CN102302420A - 红参皂苷Rg2组和Rh1组、制备方法及在制备抗皮肤老化化妆品中的应用 - Google Patents

红参皂苷Rg2组和Rh1组、制备方法及在制备抗皮肤老化化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种红参皂苷Rg2组和Rh1组、制备方法及在制备抗皮肤老化化妆品中的应用。是用人参根中提取的不含皂苷、含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物，与人参皂苷Re反应制备由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的红参混合皂苷Rg2组，与人参皂苷Rg1反应制备由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3组成的红参混合皂苷Rh1组。红参混合皂苷Rg2组和Rh1组与皂苷Rg2单体和皂苷Rh1单体相比，其促进皮肤纤维芽细胞胶原蛋白合成功能明显提高，对皮肤、人体更安全，副作用更少。

Description

红参皂苷Rg2组和Rh1组、制备方法及在制备抗皮肤老化化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及对人体和皮肤很安全的：由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6等四种组成的Rg2组混合皂苷，由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3等四种组成的Rh1组混合皂苷及制备方法；所制备的红参稀有皂苷Rg2组和Rh1组混合皂苷，具有促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成功能，与其他化妆品主料混合，可制备抗皮肤老化的化妆品。 
背景技术
随着年龄的增长真皮中胶原蛋白的量会逐渐减少（年轻人真皮组织的胶原蛋白含量一般占90%以上），又由于皮肤经常暴露于外界，紫外线光老化的皮肤与正常皮肤相比，其胶原蛋白的量也明显减少。胶原蛋白的减少使皮肤厚度相应变薄，皮肤所形成的网眼状结构从而变的脆弱、老化，出现皮肤皱纹、松懈、暗淡、色素沉淀等现象。 
为了防止真皮内胶原蛋白的减少而带来种种皮肤形态的变化，有的使用维生素A或维生素A酸衍生物等作为胶原蛋白合成的促进剂，促进胶原蛋白的合成，以维持真皮中胶原蛋白的含量。但是，这些物质本身不稳定且对皮肤具有很强的刺激性。也有的采用特殊的制剂制成抗老化化妆品（日专利公开号15-292420、15-081737），但价格昂贵，普通消费者难以接受。此外，还有用维生素C和其衍生物等促进皮肤胶原蛋白的合成，但色泽持久性和稳定性很差，应用受到限制。还有发明专利ZL2004100336979的抗皮肤老化化妆品及生产方法中，酶解的低糖基白头翁皂苷、Rg2和Rh1单体等促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成，可用于抗皮肤老化的化妆品。 
人参皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4、Rg6等四种及人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4、Rk3等四种是红参中存在的红参稀有皂苷。红参加工过程中白参的Re皂苷在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20(S)-Rg2和20(R)-Rg2皂苷，进一步20(S)-Rg2和20(R)-Rg2皂苷的20-碳上的羟基脱水组成顺反结构的Rg6和Rg4皂苷，形成Rg2组皂苷。同样，红参加工过程中白参的Rg1皂苷在人参自身酶与其他物质的作用下转化为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4皂苷，形成Rh1组皂苷（发明专利ZL 200510136799.8：高活性红参的制作方法）。但是从红参中分离提取由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4、Rg6等四种皂苷组成的Rg2组皂苷，分离提取由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4等四种皂苷组成的Rh1组皂苷，难度大，迄今为止没有相关报道。 
发明内容
本发明是从参根中提取含有人参自身皂苷酶和其他水溶性物质的提取物（不含皂苷、简称人参自身酶及水溶性物质的提取物），与人参皂苷Re反应，可制备由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的Rg2组皂苷；与人参皂苷Rg1反应，可制备由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3、Rh4组成的Rh1组皂苷，所制备的红参稀有皂苷Rg2组和Rh1组混合皂苷，具有促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成功能，与其他化妆品主料混合，可制备抗皮肤老化的化妆品。 
