CN103472165A - 快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法及其应用，采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测、并通过对已知重楼皂甙的质谱裂解规律的分析，二级质谱碎片采用高能碰撞诱导解离(HCD)方式获得，较常规的碰撞诱导解离CID能获得更多的低质量端碎片，对化合物的结构解析十分有用，建立了采用高分辨质谱仪对未知的滇重楼皂甙组成进行快速研究鉴定的技术方法，采用液相高分辩质谱联机检测鉴定技术对滇重楼中未知甾体皂甙组成进行分析鉴定，共鉴定发现了滇重楼含有17种重楼皂甙、其中发现的3种新甾体皂甙还未有报道、5种为新发现的重楼皂甙组分。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药成分的检测方法，特别涉及一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法及其应用。
背景技术
滇重楼是云南珍稀药材品种，是《中国药典》（2010版一部）重楼药材的两个基源品种之一，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，用于痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打疼痛、凉风抽搐等症，是我国五十多种名优中成药产品的主要原料药。重楼皂甙是滇重楼主要的药效成分，中国药典中列明的滇重楼皂甙组分有4种、而有文献报道发现的的重楼皂甙组分还有5种，现在对重楼皂甙的鉴定方法主要是采用柱色谱分离手段进行单体皂甙分离收集各种单体皂甙后再用核磁共振谱仪进行结构鉴定，花费研究的时间长达数月以上、分析成本昂贵。
因此，需要对传统的检测方法进行改进来对滇重楼皂甙未知组成进行分析鉴定，并具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可有效提高滇重楼皂甙组成的分析通量和分析效果，对皂甙组分的识别效率高，同时定性和定量能力强，并且检测成本低廉，可以方便地为滇重楼人工种植的品种选育提供一种快速经济的品质鉴定技术。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法及其应用，具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可有效提高滇重楼皂甙组成的分析通量和分析效果，对皂甙组分的识别效率高，同时定性和定量能力强，并且检测成本低廉，可以方便地为滇重楼人工种植的品种选育提供一种快速经济的品质鉴定技术。
本发明的一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法，包括以下步骤：
a.样品提取：称取适量滇重楼样品用甲醇超声提取离心分离过微孔滤膜,制得样品溶液；
b.采用C18色谱柱：150×2.1mm,5μm，以水和乙腈为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱比例为0～2min，水为95体积份，乙腈为5体积份；2～5min，水为95→75体积份，乙腈为5→25体积份；5～20min，水为75→67体积份，乙腈为25→33体积份；20～45min，水为67→50体积份，乙腈为33→50体积份；45～52min，水为50→5体积份，乙腈为50→95体积份；设置流速为0.1～0.8min,检测波长为190～210nm,进样量为2～20μL,柱温控制在20～45℃；
c.采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析，采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析，质谱条件为：离子化方式HESI（+），喷雾电压+3.2KV/-3.0KV,鞘气40arb，辅助气10arb，毛细管加热温度：300℃，加热温度350℃，扫描方式：全扫；扫描范围m/z100～1500；裂解方式HCD；
进一步，步骤b中，设置流速为0.4min,检测波长为203nm,进样量为10μL,柱温控制在30℃；
进一步，步骤c中，全扫的分辨率70,000，二级质谱分辨率17,500，常规碰撞能量为30，并以50%递增；
本发明还公开一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法的应用，采用所述检测方法快速鉴定滇重楼皂甙的组成。
本发明的有益效果：采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱检测、并通过对已知重楼皂甙的质谱裂解规律的分析，建立了采用高分辨质谱仪对未知的滇重楼皂甙组成进行快速研究鉴定的技术方法，具有分辨率高、质量精度高、灵敏度高、质量轴稳定性好、可有效提高滇重楼皂甙组成的分析通量和分析效果，对皂甙组分的识别效率高，同时定性和定量能力强，并且检测成本低廉，可以方便地为滇重楼人工种植的品种选育提供一种快速经济的品质鉴定技术。
具体实施方式
实施例一
a.样品提取:精密称取滇重楼样品0.2g用5ml甲醇溶解，超声提取30min,配成含滇重楼皂甙0.04g/ml的样品溶液，离心分离过0.2μm滤膜后测定；
b.液相色谱条件：
仪器：超高相液相色谱仪
色谱柱：C18柱(150×2.1mm,5μm)
流动相：A为水相：纯水，B为有机相：乙腈
梯度条件：
