相A:B的比例为85:15；20分钟流动相A:B的比例为75:25；35分钟流动相A:B的比例为68:32；45分钟流动相A:B的比例为65:35；70分钟流动相A:B的比例22:78。

绿原酸、党参炔苷、麦角甾苷、黄芩苷、人参皂苷等10种化合物在复方阿胶浆口服液中含量较低，在质谱中响应差别较大，因此在液相色谱条件下分离和检测较为困难，本发明首先对流动相的组成进行了考察，根据实验结果，步骤(2)中，优选采用A、B两相分别为浓度0.02％甲酸的水溶液和0.02％甲酸的乙腈作为流动相的组成。

优选的，所述步骤(2)中高效液相色谱的梯度洗脱如下进行：进样量5μL，分析时间70分钟，色谱条件为：色谱柱：反相C18柱，流动相：A相0.02％甲酸-水，B相0.02％甲酸-乙腈，梯度洗脱，流速为0.50mL/min，柱温：30℃；其中线性梯度洗脱程序为：0分钟流动相A:B的比例为85:15；20分钟流动相A:B的比例为75:25；35分钟流动相A:B的比例为68:32；45分钟流动相A:B的比例为65:35；70分钟流动相A:B的比例22:78(也就是说线性梯度洗脱程序为：0-20min，A相85％-75％；20-35min，A相75％-68％；35-45min，A相68％-65％；45-70min，A相65％-22％)。

其中，本发明采用的高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，配有四元泵，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)。

本发明采用的质谱仪为API4000三重四级杆质谱仪(美国AB公司)，配有Analyst工作站。

所述的质谱仪检测如下进行：碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮；电喷雾电离，检测模式为负离子模式；气帘气：30psi；雾化气：50psi；加热气：55psi；加热器温度：550℃；电压：-4000V；界面加热器：On；使用选择离子模式，依据复方阿胶浆中主要成分选择各个离子和参数范围，然后开始检测。

(1)乙腈沉淀蛋白预处理：用移液管准确移取2mL复方阿胶浆口服液样品于15mL离心管中，加入80％甲醇-水80μL和0.2mg/mL的柚皮苷溶液和0.05mg/mL的地高辛溶液各40μL，振荡均匀；加乙腈6mL，振荡器混匀10min，于4℃冰箱静置12h；4℃，2500rpm离心20min；移取上清液0.5mL，离心浓缩后加入30％甲醇-水1mL复溶；离心取上清液进样5μL分析；

(2)高效液相色谱-串联三重四级杆质谱检测：

①液相条件Agilent1200高效液相色谱仪，配有四元泵，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)，进样量5μL，分析时间70分钟，色谱条件为：流动相：A相0.02％甲酸-水，B相0.02％甲酸-乙腈，梯度洗脱，流速为0.50mL/min，柱温：30℃；其中线性梯度洗脱程序为：0分钟流动相A:B的比例为85:15；20分钟流动相A:B的比例为75:25；35分钟流动相A:B的比例为68:32；45分钟流动相A:B的比例为65:35；70分钟流动相A:B的比例22:78；

②质谱条件API4000三重四级杆质谱仪(美国AB公司)，配有Analyst工作站；碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮；电喷雾电离(ESI)，检测模式为负离子模式；气帘气(Curtain Gas)：30psi；雾化气(Nebulizer Gas1)：50psi；加热气(Heater Gas2)：55psi；加热器温度(Temp)：550℃；电压(IonSpray)：-4000V；界面加热器(ihe)：On；使用选择离子模式(MRM)，依据复方阿胶浆中主要成分选择各个离子和具体参数。

绿原酸、党参炔苷、麦角甾苷、黄芩苷、人参皂苷等10种化合物在复方阿胶浆口服液中含量较低，在质谱中响应差别较大，因此在液相色谱条件下分离和检测较为困难，本发明首先对流动相的组成进行了考察，确定采用A、B两相分别为浓度0.02％甲酸的水溶液和0.02％甲酸的乙腈作为流动相的组成。

绿原酸在酸性条件下分离度较好，但是当酸性增强，皂苷的响应较低，因此调整流动相到合适的酸度非常重要。

本发明在确定流动相后，经色谱柱分析表明，麦角甾苷和异麦角甾苷、人参皂苷R构型和S构型的化合物也不能较好地分离，因此为了提高各成分的分离度，本发明对流动相的洗脱程序进行了考察。通过调整，最终确定出分离麦角甾苷和异麦角甾苷、人参皂苷S-Rg2和R-Rg2、人参皂苷S-Rg3和R-Rg3的最佳流动相洗脱梯度，实验结果表明，采用本发明的流动相梯度能够将同分异构的化合物进行有效分离。

同时由于复方阿胶浆口服液中化学成分复杂，通过质谱进行检测和定量，如流速过快，分离度可能不够理想，对质谱的正常使用影响较大，因此本发明对流动相的流速进行了筛选，实验结果表明，当流动相的流速为0.50mL/min时，化合物分离度好，响应满足条件，且在质谱耐受范围内。因此本发明采用0.5mL/min。