本发明的技术解决方案是：一种红参皂苷Rg2组和Rh1组，其特征在于：所述红参皂苷Rg2组是由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的混合皂苷；所述红参皂苷Rh1组是由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3组成的混合皂苷。 
一种上述红参皂苷Rg2组和Rh1组的制备方法，其特征在于按如下步骤进行： 
a. 人参根（以干物计算）中加入6~10倍的65~80%乙醇，50~75℃提取皂苷，重复2~3次；提取皂苷后的滤渣中再加入（以干物计算）6~10倍水，60~80℃提取人参自身酶及水溶性物质，重复2~3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65℃以下减压浓缩、得到波美58~62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；
b. 向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入人参皂苷Re或人参皂苷Rg1，所述人参皂苷Re或Rg1与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是1：0.1-20，所述人参皂苷Re或人参皂苷Rg1的反应浓度为0.1~10%；反应后分离皂苷。
所述b步骤的反应过程中还加有有机酸（乳酸、醋酸或者柠檬酸等），有机酸的加入量为反应体积的0.01~50%。 
一种上述红参皂苷Rg2组和Rh1组在制备抗皮肤老化化妆品中的应用。 
本发明工艺方法简单，可从人参根中提取由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的混合皂苷Rg2组及由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3组成的混合皂苷Rh1组。混合皂苷Rg2组和Rh1组与皂苷Rg2单体和皂苷Rh1单体相比，其促进皮肤纤维芽细胞胶原蛋白合成功能明显提高，对皮肤、人体更安全，副作用更少。 
附图说明
图1是本发明实施例1Rg2组HPLC检测图谱。 
图2是本发明实施例1Rg2组进行UPLC-Q/TOF检测图谱。 
图3是本发明实施例1Rg2组进行UPLC-Q/TOF检测，ESI+正模式下总离子流图谱。 
图4是本发明实施例1Rg2组进行UPLC-Q/TOF检测，ESI-负模式下总离子流图谱。 
图5是本发明实施例1Rg2组中第一峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图6是本发明实施例1Rg2组中第二峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图7是本发明实施例1Rg2组中第三峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图8是本发明实施例1Rg2组中第四峰的离子峰在ESI+正模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图9是本发明实施例1Rg2组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图10是本发明实施例1Rg2组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图11是本发明实施例1Rg2组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图12是本发明实施例1Rg2组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图13是本发明实施例2Rh1组HPLC检测图谱。 
图14、15是本发明实施例2Rh1组进行UPLC-Q/TOF检测图谱。 
图16是本发明实施例2Rh1组中第一峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图17是本发明实施例2Rh1组中第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图18是本发明实施例2Rh1组中第三峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
图19是本发明实施例2Rh1组中第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析的质谱图。 
具体实施方式
实施例1： 
用人参自身酶及水溶性物质的提取物转化人参皂苷Re制备红参稀有皂苷Rg2组的制备：
