CN101354382A - 三七皂苷体内五种活性成分的同时定量分析方法 - Google Patents

Abstract

建立了同时定量分析血浆样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1的高效液相色谱－质谱(HPLC－MS)联用分析技术方法。正丁醇提取血浆样品，色谱柱为Luna－C18柱(150×2.0mm，5μm)，柱温40℃，流动相由乙腈和0.5mM的氯化铵组成；流速为0.2ml/min，乙腈按如下比例进行梯度洗脱：0.03min∶25％；1.5min∶45％；2.03－3.5min∶90min；4.0－10.0min∶25％；10.03∶stop。岛津2010LC－MS对上述五种物质检测的荷－质(m/z)比分别为967.75、835.40、981.80、981.80和1143.65。在上述条件下五种物质的最低定量限分别为：3.03、4.00、4.00、4.00和2.77ng/ml，所建立的方法专属性好，灵敏度高，适用于血浆样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1的药代动力学研究，解决了中药多组份同时定量分析的技术难点，为多组份中药药代动力学研究提供了新的思路。

Description

三七皂苷体内五种活性成分的同时定量分析方法

技术领域

本发明涉及三七总皂苷中微量物质的分析技术，尤其是同时对这些微量物质进行定量分析并用于药代动力学研究的技术。

背景技术

众所周知，由于中药(单方或复方)成份的复杂性、各成分含量差异较大、成份之间存在复杂的相互作用，给中药血药浓度的监测及药代动力学研究带来很大的困难。三七总皂苷是多组份中药中的典型代表，文献报道三七总皂苷中所含的皂苷类成份多达60多种^[1]，最近几年来国内有些学者开展了三七皂苷及其不同制剂的含量测定及药代动力学研究，但多数是借助高效液相色谱仪对单一皂苷成分如Rg1或Rb1进行研究^[2-4]。由于皂苷类成份的低紫外吸收使得现有研究方法灵敏度极低没法满足生物样品的测定要求^[4]。使得三七总皂苷在机体内的药代动力学研究受到很大的限制。

研究内容

根究三七总皂苷的研究现状，为更好地评价三七总皂苷的体内药动学特征，本发明建立了一种高灵敏度的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术分析方法，不仅克服了传统分析方法中由于皂苷类物质低紫外吸收带来的低灵敏度分析技术问题，而且还对多种微量的皂苷类成份进行了定量分析，为三七总皂苷在机体内的药动学研究提供了研究基础，也为中药多组份同时定量分析提供了技术参考。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：采用正丁醇液-液萃取方法对血浆样品进行处理；建立血浆样品中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1同时测定的色谱条件为：色谱柱：Luna-C₁₈柱，150×2.0mm(ID.)，5μm(Phenomenex，USA)，柱温：40℃；流动相：水相(A相)，0.5mM的氯化铵溶液；有机相(B相)，乙腈，梯度洗脱，流速为0.2ml L^-1。质谱条件为：干燥气(氮气)流速为1.5Lmin^-1；曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃；加热块(Block)℃为200℃；检测器电压为1.6kV；探针(probe)电压为4.5kV；裂解器电压为-70V。离子化方式：电喷雾离子化，负离子方式；选择性离子(SIM)检测：各成份荷-质(m/z)比分别为967.75、835.40、981.80、981.80和1143.65。在上述条件基础上对三七总皂苷在血浆样品中的专属性、线性关系、回收率、日内(间)差、稳定性和最低定量限进行了考察，并利用所建立的方法进行了体内三七总皂苷的药代动力学研究。

本发明的有益效果是：同时对血浆中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1进行定量分析，方法可靠、简便，分析时间短，为三七总皂苷的药代动力学研究提供了分析技术保障，也为中药多组份定量分析研究提供了技术上的参考。

