JP4698935B2

JP4698935B2 - 皮膚コラーゲン産生促進剤

Info

Publication number: JP4698935B2
Application number: JP2003129510A
Authority: JP
Inventors: 如一森田; 幸宏高田; 保宏鳥羽; 浩川上
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 2003-05-07
Filing date: 2003-05-07
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2023-05-07
Also published as: JP2004331566A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下等を防止するのに有用な皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、皮膚のメカニズムに関する研究が進められ、皮膚の乾燥感や肌荒れの原因としてマクロ的には、加齢による新陳代謝の減衰によるもののほかに、太陽光(紫外線)、乾燥、酸化等の作用が複雑に関与していることが確認されてきた。これらの因子による作用によって、真皮の最も主要なマトリックス成分であるコラーゲン繊維が顕著に減少していることが明らかとなってきた。コラーゲン繊維によって保たれていた皮膚のハリや弾力性といった張力保持機構が紫外線等の作用によって、破壊されると、皮膚はシワやたるみを増した状態になる。また、コラーゲンはその分子中に水分を保持することができ、それにより、皮膚をしっとりとした状態に保つことにも役立っているから、外的因子により、コラーゲンが破壊されると肌は、乾燥し、荒れた状態になる。
以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるコラーゲンの生合成を促進させることにより、皮膚のシワやたるみを防止でき、しかも安全性の点でも問題のない皮膚コラーゲン産生促進剤が望まれていた。
【０００３】
アンジオジェニンは血管形成因子の一つである。ヒトのアンジオジェニンは分子量14,400のタンパク質であることが知られており、全アミノ酸配列も決定されている。アンジオジェニンは血液や乳中にも存在しており、ボンドらはウシアンジオジェニンを牛の血液から分離し（非特許文献１参照。）、またスピックらは牛乳中のアンジオジェニンを単離し、このアミノ酸配列を決定している（非特許文献２参照。）。アンジオジェニンの牛乳からの製造については、牛乳を陽イオン交換クロマトグラフィーに吸着後、弱有機酸のアルカリ金属塩水溶液で溶出し、この溶出液を再度陽イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーにより回収する方法が開示されている（特許文献１参照。）。
アンジオジェニンの生理的活性で最も重要なものは上記した血管形成活性である。この作用により、アンジオジェニンは外傷、潰瘍、臓器移植、循環機能不全等の疾患への使用が示唆されている。このような作用以外はあまり知られていないが、アンジオジェニンを養毛、育毛剤に使用する例が開示されている（特許文献２参照。）。また、アンジオジェニンがメラノーマ細胞であるＢ-1６細胞のメラニン産生を特異的に抑制することを見出したことから、アンジオジェニンを有効成分とする美白剤が開示されている（特許文献３参照。）。しかし、アンジオジェニン及びその分解物が皮膚コラーゲン産生促進作用を持ち、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることについては知られていない。
【０００４】
【先行技術文献】
【特許文献１】
特開平２−２９６０００号公報
【特許文献２】
特開平４−２１０６１８号公報
【特許文献３】
特許第２５７２９３１号公報
【非特許文献１】
ボンドら（Bond et al．）「バイオケミストリー（Biochemistry）」、1988年、27巻、6282-6287ページ
【非特許文献２】
ジー・スピックら（G．Spik et al．）「バイオケミストリー（Biochemistry）」、1989年、28巻、6110-6113ページ
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、皮膚の乾燥感や肌荒れ、しわやタルミを防止でき、しかも安全性の点でも問題のない、皮膚コラーゲンの生合成を促進する物質を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、これらの課題を解決するために、広く食品素材に含まれている皮膚コラーゲン産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めていたところ、アンジオジェニンあるいはそのアンジオジェニンをペプシンやパンクレアチン等のタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物が、皮膚のコラーゲン量を増加させることができる、すなわち、コラーゲン産生促進作用があることを見出した。そして、このアンジオジェニンやアンジオジェニン分解物を皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料の有効成分として利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明は、この皮膚コラーゲン産生促進活性を有するアンジオジェニンあるいはアンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤に関する。また、本発明は、これらのアンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン分解物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品や皮膚コラーゲン産生促進用化粧料に関する。
【０００８】
本発明で皮膚コラーゲン産生促進剤とは、経口投与あるいは塗布等により、皮膚コラーゲン産生促進効果を発揮するものを言うものとする。また、本発明では、この皮膚コラーゲン産生促進剤のうち、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化してそのまま、あるいは製剤化した後、栄養剤や飲食品等に配合して経口投与するものを皮膚コラーゲン産生促進用飲食品と言うものとする。また、本発明では、皮膚コラーゲン産生促進剤のうち、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション等に製剤化して肌に塗布するものを皮膚コラーゲン産生促進用化粧料と言うものとする。また、本発明では、医薬品であるが、製剤化してそのまま経口投与するものを便宜上、前記皮膚コラーゲン産生促進用飲食品の中に含め、医薬品であるが、製剤化して肌に塗布するものを便宜上、前記皮膚コラーゲン産生促進用化粧料の中に含めるものとする。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の特徴は、アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物を有効成分とすることにある。
【００１０】