人参根中含有自身的人参皂苷酶（C Zhang, H Yu, Y Bao, L An, F Jin（金凤燮）： Chem. Pharm. Bull ., 2001， 49(7), 795-798.；  Process BioChem .,2002, 37, 793-798.）。本发明提取人参根中的人参自身酶及水溶性物质的提取物，与人参皂苷Re反应，得到20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6单体皂苷比例与红参中的皂苷比例相当的Rg2组混合皂苷。 
1、人参自身酶及水溶性物质的提取物的制备： 
新鲜人参3.5公斤（相当于1公斤干参）切成2毫米厚的片，加入8升的95%的乙醇，在50-60℃提取人参皂苷6小时，分离提取液；其渣中再加入8升的70-75%的乙醇提取，共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75℃以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60℃以下减压浓缩至波美60度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg2组和Rh1组红参皂苷的制备。
也可以用生晒干燥人参：切成2毫米厚片的1公斤生晒干燥人参中，加入8升的70-75%的乙醇，在50℃提取人参皂苷6小时；同样方法共提取3次；合并乙醇提取液，用于制备人参皂苷。人参皂苷提取过的渣中加入8升水，在75℃以下提取6小时，同样方法共提取3次；合并提取液，品温在60℃以下减压浓缩至波美60度，离心除渣、得到200-300毫升人参自身酶及水溶性物质的提取物，用于Rg2组和Rh1组红参皂苷的制备。 
几次试验，原料可以是人参、也可以是西洋参或者三七参的鲜参或者干参。人参根（以干物计算）中加入6-10倍的65-80%乙醇、在50-75℃提取皂苷，可重复3次；提取皂苷的渣中再加入干渣的6-10倍水在60-80℃提取，重复2-3次；所提取的水溶性物质，在品温65℃以下减压浓缩，均得到所需要的人参根的复合物酶及水溶性物质提取物。 
2、红参Rg2组的制备：50克的人参皂苷Re（可在市场上购买）加入于300毫升水中，研磨，再加入100毫升的上述人参自身酶及水溶性物质的提取物和600毫升的水，在80℃反应7小时，110℃灭酶0.5-1小时，几乎所有的人参皂苷Re转化为红参皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6。其反应液经1升的大孔树脂（HP-20大孔树脂，日本三菱公司产；或者AB-8大孔树脂，天津南开大学产）柱吸附皂苷，再用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脱皂苷，其洗脱液减压浓缩、干燥得36克的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6混合皂苷，即得Rg2组红参皂苷。 
Rg2组红参皂苷组成用高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）确认。 
1）Rg2组红参皂苷组成的确认： 
Rg2组红参皂苷测定的高效液相色谱仪，美国waters 2695仪器；检测器， Photodiode Array Detector Waters 2996；Knauer C18色谱柱（250mm×3mm）；流动相，乙腈（A）-水（B）；0~35min，19%A等度；35~55min，19%A~29%A线性梯度；55~65min，29%A~40%A线性梯度；65~95min，40%A~100%A线性梯度；进样量，10μL；柱温，35℃；体积流速，0.6mL/min；检测波长，203nm。
取上述Rg2组混合皂苷2毫克，溶解于1毫升的甲醇中，经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱（HPLC）检测结果，与标准品20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6皂苷比较，如图1所示。 
从图1中可以看到，与标准品皂苷项比较，Rg2组含有20(S)- Rg2、20(R)-Rg2、Rg4(F4)、Rg6四种皂苷，总含量90%以上，其峰面积比为 20(S)- Rg2：20(R)-Rg2：Rg4(F4)：Rg6 = 27：21：16：36。 
2）超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）核对Rg2组的四种皂苷： 
超高效液相色谱-质谱联用分析仪：UPLC-Q/TOF PremierTM  Micromass (Waters) 仪器；色谱柱：BEH shield RP18 (2.1×100mm，1.7μm，Waters)。超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用检测在UPLC-Q/TOF PremierTM  Micromass (Waters) 仪器完成。ESI源，正、负离子模式下，“V”模式下进行检测。
