WO2014178682A1 - 진세노사이드 rh4를 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

진세노사이드 rh4를 함유하는 피부 외용제 조성물 Download PDF

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WO2014178682A1
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skin
ginsenoside
external
formulation example
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김동현
류권렬
이옥찬
염명훈
조준철
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주식회사 아모레퍼시픽
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Definitions

  • the present invention relates to an external composition for skin containing ginsenoside Rh4, and more particularly, by containing ginsenoside Rh4, skin anti-aging effect, skin moisturizing effect, anti-inflammatory effect, acne, etc.
  • skin anti-aging effect skin moisturizing effect
  • anti-inflammatory effect acne, etc.
  • scalp and hair condition improvement effects such as anti-dandruff effect, hair growth effect and anti-white hair effect. It relates to a composition which can be done.
  • Human skin is the body's primary protective barrier, which protects the body's organs from changes in temperature and humidity, and from external environmental stimuli such as ultraviolet rays and pollutants. Undergo a change. That is, internally, the secretion of various hormones that regulate metabolism decreases, and the function of immune cells and the activity of cells decreases, thereby reducing the biosynthesis of immune proteins and constituent proteins necessary for living organisms.
  • free radicals and free radicals increase, thereby reducing the thickness of the skin, increasing wrinkles, reducing elasticity, Skin color becomes dull, skin problems frequently occur, blemishes, freckles and blotch also increase, the color becomes worse and the skin tone becomes darker.
  • the skin condition is improved by adding bioactive substances obtained from various known animals, plants, and microorganisms to cosmetics.
  • Efforts have been made, and research and development of cosmetics using ginseng (Panax ginseng C. A Meyer) in particular has been conducted.
  • Ginseng has been widely used in cosmetic compositions since its efficacy in the skin has been proven early, and ginseng root or leaf extract, ginseng saponin (ginsenoside), ginseng aglycon and ginseng polysaccharides have been used.
  • the cosmetics containing such ginseng extract, extract, polysaccharides, etc. contain a very small amount of the active substance has a disadvantage that the effect is not significantly superior to other raw materials.
  • the present inventors can provide ginsenoside Rh4 contained in ginseng to provide anti-aging, skin wrinkle improvement, whitening, and moisturizing effect as well as to improve acne and skin troubles, and to improve skin color, sebum control, and pores. It has been found that the present invention can provide a skin condition improvement effect such as a contraction effect, and can also provide a scalp and hair condition improvement effect such as anti-dandruff, hair growth, and white hair prevention.
  • an object of the present invention to provide an external preparation composition for skin containing ginsenoside Rh4 which can improve the overall condition of the skin.
  • the present invention provides an external composition for skin containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anti-aging skin external composition comprising ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a whitening skin external composition containing ginsenoside Rh4.
  • the present invention also provides a moisturizing skin external composition comprising ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention provides a topical composition for improving acne containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a skin external composition for improving color and skin tone containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a topical skin composition for reducing pores containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a skin external composition for controlling sebum containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a topical anti-dandruff composition containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for external application for hair growth comprising ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing skin whitening containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • the present invention also provides an external composition for skin using ginsenoside Rh4 as a natural preservative.
  • composition of the present invention by containing ginsenoside Rh4, through the excellent antioxidant power, anti-aging effect, skin moisturizing effect, anti-inflammatory effect, skin trouble improvement effect such as acne, whitening effect, sebum control effect, pore contraction effect, blood circulation
  • skin trouble improvement effect such as acne, whitening effect, sebum control effect, pore contraction effect, blood circulation
  • an effect of improving the scalp and hair condition such as an anti-dandruff effect, a hair growth effect and a white hair prevention effect.
  • the external preparation composition for skin according to the present invention contains ginsenoside Rh4 as an active ingredient.
  • Ginsenoside Rh4 used in the present invention has a structure of Formula 1 below.
  • Ginseng belongs to the genus Ginseng of Araliace and is a herbaceous plant as a perennial ring-negative root. It is produced in many parts of the world, including Korea, China, Japan, and the United States, and is mainly cultivated at 85-140 degrees east, 22-49 degrees north latitude, 70-97 degrees west latitude, and 34-47 degrees north latitude in North America. As described above, ginseng produced in different parts of the world is different in its composition, and ginseng saponin, which is the most important ginsenoside, is used in Korean ginseng to represent various physiological and pharmacological effects of ginseng.
  • ginsenosides About 34 kinds have been isolated so far, and the pharmacological efficacy differs depending on the type of sugars bound to the aglycone, the number of the sugars bound thereto, or the binding sites thereof. According to the structural characteristics, it is divided into diols, triols and oleanes. In addition, it contains panacen, a polyacetylene compound, a polyphenol compound, flavonoids and vitamins, which are inherent fragrance components of ginseng.
  • Ginseng has long been recognized for its efficacy and has been used for the treatment of various diseases.
  • the herbal efficacy of ginseng is known to improve stamina, improve metabolism, relieve stress, treat diabetes, improve respiratory diseases, improve digestive system, and anti-cancer activity.
  • ginseng has anti-complement activity, anti-ulcer activity, immune boosting effect, It has been reported to have anticancer action and hypoglycemic action.
  • Skin-related effects include anti-inflammatory activity (Korean J. Dermatol. 18 (1): 39-42 (1980), Korean J. Dermatol. 14 (4): 335-339 (1976)), prevention of hyperkeratosis (Korean J. Dermatol. Dermatol.
  • Ginsenoside Rh4 of the present invention may be extracted from plants, synthesized according to methods known in the art, and may be commercially available.
  • derivatives obtained by addition or substitution reaction of substituents commonly performed in the art with the ginsenoside Rh4 derivatives showing skin, hair improvement effect and antiseptic effect are included in the scope of the present invention. It is clear to those skilled in the art in consideration of this.
  • Ginsenoside Rh4 used in the present invention can be obtained especially from ginseng extract.
  • the type of ginseng used at this time is not particularly limited, and ginseng, red ginseng, white ginseng, taeguksam, misam and the like can be used.
  • the ginseng extract is contained not only in the leachate obtained by leaching and transferring from ginseng, but also in the concentrate obtained by partially or fully concentrating the leachate, or in stagnation, whole, regular, liquid extract and ginseng prepared by drying the concentrate again.
  • the chemicals that exert the main effect include all of the plant itself, and extracts from all parts of ginseng, such as stems, roots, leaves, flowers, fruits, can be used and are not limited to extracts of any particular part.
  • a method for extracting ginsenoside Rh4 from ginseng extract may use a known method.
  • the ginsenoside Rh4 may be isolated from ginseng extract prepared by water or an organic solvent by a method well known in the art in ginseng.
  • the organic solvent used in the present invention may be selected from the group consisting of ethanol, methanol, butanol, ether, ethyl acetate, chloroform and a mixed solvent of these organic solvents and water, and preferably 80% ethanol is used.
  • the extraction temperature is preferably 10 ⁇ 80 °C, it can be extracted for 3 to 24 hours. If the extraction temperature and extraction time is out of the extraction efficiency may decrease or change of components may occur.
  • composition according to the present invention may contain ginsenoside Rh4 in an amount of 0.001 to 50% by weight, preferably 0.01 to 30% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight, based on the total weight of the composition. If the content of the ginsenoside Rh4 is less than 0.001% by weight, the efficacy and effect by the above components are insignificant.
  • the composition of the present invention containing ginsenoside Rh4 can be used as an anti-aging skin external preparation composition by providing excellent antioxidant power, which enhances skin elasticity and improves wrinkles. Excellent effect to let
  • composition of the present invention can be used as a composition for whitening, which can provide an excellent whitening effect by inhibiting tyrosinase activity and inhibiting melanin production.
  • composition of the present invention can be used as a moisturizing skin external preparation composition, which can enhance skin barrier function and induce differentiation of skin keratinocytes. Therefore, it can be usefully used as an external composition for skin to prevent or improve dry skin, contact dermatitis or psoriasis caused by incomplete epidermal differentiation.
  • composition of the present invention can be used as an external preparation composition for improving acne, which is excellent in antibacterial effect, in particular, antibacterial effect against acne causing bacteria, and also provides an anti-inflammatory effect.
  • composition of the present invention can be used as an external skin composition for improving color and skin tone, and when applied to the skin, it smoothly supplies nutrients to the skin by promoting capillaries and promotes blood circulation and inhibits skin aging to improve color and skin tone. The effect is excellent.
  • the composition of the present invention can be used as a skin external preparation composition for pore reduction, sebum control and skin trouble improvement, which suppresses excessive secretion of sebum when applied to the skin, and reduces pores by promoting free radical removal and collagen synthesis.
  • the effect of suppressing skin problems is excellent by reducing the expression of inflammatory factors.
  • composition of the present invention can be used as an anti-dandruff skin external composition, which effectively discharges toxins accumulated in the hair and scalp to cleanse the scalp, inhibit the growth and growth of dandruff bacteria, and prevent the scalp inflammatory reaction, and also active It has an excellent antioxidant effect that inhibits the production and action of oxygen, so it can provide the effect of calming and strengthening the scalp and strengthening its natural defense.
  • composition of the present invention can be used as a skin external preparation composition for hair growth, which can promote the growth of hair and prevent hair loss by promoting the transition from the resting hair cycle to the growing hair cycle.
  • composition of the present invention can be used as a topical anti-skin composition for white hair, which can significantly increase the expression of MITF in melanocytes, inhibit white hair and promote the induction of black hair.
  • ginsenoside Rh4 used in the external preparation composition for skin of the present invention can provide an effect as a natural preservative.
  • the external preparation composition for skin of the present invention described above may be formulated as a cosmetic composition, and may be formulated containing a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base.
  • a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base for example emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) and non-obtained by dispersing an oil phase in solution, gels, solids, pasty anhydrous products, aqueous phases.
  • It may be provided in the form of an ionic vesicle dispersant or in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick. It may also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
  • topical skin composition of the present invention when used for the prevention of dandruff, hair growth or white hair, it may be formulated as a composition for scalp and hair, and the formulation is not particularly limited, for example, hair tonic, hair nourishing cosmetics, scalp It can be formulated as a treatment, hair treatment, hair shampoo, hair rinse, hair lotion or scalp hair combination treatment and the like.
  • the composition according to the present invention is a fatty substance, an organic solvent, a dissolving agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, an ionic or nonionic.
  • a fatty substance an organic solvent, a dissolving agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, an ionic or nonionic.
  • adjuvants conventionally used in the
  • composition of the present invention may contain a skin absorption promoting substance to increase the skin improving effect.