具体实施方式

1、含三七总皂苷血浆100μl，精密加入浓度为500ng mL^-1的内标地高辛溶液10.0μl，漩涡混匀器上混匀30s，加入1.0ml的水饱和正丁醇，继续混匀3min，将混匀物置于离心机中，8000rpm离心5min，取上层有机相0.8ml至干净的Eppendorf管中，真空减压浓缩干燥器上将有机相正丁醇挥干，残渣加入100.0μl甲醇，漩涡器上震荡融解2min，将溶解液置于高速低温冰箱中22000rpm离心10min，取上清液10.0μl上清液注入HPLC-MS仪进行分析。

2、分析的色谱条件如下：色谱柱：Luna-C₁₈柱，150×2.0mm(ID.)，5μm(Phenomenex，USA)，柱温：40℃；流动相：水相(A相)，0.5mM的氯化铵溶液；有机相(B相)，乙腈。梯度洗脱程序见下表，流速为0.2ml L^-1。

3、分析的质谱条件如下：岛津2010型LC-MS电喷雾离子源参数如下：干燥气(氮气)流速为1.5L min^-1；曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃；加热块(Block)℃为200℃；检测器电压为1.6kV；探针(probe)电压为4.5kV；裂解器电压为-70V。离子化方式：电喷雾离子化，负离子方式；选择性离子(SIM)检测：各成份荷-质(m/z)比分别为967.75、835.40、981.80、981.80和1143.65。

4对三七总皂苷在血浆样品中的专属性、线性、回收率、日内(间)差、稳定性和最低定量限进行分析：

专属性：取空白血浆和含三七总皂苷的血浆，按实施方式1方法处理血浆样品，在上述色谱和质谱条件下分析生物样品，观察血浆内源性物质是否干扰样品峰的出现。

线性：取1.5ml的Eppendorf管，加入90μl的空白血浆，精密吸取10.0μl的各皂苷混合工作液，配成含三七皂苷R1浓度为775.00、387.50、96.88、48.44、24.22、12.11、6.06和3.03ng mL^-1；Rg1、Rd、Re浓度为1025.00、512.52、128.13、64.06、32.03、16.02、8.01、4.00ngmL^-1；Rb1浓度为710.00、355.00、88.75、44.38、22.19、11.09、5.55、2.77ng mL^-1的标准浓度血浆，漩涡混匀30s，按实施方式1方法处理血浆样品，同时测定上述五种物质，以三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re、Rb1的标准浓度(C)为横坐标，三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re、Rb1与内标峰面积比值(Y＝As/Ai)为纵坐标，按1/y²权重进行线性回归，考察5只空白血浆的线性。

回收率：取1.5ml的Eppendorf管，加入90μl的空白血浆，精密吸取10.0μl的各皂苷混合工作液，配成含三七皂苷R1浓度为387.50、96.88、12.11ng mL^-1；Rg1、Rd、Re浓度为512.52、128.13、16.02ng mL^-1；Rb1浓度为355.00、88.75、11.09ng mL^-1的高、中、低三种不同浓度的血浆样品各5份，按实施方式1方法处理血浆样品，取上清液10.0μl注入HPLC/ESI/MS仪，同时测定上述五种物质，计算三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1与内标地高辛峰面积的比值(As₀/Ai₀)；

另取1.5ml的Eppendorf管，精密量取不同量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1对照品系列工作液，甲醇分别配制含三七皂苷R1浓度为387.50、96.88、12.11ng mL^-1；Rg1、Rd、Re浓度为512.52、128.13、16.02ng mL^-1；Rb1浓度为355.00、88.75、11.09ng mL^-1的高、中、低三种不同浓度的血浆样品各5份，按实施方式1方法处理血浆样品，取上清液10.0μl注入HPLC/ESI/MS仪，同时测定上述五种物质，计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rd、Re和Rb1与内标地高辛峰面积的比值(As₁/Ai₁)，按下式计算样品提取回收率，

$\frac{{\mathrm{As}}_0/{\mathrm{Ai}}_0\×1/0.8}{{\mathrm{As}}_1/{\mathrm{Ai}}_1}\×100\%$