流速0.4mL/min，进样量：10μL，检测波长为203nm，柱温为30℃
c.质谱条件
仪器：四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱
质谱参数：离子化方式HESI（+），喷雾电压+3.2KV/-3.0KV,鞘气40arb，辅助气10arb，毛细管加热温度：300℃，加热温度350℃，扫描方式：全扫（分辨率70,000），二级质谱（分辨率17,500，常规碰撞能量：30，并以50%递增）；扫描范围m/z100～1500；裂解方式HCD）。二级质谱碎片采用高能碰撞诱导解离(HCD)方式获得，较常规的碰撞诱导解离CID能获得更多的低质量端碎片，对化合物的结构解析十分有用。
鉴定结果
采用液相高分辩质谱联机检测鉴定技术对滇重楼中未知甾体皂甙组成进行分析鉴定，共鉴定发现了滇重楼含有17种重楼皂甙、其中发现的3种新甾体皂甙还未有报道、5种为新发现的重楼皂甙组分。相关鉴定出的滇重楼皂甙组成如下表：
表1已鉴定出的滇重楼皂甙组分
其中1-4号为中国药典中列明的重楼皂甙组分；7、12、15、16、17为已有报道发现的重楼皂甙组分；5、13、14号为首次发现的重楼皂甙新组分；6、8、9、10、11为新发现的重楼皂甙新组成。
实施例二
a.样品提取:精密称取滇重楼样品0.2g用5ml甲醇溶解，超声提取30min,配成含滇重楼皂甙0.04g/ml的样品溶液，离心分离过0.2μm滤膜后测定；
b.液相色谱条件：
仪器：超高相液相色谱仪
色谱柱：C18柱(150×2.1mm,5μm)
流动相：A为水相：纯水，B为有机相：乙腈
梯度条件：
流速为0.1min,检测波长为190nm,进样量为2μL,柱温控制在20℃；
c.质谱条件
仪器：四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱
质谱参数：离子化方式HESI（+），喷雾电压+3.2KV/-3.0KV,鞘气40arb，辅助气10arb，毛细管加热温度：300℃，加热温度350℃，扫描方式：全扫（分辨率70,000），二级质谱（分辨率17,500，常规碰撞能量：30、50%递增）；扫描范围m/z100～1500；裂解方式HCD）。
本实施例的检测发现了滇重楼含有17种重楼皂甙、其中发现的3种新甾体皂甙还未有报道、5种为新发现的重楼皂甙组分，但效果较例一差。
实施例三
a.样品提取:精密称取滇重楼样品0.2g用5ml甲醇溶解，超声提取30min,配成含滇重楼皂甙0.04g/ml的样品溶液，离心分离过0.2μm滤膜后测定；
b.液相色谱条件：
仪器：超高相液相色谱仪
色谱柱：C18柱(150×2.1mm,5μm)
流动相：A为水相：纯水，B为有机相：乙腈
梯度条件：
流速为0.8min,检测波长为210nm,进样量为20μL,柱温控制在45℃。
c.质谱条件
仪器：四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱
质谱参数：离子化方式HESI（+），喷雾电压+3.2KV/-3.0KV,鞘气40arb，辅助气10arb，毛细管加热温度：300℃，加热温度350℃，扫描方式：全扫（分辨率70,000），二级质谱（分辨率17,500，常规碰撞能量：30，并以50%递增）；扫描范围m/z100～1500；裂解方式HCD）。
本实施例的检测发现了滇重楼含有17种重楼皂甙、其中发现的3种新甾体皂甙还未有报道、5种为新发现的重楼皂甙组分，但效果与例二相近。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.样品提取：称取适量滇重楼样品用甲醇超声提取离心分离过微孔滤膜,制得样品溶液；
b.采用C18色谱柱：150×2.1mm,5μm，以水和乙腈为流动相，进行梯度洗脱，梯度洗脱比例为0～2min，水为95体积份，乙腈为5体积份；2～5min，水为95→75体积份，乙腈为5→25体积份；5～20min，水为75→67体积份，乙腈为25→33体积份；20～45min，水为67→50体积份，乙腈为33→50体积份；45～52min，水为50→5体积份，乙腈为50→95体积份；设置流速为0.1～0.8min,检测波长为190～210nm,进样量为2～20μL,柱温控制在20～45℃；
c.采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析，采用四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱分析，质谱条件为：离子化方式HESI（+），喷雾电压+3.2KV/-3.0KV,鞘气40arb，辅助气10arb，毛细管加热温度：300℃，加热温度350℃，扫描方式：全扫；扫描范围m/z100～1500；裂解方式HCD。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法，其特征在于：步骤b中，设置流速为0.4min,检测波长为203nm,进样量为10μL,柱温控制在30℃。
3.根据权利要求2所述的快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法，其特征在于：步骤c中，全扫的分辨率70,000，二级质谱分辨率17,500，常规碰撞能量为30，并以50%递增。
4.根据权利要求1-3任一所述的快速鉴定滇重楼皂甙组成的检测方法的应用，其特征在于：采用所述检测方法快速鉴定滇重楼皂甙的组成。
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