同时本发明对质谱的源参数进行了考察，并针对测定的化学成分进行了质谱参数优化，确定待测化合物信息准确性、灵敏度和稳定性良好。

复方阿胶浆成分复杂，分离和检测都较为困难，该分析方法，为液相色谱-质谱联用技术用于中药产品质量分析提供了参考。本发明根据中药复方阿胶浆口服液中所含的活性成分，包括有机酸、苯乙醇苷和人参皂苷类化合物的性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相，梯度洗脱程序、流速、色谱柱和质谱条件，针对10种化学成分，涵盖了4味药材，通过多反应检测模式，准确灵敏的检测该10种活性成分的含量，提供了一种高效液相色谱-串联三重四级杆质谱同时实现复方阿胶浆中10种化学成分的定量分析方法；多次实验结果表明，10种化学成分绿原酸在9.37-389μg/mL、麦角甾苷在8.75-350μg/mL、异麦角甾苷在31.1-1244μg/mL、党参炔苷在18.7-746μg/mL、黄芩苷在8.78-140μg/mL、三七皂苷皂苷R2在2.83-113μg/mL、20(S)-人参皂苷在Rg2在20.9-834μg/mL、20(R)-人参皂苷在Rg214.2-568μg/mL、20(S)-人参皂苷Rg3在23.9-383μg/mL、20(R)-人参皂苷Rg3在12.5-499μg/mL范围内线性关系好相关系数在0.99以上；复方阿胶浆口服液在低浓度、中浓度和高浓度的回收率平均为93.94％-123.5％，能够较好地满足阿胶浆定量分析的要求。本发明提供的中药复方阿胶浆口服液的质量检测方法可以在线同时检测10种化合物，因此具有很高的分析效率和针对性，可以克服现有分析方法的不足，且本发明提供的分析方法稳定性好，对各成分分离度好，可以灵敏准确的定性定量分析各化合物。因此，本发明提供质量检测方法可以客观、全面、准确的评价复方阿胶浆口服液的质量，对控制产品的质量和保证临床疗效具有重要意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1中药复方阿胶浆口服液的质量检测

1、实验材料

(1)供试液的制备：取复方阿胶浆口服液5批(110950、1109511、110952、110953、110954)，按照技术方案中所述样品预处理的方法除去阿胶浆中的蛋白后，经离心、静置、离心浓缩、稀释等步骤后进行分析；

(2)标准品的制备：精密称取不同量的绿原酸、麦角甾苷、异麦角甾苷、党参炔苷、黄芩苷、三七皂苷R2、20(S)-人参皂苷Rg2、20(R)-人参皂苷Rg2、20(S)-人参皂苷Rg3、20(R)-人参皂苷Rg3，配成如下表所示的混标溶液。

表1标准品溶液(μg/mL)

(3)内标溶液的制备：精密称取柚皮苷2mg和地高辛0.5mg，配成0.2mg/mL和0.05mg/mL的内标溶液。

2、标准曲线的制备

按照技术方案中样品预处理的方法，将复方阿胶浆口服液样品2mL用空白胶汁替代，加入不同浓度的混标溶液80μL和内标溶液40μL，按照同样的步骤进行处理，最后标准曲线样品进样5μL分析，然后以待测化合物峰面积与内标化合物峰面积的比值为纵坐标、各标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线：

绿原酸标准曲线：y＝0.0234x+0.1791，r²＝0.9948

麦角甾苷标准曲线：y＝0.0142x+0.03，r²＝0.9996

异麦角甾苷标准曲线：y＝0.0087x+0.4007，r²＝0.9948

党参炔苷标准曲线：y＝0.0051x+0.0877，r²＝0.9974

黄芩苷标准曲线：y＝0.0283x+0.0722，r²＝0.9982

三七皂苷R2标准曲线：y＝0.2536x-0.0154，r²＝0.9999

人参皂苷S-Rg2标准曲线：y＝0.1565x+2.6882，r²＝0.9989

人参皂苷R-Rg2标准曲线：y＝0.1441x+1.1247，r²＝0.9993

人参皂苷S-Rg3标准曲线：y＝0.0467x+0.6819，r²＝0.9979

人参皂苷R-Rg3标准曲线：y＝0.0481x+0.4549，r²＝0.9992

通过以上分析，10种化合物在本发明提供的分析条件下，能够较好的达到分离，各化合物的标准曲线的线性关系良好。因此本发明提供的分析方法可用于同时检测复方阿胶浆口服液中有机酸、苯乙醇苷和人参皂苷类化合物。

实施例2灵敏度实验

灵敏度实验包括仪器的灵敏度和方法的灵敏度，分别用仪器的检测限和方法的定量限表示。

将HB-6用80％的甲醇-水分别稀释10倍、30倍、60倍、120倍、240倍、360倍、480倍，按照样品预处理方法，将HB-6的稀释液加入空白胶汁中后经离心、静置、离心浓缩、稀释等步骤后进样分析，测定信噪比，取信噪比≥3的对照品浓度作为仪器检测限，信噪比≥10的对照品浓度作为方法的定量限。

