JP5890100B2 - 皮膚コラーゲン産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下等を防止するのに有用な皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）及び／またはＴＧＦ−βをタンパク質分解酵素で分解して得られるＴＧＦ−β分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤に関する。

近年、皮膚のメカニズムに関する研究が進められ、皮膚の乾燥感や肌荒れの原因としてマクロ的には、加齢による新陳代謝の減衰によるもののほかに、太陽光（紫外線）、乾燥、酸化等の作用が複雑に関与していることが確認されてきた。これらの因子による作用によって、真皮の最も主要なマトリックス成分であるコラーゲン繊維が顕著に減少していることが明らかとなってきた。コラーゲン繊維によって保たれていた皮膚のハリや弾力性といった張力保持機構が紫外線等の作用によって、破壊されると、皮膚はシワやたるみを増した状態になる。また、コラーゲンはその分子中に水分を保持することができ、それにより、皮膚をしっとりとした状態に保つことにも役立っているから、外的因子により、コラーゲンが破壊されると肌は、乾燥し、荒れた状態になる。以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるコラーゲンの生合成を促進させることにより、皮膚のシワやたるみを防止でき、しかも安全性の点でも問題のない皮膚コラーゲン産生促進剤が望まれていた。

トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、哺乳動物の乳に存在する増殖因子の一つである。ＴＧＦ−βファミリーには５種類のサブタイプが存在し、ジスルフィド結合により約２５ｋＤａの二量体を形成するタンパク質である。細胞増殖や合成の促進・抑制等を調節する働きを持つ。ＴＧＦ−βの有用な作用として、動物細胞における分化誘導作用が確認されている（特許文献１）。また、皮膚においては線維芽細胞の増殖因子として報告されている（非特許文献１）。

特開２００４−２５４６７４

J.Dermatol.Sci., vol.24(Supple), p.70, 2000

本発明は、安全性の点で問題のない皮膚コラーゲン産生促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料を提供することを課題とする。

本発明者らは、これらの課題を解決するために、広く食品素材に含まれている皮膚コラーゲン産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、ＴＧＦ−βあるいはそのＴＧＦ−βを分解して得られるＴＧＦ−β分解物が、皮膚のコラーゲン量を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−β分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
（２）前記ＴＧＦ−β分解物が、ＴＧＦ−βをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（１）記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（３）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（２）記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（４）前記ＴＧＦ−β分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品。
（６）（１）〜（４）のいずれかに記載のＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用化粧料。
（７）ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−β分解物を経口摂取又は塗布することによる肌質の改善方法。
（８）ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−β分解物を１日あたり１０μｇ以上経口摂取するか、又は０．００１〜２重量％になるよう塗布することによる肌質の改善方法。

本発明により、ＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料が提供される。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料は、皮膚のコラーゲン産生を促進させる作用を有し、皮膚のシワやたるみ、乾燥感や肌荒れの予防や治療に有用である。

本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の特徴は、ＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−βをタンパク質分解酵素で分解して得られるＴＧＦ−β分解物を有効成分とすることにある。本発明のＴＧＦ−βはどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のＴＧＦ−βはすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたＴＧＦ−βも使用可能である。また、ＴＧＦ−βはウシ初乳中に比較的大量に含有されており、乳から回収したものであっても良い。さらにＴＧＦ−βは細胞培養の培養液から回収することも可能であり、このような細胞由来のものであっても使用可能である。例えば、乳由来のＴＧＦ−βについては、公知の方法（例えば、J. Protein Chem., vol.10, p565-575, 1991参照）に従って製造することが可能であり、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等を行うことにより、ＴＧＦ−βを得ることができる。

ＴＧＦ−β分解物は、ＴＧＦ−βをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は５００以上であることが好ましい。

本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、皮膚コラーゲン産生促進効果を発揮する。本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるＴＧＦ−βあるいはＴＧＦ−β分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化される。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することが出来る。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。また、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等が、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等が、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
さらには、これらのＴＧＦ−βやＴＧＦ−β分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。また、ビタミンＣ等の従来からコラーゲン産生に有効な作用を持つと考えられている成分とともにＴＧＦ−βやＴＧＦ−β分解物を配合すれば、一層の皮膚コラーゲン産生促進作用が期待できる。なお、ＴＧＦ−βあるいはＴＧＦ−β分解物は、比較的熱に対して安定であるので、ＴＧＦ−βあるいはＴＧＦ−β分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。

本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、皮膚コラーゲン産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。

本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果によると、皮膚コラーゲン産生促進作用を示すためには、ＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物をラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ以上摂取する必要があることが判った。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日１０μｇ以上のＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物を摂取すれば効果が期待できるので、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。

本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、ＴＧＦ−β及び／またはＴＧＦ−β分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。

