JP5118398B2 - コラーゲン産生促進能及び/又は線維芽細胞増殖促進能を有する組成物 - Google Patents
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(1)(A)アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、(B)ダイズタンパク質のサーモリシン分解物とを含有する組成物。
(2)細胞におけるコラーゲン産生を促進するために使用され得る、項目(1)に記載の組成物。
(3)線維芽細胞増殖を促進するために使用され得る、項目(1)又は(2)に記載の組成物。
脂肪族カルボン酸としては、飽和又は不飽和の炭素数1〜22の脂肪族カルボン酸が挙げられ、好ましくは飽和又は不飽和の炭素数2〜18の脂肪族カルボン酸である。具体例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ピバル酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、オクチル酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ベヘン酸、アクリル酸、プロピオル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸、ウンデシレン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リシノレン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、シクロペンタンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸などの脂肪族モノカルボン酸;シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フマル酸、マレイン酸などの脂肪族ジカルボン酸又はそのモノエステル(例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、s−ブチル、t−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル等の炭素数1〜6のアルキルエステル等);レチノイン酸等が挙げられる。また、脂肪族カルボン酸は置換されていても良く、その置換基としては、炭素数1〜6のアルコキシ基(例、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、s−ブトキシ基、t−ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等)、ハロゲン原子(例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子)、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
芳香族カルボン酸としては、炭素数7〜12の芳香族カルボン酸が挙げられ、好ましくは炭素数7〜10の芳香族カルボン酸である。具体例としては、安息香酸、ナフトエ酸、桂皮酸等の芳香族モノカルボン酸;フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸等の芳香族ジカルボン酸;等が挙げられる。また、芳香族カルボン酸は置換されていても良く、その置換基としては、炭素数1〜6のアルキル基(例、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、s−ブチル基、t−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等)、炭素数1〜6のアルコキシ基(例、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、s−ブトキシ基、t−ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等)、ハロゲン原子(例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子)、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
アルケニル基としては、炭素数2〜12のアルケニル基が挙げられ、好ましくは炭素数2〜6のアルケニル基である。具体例としては、ビニル基、アリル基、ブテニル基(例、1−ブテニル、2−ブテニル)等が挙げられる。
これらアルキル基及びアルケニル基は置換されていても良く、その置換基としては、炭素数1〜6のアルコキシ基(例、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、s−ブトキシ基、t−ブトキシ基、イソブチルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基等)、ハロゲン原子(例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子)、アミノ基、ヒドロキシ基、オキソ基、フェニル基等が挙げられる。
糖残基としては、単糖残基、オリゴ糖残基等が挙げられる。単糖残基の具体例としては、グルコース残基、フラクトース残基、ガラクトース残基、マンノース残基、タロース残基、イドース残基、アルトロース残基、アロース残基、グロース残基、キシロース残基、リボース残基、アラビノース残基、ラムノース残基、フコース残基、グルクロン酸残基等が挙げられる。オリゴ糖残基としては、2〜10の単糖からなるオリゴ糖残基が挙げられる。オリゴ糖残基の構成単糖としては、グルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノース、タロース、イドース、アルトロース、アロース、グロース、キシロース、リボース、アラビノース、ラムノース、フコース、グルクロン酸等が挙げられ、これらは同一又は異なっていてもよい。糖残基のヒドロキシ基の水素原子は置換されていても良く、その置換基としては、炭素数1〜7のアシル基(例、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基等)、炭素数1〜6のアルキル基(例、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、s−ブチル基、t−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等)等が挙げられる。
また、本発明において用語「線維芽細胞増殖促進能を有する」とは、被験物を線維芽細胞に作用させた場合に、当該被験物を作用させない場合と比較して、線維芽細胞の増殖が促進されることを意味する。特定の態様では、当該用語における線維芽細胞とは皮膚線維芽細胞を意味する。
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物の調製
粉末状分離ダイズタンパク質(製品名「PR-800」、不二製油株式会社製)50gを2Lの蒸留水に分散し、0.1N NaOHでpH8.0に調整した。500mgのサーモリシン(EC3.4.24.4、Bacillus thermoproteolyticus由来、製品名「サモアーゼPC10F」、大和化成株式会社製、100 units/mg)を添加して、60℃で15時間での分解を行なった。反応後、100℃で10分間煮沸してサーモリシンを失活させた。放冷後、25gのろ過助剤(ラジオライト500、昭和化学工業株式会社)を添加し、撹拌した後、ろ過を行なった。得られたろ液を500mlまで減圧濃縮し、その後凍結乾燥をして、最終的に約26gのダイズタンパク質サーモリシン分解物を得た。
実施例2
皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生検定