  • test examples and formulation examples are provided only for the purpose of illustration to help the understanding of the present invention is not limited to the scope and scope of the present invention by the following examples.
  • Ginsenoside Rh4 for testing the efficacy of the composition of the present invention was purchased from Ambo laboratory.
  • the keratinocytes (keratinocyte) isolated from the skin tissue of the person into a 5 ⁇ 10 4 are in each well of a 24-well plate was attached for 24 hours. After 16 hours, ginsenoside Rh4 was treated with 1%. At this time, the control group was not treated with ginsenoside Rh4 for comparison. After 2 hours, the culture solution was removed, and 100 ⁇ l of phosphate buffered saline (PBS) was added to each well. The keratinocytes were irradiated with UV 30mJ / cm 2 using an ultraviolet B (UVB) lamp (Model: K5T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki, Japan), and then PBS was removed and each cell was treated with keratinocyte culture solution 200.
  • UVB ultraviolet B
  • ginsenoside Rh4 according to the present invention effectively inhibits the production of ROS known to cause skin cell damage by ultraviolet rays and ROS to a level higher than that when the amount of ROS after ultraviolet stimulation is not irradiated with ultraviolet rays. It can be seen that the antioxidant effect is very excellent by inhibiting the production of. Therefore, it was confirmed that ginsenoside Rh4 according to the present invention can prevent pores from widening by inhibiting oxidation and preventing aging, and can improve skin trouble by defending generation of skin irritation.
  • the inhibition of elastase activity of ginsenoside Rh4 was measured in comparison with EGCG.
  • the elastase and substrate used were purchased commercially from Sigma-Aldrich, USA (Cat. No. E0127).
  • Elastase activity inhibitory activity was tested by the following test method.
  • Ginsenoside Rh4 200 ⁇ L
  • 50 ⁇ L of 20 ⁇ g / mL elastase type III solution were mixed in a 96 mg plate prepared with 10 mg / L Tris-HCL buffer (pH 8.0).
  • 250 ⁇ M of EGCG was used as a positive control and distilled water was used as a non-treated group as a negative control.
  • 100 ⁇ L of 0.4514 mg / mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE prepared with the above buffer was added and reacted at 25 ° C for 15 minutes. After completion of the reaction, the absorbance at a wavelength of 415 nm was measured. A blank test was performed in the same manner to correct.
  • Equation 1 Calculation method of the elastase activity inhibitory activity is shown in Equation 1 below, the results are shown in Table 2 below.
  • the degree of suppressing the elastase activity of ginsenoside Rh4 was significantly higher than that of EGCG, which is known as an elastase inhibitor, and the effect of inhibiting the elastase activity of ginsenoside Rh4 of the present invention was It can be confirmed that excellent.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Media
  • fetal calf serum 2.5% fetal calf serum. Incubated in a CO 2 5%, 37 °C incubator until the growth of about 80%.
  • Ginsenoside Rh4 or retinoic acid was treated at a concentration of 10 ⁇ g / ml for 24 hours, followed by cell culture.
  • the degree of collagenase production of cell cultures was measured using a commercially available collagenase measuring instrument (Amersham Pharmacia, USA, Catalog #: RPN 2610).
  • the cell culture solution collected in a 96-well plate uniformly coated with primary collagenase antibody was placed in an incubator for 3 hours.
  • the chromophore-bound secondary collagen antibody was placed in a 96-well plate and reacted for another 15 minutes.
  • 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (sigma) a color-causing substance, was added to induce color development for 15 minutes at room temperature. When the color reaction was stopped, the color of the reaction solution became yellow, and the degree of yellow was different according to the progress of the reaction.
  • the absorbance of the yellow 96-well plate was measured at 405 nm using an absorbance meter, and the degree of synthesis of collagenase was calculated by Equation 2 below, and the results are shown in Table 3 below. Indicated. At this time, the reaction absorbance of the cell culture liquid collected from the group not treated with the composition was used as a control.
  • ginsenoside Rh4 of the present invention inhibits the substrate metalloprotease (MMP-1), it can be confirmed that it has an anti-aging effect by reducing collagen degradation in the skin.
  • MMP-1 substrate metalloprotease
  • Nutritional cream was prepared in a conventional manner according to the composition of Table 4 (unit: wt%).
  • Formulation Example 1 containing the ginsenoside Rh4 of the present invention was further increased skin elasticity compared to the group to which Comparative Formulation Example 1 was applied.
  • composition containing ginsenoside Rh4 of the present invention is very effective for improving skin elasticity.
  • Formulation Example 1 and Comparative Formulation Example 1 were used to confirm the effect of improving wrinkles in humans by the composition of the present invention.
  • R2 Divide the wrinkle contours by 5 spaces, and then average the R1 values
  • R3 The highest value among the R1 values divided by five
  • R4 The mean value of the baseline of the fold contour minus the top and valley values of each angle
  • Tyrosinase enzyme was extracted from the mushroom (Mushroom) was used as the Sigma (SIGMA). First, the substrate tyrosine was dissolved in distilled water to make a solution of 0.3 mg / ml, and the solution was added to the test tube by 1.0 ml. Then, 1.0 ml of potassium-phosphate buffer solution (0.1 mol concentration, pH 6.8) and 0.7 ml of distilled water were added thereto. Added.
  • 0.2 ml of the sample solution prepared by mixing ginsenoside Rh4 of the present invention in an appropriate concentration in an ethanol solution was added to the reaction solution and reacted for 10 minutes in a 37 ° C thermostat.
  • the control group was prepared by adding only 0.2 ml of solvent instead of each sample solution, and ascorbic acid was used as a positive control group.
  • 0.1 ml of a tyrosinase solution of 2500 units / ml was added to the reaction solution and reacted for 10 minutes in a 37 ° C thermostat.
  • the reaction tube containing the reaction solution was quenched in ice water to stop the reaction, and the absorbance at wavelength 475 nm was measured with a photospectrometer.
  • Table 7 Each tyrosinase inhibitory effect was calculated by the following equation.
  • the cells were washed with 1N NaOH and absorbed at 405 nm.
  • the cells without test substance were used as a control group, and the degree of inhibition of melanin production of each test substance was measured by comparing with the melanin content of the control group. According to Equation 4, the melanin production inhibition rate is calculated and the results are shown in Table 8.
  • Formulation Example 1 In order to measure the effect of ginsenoside Rh4 on the increase in skin moisturizing power, Formulation Example 1 and Comparative Formulation Example 1 were used, and evaluated as follows.
  • the amount of CE (Cornified Envelop) generated during the differentiation of keratinocytes was measured using absorbance.
  • the keratinocytes of humans isolated from the epidermis of the newborn were cultured and attached to the bottom of the culture flask, and then treated with 5 ppm concentration of ginsenoside Rh4 in the culture medium. Incubate for 5 days until growth. At this time, the low calcium (0.03mM) treated group and the high calcium (1.2mM) treated group were used as negative and positive controls, respectively. Then, the cultured cells were harvested and washed with PBS (Phosphate buffered saline), and then 10 mM Tris-HCl buffer containing 2% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 20 mM DTT (Dithiothreitol).
  • PBS Phosphate buffered saline
  • LDPI Laser Doppler Perfusion Imager
  • the cosmetic composition according to the present invention significantly increased the skin blood flow than Comparative Formulation Example 1 containing no ginsenoside Rh4, it was confirmed that the blood color is improved through the blood circulation. . This ultimately suggests that the cosmetic composition containing ginsenoside Rh4 according to the present invention can contribute effectively to the skin's nutrient delivery, inhibit skin aging and delay.
  • Comparative Formulation Example 1 containing no ginsenoside Rh4 according to the present invention showed no significant skin tone improvement, whereas Formulation Example 1 containing ginsenoside Rh4 as an active ingredient was used more than before use. It was confirmed that a lot of later skin tone was improved.
  • Ginsenoside Rh4 according to the present invention was measured by comparing collagen biosynthesis promoting effect with TGF- ⁇ . First, fibroblasts were seeded by 10 5 per hole in 24 wells and cultured until 90% growth. This was incubated in serum-free DMEM medium for 24 hours, and then treated with 10 g / ml of ginsenoside Rh4 and TGF- ⁇ of the present invention dissolved in serum-free medium, and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours. These supernatants were removed and procollagen increased or decreased using procollagen type I ELISA kit (procollagen type (I)). The results are shown in Table 15, and the synthesis ability of collagen was compared with the non-treated group as 100.
  • ginsenoside Rh4 according to the present invention was confirmed to exhibit a higher level of collagen synthesis than the positive control group TGF- ⁇ . Therefore, it was confirmed that ginsenoside Rh4 according to the present invention can reduce the enlarged pores by increasing the amount of collagen production around the pores.
  • Comparative Formulation Example 1 does not have a pore reduction effect, but in the case of Formulation Example 1 shows a pore reduction effect that can be visually confirmed, ginsenoside Rh4 according to the present invention reduces the size of the pores It was found that the effect was excellent.
  • HEK293 cells were transfected with p3 ⁇ FLAG-CMV-5 ⁇ R2 and cultured in a 24 well plate at 2.5 ⁇ 10 5 cells per well (Park et al., 2003, JDS. Vol. 31, pp. 191-98). The next day, a new medium with enzyme substrate and inhibitor was added. 0.05 ⁇ Ci [ 14 C] testosterone (Amersham Pharmacia biotech, UK) was used as the substrate of the medium.
  • ginsenoside Rh4 was added and incubated for 2 hours at 37 ° C and 5% CO 2 incubator. At this time, the ginsenoside Rh4 was used as a negative control group, the pinasteride was used as a positive control group. Thereafter, the culture medium was collected, the steroid was extracted with 800 ⁇ l ethyl acetate, the organic solvent layer was separated, dried, and the remaining residue was dissolved in 50 ⁇ l ethyl acetate. The silica plastic sheet kieselgel 60 F254 ) was developed using ethyl acetate-hexane (1: 1) as a solvent.
  • 5 ⁇ -reductase which converts testosterone into dihydrotestosterone, binds to a receptor protein in the cytoplasm, enters the nucleus, activates sebaceous gland cells, promotes differentiation, and hypersecretes sebum in sebaceous glands.
  • ginsenoside Rh4 effectively inhibits the activity of blocking the conversion of testosterone to dihydrotestosterone, and it was shown to have a superior inhibitory effect than finasteride known to inhibit the activity of 5 ⁇ -reductase. Accordingly, it was confirmed that ginsenoside Rh4 can suppress sebum hypersecretion by effectively inhibiting the activity of 5 ⁇ -reductase.