日内(间)差：按线性操作方法，配制含三七皂苷R1浓度为387.50、96.88、12.11ng mL^-1；Rg1、Rd、Re浓度为512.50、128.13、16.02ng mL^-1；Rb1浓度为355.00、88.75、11.09ng mL^-1的高、中、低三种不同浓度的样品进行测定，一天内每个浓度各测定5次，分别以R.E％和C.V％表示日内方法的准确度和精密度；按上述方法操作，每天将三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1的高、中、低三种不同浓度的血浆样品各做5份，同时测定上述五种物质，连续3天分别以R.E％和C.V％表示日间方法的准确度和精密度。

稳定性：配制与日内(间)差相同浓度的样品，在上述条件下测定，分别进行三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1在室温12h、-20℃存放4周、-20℃冻溶3次及4℃自动进样器内放置时的稳定性考察。

参考文献

[1]鲍建才，刘刚，张崇喜，等.三七的化学成份研究进展[J].中成药，2006；28：246-253.

[2]王艳萍，孟庆彪，王伟东等.血塞通注射液药代动力学研究.中国药房.2002，13(3)：144～145.

[3]吴云娟，朱晓艺，方晓玲等.三七总皂苷鼻腔给药的药代动力学与药效学.药学学报，2005，40(4)：377～381.

[4]Xu Qingfang，Fang Xiaoling，et al.Pharmacokkinetics and bioavailability of ginsenosideRb1 and Rg1 from Panax notoginseng in rats.J Ethnopharmacol.2003，84(2-3)：187-192.

Claims (5)

1、一种血浆中三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1同时定量分析方法，包括上述五种物质的提取方法，色谱和质谱参数，方法学的考察，药代动力学研究中的应用。其特征为：正丁醇液-液萃取血浆样品中的三七皂苷R1、Rg1、Rd、Re和Rb1，建立相应的色谱和质谱方法，对上述样品在血浆中的专属性、线性、回收率、日内(间)差、稳定性和最低定量限进行考察并用于体内三七总皂苷的药代动力学研究。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是：血浆100μl，精密加入浓度为500ng mL^-1的内标地高辛溶液10.0μl，漩涡混匀器上混匀30s，加入1.0ml的水饱和正丁醇，继续混匀3min，将混匀物置于离心机中，8000rpm离心5min，取上层有机相0.8ml至干净的Eppendorf管中，真空减压浓缩干燥器上将有机相正丁醇挥干，残渣加入100.0μl甲醇，漩涡器上震荡融解2min，将溶解液置于高速低温冰箱中22000rpm离心10min，取上清液10.0μl上清液注入岛津2010型HPLC/ESI/MS仪进行测定。

3、根据权利要求1所述方法，其特征是：色谱柱：Luna-C₁₈柱，150×2.0mm(ID.)，5μm(Phenomenex，USA)，柱温：40℃；流动相：水相(A相)，0.5mM的氯化铵溶液；有机相(B相)，乙腈。梯度洗脱程序见下表，流速为0.2ml L^-1。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征是：LC-MS质谱条件：电喷雾离子源参数如下：干燥气(氮气)流速为1.5L min^-1；曲型脱溶剂装置(CDL)温度为250℃；加热块(Block)℃为200℃；检测器电压为1.6kV；探针(probe)电压为4.5kV；裂解器电压为-70V。离子化方式：电喷雾离子化，负离子方式；选择性离子(SIM)检测：各成份荷-质(m/z)比分别为967.75、835.40、981.80、981.80和1143.65。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征是：在上述2、3、4条件下考察了三七总皂苷在血浆样品中的专属性、线性、回收率、日内(间)差、稳定性和最低定量限，表明专属性良好，五种被测物线性R²均在0.99以上，回收率均为67.47％-94.18％，日内(间)精密度为1.82％-11.46％。在此基础上进行了三七总皂苷体内的药代动力学研究。