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞(CRL−1836)を、48ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、1.0×104細胞/ウェルの密度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で2日間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)に牛胎仔血清(FBS)を10重量%の濃度で含有した培地を各ウェル400μlずつ使用した。次いで、FBSを添加しない上記培養液すなわち無血清培地に交換し、さらに1日間培養した。その後、培養液を除去し、下記の表1に示す被験薬をそれぞれの濃度で溶解した400μlの無血清培地に交換して培養した。一方、L−アスコルビン酸もダイズサーモリシン分解物も添加しない無血清培地を400μl添加したものをコントロールとして用いた。3日間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたタイプIコラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法(Anti−Human Procollagen typeI C−peptide EIA Kit;タカラバイオ株式会社製)で定量した。定量結果をもとに、コントロール培養液中のタイプIコラーゲン量を100%として各被験培養液中のコラーゲン量を算出した。この結果を表1に纏める。
また、L−アスコルビン酸とダイズサーモリシン分解物とを組み合わせることにより得られるコラーゲン産生促進作用は、相乗効果的に著しく高いものであることも同時に認められた。
ダイズサーモリシン分解物の分子量分画物の調製
ダイズサーモリシン分解物の分子量分画物を用いても、L−アスコルビン酸のコラーゲン産生促進能を増強し得るかどうかを探るため、被験材料として、実施例1で調製したダイズサーモリシン分解物の他に、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物の分子量分画物の調製を行った。
ダイズサーモリシン分解物の分子量分画物のコラーゲン産生促進能検定
以上のようにして調製された分子量分画物を用いて、コラーゲン産生促進能の検定を行った。
まず、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞(CRL−1836;ATCC)を、48ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、12500細胞/1cm2密度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で約72時間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(D−MEM)に牛胎仔血清(FBS)を10重量%の濃度で含有した培地を各ウェル500μlずつ使用した。細胞がコンフルエントになった時点で、培養液を除去し、下記の表2に示す被験物を100μg/ml添加したD−MEM培地を500μlずつ添加した。なお、実施例1で調製したダイズサーモリシン分解物も実施例3で調製した分子量分画物も添加しない培地を500μl添加したものをコントロールとして用いた。72時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたタイプIコラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法(Anti−Human Procollagen typeI C−peptide EIA Kit;タカラバイオ株式会社製)で定量した。定量結果をもとに、コントロール培養液中のタイプIコラーゲン量を100%として各被験培養液中のタイプIコラーゲン量を算出した。結果を表2に纏める。
皮膚線維芽細胞の増殖促進試験
上記実施例2において認められた、アスコルビン酸類とダイズサーモリシン分解物との併用によるコラーゲン産生促進効果の作用機序について詳しく調べるため、コラーゲンを産生する線維芽細胞の増殖に対する両成分の影響を検討した。
<1> L−アスコルビン酸とダイズサーモリシン分解物の併用作用:
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞(NHDF;CRL−2089)を、96ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、1280細胞/ウェルの密度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で24時間培養を行った。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)に牛胎仔血清(FBS)を10重量%の濃度で含有した培地を各ウェル200μlずつ使用した。次いで、上記培養液からFBSを抜いた無血清培地に交換し、さらに24時間培養した。その後、培養液を除去し、下記の表3に示す被験薬をそれぞれの濃度で溶解した200μlの無血清培地に交換して培養した。一方、L−アスコルビン酸もダイズサーモリシン分解物も添加しない無血清培地を200μl添加したものをコントロールとして用いた。さらに24時間培養した後、WST−1法よりも高感度とされているWST−8法にて各ウェル中の生細胞数を計測した(Cell Counting Kit−8;(株)同仁化学研究所製)。測定結果をもとに、コントロールにおける生細胞数を100%として、各被験薬添加群の生細胞数(%)を算出した。この結果を表3に纏める。
L−アスコルビン酸に代えて、リン酸L−アスコルビルマグネシウムを用い、上記<1>と同様にして、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞に対する増殖促進作用を調べた。その結果を、下記の表4に纏める。
〔成分〕 〔比率〕
アスコルビン酸グルコシド 2.0
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物(平均分子量1500) 0.5
スクワラン 2.0
流動パラフィン 5.0
セタノール 0.5
モノステアリン酸グリセリル 2.0
POE(25)セチルエーテル 2.0
トリエタノールアミン 0.8
グリセリン 4.0
1,3-ブチレングリコール 6.0
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
100.0重量%
〔成分〕 〔比率〕
テトライソパルミチン酸アスコルビル(VCIP) 1.0
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物(平均分子量1500) 1.0
ワセリン 1.0
スクワラン 5.0
流動パラフィン 10.0
ステアリン酸 1.5
ステアリルアルコール 2.0
モノステアリン酸グリセリル 2.0
POE(20)セチルエーテル 3.0
トリエタノールアミン 1.0
グリセリン 6.0
1,3-ブチレングリコール 8.0
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
100.0重量%
〔成分〕 〔比率〕
L−アスコルビン酸モノリン酸エステルナトリウム塩 0.2
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物(平均分子量1500) 0.1
POE(20)ソルビタンモノイソステアリン酸エステル 0.3
コハク酸 0.2
コハク酸ナトリウム 0.5
エデト酸三ナトリウム 0.05
1,3-ブチレングリコール 6.0
防腐剤 適量
香料 適量
精製水 適量
100.0重量%
〔成分〕 〔比率〕
L−アスコルビン酸 0.5
ダイズタンパク質のサーモリシン分解物(平均分子量1500) 1.0
ビタミンB2 0.005
エリスリトール 10.0
酸味料 1.0
甘味料 1.0
香料 0.01
精製水 残量
100.0重量%
Claims (2)
- (A)アスコルビン酸、アスコルビン酸のエステル誘導体、アスコルビン酸のエーテル誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、
(B)ダイズタンパク質の平均分子量300〜10000のサーモリシン分解物
とを含有する組成物。 - 細胞におけるコラーゲン産生を促進するために使用され得る、請求項1に記載の組成物。
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