  • Formulation Example 3 and Comparative Formulation Examples 3 to 4 were prepared according to the ingredients and the contents (% by weight) shown in Table 19 below. Specifically, Formulation Example 3 is a formulation of ginsenoside Rh4, Comparative Formulation Example 3 does not contain any active ingredients for improving acne skin, Comparative Formulation Example 4 is a standard to be used as a reference for antimicrobial activity It contains erythromycin, which is widely used as an acne treatment.
  • the preparation method of Formulation Example 3 and Comparative Formulation Examples 3-4 is as follows.
  • the components of phase A in Table 19 were completely dissolved and the components of phase B were completely dissolved in a separate dissolution bath, followed by solubilization by adding phase B to phase A.
  • the components of phase C were added thereto according to the blending ratios described in Table 19 to homogenize the mixture and then filtered to prepare the compositions.
  • Antibacterial activity was tested against propionibacterium acnes (ATCC 6919: Medium-BHI broth), which is an acne-causing strain, with each cosmetic composition prepared in the formulation of Formulation Example 3 and Comparative Formulation Examples 3-4. .
  • the antibacterial test method for acne bacteria was as follows.
  • Propionibacterium acnes was used as a culture broth inoculated in BHI broth and anaerobic culture.
  • test bacteria 0.15 ml of the test bacteria was added to 15 ml of BHI broth (pH 6.8) or LB broth (pH 4.5) and mixed well as a dilution solution.
  • the antimicrobial activity test results for acne bacteria are shown in Table 20 below. MIC is expressed in terms of the concentration of the active ingredient contained in the formulation.
  • 3T3-L1 cells a mouse fibroblast cell line
  • DMEM Dulbecco's modified eagle's medium, GIBCO BRL, Life Technologes
  • FBS fetal bovine serum
  • the well culture plate was attached at 1 ⁇ 10 5 cells / well. After 2 days, it was again exchanged with fresh DMEM (containing 10% FBS) medium and incubated for 2 days. The cultured cells were then induced to differentiate with DMEM (containing 10% FBS) containing 1 ⁇ g / ml insulin, 0.5 mM IBMX and 0.25 ⁇ M dexamethasone, and ginsenoside Rh4 and caffeine. After 2 days of treatment 50 ⁇ M was exchanged for DMEM containing insulin and incubated for 5 days. After 5 days, the cells were exchanged with normal medium (DMEM, containing 10% FBS) and cultured while observing until the cells changed to fat cells.
  • DMEM normal medium
  • ginsenoside Rh4 used in the present invention is not only a small amount of fat accumulated in adipocytes, but also has a superior lipid synthesis inhibitory effect than caffeine, a known lipid synthesis inhibitor. have. Therefore, sebum is reduced by inhibiting lipid synthesis, thereby suppressing the occurrence of acne.
  • Formulation Example 3 did not recur acne compared to Comparative Formulation Example 3, it can be seen that there is an excellent effect on the overall acne improvement.
  • Comparative Formulation Example 4 containing an antimicrobial activity standard shows an acne improvement effect, but in use, the skin irritation seems to be unsuitable for long-term use due to the strong skin irritation, the composition according to the present invention does not have a stimulus for long-term use Even appeared to be appropriate.
  • normal human skin keratinocytes (NHEK, obtained from Lonza) were dispensed in 96-well plates at 5x10 4 cells / well, and then in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator. Incubated for 24 hours. After 24 hours, the cells were washed twice with PBS and changed to serum-free keratinocyte basement media (KBM). Each well was treated with ginsenoside Rh4 according to the concentration of Table 23 for 30 minutes, followed by PGSA (10 ⁇ g / ml), PGSA (50 ⁇ g / ml), and PGSA (50 ⁇ g / ml) + LPS (1). [Mu] g / ml) was treated respectively.
  • PGSA peptidoglycan from S. aureus
  • PGSA peptidoglycan from Staphylococcus aureus
  • LPS lypopolysaccaride
  • - Gram-negative bacteria
  • the topical skin composition of the present invention can provide an excellent anti-inflammatory effect by significantly reducing the secretion of IL-8 increased by PGSA and LPS.
  • the keratinocytes (Cell name: HaCaT obtained from ATCC) were dispensed into 96 well plates at 4x10 4 cells / well, followed by incubation for 24 hours in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator. It was. After 24 hours, wash 96 well plates twice with Hanks'Balanced Salt solution (HBSS) buffer, and then add reaction buffer (2 ⁇ M Fluo-4-AM, 20% pluronic acid, 2.5 mM probenecid) to the cells. gave. After reaction at 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 30 minutes, and at room temperature for 30 minutes, the cells were washed twice with HBSS buffer and treated with ginsenoside Rh4 at a concentration (%) as shown in Table 24 below.
  • HBSS Hanks'Balanced Salt solution
  • Inhibition rate (%) for the cellular influx of calcium ions compared to the difference between the minimum value and the maximum value when treated with 2 U / ml trypsin or 5 ⁇ M PAR-2 active peptide (SLIGKV) is shown in Table 24 below.
  • the external preparation composition for skin containing ginsenoside Rh4 of the present invention can provide an excellent antipruritic effect by effectively inhibiting PAR-2 activity causing itching.
  • a shampoo in the composition of Table 25 To prepare a shampoo in the composition of Table 25. Specifically, the surfactant and ethylene glycol distearate are added to purified water, heated to 80 ° C., uniformly dissolved, and then slowly cooled to 40 ° C. under stirring, and the active ingredient and preservative according to the present invention are added to the mixture. A viscosity modifier, a perfume, and a hair conditioner were added and mixed, followed by cooling to room temperature under stirring.
  • Example 4 containing ginsenoside Rh4 shows a better effect in preventing scalp itch.
  • the keratin proteins that make up hair are produced in hair root keratinocytes, which are differentiated from dermal papilla cells.
  • a rat immortalized dermal papilla cell (DP6) cell line was used in the present invention (Wendy Filsell, Journal of Cell Science 107, 1761-1772 (1994)).
  • This dermal papilla cell line was cultured by microdissection from the hair roots of male PVG rat whiskers and cultured with DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) containing 10% FBS (Fetal bovine serum).
  • ginsenoside Rh4 increases the growth of dermal papilla cells, which can be confirmed to increase significantly in a concentration-dependent manner.
  • Hair loss treatment of minoxidil is known as mitochondrial potential potassium ion channel openers (K ATP channel opener), a representative drug used in the treatment of androgenetic alopecia.
  • K ATP channel opener mitochondrial potential potassium ion channel openers
  • To evaluate the mechanism of minoxidil the treatment of toltamide (SIGMA AlDRICH, T0891), which blocks the K ATP channel in fibroblasts constituting the dermis of the scalp, inhibits cell proliferation, and then opens potassium ion channels to allow cell proliferation. A recovering test method was used.
  • a mouse embryonic fibroblast cell line (NIH3T3) cell line was used.
  • the cell line is a cell line in which the fibroblast cell line isolated from NIH Swiss mouse embryo was naturally immortalized by 3T3 protocol.
  • the cell line was incubated in DMEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) containing 10% FBS for 24 hours in an incubator maintained at 5% CO 2 , 37 °C.
  • NIH3T3 was placed in a 96-well plate and incubated in a 37 ° C.
  • ginsenoside Rh4 promotes melanin synthesis of melanocytes, the melanin production is increased, showing an excellent melanin production promoting effect.
  • ginsenoside Rh4 increases the expression of MITF and tyrosinase protein in melanocytes.
  • Staphylococcus aureus, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa strains used in the experiment were tested on Tryptic Soy Broth.
  • Candida albicans and Aspergillus niger strains were cultured in Sabouraud Dextrose Broth. Incubate 1/100 (Candida albicans) in each medium The strain was diluted 1/10) was used as the test bacteria.
  • Aspergillus niger used a spore suspension prepared to be 2 ⁇ 10 8 cfu / ml as the test cell solution.
  • test bacteria 0.15 ml of the test bacteria was added to 15 ml of each medium, and a well mixed solution was used as a diluting solution.
  • 16 ⁇ l of the sample was added to the first row of a 96 well plate, and 184 ⁇ l of the diluted solution was added thereto. The remaining wells were added with 100 ⁇ l of dilution solution. After mixing well the mixture of the first row, 100 ⁇ l was taken in the second row, mixed well, and then diluted 100 times by taking 100 ⁇ l again in the third row.
  • Staphylococcus aureus Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, in a 32 C thermostat, Candida albicans, Aspergillus niger niger) was incubated in a 25 °C thermostat.
  • ginsenoside Rh4 exhibits antimicrobial activity against various strains, through which it can be predicted that ginsenoside Rh4 can act as a natural preservative or antimicrobial agent in the composition.

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Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rh4를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 진세노사이드 Rh4를 함유함으로써 우수한 항산화력을 통하여 피부 노화 방지 효과, 피부 보습력 개선 효과, 항염 효과, 여드름 및 등의 피부 트러블 개선 효과, 미백 효과, 피지 조절 효과, 모공 수축 효과, 혈행 개선을 통한 안색 개선 등의 전반적인 피부 상태 개선 효과뿐만 아니라 비듬 방지 효과, 육모 효과 및 백모 방지 효과 등의 두피 및 모발 상태 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

진세노사이드 RH4를 함유하는 피부 외용제 조성물
본 발명은 진세노사이드 Rh4를 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 진세노사이드 Rh4를 함유함으로써 우수한 항산화력을 통하여 피부 노화 방지 효과, 피부 보습력 개선 효과, 항염 효과, 여드름 등의 피부 트러블 개선 효과, 미백 효과, 피지 조절 효과, 모공 수축 효과, 혈행 개선을 통한 안색 개선 등의 전반적인 피부 상태 개선 효과뿐만 아니라 비듬 방지 효과, 육모 효과 및 백모 방지 효과 등의 두피 및 모발 상태 개선 효과를 제공할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
인간의 피부는 인체의 일차 방어막으로서 온도 및 습도의 변화, 자외선, 공해물질과 같은 외부 환경의 자극으로부터 체내의 기관을 보호해 주는 기능을 하며, 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하고, 혈색이 나빠지고 피부톤도 어두워지는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.