超高效液相色谱（UPLC）检测条件：流动相为（A）0.1%甲酸-乙腈——（B）0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0~5min，5%A~95%A线性梯度，5~10min，95%A等度。进样量，10μL；流速，0.5 mL/min；柱温，30℃；检测波长，203nm。 
四级时间飞行串联质谱（Q/TOF）检测条件：毛细管电压，2.5kv；样品孔电压，35v；离子源温度，100℃；脱溶剂气温度，350℃；锥孔气流速，50L/hr；脱溶剂气流速，1000L/hr；质量扫描范围，100-1000Da。 
人参皂苷20(S)- Rg2和20(R)-Rg2的分子式为C42H72O1，分子量为784；Rg4(F4)和Rg6的分子式为C42H70O12，分子量为766；Rg2组进行UPLC-Q/TOF检测，如图2、3、4所示。 
从图2、3、4中可以看出，有四个明显的紫外吸收峰，与Rg2组的HPLC检测图谱一致，分别为20(S)- Rg2、20(R)-Rg2、Rg4(F4)、Rg6的紫外吸收峰，其保留时间依次为2.86、2.90、3.49、3.55（min）。通过串联质谱（Q/TOF）检测，在正、负离子模式下总离子流图中的为20(S)- Rg2、20(R)-Rg2、Rg4(F4)、Rg6的保留时间依次为2.89、2.93、3.52、3.57（min），与UPLC紫外吸收峰保留时间一致。 
四种物质的总离子流峰一级质谱分析： 
a. Rg2组人参稀有皂苷在ESI+正模式下的一级质谱分析：
首先对Rg2组人参稀有皂苷中第一、第二峰的离子峰在ESI+模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图5、6所示。
20(S)和20(R)-Rg2的分子量为784。从图5、6中可以看出，在ESI+模式下，使第一、第二峰物质分子上加了一个H，形成了m/z为785的准分子离子峰，即[M+H]+。葡萄糖分子量为180，葡萄糖基的分子量为162，鼠李糖基的分子量为146。m/z767离子是m/z785离子峰失去一分子H2O产生的碎片，即[M-H2O+H]+ =784-18+1=767；m/z621离子是m/z785离子峰失去末端的鼠李糖基，再失去一分子H2O产生的碎片，即[M-Rha-H2O+H]+=784-146-18+1=621；m/z459离子是在m/z785离子峰失去一个鼠李糖基的基础上再失一个葡萄糖基和一分子H2O产生的碎片，即[M-Glc-Rha-H2O+H]+=784-146-162-18+1=459；m/z441、m/z423、m/z405离子为m/z459碎片再依次失去一分子H2O所产生的碎片。由此可以确认第一、第二峰物质是20(S)-Rg2、20(R)-Rg2物质。 
再对Rg2组人参稀有皂苷中第三、第四峰的离子峰在ESI+模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱，如图7、8所示。 
Rg4和Rg6的分子量为766。从图7、8中可以看出，在ESI+模式下，使第三、第四峰物质分子上加了一个H，形成了m/z为767.5的准分子离子峰，即[M+H]+；m/z785.5离子峰归属于ESI+模式下形成的[M+H2O]+；m/z749.5离子是m/z767.5离子峰失去一分子H2O所产生的碎片；m/z621是m/z767离子峰失去末端的鼠李糖基产生的碎片；m/z 587为在m/z767离子峰失去末端鼠李糖基的基础上再失一分子H2O产生的碎片；m/z 441为在m/z767离子峰失去一个鼠李糖基的基础上再失去一个葡萄糖基和一分子H2O所产生的碎片；m/z 423和m/z405离子是m/z441碎片再依次失去一分子H2O所产生的碎片。由此可以确认第三、第四峰物质是Rg4和Rg6物质。 
b. Rg2组皂苷在ESI-负模式下的一级质谱分析 
在负离子模式下，由于流动相中加入了甲酸，所以样品的一级质谱能得到[M+HCOOH]—离子峰。首先对Rg2组人参稀有皂苷中第一、第二峰的离子峰在ESI-模式下进行一级质谱分析，如图9、10所示。
20(S)、20(R)-Rg2的分子量为784，从图9、10中可以看出，在ESI-模式下，形成[第一、第二峰物质分子+HCOOH]—离子峰，HCOOH分子量为46，而负离子模式下又减少一个H，所以Rg2通过Q/TOF得到离子峰m/z 829，其丢失一-HCOOH后生成核离子m/z 783。故可判断，样品中含有20(S)-Rg2和20(R)-Rg2，其分子量为784。 
再对Rg2组人参稀有皂苷中第三、第四峰的离子峰在ESI-模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图11、12所示。 
Rg4和Rg6的分子量为766，从图11、12中可以看出，在ESI-模式下，形成[第三、第四峰物质分子+HCOOH]—离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以Rg4和Rg6得到离子峰m/z 811，其丢失一甲基后生成核离子m/z 765。故可判断，样品中含有Rg4和Rg6，其分子量为766。 