实施例3准确性与重复性实验

取同一批次的复方阿胶浆口服液4支混合后，经超声20min后，准确移取1mL口服液和1mL空白胶汁1mL，混合均匀后，加入80μL的高中低三个浓度的标准储备液和内标溶液40μL，按照标准操作进行处理，并进样分析，计算回收率及相对标准偏差；所述准确性用回收率来表示，重复性用相对标准偏差来表示。

针对样品的预处理方法和分析方法，考察基质对分析结果的影响，需测定样品预处理的提取效率和基质效应。分别配制高中低三组浓度的标准储备液，分别在沉淀蛋白前和沉淀蛋白后加入制备成回收样本和基质样本，再制备三组浓度的空白溶剂样本，平行各三份，共9份样品，分别计算提取回收率和基质效应。

表4为复方阿胶浆口服液定量分析方法的线性回归方程、相关系数、方法定量限和检测限，

表5为该定量方法的基质效应、提取回收率、加样回收率及精密度。

表4线性范围

实施例4中药复方阿胶浆口服液的分析

高效液相色谱法串联三重四级杆质谱法测定复方阿胶浆口服液中10种化合物，分别取不同批号的阿胶浆5支，超声20min，分别精密吸取2mL口服液，加入80μL80％甲醇-水和40μL内标溶液，混匀后，加入6mL乙腈沉淀蛋白，混匀后静置12h，取出后离心取上清液0.5mL，离心浓缩至干后用1mL30％甲醇-水复溶，样品离心后取上清液进样直接分析。

色谱分离时间为70分钟，色谱条件为：Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：A相(0.02％甲酸/水)-B相(0.02％甲酸/乙腈)；柱温：30℃；进样量：5μL，线性梯度洗脱(0分钟流动相A:B的比例为85:15；20分钟流动相A:B的比例为75:25；35分钟流动相A:B的比例为68:32；45分钟流动相A:B的比例为65:35；70分钟流动相A:B的比例22:78)。

表6中药复方阿胶浆口服液中10种化合物的检测结果(保留时间：min)

表7中药复方阿胶浆口服液中10种化合物的检测结果(峰面积)

由表6和表7的实验结果表明，本发明提供的中药复方阿胶浆口服液的检测方法，可以同时检测到10种化合物，涵盖了四味药材，这10个化合物在色谱柱上具有较好的分离度，从保留时间上看出，各化合物和对照品具有很好的匹配度，因此采用本发明提供的检测方法可以定量检测到复方阿胶浆口服液中10个活性化合物，相比现有技术具有针对性强、准确度高等优点，且对控制和全面评价中药复方阿胶浆口服液质量具有很好的应用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种复方阿胶浆口服液的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述内标溶液为柚皮苷和地高辛溶液；其中，柚皮苷溶液的浓度范围为0.02-0.5mg/mL；地高辛溶液的浓度范围为0.02-0.2mg/mL；优选0.2mg/mL的柚皮苷溶液和0.05mg/mL的地高辛溶液。

3.如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙腈的用量为样品体积的3倍。

4.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述静置是在4℃冰箱静置10-24h；所述离心的条件如下：4℃，2500rpm，10-30min。

5.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，步骤(1)如下进行：用移液管准确移取2mL复方阿胶浆口服液样品于15mL离心管中，加入80％甲醇-水80μL和柚皮苷和地高辛内标溶液各40μL，振荡均匀；加乙腈6mL，振荡器混匀10min，于4℃冰箱静置12h；4℃，2500rpm离心20min；移取上清液0.5mL，离心浓缩后加入30％甲醇-水1mL复溶；离心取上清液进样5μL分析。

6.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，流动相的流速为0.50mL/min。

7.如权利要求1-6任一所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，线性梯度洗脱程序为：0分钟流动相A:B的比例为85:15；20分钟流动相A:B的比例为75:25；35分钟流动相A:B的比例为68:32；45分钟流动相A:B的比例为65:35；70分钟流动相A:B的比例22:78。

8.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用A、B两相分别为浓度0.02％甲酸的水溶液和0.02％甲酸的乙腈作为流动相的组成。

9.如权利要求1或8所述的质量检测方法，其特征在于，采用的高效液相色谱仪为Agilent1200高效液相色谱仪，配有四元泵，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(250mm×4.6mm,5μm)；采用的质谱仪为API4000三重四级杆质谱仪(美国AB公司)，配有Analyst工作站；所述的质谱仪检测如下进行：碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮；电喷雾电离，检测模式为负离子模式；气帘气：30psi；雾化气：50psi；加热气：55psi；加热器温度：550℃；电压：-4000V；界面加热器：On；使用选择离子模式。

10.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)高效液相色谱-串联三重四级杆质谱检测：

②质谱条件API4000三重四级杆质谱仪(美国AB公司)，配有Analyst工作站；碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮；电喷雾电离(ESI)，检测模式为负离子模式；气帘气(Curtain Gas)：30psi；雾化气(Nebulizer Gas1)：50psi；加热气(Heater Gas2)：55psi；加热器温度(Temp)：550℃；电压(IonSpray)：-4000V；界面加热器(ihe)：On；使用选择离子模式(MRM)。