以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

Ｓセファロース ３,０００ｇ を充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液して、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、ＴＧＦ−βを含む溶出画分を再度フェニルＳセファロース疎水性カラムクロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＨＰＬＣシステムにてＣ４およびＣ８逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで順次処理し、ＴＧＦ−β４１２ｍｇ（画分Ａ）を得た。なお、このようにして得られたＴＧＦ−βは、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。

実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチンを加え、３７℃で５分から６時間、酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、ＴＧＦ−β分解物２４ｍｇ（画分Ｂ、Ｃ、Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたＴＧＦ−β分解物の平均分子量は、Ｂが約８，０００、Ｃが約５００、Ｄが約３００であった。画分Ｂ、Ｃ、Ｄは、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。

［試験例１］
実施例１で得られた画分Ａ及び実施例２で得られた画分Ｂ乃至Ｄについて、ラットを用いた動物実験によりコラーゲン産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（コントロール群）、実施例１で得られた画分Ａをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ａ−１群）、実施例１で得られた画分Ａをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ａ−２群）、実施例２で得られた画分Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｂ−１〜Ｄ−１群）、実施例２で得られた画分Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｂ−２〜Ｄ−２群）の９試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して１０週間飼育した。皮膚のコラーゲン量については、ラットの真皮をＮｉｍｎｉらの方法（Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２９２頁， １９６７年 参照）に準じて処理した後、可溶性画分に含まれるヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンのみに含まれる特殊なアミノ酸で、コラーゲンを構成する全アミノ酸の約１０％を占めることからコラーゲン量の推定ができる（浅野隆司ら，Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｏｒｙ，１２頁， ２００１年 参照）。その結果を表１に示す。

この結果、１０週間後の可溶性画分中ヒドロキシプロリン量は、コントロール群に比べ、すべての試験群で有意に高い値を示した。このことから、ＴＧＦ−β及び平均分子量が５００以上８０００以内であるＴＧＦ−β分解物には、皮膚コラーゲン産生促進作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。また、この皮膚コラーゲン産生促進作用はＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β分解物をラット体重１ｋｇ当たり最低１０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。

［試験例２］
実施例１で得られた画分Ａ及び実施例２で得られた画分Ｂについて、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ（ＡＴＣＣＲＬ １５０６）〕を用いた実験により皮膚コラーゲン産生促進作用を調べた。１０容量％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）含有変法イーグル培地（ＭＥＭ、１０‐１０１、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を４×１０^４個／ウエル／０．４ｍｌとなるように２４ウエルプレートに播種して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で２４時間培養した後、０．６容量％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に置換した。そして、実施例１で得られた画分Ａ及び実施例２で得られた画分Ｂを、各ウエルに０．１容量％となるように添加（ｎ＝６）して、２４時間培養した後、β−アミノプロピオニトリルを５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを１μＣｉ／ｍｌとなるように添加して、さらに２４時間培養して培養液を得た。このようにして得られた培養液より、Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０頁，１９７９年 参照）に従いコラーゲン画分を分画し、コラーゲン画分に取り込まれた放射能を測定した。なお、対照として、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。

これによると、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β分解物を添加した群は、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも２倍以上のコラーゲン産生促進能を示した。このことから、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、コラーゲン産生を促進する作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。

表３に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温１年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。

表４に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼して皮膚コラーゲン産生促進用ビスケットを製造した。

表５に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進剤を常法により製造した。

表６に示す配合の化粧水を常法により製造した。

表７に示す配合のクリームを常法により製造した。

［試験例３］
実施例６で得られた化粧水及び実施例７で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−β分解物を除いた以外は実施例６及び７と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女子２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｅ、Ｆ群）に、また、手に肌荒れが認められる女子２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｇ、Ｈ群）に分け、Ｅ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｆ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｇ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｈ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表８に示す。

表８より、実施例品６の化粧水、実施例品７のクリームを使用したＥ群、Ｇ群では、比較品の化粧水、クリームを使用したＦ群、Ｈ群に比べ、特に乾燥感や肌荒れに対し、顕著な改善効果を示すことが明らかとなった。

Claims (6)

1. ＴＧＦ−β分解物を有効成分とし、前記ＴＧＦ−β分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
2. 前記ＴＧＦ−β分解物が、ＴＧＦ−βをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項１記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
3. 前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項２記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＴＧＦ−β分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用化粧料。
5. 分子量が５００以上、８０００以下であるＴＧＦ−β分解物を経口摂取又は塗布することによる非治療的な肌質の改善方法。
6. 分子量が５００以上、８０００以下であるＴＧＦ−β分解物を１日あたり１０μｇ以上経口摂取するか、又は０．００１〜２重量％になるよう塗布することによる非治療的な肌質の改善方法。