이러한 피부 내적 및 외적 요인에 의한 피부 상태의 변화를 방지하고, 건강한 피부 상태를 유지하기 위해서 기존에 알려진 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부 상태를 개선시키기 위한 노력이 있어 왔으며, 특히 인삼(Panax ginseng C. A Meyer) 성분을 이용한 화장료의 연구개발이 다수 이루어졌다. 인삼은 피부에 있어 그 효능이 일찍이 입증되어 화장료 조성물에 널리 사용되어 왔으며, 인삼의 뿌리 또는 잎의 추출물, 인삼 사포닌(ginsenoside), 인삼 어글리콘(aglycon) 및 인삼 다당체들이 사용되어졌다. 그러나 이러한 인삼추출물, 엑기스, 다당체 등을 함유한 화장료들은 그 활성 물질이 극미량 함유되어 있어 다른 원료들에 비해 그 효과가 확연히 뛰어나지 않은 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 인삼에 함유되어 있는 진세노사이드 Rh4가 항노화, 피부 주름 개선, 미백, 보습 개선 효과 뿐만 아니라 여드름 및 피부 트러블의 개선 효과도 제공할 수 있으며 피부 혈색 개선의 효과, 피지 조절, 모공 수축 효과 등의 피부 상태 개선 효과를 제공할 수 있고, 또한 비듬 방지, 육모 및 백모 방지 등의 두피 및 모발 상태 개선 효과를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 진세노사이드 Rh4를 함유하여 피부의 전반적인 상태를 개선시킬 수 있는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 함유하는 미백용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 보습용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 여드름 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 혈색 및 피부톤 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 모공 축소용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피지 조절용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 비듬 방지용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 육모용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 백모 방지용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 진세노사이드 Rh4를 천연 방부제로 사용하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 진세노사이드 Rh4를 함유함으로써 우수한 항산화력을 통하여 피부 노화 방지 효과, 피부 보습력 개선 효과, 항염 효과, 여드름 등의 피부 트러블 개선 효과, 미백 효과, 피지 조절 효과, 모공 수축 효과, 혈행 개선을 통한 안색 개선 등의 전반적인 피부 상태 개선 효과뿐만 아니라 비듬 방지 효과, 육모 효과 및 백모 방지 효과 등의 두피 및 모발 상태 개선 효과를 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유한다.
본 발명에서 사용되는 진세노사이드 Rh4는 하기 화학식 1의 구조를 가진다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2014003954-appb-I000001
인삼은 오가피나무과(Araliace)의 인삼속에 속하고, 다년생 반지음성 숙근초로서 초본식물이다. 한국, 중국, 일본 및 미국 등 세계 여러 곳에서 생산되며 동아시아에서는 동경 85-140도, 북위 22-49도, 북미주에서는 서경 70-97도, 북위 34-47도에서 주로 재배된다. 이와 같이 세계 각지에서 생산되는 인삼은 그 성분에 차이가 있으며 인삼의 여러 생리학적, 약리학적 효능을 나타내는데 가장 중요한 진세노사이드라고 하는 인삼 사포닌(saponin)은 한국산 인삼에 가장 많이 포함되어 있다. 진세노사이드는 지금까지 약 34종이 분리되었으며, 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합 위치에 따라 약리 효능이 각각 다르다. 구조적 특징에 따라 디올계, 트리올계 및 올레안(oleanane)계로 구분된다. 이밖에도 인삼 고유의 향기 성분인 파나센(panacen), 폴리아세틸렌 화합물, 폴리페놀 화합물, 플라보노이드 및 비타민 등이 함유되어 있다.
인삼은 예로부터 한방적으로 그 효능이 인정되어 다양한 질환의 치료에 사용되었다. 인삼의 한방적 효능으로는 체력증진, 신진대사 개선, 스트레스 해소, 당뇨병 치료, 호흡기 질환 개선, 소화기관 개선 및 항암작용이 알려져 있고, 최근 연구에서 인삼은 항보체 활성, 항궤양작용, 면역증강, 항암작용 및 혈당 강하작용이 있는 것으로 보고되고 있다. 피부와 관련된 효능으로는 소염작용(Korean J. Dermatol. 18(1):39-42(1980), Korean J. Dermatol. 14(4):335-339(1976)), 과각화방지(Korean J. Dermatol. 28(4):434-440(1990)), 여드름 예방 및 치료(Korean J. Dermatol. 30(1):27-33(1992), Korean J. Dermatol. 28(4):434-440(1990)), 항산화 효과(Proceedings of the 2nd international ginseng symposium 13-17(1978)), 탄력성 및 수화성 증가(Fitoterapia 57(1):15-28(1986), Fitoterapia 57(4) 217-222(1986)), 상처치유(Brit. J. Pharmacol. 125:255-262(1998), Arch. pharm. res. 25(1):71-76(2002)), 콜라겐 분해 억제(Mol. Cells 9(5):476-483(1999)), 미백효과(Journal of the society of cosmetic scientists of korea 27(2):45-56(2001)) 등이 연구 발표되었다.
본 발명의 진세노사이드 Rh4는 식물에서 추출될 수도 있고, 당업계에 공지된 방법에 따라 합성하여 사용할 수도 있으며, 상업적으로 시판되는 것을 사용할 수도 있다. 또한 상기 진세노사이드 Rh4를 당업계에서 통상적으로 실시되는 치환기의 부가 또는 치환 반응을 하여 얻어지는 유도체 중 피부, 모발 개선효과 및 방부효과를 나타내는 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다는 것은 당업계의 기술수준을 고려하여 당업자에 명확하다.
본 발명에서 사용되는 진세노사이드 Rh4는 특히 인삼 추출물에서 수득할 수 있다. 이 때 사용되는 인삼의 종류는 특히 제한되지 않고, 수삼, 홍삼, 백삼, 태극삼, 미삼 등을 사용할 수 있다. 또한 상기 인삼 추출물은 인삼으로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액 뿐 아니라 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물 또는 상기의 농축물을 다시 건조시켜 제조한 침체, 전제, 정기, 유동엑기스 및 인삼 중에 함유되어 주 효과를 발휘하는 화학 물질은 물론 식물 그 자체를 모두 포함하며, 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매 등 인삼의 모든 부분으로부터의 추출물이 사용가능하고 어느 특정 부분의 추출물로 한정되지 않는다. 또한 인삼 추출물로부터 진세노사이드 Rh4를 추출하는 방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.
구체적으로 상기 진세노사이드 Rh4는 인삼에서 당업계에 잘 알려진 방법으로 물 또는 유기용매로 인삼 추출물을 제조한 후, 이로부터 분리할 수 있다. 본 발명에 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용한다. 이때, 추출온도는 10~80℃가 바람직하며, 3~24시간 동안 추출할 수 있다. 상기 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 진세노사이드 Rh4를 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%, 바람직하게는 0.01~30중량%, 보다 바람직하게는 0.1~10중량%의 양으로 함유할 수 있다. 상기 진세노사이드 Rh4의 함량이 0.001중량% 미만이면 상기 성분에 의한 효능, 효과가 미약하고, 50중량%를 초과하면 피부 안전성 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.
진세노사이드 Rh4는 우수한 항산화력을 가지는 성분이므로, 진세노사이드 Rh4를 함유하는 본 발명의 조성물은 우수한 항산화력을 제공함으로써 항노화용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 효과가 뛰어나다.
본 발명의 조성물은 미백용 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 티로시나제 활성을 저해하고 멜라닌의 생성을 억제함으로써 우수한 미백 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 보습용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 장벽 기능을 강화시키고 피부 각질형성세포의 분화를 유도시킬 수 있다. 따라서 표피 분화의 불완전함으로 생기는 피부건조증, 접촉성 피부염 또는 건선 등을 예방 또는 개선하는 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 여드름 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 항균 효과, 특히 여드름 원인균에 대한 항균 효과가 우수하고, 또한 항염 효과를 제공한다.
본 발명의 조성물은 혈색 및 피부톤 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부에 적용 시 모세혈관을 확장시키고 혈액순환을 촉진시킴으로써 피부에 영양분을 원활하게 공급하고 피부 노화를 억제시켜 혈색 및 피부톤 개선 효과가 탁월하다.
본 발명의 조성물은 모공 축소, 피지 조절 및 피부 트러블 개선용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부에 적용 시 과잉으로 분비되는 피지를 억제하고, 활성 산소 제거와 콜라겐 합성을 촉진함으로써 모공을 축소시키며, 염증 인자의 발현 감소로 피부 트러블을 억제하는 효과가 탁월하다. 또한, 우수한 항산화력으로 인해 피부 자극의 생성을 방어할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비듬 방지용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 모발과 두피에 축적된 독소를 효과적으로 배출하여 두피를 정화하고, 비듬균의 증식과 성장을 억제하여 두피염증반응을 예방할 수 있으며, 또한 활성산소의 생성 및 작용을 억제하는 항산화 효능이 뛰어나 두피를 진정시키고 강화시키며 본연의 방어력을 강화시키는 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 육모용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 휴지기 모발주기의 성장기 모발주기로의 이행을 촉진시킴으로써 모발의 생장을 촉진하고, 탈모를 방지하는 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 백모 방지용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 멜라노사이트에서 MITF의 발현을 현저히 상승시켜 백모를 억제하며 흑모 유발을 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물에 사용되는 진세노사이드 Rh4는 천연 방부제로서의 효과를 제공할 수 있다.
상기한 본 발명의 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물로서 제형화될 수 있으며, 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
특히, 본 발명의 피부 외용제 조성물이 비듬 방지, 육모 또는 백모 방지용으로서 사용될 경우에는 두피 및 모발용 조성물로서 제형화될 수 있으며, 제형이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 헤어토닉, 모발 영양화장수, 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어로션 또는 두피 모발 겸용 트리트먼트 등으로 제형화될 수 있다.
또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.
이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 제형예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[참고예 1]
본 발명의 조성물의 효능을 실험하기 위한 진세노사이드 Rh4는 앰보연구소로부터 구입하여 사용하였다.