本発明の原料のアンジオジェニンはどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のアンジオジェニンはすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたアンジオジェニンも使用し得る。また、アンジオジェニンはウシ初乳中に比較的大量に含有されており、乳から回収したものであっても良い。さらにアンジオジェニンは細胞培養の培養液から回収することも可能であり、このような細胞由来のものであっても使用可能である。
【００１１】
本発明においては、哺乳動物の乳より調製したアンジオジェニンを使用し、皮膚コラーゲン産生促進剤を調製する方法を実施例に開示するが、乳由来のアンジオジェニンに限定されるものではない。給源とする乳としては、ウシ、水牛、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等の分娩後1〜7日以内、特に好ましくは分娩後1〜5日以内の初乳がアンジオジェニン含量が高いため適しているが、通常の泌乳期の乳であっても本発明の原料として使用可能である。それを製造するには、公知の方法、例えば上記［特許文献１］であげた陽イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーを組み合わせてアンジオジェニンを精製する方法等を工業的に有利に利用することができる。
【００１２】
アンジオジェニン分解物は、上記のアンジオジェニンをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が10,000以下となるように限定分解したペプチド混合物である。分子量の下限は500以上が好ましい。
【００１３】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、皮膚コラーゲン産生促進効果を発揮する。
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるアンジオジェニンあるいはアンジオジェニン分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化される。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することが出来る。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。また、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等が、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等が、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
【００１４】
さらには、これらのアンジオジェニンやアンジオジェニン分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。また、ビタミンＣ等の従来からコラーゲン産生に有効な作用を持つと考えられている成分とともにアンジオジェニンやアンジオジェニン分解物を配合すれば、一層の皮膚コラーゲン産生促進作用が期待できる。なお、アンジオジェニンあるいはアンジオジェニン分解物は、比較的熱に対して安定であるので、アンジオジェニンあるいはアンジオジェニン分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。
【００１５】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、皮膚コラーゲン産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。
【００１６】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果によると、皮膚コラーゲン産生促進作用を示すためには、アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン分解物をラット体重1kg当たり20mg以上摂取する必要があることが判った。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日20mg以上のアンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン分解物を摂取すれば効果が期待できるので、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。
【００１７】
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、0.001〜2重量％となるように、アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。
【００１８】
次に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１９】
【実施例１】
陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製）400gを充填したカラム（直径5cm×高さ30cm）を脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳40 l (pH 6.7)を流速25ml/minで通液した。通液後、カラムを脱イオン水で十分洗浄し、2.0M塩化ナトリウムを含む 0.02M炭酸緩衝液(pH 7.0)で溶出した。そしてアンジオジェニンを含有する溶出画分をS-Sepharose FFカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、10mMリン酸緩衝液（pH7．0）で平衡化した後、0〜2.0M塩化ナトリウムのリニアグラジエントで吸着した画分を溶出し、アンジオジェニンを含む画分を回収した。そしてその画分をHiLoad 16/60 Superdex 75 pg（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、アンジオジェニンを多く含む画分1.8gを得た。なお、このようにして得られたアンジオジェニンを多く含む画分中のアンジオジェニン含量は10％であり、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【００２０】
【実施例２】
陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール (富士紡績社製) 3,000gを充填したカラムを脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳100 l (pH 6.7)を通液した。次に、このカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、0.1〜2.0M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、アンジオジェニンを含有する溶出画分を S-Sepharose陽イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製）で分画し、得られたアンジオジェニン含有画分を90℃で10分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、このアンジオジェニン含有画分をMono S陽イオン交換クロマトグラフィー、Superose12ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びC4逆相クロマトグラフィーで順次処理し、アンジオジェニン55mgを得た。なお、このようにして得られたアンジオジェニンの純度は99％であり、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【００２１】