由此，与标准品的20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6比对，再进行超高效液相色谱-质谱联用法的确认，Rg2组混合物皂苷由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成；四种皂苷总含量90%以上，总皂苷中的20(S)- Rg2和20(R)-Rg2的含量比例为30-70%。皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6的结构式为： 
Figure RE-271735DEST_PATH_IMAGE001
20(S)-Rg2                              20(R)-Rg2   
   Rg4（F4）                           Rg6                     。
实施例2： 
用实施例1制得的人参自身酶及水溶性物质的提取物，转化人参皂苷Rg1制备Rh1组的制备：50克的人参皂苷Rg1（可在市场上购买）加入于300毫升水中，研磨，再加入100毫升实施例1制得的人参自身酶及水溶性物质的提取物和600毫升的水，在80-110℃反应20-2小时，几乎所有的人参皂苷Rg1转化为红参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4。其反应液经1升的大孔树脂（HP-20大孔树脂，日本三菱公司产；或者AB-8大孔树脂，天津南开大学产）柱吸附皂苷，用8升的水洗掉未吸附的糖和渣；再用6升的75-80%乙醇洗脱皂苷，其洗脱液减压浓缩、干燥得30克的20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3混合皂苷，即Rh1组混合皂苷。
上述反应中，人参皂苷Rg1的反应浓度0.1-10%，人参皂苷Rg1与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1~20倍，反应温度70-120℃，均得到良好的效果。 
1、Rh1组红参皂苷组成的确认： 
Rh1组红参皂苷测定的高效液相色谱仪，美国waters 2695仪器；检测器， Photodiode Array Detector Waters 2996；Knauer C18色谱柱（250mm×3mm）；流动相，乙腈（A）-水（B）；0~35min，19%A等度；35~55min，19%A~29%A线性梯度；55~65min，29%A~40%A线性梯度；65~95min，40%A~100%A线性梯度；进样量，10μL；柱温，35℃；体积流速，0.6mL/min；检测波长，203nm。
取上述Rh1组红参皂苷2毫克溶解于1毫升的甲醇中，经0.45μm滤膜过滤，高效液相色谱（HPLC）检测，与标准品20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4皂苷比较，如图13所示。 
从图13中可以看到，Rh1组由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4皂苷所组成，四种皂苷含量90%以上，四种皂苷的含量比（峰面积）比为27:22:18:33。 
2、超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）核对Rh1组的四种皂苷： 
超高效液相色谱-质谱联用分析仪：UPLC-Q/TOF PremierTM  Micromass (Waters) 仪器；色谱柱：BEH shield RP18 (2.1×100mm，1.7μm，Waters)。超高效液相色谱-四级杆串联质谱联用检测在UPLC-Q/TOF PremierTM  Micromass (Waters) 仪器完成。ESI源，正、负离子模式下，“V”模式下进行检测。
超高效液相色谱（UPLC）检测条件：流动相为（A）0.1%甲酸-乙腈——（B）0.1%甲酸-水；梯度洗脱：0~5min，5%A~95%A线性梯度，5~10min，95%A等度。进样量，10μL；流速，0.5 mL/min；柱温，30℃；检测波长，203nm。 
四级时间飞行串联质谱（Q/TOF）检测条件：毛细管电压，2.5kv；样品孔电压，35v；离子源温度，100℃；脱溶剂气温度，350℃；锥孔气流速，50L/hr；脱溶剂气流速，1000L/hr；质量扫描范围，100-1000Da。 
红参皂苷20(S)-Rh1和20(R)-Rh1的分子式为C36H62O9，分子量为638；Rh4（F4）和Rk3的分子式为C36H60O8，分子量为620。 
所得到的对Rh1组样品进行UPLC-Q/TOF检测，得到的图谱如图14、15所示。 