[시험예 1] 활성 산소종(ROS: reactive oxygen species) 생성 억제 효과
사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(keratinocyte)를 24웰 플레이트의 각 웰에 5×104개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 16시간 후, 진세노사이드 Rh4를 1%로 처리하였다. 이 때 비교를 위하여 대조군은 진세노사이드 Rh4를 처리하지 않았다. 2시간 뒤에 배양액을 제거한 후, 각 웰에 100㎕의 인산완충염액(PBS)을 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: K5T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki社, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 다음, PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액 200㎕를 첨가하였다. 여기에 진세노사이드 Y를 다시 처리하고 일정 시간대별로 자외선 자극에 의해 증가한 활성 산소종의 양을 정량하였다. ROS의 양은 ROS에 의해 산화되는 DCF-DA(dichlorofluorescin diacetate)의 형광을 측정하는 Tan의 방법을 참고하여 정량하였으며(Tan et al., 1998, J. Cell Biol. Vol. 141, pp1423-1432), 비히클만 처리한 대조군의 ROS에 대한 비율을 산출한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
시험물질 UVB 30 mJ/cm2 조사 후 경과된 시간
0hr 2hr 3hr
비히클 100 244 287
UVB + 비히클 100 325 381
UVB + 진세노사이드 Rh4 100 235 279
상기 표 1의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4는 자외선에 의해 피부 세포 손상을 일으키는 것으로 알려진 ROS의 생성을 효과적으로 억제하며 자외선 자극 후 ROS의 양이 자외선을 조사하지 않은 경우 이상의 수준으로 ROS의 생성을 억제하여 항산화 효능이 매우 뛰어남을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4가 산화를 억제하고 노화를 막음으로써 모공이 넓어지는 것을 예방할 수 있으며, 피부 자극의 생성을 방어함으로써 피부 트러블을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
[시험예 2] 엘라스타아제 활성 억제 효능 측정
진세노사이드 Rh4의 엘라스타아제 활성 저해능을 EGCG와 비교하여 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치 사로부터 상업적으로 구매하였다(Cat.No. E0127).
하기의 시험방법으로 엘라스타아제 활성 저해작용을 시험하였다.
96웰 플레이트에서 10mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)으로 조제한 것에 진세노사이드 Rh4(200μL) 및 20㎍/mL 엘라스타아제·타입 III 용액 50μL를 혼합하였다. EGCG 250μM은 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μL를 첨가하고, 25℃에서 15분 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다.
엘라스타아제 활성 저해작용의 계산방법은 하기 수학식 1과 같으며, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
수학식 1
Figure PCTKR2014003954-appb-M000001
A: 시험물질 무첨가, 효소 첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
B: 시험물질 무첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
C: 시험물질 첨가, 효소 첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
D: 시험물질 첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
표 2
화합물 억제정도(%)
비처리군 0
EGCG 65
진세노사이드 Rh4 77
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rh4의 엘라스타아제 활성 억제 정도가 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 EGCG 보다도 현저하게 우수한 것으로 나타나 본 발명의 진세노사이드 Rh4의 엘라스타아제 활성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[시험예 3] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능
본 발명의 진세노사이드 Rh4의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다.
2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO2 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 진세노사이드 Rh4 또는 레티노익산을 10㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.
상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.
노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.
수학식 2
Figure PCTKR2014003954-appb-M000002
표 3
화합물 발현정도(%)
비처리군 100
레티노익산 75
진세노사이드 Rh4 73
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rh4의 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 콜라게나아제 발현 저해 효과가 비슷한 수준임을 알 수 있다.
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 진세노사이드 Rh4는 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키며, 피부 내의 콜라겐 분해를 감소시켜 항노화 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
[제형예 1 및 비교제형예 1]
하기 표 4의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).
표 4
배합성분 제형예 1 비교제형예 1
정제수 To 100 To 100
진세노사이드 Rh4 0.1 -
식물성 경화유 1.50 1.50
스테아린산 0.60 0.60
글리세롤 스테아레이트 1.00 1.00
스테아릴 알코올 2.00 2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 &소디움 스테아로일 락틸에이트 1.00 1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드 1.00 1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드 2.00 2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜 1.50 1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드 11.00 11.00
사이클로메디콘 6.00 6.00
방부제, 향 적량 적량
트리에탄올 아민 0.1 0.1
[시험예 4] 피부 탄력 향상 효능 확인
사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1과 비교제형예 1의 제형으로 다음과 같이 평가하였다.
30~40대의 건강한 여성 20명을 각각 제형예 1과 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 표 5의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.
표 5
실험제품 피부탄력효과
제형예 1 0.38
비교제형예 1 0.10
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 진세노사이드 Rh4가 함유된 제형예 1은 비교제형예 1을 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가되었다.
따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rh4를 함유하는 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.
[시험예 5] 피부 주름 개선 효능 확인
본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1과 비교제형예 1을 이용하였다.
상기 제형예 1과 비교제형예 1의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 20명을 각각 제형예 1과 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.
표 6
사용 8주 후임상 결과 R1 R2 R3 R4 R5
제형예 1 0.14 0.13 0.09 0.02 0.01
비교제형예 1 0.27 0.26 0.21 0.03 0.03
R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값
R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값
R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값
상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1의 외용제 조성물은 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 알 수 있었다.
[시험예 6] 티로시나제 저해 효과
티로시나제 효소는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 티로신을 증류수에 용해시켜 0.3mg/ml의 용액으로 만들고 그 용액을 1.0ml씩 시험관에 넣은 다음, 여기에 포타슘-포스페이트 완충용액(0.1mol 농도, pH 6.8) 1.0ml 및 증류수 0.7ml를 첨가하였다.
본 발명의 진세노사이드 Rh4를 에탄올 용액에 적당한 농도로 혼합하여 준비한 시료액 0.2ml를 반응액에 넣은 다음 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군은 각 시료액 대신 용매만을 0.2ml 넣은 것으로 준비하였고, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 이 반응액에 2500유닛/ml의 티로시나제 용액 0.1ml씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음물 속에 넣어서 급냉시켜 반응을 중지시키고 광전분광분석계로 파장 475nm에서의 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 각각의 티로시나제 저해 효과는 하기 수학식 3으로 산출하였다.
수학식 3
Figure PCTKR2014003954-appb-M000003
표 7
시험물질 티로시나제 저해율(%)
대조군(무첨가) 0
아스코르브산 52
진세노사이드 Rh4 63
상기 표 7의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4의 티로시나제 억제율이 공지된 티로시나제 저해제인 아스코르브산보다 훨씬 높아 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.
[시험예 7] B16/F10 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과
진세노사이드 Rh4 및 코지산을 각각 0.1중량%로 함유한 시료를 시험물질로 하여 일정 농도로 B16/F10 멜라노마 세포(한국세포주은행)의 배양액에 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하고 1N NaOH로 세포를 녹여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 각 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하였다. 수학식 4에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하여 그 결과를 표 8에 나타내었다.
수학식 4
Figure PCTKR2014003954-appb-M000004
표 8
시험물질 멜라닌생성 저해율(%)
대조군(무첨가) 0
코지산 53
진세노사이드 Rh4 68
상기 표 8의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4의 멜라닌 생성 억제율이 공지된 멜라닌 생성 저해제인 코지산보다 훨씬 높아 미백 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.
[시험예 8] 피부 보습력 증가 효과 측정
진세노사이드 Rh4가 피부 보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 1 및 비교제형예 1을 이용하였고, 하기와 같이 평가하였다.
건조 피부로 분류된 40~50대 성인 남녀 20명을 각각 제형예 1 및 비교제형예 1의 2개 군에 대해 10명씩 2조로 나누어 영양크림을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점, 그리고 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 피부수분량측정기(Corneometer CM825, C+K Electronic Co., 독일)로 피부수분량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 표 9의 결과는 시험개시 직전에 측정한 피부 수분량 측정기 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.
표 9
시험군 수분 증가율 (%)
1주 경과 2주 경과 4주 경과 6주 경과
제형예 1 32 33 37 34
비교제형예 1 30 32 32 15
상기 표 9의 결과를 보면, 비교제형예 1을 도포한 경우에는 도포가 이루어진 4주까지는 약 30% 정도의 수분 증가율을 보이지만, 도포를 중지한 후에는 피부수분량이 감소하는 반면, 진세노사이드 Rh4를 함유한 제형예 1을 도포한 경우에는 도포를 중지한 후에도 30% 이상의 피부수분 증가율을 보임을 확인할 수 있다. 이를 통해 진세노사이드 Rh4를 함유한 본 발명의 조성물은 피부 보습력 효과가 우수함을 알 수 있다.
[시험예 9] 각질형성세포 분화 촉진 효과 측정
진세노사이드 Rh4의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.
먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 진세노사이드 Rh4를 배양액에 5ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리를 하고, 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
표 10
시험물질 각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03mM) 용액(음성 대조군) 100
고칼슘(1.2mM) 용액(양성 대조군) 210
진세노사이드 Rh4 285
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 진세노사이드 Rh4를 처리한 경우 각질 형성 세포의 분화 촉진 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
[시험예 10] 피부 장벽기능 회복 효과 측정
진세노사이드 Rh4가 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 성인 남녀 10명의 상박을 테이프 스트립핑(Tape Stripping) 방법을 이용하여 피부 장벽에 손상을 주고 각각 하기 표 11의 조성으로 제조한 제형예 2 및 비교제형예 2의 2개 군을 도포하면서 7일 동안 하루에 한번씩 경피수분손실량(TWEL)의 회복 정도를 Vapometer(Delfin, 핀란드)로 측정 비교하였다. 여기에서 비교제형예 2는 음성대조군으로서 비히클(vehicle)이다. 실험 결과는 하기 표 12에 나타내었다. 표 12의 결과는 장벽 손상 전과 장벽 손상 후의 처리전 차이를 100% 기준으로 하여 비교하였다.
표 11
배합성분 제형예 2 비교제형예 2
정제수 69 70
프로필렌글리콜 30 30
진세노사이드 Rh4 1 -
표 12
시험군 TWEL 변화 (%)
처리전 1일 2일 3일 4일 5일 6일
제형예 2 100 123.5 126.4 121.8 114.9 111.0 107.4
비교제형예 2 100 121.4 112.7 98.3 70.5 62.3 43.5
상기 표 12에서 알 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 Rh4를 함유하지 않은 비교제형예 2를 처리한 경우에는 시간이 지남에 따라 경피 수분 손실량이 점점 많아 지는 반면, 진세노사이드 Rh4를 함유하는 제형예 2를 처리할 경우에는 빠른 속도로 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오며 장벽 손상이 회복됨을 확인할 수 있다.
[시험예 11] 혈색 개선 효과
본 발명에 의한 화장료 조성물의 피부 혈액 순환 촉진 효과를 평가하기 위하여, LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)를 이용하여 피부에서의 혈액순환 정도를 측정하였다. LDPI는 피부에서의 혈액순환을 측정하는 기기로 널리 알려져 있고 현재 사용되고 있는 기기로서, 피부의 모세혈관에서 혈액의 속도 및 양 뿐만 아니라 소동맥과 소정맥에서의 흐름까지 측정해 낼 수 있는 매우 민감한 기기이다.
