JP5588474B2 - コラーゲンおよび/またはヒアルロン酸産生促進用組成物 - Google Patents
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Description
[1] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を含有する、細胞におけるコラーゲンおよびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種の産生を促進するための組成物、
[2] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を用いて、細胞におけるコラーゲンおよびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種の産生を促進する方法、
[3] 細胞におけるコラーゲンおよびヒアルロン酸からなる群より選択される少なくとも1種の産生を促進するための組成物の製造のための、ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物の使用、
[4] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を含有する、角質水分低下を抑制するための組成物、
[5] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を含有する、皮膚の粗さを改善するための組成物、
[6] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を用いて、角質水分低下を抑制する方法、
[7] ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物を用いて、皮膚の粗さを改善する方法、
[8] 角質水分低下を抑制するための組成物の製造のためのダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物の使用、並びに
[9] 皮膚の粗さを改善するための組成物の製造のためのダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物の使用、
に関するものである。
なお、コラーゲン産生促進能の有無は、例えば、後述の実施例2等に記載のようにして確認することができる。また、ヒアルロン酸産生促進能の有無は、例えば、後述の実施例7に記載のようにして確認することができる。
本発明の該組成物を用いることにより、高い角質水分低下抑制効果、即ち、高い保水力向上作用を奏する。
本発明の該組成物を用いることにより、皮膚の粗さ改善効果を奏する。
粉末状分離ダイズタンパク質(製品名「PR-800」、不二製油株式会社製)50gを2Lの蒸留水に分散し、0.1N NaOHでpH8.0に調整した。500mgのサーモリシン(Bacillus thermoproteolyticus由来、製品名「サモアーゼPC10F」、大和化成株式会社製、100 units/mg)を添加して、60℃で15時間での分解を行なった。反応後、100℃で10分間煮沸してサーモリシンを失活させた。放冷後、25gのろ過助剤(ラジオライト500、昭和化学工業株式会社)を添加し、撹拌した後、ろ過を行なった。得られたろ液を500mlまで減圧濃縮し、その後凍結乾燥をして、最終的にダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物として、26gのサーモリシン加水分解物を得た。
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞(CRL−1836;ATCC)を、48ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、12500細胞/1cm2密度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で約72時間培養を行なった。培養液は、Dulbecco’s Modified Eagle Medium(D−MEM)に牛胎仔血清(FBS)を10重量%の濃度で含有させた培地を各ウェル500μLずつ使用した。細胞がコンフルエントになった時点で、培養液を除去し、D−MEMに実施例1で調製したサーモリシン加水分解物を100、300、または1000μg/ml濃度添加した培地を500μlずつ添加した。なお、ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物を添加しない培地を500μl添加したものをコントロールとして用いた。さらに72時間培養した後、培養液を採取し、培養液中のタイプIコラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法(Anti−Human Procollagen typeI C−peptide EIA Kit;タカラバイオ株式会社製)で定量した。定量結果をもとに、コントロール培養液中のタイプIコラーゲン量を100%として、ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物添加培養液のタイプIコラーゲン量を算出した。結果を表1に示す。
実施例2で培養液を採取した後の細胞に対してD−MEMを250μl添加した後、Cell Counting Kit−8(同仁化学研究所製)を用いて生細胞の数を計測した。結果を表2に示す。
1)加水分解処理
脱脂大豆粉末(商品名プロファム974、ADMファーイースト株式会社製)1gを40mlの蒸留水に分散し、0.1N NaOHでpH8.5に調整した。これに50mgのサーモリシン(製品名「サモアーゼPC10F」、大和化成株式会社製)を添加して、60℃で15時間での分解を行った。反応後、100℃で10分間煮沸してサーモリシンを失活させた。放冷後、1gのろ過助剤(ラジオライト500、昭和化学工業株式会社)を添加し、撹拌した後、ろ過を行った。
上述のようにして得られたろ液40mlを、強酸性イオン交換樹脂(商品名「Dowex 50W×2,H+form,50−100mesh」、ダウケミカルカンパニー製)を充填した150ml容カラムに通した後、カラムの5倍容の脱イオン水で洗浄し、非ペプチド成分を除去した。2Mのアンモニア溶液を通液し、カラム吸着成分を溶出させて、ペプチド画分を回収した。エバポレーターを用いてアンモニアを除去し、更に濃縮して乾固させた。5mlの水を加えて乾固物を溶解した後、遠心分離(10,000rpm、30分間)を行い、不溶物を除去した。その上清を凍結乾燥した結果、ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物として、125mgの粗ペプチドが得られた。
GPC法により分子量分画を行った。Sephadex G−25(Mediumタイプ、Amersham Biosciences社製)を充填したカラム(φ2.6×100cm)を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化した。次いで、このカラムに、凍結乾燥後の上記粗ペプチド125mgを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)2.0ml中に溶解した粗ペプチド溶液を全量負荷し、流速1.0ml/分で溶出した。分子量既知のペプチド標品として、実施例1で使用したものと同様の標品を用い、214nmでペプチドを検出した。溶出時間から分子量分布および平均分子量を推定した。分子量分布3000〜3400(平均分子量約3200)のフラクション(F1)、分子量分布2000〜3000(平均分子量約2500)のフラクション(F2)、分子量分布1000〜2000(平均分子量約1500)のフラクション(F3)、および分子量分布100〜1000(平均分子量約550)のフラクション(F4)を得た。これらを脱塩処理後に凍結乾燥することにより、26.0mg(F1)、32.8mg(F2)、16.4mg(F3)および4.2mg(F4)の粉末を得た。