从图14、15中可以看出，Rh1组有四个明显的紫外吸收峰，和Rh1组的HPLC检测图谱一致，其保留时间依次为2.92、2.98、3.64、3.71（min）；通过串联质谱（Q/TOF）检测， Rh1组样品的总离子流图中ESI正负模式下有四个明显的峰，保留时间依次为2.95、3.02、3.68、3.74（min），与UPLC紫外吸收峰保留时间一致。因此，可进行对总离子流峰进行一级质谱分析。 
首先对Rh1组人参稀有皂苷中第一、第二峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图16、17所示。 
20(S)-Rh1、20(R)-Rh1的分子量为638；从图16、17中可以看出，在ESI-负模式下形成[第一、第二峰物质分子+HCOOH]—离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以样品Rh1通过Q/TOF得到的离子峰m/z 683，故可判断，样品中含有20(S)-Rh1和20(R)-Rh1，分子量为638。 
再对Rh1组人参稀有皂苷中第三、第四峰的离子峰在ESI-负模式下进行一级质谱分析，得到的一级质谱如图18、19所示。 
Rk3和Rh4的分子量为620；从图18、19中可以看出，在ESI-负模式下形成[第三、第四峰物质分子+HCOOH]—离子峰，而负离子模式下又减少一个H，所以Rk3和Rh4得到的离子峰m/z 665。故可判断，样品中含有Rk3和Rh4，其分子量为620。在ESI+正模式下得到同样的结果。 
以上，Rh1组由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4皂苷所组成；经超高效液相色谱-质谱联用法（UPLC-Q/TOF）核对，Rh1组中含有20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4四种皂苷，四种皂苷总含量90%以上，Rh1组总皂苷中的20(S)-Rh1和20(R)-Rh1含量比例为30~75%。其结构式为： 
Figure RE-869386DEST_PATH_IMAGE003
Figure RE-119102DEST_PATH_IMAGE004
            。
实施例3： 
人参自身酶及水溶性物质的提取物加入有机酸，可提高转化Re制备Rg2组混合皂苷的效果。
5克人参皂苷Re加入于22毫升水，研磨，再加入3毫升实施例1的人参自身酶及水溶性物质的提取物，加入25毫升乳酸，在70℃反应2小时，用300毫升水稀释，经100毫升的大孔树脂柱上反复吸附皂苷，用水洗渣，再用400毫升的70%乙醇洗脱，减压浓缩、干燥得到3.4克的由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的Rg2组混合皂苷。Rg2组混合皂苷经HPLC检测，其组成与实施例1的Rg2组混合皂苷组成相似。 
上述反应中，人参皂苷Re反应浓度0.1-10%，人参皂苷Re与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍；所用的有机酸是乳酸、醋酸或柠檬酸，有机酸的加量为反应体积的0.01-50%；反应温度60-90℃条件下，均得到良好的效果。 
实施例4： 
人参自身酶及水溶性物质的提取物加入有机酸，可提高转化Rg1可制备由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4组成的Rh1组混合皂苷的效果。
5克人参皂苷Rg1加入于25毫升水，研磨，再加入5毫升实施例1的人参自身酶及水溶性物质的提取物，加入15毫升醋酸，在80℃反应3小时，用300毫升水稀释，经100毫升的大孔树脂柱上反复吸附皂苷，用水洗渣，再用400毫升的70%乙醇洗脱，减压浓缩、干燥得到2.9克的由20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rk3和Rh4组成的Rh1组混合皂苷。Rh1组混合皂苷经HPLC检测，其组成与实施例2的Rh1组混合皂苷组成相似。 
上述反应中，人参皂苷Rg1反应浓度0.1-10%，人参皂苷Rg1与人参自身酶及水溶性物质的提取物（人参根干品原料计算）的反应比例（重量）是1：0.1-20倍；所用的有机酸是乳酸、醋酸或柠檬酸，有机酸的加量为反应体积的0.01-50%；反应温度60-90℃条件下，均得到良好的效果。 
实验例： 
实施例1的Rg2组、实施例2的Rh1组红参皂苷促进纤维芽细胞的胶原蛋白合成的测定：