【実施例３】
実施例２で得られたアンジオジェニン5mgを水10mlに溶解し、最終濃度0.01重量％となるようパンクレアチン（シグマ社製）を1％加え、37℃で５時間酵素処理した。そして、90℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してアンジオジェニン分解物 4.0mgを得た。このようにして得られたアンジオジェニン分解物の分子量は10,000以下であり、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【００２２】
【実施例４】
実施例２で得られたアンジオジェニン5mgを水10mlに溶解し、最終濃度0.01重量％となるようトリプシン（シグマ社製）を加え、37℃で5時間酵素処理した。そして、90℃で5分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してアンジオジェニン分解物 4.2mgを得た。このようにして得られたアンジオジェニン分解物の分子量は10,000以下であり、そのまま皮膚コラーゲン産生促進剤として使用可能である。
【００２３】
【試験例１】
実施例２で得られたアンジオジェニン及び実施例３で得られたアンジオジェニン分解物について、ラットを用いた動物実験によりコラーゲン産生促進作用を調べた。7週齢のWistar系雄ラットを、生理食塩水投与群（Ａ群）、実施例２で得られたアンジオジェニンをラット体重1kg当たり20mg投与する群（Ｂ群）、実施例２で得られたアンジオジェニンをラット体重1kg当たり200mg投与する群（Ｃ群）、実施例３で得られたアンジオジェニン分解物をラット体重1kg当たり20mg投与する群（Ｄ群）、実施例３で得られたアンジオジェニン分解物をラット体重1kg当たり200mg投与する群（Ｅ群）の5試験群（n=6）に分け、それぞれを毎日1回ゾンデで投与して10週間飼育した。
皮膚のコラーゲン量については、ラットの真皮をNimniらの方法(Arch. Biochem. Biophys., 292頁, 1967年参照)に準じて処理した後、可溶性画分に含まれるヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンのみに含まれる特殊なアミノ酸で、コラーゲンを構成する全アミノ酸の約10％を占めることからコラーゲン量の推定ができる(浅野隆司ら,Bio Industory，12頁, 2001年参照)。その結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
──────────────────―――
群ヒドロキシプロリン量(μg/ml)
──────────────────―――
Ａ群 0.3±0.1
Ｂ群 0.9±0.2^※
Ｃ群 1.3±0.2^※
Ｄ群 0.8±0.1^※
Ｅ群 1.1±0.2^※
──────────────────――
数値は、平均値±標準偏差（n=6）を示す。
また、※は対照群であるＡ群と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。
【００２５】
これによると、10週間後の可溶性画分中、ヒドロキシプロリン量は、Ａ群に比べ、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群及びＥ群で有意に高い値を示した。
このことから、アンジオジェニン及びアンジオジェニン分解物には皮膚コラーゲン産生促進作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。
また、この皮膚コラーゲン産生促進作用はアンジオジェニンまたはアンジオジェニン分解物をラット体重1kg当たり最低20mg投与した場合に認められることが明らかとなった。
【００２６】
【実施例５】
表２に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温1年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。
【００２７】
【表２】
───────────────────────────
混合異性化糖 15.0（重量％）
果汁 10.0
クエン酸 0.5
アンジオジェニン（実施例２） 0.1
香料 0.1
ミネラル混合 0.1
水 74.2
───────────────────────────
【００２８】
【実施例６】
表３に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼して皮膚コラーゲン産生促進用ビスケットを製造した。
【００２９】
【表３】
──────────────────────────
小麦粉 50.0（重量％）
砂糖 20.0
食塩 0.5
マーガリン 12.5
卵 12.5
水 2.5
ミネラル混合 0.8
アンジオジェニン（実施例２） 1.2
──────────────────────────
【００３０】
【実施例７】
表４に示す配合の皮膚コラーゲン産生促進剤を常法により製造した。
【００３１】
【表４】
───────────────────────────
含水結晶ぶどう糖 83.5（重量％）
アンジオジェニン（実施例２） 10.0
ミネラル混合 5.0
シュガーエステル 1.0
香料 0.5
───────────────────────────
【００３２】
【試験例２】
実施例２で得られたアンジオジェニン及び実施例３で得られたアンジオジェニン分解物について、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたCCD45SK(ATCCRL 1506)〕を用いた実験により皮膚コラーゲン産生促進作用を調べた。10容量％ウシ胎児血清(以下FBSと略記)含有変法イーグル培地（MEM、10‐101、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を4×10⁴個/ウエル/0.4mlとなるように24ウエルプレートに播種して、5％炭酸ガス、飽和水蒸気下、37℃で24時間培養した後、0.6容量％FBS含有MEM培地に置換した。そして、実施例２で得られたアンジオジェニン及び実施例３で得られたアンジオジェニン分解物を、各ウエルに0.1容量％となるように添加（n=6）して、24時間培養した後、β-アミノプロピオニトリルを50μg/ml、トリチウム-L-プロリンを1μCi/mlとなるように添加して、さらに24時間培養して培養液を得た。このようにして得られた培養液より、Websterらの方法(Analytical Biochemistry,220頁,1979年参照)に従いコラーゲン画分を分画し、コラーゲン画分に取り込まれた放射能を測定した。なお、対照として、アンジオジェニン及びアンジオジェニン分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表５に示す。
【００３３】
【表５】