항온항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, LDPI를 이용하여 초기값을 측정하였다. 먼저 평소 손발이 차가운 여성 30명의 이마 아래 부분의 초기 혈류량을 LDPI로 측정하였다. 그런 다음 상기 제형예 1 및 비교제형예 1을 1주일 동안 피시험자들에게 사용하도록 한 후에 측정한 혈류량과 상기 초기 측정값을 비교한 결과(피부 혈류량 변화)를 하기 표 13에 나타내었다.
표 13 화장료 사용 전후 LDPI 결과-피부 혈류량
시험물질 1주 사용 후 피부 혈류량 변화율(%)
제형예 1 11
비교제형예 1 5
상기 표 13의 결과에서, 본 발명에 의한 화장료 조성물은 진세노사이드 Rh4를 함유하지 않은 비교제형예 1보다 피부 혈류량을 현저하게 증가시켰으며, 이러한 혈액 순환 촉진을 통해 혈색이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 궁극적으로 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4를 함유하는 화장료 조성물이 피부의 영양분을 효과적으로 전달하고 피부 노화를 억제하며 지연시키는 데 기여할 수 있음을 시사한다.
[시험예 12] 피부톤 개선 효과
상기 제형예 1 및 비교제형예 1의 피부톤 개선 효과를 알아보기 위하여 30명의 피험자에게 각각 사용(저녁 1회/일 도포, 총 1주간)하도록 한 후, Facial Stage DM-3(Moritex, Japan) 기기를 활용하여 피부톤 개선 정도를 평가하였다. 피부톤 개선율은 피부의 명도 및 색채 측정값으로 피부의 명도 및 색채 변화 값으로 판단하였으며, 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다. 명도 및 색채 변화 값이 클수록 피부톤이 개선되었음을 의미한다.
표 14
시험물질 피부톤 개선율(%)
명도(평균±표준편차) 색채(평균±표준편차)
제형예 1 13±2.37 13±3.04
비교제형예 1 5±2.34 5±2.05
표 14의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4를 함유하지 않는 비교제형예 1은 유의적인 피부톤 개선 효능을 보이지 않은 반면, 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 제형예 1은 사용 전보다 사용 후의 피부톤을 많이 개선시키는 것을 확인하였다.
[시험예 13] 모공 축소 효과
1. 콜라겐 생합성 촉진을 통한 모공 축소 효과
본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4를 콜라겐 생합성 촉진 효과를 TGF-β와 비교하여 측정하였다. 먼저, 섬유아세포(fibroblast)를 24 공(well)에 1 공 당 105개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹인 본 발명의 진세노사이드 Rh4와 TGF-β를 각각 10ng/ml씩 처리하고 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 형(I) ELISA 키트(procollagen type(I))를 이용하여 프로콜라겐(procollagen)의 증감여부를 보았다. 그 결과를 표 15에 나타내었으며, 콜라겐의 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비하였다.
표 15
시험물질 콜라겐 합성능(%)
비처리군 100
TGF-β 183.5
진세노사이드 Rh4 196.1
상기 표 15의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4는 양성대조군인 TGF-β 보다 높은 수준의 우수한 콜라겐 합성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4가 모공 주변의 콜라겐 생성량을 증가시켜 넓어진 모공을 축소시킬 수 있음을 확인하였다.
2. 모공 축소 효과
제형예 1 및 비교제형예 1의 모공 축소 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 모공 크기가 넓은 피험자 남녀 20명을 선정하여 10명씩 2개 군으로 나누고 각 군별로 얼굴에 제형예 1 및 비교제형예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 모공 축소의 효과에 대한 판정은 실험 전과 4주 후 사진을 찍어서 전문가들의 육안 평가로 이루어졌다. 그 결과는 하기 표 16에 나타내었다(평가 등급: 0 - 전혀 축소 되지 않았다; 5 - 매우 축소되었다).
표 16
시험물질 평가 등급
제형예 1 4
비교제형예 1 0
상기 표 16의 결과로부터, 비교제형예 1은 모공 축소 효과가 없지만, 제형예 1의 경우에는 육안으로 확인 가능할 정도의 모공 축소 효과를 나타내어 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4는 모공의 크기를 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있었다.
[시험예 14] 피지 분비 억제 효과
1. 5α-리덕타아제 활성 억제를 통한 피부 과분비 억제 효과
5α-리덕타아제 활성 억제 효과를 확인하기 위해서 HEK293-5αR2 세포에서 [14C]테스토스테론이 [14C]디하이드로테스토스테론(DHT: dihydrotestosterone)으로 변환되는 비율을 측정하였다. HEK293 세포에 p3 x FLAG-CMV-5αR2를 형질감염시켜서 24 웰 플레이트에 웰당 2.5 x 105 세포로 넣고 배양하였다(Park et al., 2003, JDS. Vol. 31, pp. 191-98). 다음날 효소 기질과 저해제가 첨가된 새로운 배지로 바꿔주었다. 배지의 기질로는 0.05μCi [14C]테스토스테론(Amersham Pharmacia biotech, UK)을 사용하였다.
5α-리덕타아제 활성 억제 정도를 확인하기 위해서 진세노사이드 Rh4를 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 이 때 진세노사이드 Rh4를 넣지 않은 것은 음성대조군으로 사용하고, 피나스테라이드(finasteride)를 넣은 것을 양성대조군으로 사용하였다. 이 후 배양 배지를 수거하여 스테로이드를 800㎕ 에틸아세테이트로 추출한 다음 상부의 유기용매층을 분리하여 말린 후 남은 잔유물을 다시 50㎕ 에틸아세테이트로 녹여서 실리카 플라스틱시트 카이젤겔 60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254) 상에서 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 용매로 하여 전개하였다.
플라스틱 시료를 공기 중에서 건조한 후, 동위원소의 양을 측정하기 위하여 바스 시스템을 사용하였는데, 건조된 플라스틱 시트와 엑스레이 필름을 함께 바스 카셋트에 넣어 1주일 후에 필름에 남아있는 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 측정한 다음 하기 수학식 5 및 6에 따라 전환율 및 저해율을 각각 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다.
수학식 5
Figure PCTKR2014003954-appb-M000005
수학식 6
Figure PCTKR2014003954-appb-M000006
표 17
시험물질 전환율(%) 저해율(%)
음성대조군 48.0 -
양성대조군 27.6 42.5
진세노사이드 Rh4 14.9 61.3
상기 표 17의 결과에서, 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시켜 세포질 내에 있는 수용체 단백질과 결합해 핵 내로 들어가 피지선 세포를 활성화하고 분화를 촉진시켜 피지선 내에서 피지를 과분비시키는 역할을 하는 5α-리덕타아제의 활성을 진세노사이드 Rh4가 효과적으로 억제함으로써 테스토스테론의 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 차단하는 것을 확인할 수 있었으며, 5α-리덕타아제의 활성을 억제하는 것으로 알려진 피나스테라이드보다도 우수한 억제 효과를 가지는 것으로 나타났다. 따라서, 진세노사이드 Rh4는 5α-리덕타아제의 활성을 효과적으로 억제시킴으로써 피지의 과분비를 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
2. 피지 분비 억제 효과
상기 제형예 1 및 비교제형예 1의 피지 분비 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 피지분비가 많다고 느끼는 피험자 남녀 30명을 선정하여 지정된 부위에 제형예 1 및 비교제형예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 피지감소의 효과에 대한 판정은 피지량 측정기(Sebumeter SM810, C+K Electronic Co., 독일)를 사용하여 2주 및 4주 경과 후 평균 피지 감소율(%)을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.
표 18
시험물질 피지 감소율(%)
2주 경과 후 4주 경과 후
제형예 1 32 40
비교제형예 1 5 5
상기 표 18의 결과에서, 본 발명에 의한 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 제형예 1은 이를 함유하지 않은 비교제형예 1보다 과잉으로 분비되는 피지를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.
[제형예 3 및 비교제형예 3~4]
하기 표 19에 나타낸 성분 및 함량(중량%)에 따라 제형예 3 및 비교제형예 3~4를 제조하였다. 구체적으로 설명하면, 제형예 3은 진세노사이드 Rh4를 배합시킨 것이고, 비교제형예 3은 여드름 피부 개선의 유효성분을 전혀 포함시키지 않은 것이며, 비교제형예 4는 항균력에 대한 기준으로 삼을 표준물질로서 여드름 치료제로 많이 사용하는 에리스롬마이신(erythromycin)을 함유시킨 것이다.
제형예 3 및 비교제형예 3~4의 제조 방법은 다음과 같다. 하기 표 19의 A상의 성분들을 완전 용해시키고 별도의 용해조에서 B상의 성분들을 완전 용해시킨 다음, B상을 A상에 첨가하여 혼합가용화시켰다. 여기에 C상의 성분들을 표 19에 기재된 배합비율에 따라 첨가하여 혼합 균일화시킨 다음 여과시켜 본 조성물들을 제조하였다.
표 19
구분 제형예 3 비교제형예 3 비교제형예 4
A 탈이온수(Deionized Water) To 100 To 100 To 100
EDTA-2Na 0.02 0.02 0.02
글리세린 5.0 5.0 5.0
B 에탄올 2.0 2.0 2.0
PEG-60 경화 피마자유(hydrogenated castor oil) 0.4 0.4 0.4
향료(perfume) 0.04 0.04 0.04
C 진세노사이드 Rh4 5.0 - -
에리스롬마이신 - - 5.0
[시험예 15] 여드름균에 대한 항균력 시험
제형예 3 및 비교제형예 3~4의 조성으로 제조된 각각의 화장료 조성물을 가지고 여드름 원인 균주인 프로피오니박테리움 아크네스(ATCC 6919: 배지-BHI 브로쓰(broth))에 대하여 항균력을 시험하였다.
여드름균에 대한 항균력 시험 방법은 다음과 같았다.
(1) 시험 균액 준비
프로피오니박테리움 아크네스는 BHI 브로쓰에 접종하여 혐기 배양한 배양액을 사용하였다.
(2) 희석 용액 준비
BHI 브로쓰(pH 6.8) 또는 LB 브로쓰(pH 4.5) 15ml에 상기 시험 균액을 0.15ml 첨가하여 잘 혼합한 것을 희석용액으로 사용하였다.
(3) 시료 준비
제형예 3 및 비교제형예 3~4로부터 제조된 화장료 조성물 원액 그대로를 시료로 사용하였다.
(4) 항균력 시험
1) 96웰의 세포배양관(96 well plate) 1번 행에 출발 농도에 맞도록 시료를 넣고 희석용액으로 총량을 200μl씩을 넣는다.