将人体皮肤纤维芽细胞接种于含有5%的小牛的血清（FBS）的DMEM培养基上，分放于96孔板中、培养24小时后，换成含有规定浓度样品（实施例1、2的Rg2组、Rh1组混合皂苷，Rg2和Rh1的单体皂苷）的5%FBS的DMEM培养基上培养，参比为使用50μΜ的抗坏血酸磷酸镁进行。用含样品的培养基培养48小时以后，测定总蛋白和胶原蛋白含量。总蛋白质的量用0.1%的Triton X-100溶液将细胞破碎溶解后，采用Lowry法测定。胶原蛋白含量和胶原蛋白标准曲线用ELISA抗体法测定。培养好的上清加入到强吸附SUMILON MULTI  WELL PLATE H TYPE plate（日本住友产品），在4℃过夜，加入1%的小牛血清蛋白（BSA）溶液37℃下保持1小时；加入用0.3%的BSA溶液稀释过的人胶原蛋白抗体（Anti-HumanCollagen Type l antibody，Rabbit）做在37℃反应1小时的第一次抗体反应；二次抗体用0.3%的BSA溶液稀释100倍的PO（Rabbit）抗体在37℃条件下反应1小时；再用0.3mg/ml 浓度的2、2偶氮（3-乙基联苯胺-6-磺酸）二铵盐 [2，2-Azinobis-（3-ethylbenzoline-6-sulfonic acid）diammouium salt（ABTS）]（溶解在0.1Μ，pH4.0的磷酸-柠檬酸缓冲液），反应20分钟，测定405nm波长的吸光值。以上实施例的胶原蛋白合成能力的测定：培养基中的胶原蛋白的量由相同方法所测得的标准曲线查得。通过ELISA所测定培养基中的胶原蛋白的量除以由Lowry法测定总蛋白质量，就可以计算出细胞所生成的胶原蛋白的产生量。胶原蛋白的产生量为：
胶原蛋白的产生量=培养基中的胶原蛋白（ng/well）/总蛋白(mg/well)
胶原蛋白合成能力，未加样品的细胞的胶原蛋白的合成量定为100，计算加入Rg2组混合皂苷、Rh1组混合皂苷的细胞的胶原蛋白的合成量（%）。试验结果：红参皂苷Rg2组、Rh1组混合皂苷、Rg2和Rh1单体皂苷的促进人体皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成结果，由表1表示。
  
表1  红参皂苷Rg2组、Rh1组混合物、Rg2和Rh1单体对纤维芽细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成的促进作用（n=6）
Figure RE-430608DEST_PATH_IMAGE005
上表中PC：50μΜ的抗坏血酸磷酸镁盐
从表1中可以看到，红参皂苷Rg2组、Rh1组混合皂苷明显促进皮肤纤维芽细胞Ⅰ型的胶原蛋白合成，Rg2组混合皂苷优于Rg2单体皂苷；Rh1组混合皂苷优于Rh1单体皂苷；可用于皮肤抗老化化妆品。
实施例5： 
红参皂苷Rg2组、Rh1组混合皂苷，明显促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成，Rg2组混合皂苷优于Rg2单体皂苷；Rh1组混合皂苷优于Rh1单体皂苷；可用于皮肤抗老化化妆品。
化妆品配方1： 
（A）
红参皂苷Rg2组混合皂苷                                  2.0%
精制加氢大豆磷脂                                              0.5%
肉蔻酸甘油酯butyl myristate pentastearate         3.0%
Selachyl alcohol   鲛类多醇                                2.0%
软脂酸十六烷                                                      4.0%
精制橄榄角鲨烷                                                 10.0%
3乙基己酸甘油酯Triethylhexanoin                   8.0%
鲸醋酸                                                                 6.0%
苯甲酸甲酯                                                         0.2%
（B）
甘油                                                                    3.0%
Xanthan gum微生物胶2%的水溶液               10.0%
苯甲酸甲酯                                                       0.2%
精制水                                                               51.1%
制备：将A、B分别加热到80℃，均一溶解，在混合器中将A边搅拌边加入B进行乳化后，边搅拌边冷却至35℃即可。
化妆品配方2： 
（A）
红参皂苷Rh1组混合皂苷                               0. 1%
硬脂酸甘油                                                      5.0%
P O E（25） 聚氧乙基醚                               1.5%
3癸酸甘油酯                                                  7.0%
鲸醋酸                                                             5.0%