数値は、平均値±標準偏差（n=6）を示す。
また、※は対照群と比較して有意差があることを示す（p<0.05）。
【００３４】
これによると、アンジオジェニン及びアンジオジェニン分解物を添加した群は、アンジオジェニン及びアンジオジェニン分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも2倍以上のコラーゲン産生促進能を示した。
このことから、アンジオジェニン及びアンジオジェニン分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、コラーゲン産生を促進する作用があることが明らかとなり、皮膚コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。
【００３５】
【実施例８】
表６に示す配合の化粧水を常法により製造した。
【００３６】
【表６】

【００３７】
【実施例９】
表７に示す配合のクリームを常法により製造した。
【００３８】
【表７】

【００３９】
【試験例３】
実施例８で得られた化粧水及び実施例９で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、アンジオジェニンを除いた以外は実施例８及び９と同じ配合のものを用いた。
顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女子20人を、それぞれ10人ずつ無作為に2群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女子20人を、それぞれ10人ずつ無作為に2群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水を、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水を、Ｃ群の手指には本発明品のクリームを、Ｄ群の手指には比較品のクリームを、それぞれ1日2回通常の使用状態と同様に10日間塗布してもらった。その結果、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒れ等の改善が顕著であり、皮膚コラーゲン産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。
【００４０】
【発明の効果】
本発明により、アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料が提供される。
本発明の皮膚コラーゲン産生促進剤、皮膚コラーゲン産生促進用飲食品及び皮膚コラーゲン産生促進用化粧料は、皮膚のコラーゲン産生を促進させる作用を有し、皮膚のシワやたるみ、乾燥感や肌荒れの予防や治療に有用である。

Claims

アンジオジェニン及び／またはアンジオジェニンをパンクレアチンまたはトリプシンで加水分解して得られるアンジオジェニン加水分解混合物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
請求項１に記載のアンジオジェニン及び／またはアンジオジェニン加水分解混合物を配合した皮膚コラーゲン産生促進用化粧料。