2) 1번 행의 혼합액을 잘 섞어준 다음 100μl를 취하여 2번 행에 넣고 잘 섞어준 다음, 다시 100μl를 취하여 3번 행에 넣는 방식으로 이중 희석(double dilution)을 행한다.
3) 32℃에서 24시간 및 48시간 정치 배양한 후 현탁된 정도로 균의 증식 유무를 판단하여 균의 증식이 없는 최소농도를 MIC(최소저지농도; Minimum Inhibitory Concentration) 값으로 결정한다. 만약 혼합액이 불투명하여 균의 증식 유무를 판단하기 어려우면 현미경 관찰을 통하여 확인한다.
여드름균에 대한 항균력 시험 결과를 하기 표 20에 나타내었다. MIC는 제형에 함유된 유효성분의 농도로 환산하여 표기하였다.
표 20
항목 pH 프로피오니박테리움 아크네스
제형예 3 5.7 > 30ppm
비교제형예 3 5.7 최고 농도(항균력 없음)
비교제형예 4 5.7 > 100ppm
MIC에서 ppm 농도가 작을수록 여드름균에 대한 항균력에 대하여 유효한 물질이라고 할 수 있는데, 제형예 3의 경우 공지의 여드름 치료제인 에리스롬마이신을 사용한 비교제형예 4보다 ppm 농도가 현저하게 작게 나와 진세노사이드 Rh4를 함유하는 조성물은 시험균에 대하여 훨씬 우수한 항균력을 가짐을 확인할 수 있다.
[시험예 16] 지질합성(Lipogenesis) 억제 시험
생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1×105 세포/웰로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 1㎍/㎖ 인슐린(insulin), 0.5mM IBMX 및 0.25μM 덱사메타손(dexamethasone)을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)로 분화 유도를 하고 진세노사이드 Rh4 및 카페인을 50μM을 처리한 다음 처리 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.
진세노사이드 Rh4의 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 수단 III 염색(S4136, sigma-aldrich)을 실시하였다. 지방 세포를 인산염 버퍼 내에서 4% 파라포름알데하이드(pH 7.2)로 상온에서 고정한 후에 PBS(phosphate buffered saline)로 수세해 준 다음, 수단 III으로 염색한 후에 사진을 찍어서 육안 비교하였다. 대조군은 시험물질이나 비교물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 다른 비교군으로 카페인 50μM을 처리하였다. 지방 축적 억제 정도는 염색된 정도를 +++, ++, +, -로 나누어 등급을 부여하였으며, 이때 +++로 갈수록 염색 정도가 크다는 것을 의미한다. 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다.
표 21
시료 저해율%
대조군 +++
비교군 +
진세노사이드 Rh4 -
상기 표 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용된 진세노사이드 Rh4는 지방세포 내 축적된 지방의 양이 적을 뿐만 아니라, 공지된 지질합성 저해 물질인 카페인 보다 우수한 지질합성 저해 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서, 지질합성이 억제됨으로써 피지가 감소되어 여드름 발생을 억제할 수 있다.
[시험예 17] 여드름 개선과 피지분비 감소 및 자극 유무의 시험
여드름을 보유하고 있는 30명을 10명씩 3개 군으로 나누고 각각의 군에 해당하는 피험자에게 상기 제형예 3 및 비교제형예 3~4로 제조된 화장료 조성물을 한 달간 사용하게 하였다. 여드름 개선 척도는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기의 표 22에 10명의 평균점수로 표기하였다.
여드름 소멸 시기는 소멸이 판독된 일수를 기준으로 하였으며, 여드름 재발은 유무로 1개월 뒤의 결과를 기준으로 하였다. 피지 분비감소는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기 표 22에 10명의 평균점수로 표기하였다. 피부자극의 유무는 (자극반응을 보인 명수)/(총 시험자수)로 보았다.
표 22
염증성 여드름 개선 면포성 여드름 소멸시기 여드름 재발 피지분비 감소 자극 유무
제형예 3 4.2 3일 무 4.1 0/10
비교제형예 3 2.1 13일 유 2.0 0/10
비교제형예 4 4.2 2일 무 4.1 9/10
상기 표 22에 나타내 바와 같이, 제형예 3은 비교제형예 3에 비해 여드름이 재발되지 않았고, 전반적으로 여드름 개선에 대해 우수한 효과가 있음을 알 수 있다. 한편, 항균력 표준물질을 함유한 비교제형예 4의 경우 여드름 개선 효과를 나타내고 있지만, 사용함에 있어 피부자극이 강하여 장기적으로 사용하기에는 적당하지 않은 것으로 보이나, 본원 발명에 따른 조성물은 자극이 없어 장기간의 사용에도 적당한 것으로 나타났다.
[시험예 18] IL-8 생성 억제 효과
실험 하루 전 피부 각화상피세포(Normal human skin keratinocyte, NHEK, 입수처: Lonza)를 96웰(well) 플레이트에 5x104 세포/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, PBS로 세포를 2회 씻어주고 무혈청 KBM(serum free keratinocyte basement media)으로 갈아주었다. 각각의 웰에 진세노사이드 Rh4를 하기 표 23의 농도별로 처리하여 30분간 반응시킨 후, PGSA(10㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 여기서, PGSA(peptidoglycan from S. aureus)는 포도상구균에서 추출한 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로서, 그람 양성(+) 균의 세포벽의 주요 구성 성분이고 박테리아의 세포막 성분들은 염증을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 또한, LPS(lypopolysaccaride)는 그람 음성(-) 박테리아균의 세포막 주요 구성성분이며 염증 유발의 주원인으로 알려져 있다.
24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양한 후 배양액을 취하여 인터류킨-8(Interleukin-8, IL-8)에 대한 ELISA를 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 23에 나타내었다. ELISA는 제조회사(BD science)의 실험 방법을 이용하였다.
표 23
구분 IL-8 분비(pg/㎖)
무처리 대조군(Control) 935.12
PGSA(10㎍/㎖) 4812.60
PGSA(50㎍/㎖) 5895.08
PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖) 6814.91
진세노사이드 Rh4(5ppm) (1398.33)
진세노사이드 Rh4(25ppm) (1212.41)
진세노사이드 Rh4(50ppm) (1010.37)
상기 표 23에서 진세노사이드 Rh4가 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 현저히 감소 및 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 현저히 감소시킴으로써 우수한 항염증 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
[시험예 19] 가려움 완화 평가
실험 하루 전 각질형성세포(세포주명: HaCaT 입수처: ATCC)를 96 웰(well) 플레이트에 4x104세포/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, HBSS(Hanks’Balanced Salt solution) 버퍼로 96 웰 플레이트를 2회 워싱(washing)한 다음, 반응 버퍼(2μM Fluo-4-AM, 20% pluronic acid, 2.5mM probenecid)를 세포에 넣어주었다. 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30분, 상온에서 30분간 반응시킨 후, HBSS 버퍼로 2회 워싱하고 하기 표 24와 같은 농도(%)의 진세노사이드 Rh4로 세포를 처리하였다.
10분간 반응시킨 후, 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)를 처리하고 80초간 세포 내 Ca2+ 농도 변화를 측정하였다. 세포 내 Ca2+ 농도 변화 측정은 플렉스테이션3(FlexStation3: Molecular Device, USA)를 이용하였다. 진세노사이드 Rh4와 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 후 80초간의 플렉스(flex)를 측정하여 얻어낸 값의 최소값과 최대값의 차를 구한 후, 그 값을 2U/ml 트립신 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 시의 최소값과 최대값의 차와 비교하여 칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)을 하기 표 24에 나타내었다.
표 24
진세노사이드 Rh4 농도 칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)
트립신(2U/ml) PAR-2 활성 펩타이드(5μM)
0.05% 27 29
0.1% 32 33
0.5% 39 43
1.0% 44 52
상기 표 24에서 알 수 있듯이, 트립신 또는 PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)에 의한 세포 내 칼슘 이온들의 유입이 진세노사이드 Rh4의 처리에 따라 감소되며, 진세노사이드 Rh4의 농도를 높여줌에 따라 세포 내 칼슘 이온들의 유입이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 진세노사이드 Rh4를 함유하는 피부 외용제 조성물은 가려움을 유발시키는 PAR-2 활성을 효과적으로 억제함으로써 우수한 항소양 효과를 제공할 수 있다.
[제형예 4 및 비교제형예 5]
하기 표 25의 조성으로 샴푸를 제조하였다. 구체적으로, 계면활성제와 에틸렌글리콜디스테아레이트를 정제수에 첨가하여 80℃가 될 때까지 가열하여 균일하게 용해시킨 후, 교반하에 40℃까지 서서히 냉각시키고, 상기 혼합물에 본 발명에 따른 유효성분과 방부제, 점도조절제, 향료, 모발 컨디셔닝제를 투입하여 혼합한 후, 교반하에 실온까지 냉각시켜 제조하였다.
표 25
성분 제형예 4 비교제형예 5
라우릴황산암모늄 10 10
폴리옥시에틸렌라우릴황산암모늄 5 5
코코아미도프로필베타인 2 2
에틸렌글리콜디스테아레이트 1.5 1.5
코코일 모노에탄올아미드 0.8 0.8
진세노사이드 Rh4 5.0 -
폴리쿼터늄-10 0.2 0.2
청색1호 0.0002 0.0002
황색4호 0.0001 0.0001
메틸파라벤 0.1 0.1
향료 0.8 0.8
구연산 0.1 0.1
디메치콘 1.0 1.0
물 to 100 to 100
표 26
제형예 4 비교제형예 5
비듬감소율(%) 62.8 0.7
55.9 -0.5
73.1 -1.1
65.3 1.5
48.1 2.2
59.3 1.3
69.6 6.3
72.6 3.6
58.6 3.3
71.6 4.6
59.6 3.7
68.4 4.2
평균값 68.4 2.5
SD 7.72 2.2
[시험예 20] 비듬감소 효과 시험
비듬이 비교적 많은 19~35세의 남성 24명을 선정하여 각 제형예 4 및 비교제형예 5의 샴푸에 대하여 12명씩 2개 그룹으로 1개월간 다음과 같은 방식으로 사용하게 한 후 비듬 감소율을 측정하였다.
시험 개시전에 보통 통상의 샴푸로 세발하고, 세발 후 2일간 누적된 비듬을 채집하여 채집된 비듬의 중량과 각 제형예 4 및 비교제형예 5의 샴푸로 2일에 한번씩 세발하여 시험종료 후 2일간 누적된 비듬의 중량을 비교 평가하였다. 이때 누적된 비듬은 진공 흡입 장치로써 두피로부터 직접 채집하여, 하기 수학식 7에 의거하여 비듬 감소율을 구하고 그 결과를 하기 표 26에 나타내었다.