実施例2においてサーモリシン加水分解物を100、300、または1000μg/ml濃度添加して実施した代わりに、実施例4で得たF1〜F4粉末を各々100μg/ml濃度添加して実施した以外は、実施例2と同様にして、皮膚線維芽細胞におけるタイプIコラーゲン産生促進効果を調べた。結果を表3に示す。
実施例5で培養液を採取した後の細胞に対して、実施例3と同様にして生細胞の数を計測した。結果を表4に示す。
ヒト正常表皮角化細胞(NHEK、倉敷紡績株式会社製)を48ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、25000細胞/1cm2密度でプレートに播種し、37℃で、5%炭酸ガスおよび95%空気の環境下で約72時間培養を行なった。培養液は、HuMedia KG−2(倉敷紡績株式会社製)を各ウェル400μLずつ使用した。72時間後に培養液を除去し、実施例1に記載のようにして調製したダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物を、30、100または300μg/ml濃度添加したHuMedia KG−2培地を400μLずつ添加した。なお、当該加水分解物を添加しない培地を400μL添加したものをコントロールとして用いた。さらに72時間培養した後、培養液を採取し、培養液中のヒアルロン酸濃度を酵素結合免疫測定法(ヒアルロン酸測定キット;生化学工業株式会社製)で定量した。定量結果をもとにコントロール培養液中のヒアルロン酸量を100%として、ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物添加培養液のヒアルロン酸量を算出した。結果を表5に示す。
へアレスマウスを用いて紫外線によるシワ発生に対する予防効果を、ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物の塗布試験により検定する。すなわち、5週齡雄性へアレスマウスを3群に分け(8匹/1群)、3週間にわたり、第1週目に90mJ/cm2、第2週目に120mJ/cm2、第3週目に150mJ/cm2のUVB紫外線を1週間あたり3回照射する。また紫外線を照射している3週間、各群のヘアレスマウスには、ダイズタンパク質のプロテアーゼ加水分解物等を含有する試験溶液を50μl(適用量:1μg/cm2)ずつ1日3回背中に塗布する。そして、第1回目の紫外線照射から24日後に、目視にてシワを7段階にスコア化(表6)し、シワ発生の予防効果を評価する。この抗シワ検定により、プロテアーゼ加水分解物を含有する試験溶液を塗布した群に優れたシワ発生の予防効果が認められる。
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞(CRL−1836;ATCC)を、60φシャーレ中で培養した。より詳細には、2500細胞/1cm2の密度でシャーレに播種し、37℃で、5%炭酸ガス及び95%空気の環境下で、サブコンフルエントになるまで6日間培養を行なった。培養液は、Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に牛胎仔血清(FBS)を10重量%の濃度で含有した培地を3ml使用した。次いで、FBSを添加しない上記培養液(すなわち、無血清培地)に交換し、さらに1日間培養した。その後、実施例1で調製したサーモリシン加水分解物を3000μg/ml濃度添加した無血清培地3mlに交換して24時間培養した。一方、ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物を添加しない無血清培地3mlに交換したものをコントロールとした。
1)角質水分低下抑制効果
以下のようにして、角質層の乾燥に及ぼすぺプチド経口投与の影響を検討した。
5週齢の雌のヘアレスマウス(各群5匹)に対し、被験ぺプチド(実施例1と同様にして調製したダイズタンパク質のサーモリシン分解物(平均分子量1500)又は市販のコラーゲンぺプチド(テラピア鱗コラーゲンぺプチド、商品名:マリンコラーゲンリッチ500、日本化薬製))を、5g/kg/日となるように食餌に混ぜて自由摂食させた。一方、被験ペプチドを含まない食餌を摂取させたものを対照群とした。
また上記と同様の試験系において、UV照射12週目におけるヘアレスマウスの皮膚の粗さを2次元皮膚表面解析装置ビジオスキャン(Courage+Khazaka社製)を用いて解析を行なった。その結果、対照群のスコア(0.938)に比べて、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物の投与群では0.472、コラーゲンペプチド投与群では0.496といずれも、対照群と比較して統計学的に有意に低い数値を示すことが明らかとなった。従って、ダイズタンパク質のサーモリシン分解物は、コラーゲンペプチドと同様に、その経口摂取により皮膚の粗さを有意に改善させる効果を持つことが認められた。
清涼飲料水の処方例1
原料 1本(50g)当たりの配合量(g)
ダイズタンパク質の
サーモリシン加水分解物 1.0
ビタミンC 0.5
ビタミンB2 0.05
エリスリトール 5.0
香料 0.01
精製水 43.44
Claims (7)
- ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物を含有する食品組成物を経口摂取させ、皮膚のコラーゲンおよび/またはヒアルロン酸量の低下に起因する状態を改善および/または予防させる美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 皮膚の角質水分低下を抑制させる、請求項1に記載の美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 皮膚の保水力を向上させる、請求項1又は2に記載の美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 皮膚の粗さを改善させる、請求項1〜3のいずれかに記載の美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 皮膚のシワおよび/またはタルミを改善および/または予防させる、請求項1〜4のいずれかに美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 皮膚の弾力性および/またはハリの低下を改善および/または予防させる、請求項1〜5のいずれかに記載の美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
- 前記ダイズタンパク質のサーモリシン加水分解物の平均分子量が300〜10000である、請求項1〜6のいずれかに記載の美容方法(但し、ヒトの疾病を治療する方法は除く。)。
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