羟苯甲酸丙酯                                                 0.2%
（B）
1，3—丁二醇                                                1.5%
苯甲酸甲酯                                                    0.2%
精制水                                                          59.3%
（C）
Xanthan gum2%的水溶液                               10.0%        
EDTA二钠                                                      0.2%
精制水                                                            10.0%
制备方法：将A、B分别加热到80℃均一溶解，将B溶解边加入到A乳化后，边搅拌边冷却到50℃时添加C，冷却至35℃即可。
化妆品配方3： 
（A）
红参皂苷Rg2组                                  0. 1 %
红参皂苷Rh1组                                  0.1 %
P O E（40）硬化蓖麻油                     1. 5 %
1，3—丁二醇                                     5. 0 %
一缩二丙二醇                                     5. 0 %
苯甲酸甲酯                                         0. 2 %
（B）
Chamomilla recutita花浸出物             0. 2 %
透明质酸钠 1%水溶液                       5. 0 %
精制水                                                 82. 9 %
制备方法：将A 在 70℃下加热到均一溶解，B在室温下混合均匀。在室温下边搅拌A边逐步加入B，溶化即可。
[0080] 化妆品配方4： 
（A）
红参皂苷Rg2组                                                   1. 0 %
红参皂苷Rh1组                                                   1.0 %
精制加氢大豆磷脂                                                1.0%
精制橄榄角鲨烷                                                   10.0%
季戊四醇基四乙基己酸Pentaerythrityl Tetraethylhexanoate    6.0%
羟苯甲酸丙脂                                 0.2%
（B）
丙烯酸酯/C10-C30 丙烯酸盐（Acrylates/C10-C30 Alkyl Acrylate Crosspolymer）                    15%。

Claims (4)

1.一种红参皂苷Rg2组和Rh1组，其特征在于：所述红参皂苷Rg2组是由红参稀有皂苷20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg4和Rg6组成的混合皂苷；所述红参皂苷Rh1组是由红参稀有皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4和Rk3组成的混合皂苷。
2.一种如权利要求1所述红参皂苷Rg2组和Rh1组的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
a. 人参根（以干物计算）中加入6~10倍的65~80%乙醇，50~75℃提取皂苷，重复2~3次；提取皂苷后的滤渣中再加入（以干物计算）6~10倍水，60~80℃提取人参自身酶及水溶性物质，重复2~3次；将所提取的人参自身酶及水溶性物质在品温65℃以下减压浓缩、得到波美58~62度的提取液，既为人参自身酶及水溶性物质的提取物；
b. 向所得人参自身酶及水溶性物质的提取物中加入人参皂苷Re或人参皂苷Rg1，所述人参皂苷Re或Rg1与人参自身酶及水溶性物质的提取物的重量比是1：0.1~20，所述人参皂苷Re或人参皂苷Rg1的反应浓度为0.1~10%；反应后分离皂苷。
3.根据权利要求2所述红参皂苷Rg2组和Rh1组的制备方法，其特征在于所述b步骤的反应过程中还加有有机酸，有机酸的加入量为反应体积的0.01~50%。
4.一种如权利要求1所述红参皂苷Rg2组和Rh1组在制备抗皮肤老化化妆品中的应用。
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