수학식 7
Figure PCTKR2014003954-appb-M000007
상기한 표 26에서 알 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 Rh4를 함유한 제형예 4의 경우 우수한 비듬방지 효과를 나타냄을 알 수 있다.
[시험예 21] 두피 가려움증 방지 효과 시험
비교적 두피 가려움을 심하게 느끼는 25세~45세의 남녀 24명을 선정하여 12명씩 2개 그룹으로 나누어 각 제형예 4 및 비교제형예 5의 샴푸를 3일에 1회씩 2주간 사용하게 한 후 두피 가려움 방지 효과를 하기 평가기준을 통하여 평가하고 그 결과를 하기 표 27에 나타내었다.
[평가 기준]
매우 우수하다 - 5점
우수하다 - 4점
보통이다 - 3점
불량하다 - 2점
매우 불량하다 - 1점
표 27
구분 제형예 4 비교제형예 5
두피의 가려움증 제거효과 4.2 2.3
상기한 표 27에서 알 수 있는 바와 같이, 진세노사이드 Rh4를 함유한 제형예 4의 경우가 두피 가려움증을 방지하는데 보다 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.
[시험예 22] 모낭 모유두 세포 증식 효과
모발을 구성하는 케라틴 단백질은 모근부 케라틴형성세포 (keratinocyte)에서 생성되며, 이 케라틴형성세포는 모유두 세포로부터 분화된다. 본 조성물의 모유두 세포를 활성을 평가하기 위하여 본 발명에서는 DP6(rat immortalized dermal papilla cell) 세포주를 사용하였다(Wendy Filsell, Journal of Cell Science 107, 1761-1772 (1994)). 본 모유두 세포주는 수컷 PVG 래트 수염의 모근에서 현미해부(microdissection) 방법으로 분리하여 배양한 세포주이며, 10% FBS(Fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 5% CO2, 37℃가 유지되는 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. DP6을 96 웰 플레이트에 넣고 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양한 후 본 진세노사이드 Rh4를 각각 5ppm, 10ppm 및 20ppm의 농도로 처리하였다. 약물 처리 24시간 경과 후에 WST-1 키트(Roche)를 사용하여 세포 증식능을 측정하였다. 결과는 하기 표 28에 나타내었다.
표 28
구분 세포 증식능(%)
무처리 대조군(Control) 100
진세노사이드 Rh4(5ppm) 131
진세노사이드 Rh4(10ppm) 139
진세노사이드 Rh4(20ppm) 148
상기 표 28에서 알 수 있는 바와 같이 진세노사이드 Rh4를 처리한 경우 모유두 세포의 증식이 증가하며, 이는 농도 의존적으로 유의차있게 증가하는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 23] 칼륨 이온 채널 활성 증가 효과 평가
탈모 치료제인 미녹시딜은 잠재적인 미토콘드리아 칼륨 이온 채널 오프너(KATP channel opener)로 알려져 있으며, 안드로겐성 탈모의 치료에 사용되는 대표적인 약물이다. 이러한 미녹시딜의 기작을 평가하기 위해서 두피의 진피를 구성하는 섬유아 세포에서 KATP 채널을 막는 톨부타미드(SIGMA AlDRICH, T0891)를 처리하여 세포증식을 억제하고, 다시 칼륨 이온 채널을 열어 세포증식이 회복되는 시험법을 사용하였다.
본 조성물의 KATP 채널 오프너로서의 기능을 평가하기 위해서 본 발명에서는 섬유아세포주인 NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line) 세포주를 사용하였다. 본 세포주는 NIH 스위스 마우스 배아(Swiss mouse embryo)에서 분리한 섬유아 세포주를 3T3 프로토콜로 자연 불멸화시킨 세포주이다. 상기 세포주는 10% FBS가 함유된 DMEM(Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)에서 5% CO2, 37℃가 유지되는 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. NIH3T3을 96웰 플레이트에 넣고 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양한 후 2.5mM 톨부타미드를 처리하고, 10분 뒤에 양성대조군인 미녹시딜 10μM과 진세노사이드 Rh4를 각각 2.5ppm, 5ppm 및 10ppm의 농도로 처리하며, 약물 처리 48시간 경과 후에 WST-1 키트(Roche)를 사용하여 세포 증식능을 측정하였다. 결과는 하기 표 29에 나타내었다.
표 29
구분 세포 증식능(%)
무처리 대조군(Control) 100
미녹시딜 132
진세노사이드 Rh4(2.5ppm) 111
진세노사이드 Rh4(5ppm) 129
진세노사이드 Rh4(10ppm) 136
상기 표 29에서 알 수 있는 바와 같이 진세노사이드 Rh4를 처리한 경우 섬유아 세포의 증식이 회복되고, 세포 증식능이 처리한 진세노사이드 Rh4의 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있으며, 진세노사이드 Rh4를 10ppm으로 처리한 경우에는 미녹시딜을 처리한 경우의 수준으로 세포의 증식이 회복되는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 24] 진세노사이드 Rh4의 멜라닌 생성 촉진 효과 시험
RPMI 배지에 5%의 우태아혈청, 100IU의 페니시린G 및 0.2μM의 TPA를 첨가한 배지에 멜라닌 세포(melan-a)를 24웰플레이트(24-well microtiter plate)에 50,000세포/웰이 되도록 분주하였다. 다음날 분주된 세포에 시험 물질로서 진세노사이드 Rh4를 최종농도 10ppm 또는 50ppm으로 처리하고, 음성 대조군으로는 0.1% DMSO를, 양성 대조군으로는 100μM IBMX를 처리한 후에 37℃ 온도에서 3일간 배양하였다. 배양 후, PBS로 웰을 씻어주고 1N NaOH를 100㎕씩 넣은 후 세포 안의 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌의 흡광도를 평판배양측정기(microplate reader)를 이용하여 405nm에서 측정하였다. 진세노사이드 Rh4의 멜라닌 생성 촉진 효과를 대조군과 비교한 결과는 하기 표 30에 나타내었다.
표 30
시료 멜라닌 합성양(%)
DMSO(0.1%) 100
IBMX(100μM) 120
진세노사이드 Rh4(10ppm) 109
진세노사이드 Rh4(50ppm) 123
상기 표 30을 보면, 진세노사이드 Rh4가 멜라노사이트의 멜라닌 합성을 촉진시켜 멜라닌 생성이 늘어나, 우수한 멜라닌 생성 촉진 효과를 나타냄을 알 수 있다.
[시험예 25] 진세노사이드 Rh4의 멜라노사이트에서의 MITF 및 티로시나제 발현 촉진 효과
501mel 세포주를 이용하여 6웰플레이트(6-well microtiter plate)에 500,000세포/웰이 되도록 분주하고, 각공에 음성 대조군으로는 DMSO 0.1%, 양성 대조군으로는 IBMX 100μM, 그리고 시험군으로는 진세노사이드 Rh4를 10ppm으로 처리하여, 37℃ 온도에서 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양한 후 단백질을 얻었다. 이렇게 얻은 단백질에 대하여 MITF 및 티로시나제 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 하였다. 단백질 추출과 웨스턴 블랏은 통상적으로 당업자가 사용하는 표준 방법으로 수행하였다. 웨스턴 블랏 후 그 결과를 음성 대조군을 100으로 하고 이 값과 비교하여 하기 표 31에 나타내었다.
표 31
MITF 티로시나제
IBMX 진세노사이드 Rh4 IBMX 진세노사이드 Rh4
24hr 121 98 160 155
48hr 98 115 149 156
72hr 224 123 298 179
상기 표 31을 보면, 진세노사이드 Rh4는 멜라노사이트에서 MITF와 티로시나제 단백질 발현을 상승시킴을 확인할 수 있다.
[시험예 26] 진세노사이드 Rh4의 항균력 평가
진세노사이드 Rh4의 항균력을 평가하기 위해 항균 실험을 실시하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
실험에 사용한 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리치아 콜리(Escherichia coli), 세도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주는 트립티케이스 대두 배지(Tryptic Soy Broth)에서, 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 균주는 사부로 덱스트로오스 배지(Sabouraud Dextrose Broth)에서 배양했다. 배양액을 각 배지에 1/100(캔디다 알비칸스 균주는 1/10) 희석한 희석액을 시험균액으로 사용하였다. 아스퍼질러스 니거는 2×108 cfu/ml이 되도록 제조한 포자 현탁액을 시험균액으로 사용하였다.
각 배지 15ml에 상기 시험균액을 0.15ml 첨가하여 잘 혼합한 것을 희석용액으로 사용하였다.
96 딥 웰 플레이트(96 well plate) 1번 행에 시료를 16㎕씩 넣고, 희석용액을 184㎕씩 넣었다. 나머지 웰들에는 희석용액 100㎕씩을 넣었다. 1번 행의 혼합액을 잘 섞어준 다음 100㎕를 취하여 2번 행에 넣고 잘 섞어준 다음, 다시 100㎕를 취하여 3번 행에 넣는 방식으로 2배씩 희석시켰다.
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스체리치아 콜리(Escherichia coli), 세도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 32 C 항온조에서, 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)는 25℃ 항온조에서 배양하였다.
48시간 후에 균 증식여부를 현탁도와 현미경으로 확인하여 최소저해농도(MIC) 값을 결정하고 그 결과를 하기 표 32에 나타내었다.
표 32
샘플 최소저해농도(MIC), 단위 %
세도모나스애루지노사 스타필로코쿠스 아우레우스 에스체리치아 콜리 캔디다 알비칸스 아스퍼질러스 니거
진세노사이드 Rh4 0.21 0.04 0.124 > 3 > 1
상기 표 32에서 보는 바와 같이, 진세노사이드 Rh4는 다양한 균주에 대하여 항균력을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이를 통하여 진세노사이드 Rh4는 조성물 내에서 천연 방부제, 또는 항균제로서 작용할 수 있음을 예측할 수 있다.

Claims (23)

  1. 하기 화학식 1로 표현되는 진세노사이드 Rh4를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2014003954-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rh4는 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항산화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항노화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 탄력 향상용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미백용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 장벽 기능 강화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 각질형성세포 분화 유도용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 여드름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항균용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 지질생성을 억제함을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 혈색 및 피부톤 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 모공 축소용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피지 조절용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 트러블 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 자극 생성 방어용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 비듬 방지용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 육모용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 백모 방지용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 Rh4는 천연 방부제로서 사용됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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