JPH07250679A - 変異型サーモリシンｔｙ１４０及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、配列番号：１で表わされ、サーモリ
シンのアミノ酸配列の１４０番目のバリン残基が、アラ
ニン残基に置換されていることを特徴とする変異型サー
モリシンＴＹ１４０及び配列番号：１のアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含む変異型サーモリシンＴＹ１４
０の遺伝子、特に配列番号：２の塩基配列を有する上記
遺伝子を提供する。 【効果】本発明遺伝子は、変異型サーモリシンＴＹ１４
０のアミノ酸配列をコードし、その製造に有用であり、
また本発明変異型サーモリシンＴＹ１４０は、サーモリ
シンに比して熱安定性、基質特異性、これを利用して得
られる蛋白分解物の特性面等でより有利である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な変異型サーモリシ
ンＴＹ１４０及びその遺伝子に関する。

【０００２】

【従来技術とその課題】バチルス・サーモプロテォリテ
ィカス・ロッコ〔Bacillus thermoproteolyticus Rokk
o, Endo,S., J.Fermentation Tech.,40, 346-353 (196
2)〕由来の中性プロテアーゼであるサーモリシンは、３
１６アミノ酸残基からなるポリペプチドの三次元構造を
有することが知られており〔B.W. Matthews, et al., N
ature, 238, 37-41 (1972)〕、該酵素を構成する蛋白質
の完全なアミノ酸配列も知られており〔Titani et al.,
Nature, 238, 35-37 (1972)〕、また該ポリペプチドを
コードする遺伝子及びそのプレ・プロ配列も明らかにさ
れている〔例えば特開平３−２３２４９４号公報等参
照〕。

【０００３】上記酵素は、例えば人工甘味料アスパルテ
ームの合成等の食品分野を始めとして、洗剤、化粧品分
野等において有用なものであるが、その有用性を向上さ
せ、利用分野を更に拡大させるためには、該酵素の基質
特異性、至適ｐＨ、物理的安定性等の諸性質の改善が必
要となり、この改善は、該酵素蛋白質のアミノ酸配列の
改変によってなされることが好ましい。

【０００４】本発明者らは、上記観点より鋭意研究を重
ねてきたが、その過程で、上記酵素の生産菌を変異処理
して得られる各種の変異株の内に、親株と対比して基質
特異性が大きく変化しており、温度安定性や、大豆蛋白
等の分解産物の性質、特に苦み等の点でより優れた酵素
を生産し得る変異株が存在することを見出すと共に、該
変異株の産生する酵素をコードする遺伝子を単離し、そ
の塩基配列及びこれによりコードされるアミノ酸配列を
解析するに成功し、ここに本発明を完成するに至った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
配列番号：１で表わされ、サーモリシンのアミノ酸配列
の１４０番目のバリン残基がアラニン残基に置換されて
いることを特徴とする変異型サーモリシンＴＹ１４０、
並びに配列番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含む変異型サーモリシンＴＹ１４０の遺伝子（以下
「本発明遺伝子」という）、殊に配列番号：２の塩基配
列を有する上記遺伝子が提供される。

【０００６】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡ
Ｃ、ＩＵＢの規定、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む
明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及
び当該分野における慣用記号に従うものとする。

【０００７】本発明遺伝子は、上記変異型サーモリシン
ＴＹ１４０構成蛋白質のアミノ酸をコードしており、該
蛋白質の遺伝子工学的手法による製造に利用でき、また
該酵素の研究や更なる改変等に有用である。

【０００８】本発明遺伝子の単離は、一般的遺伝子工学
手法により、代表的には例えば本発明遺伝子を含む目的
酵素生産菌よりゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ法〔ポリ
メラーゼ・チェイン・リアクション法、Saiki,R.K. et
al., Science, 239, 487-491(1988) 〕を利用して、直
接クローニングする方法により実施することができる。
該ＰＣＲ法における各操作はいずれも公知の方法に従う
ことができる。

【０００９】例えば、プライマーの調製は、ホスホアミ
ダイト法等に従うことができ、ＤＮＡの単離精製は、ア
ガロースゲル電気泳動法に従うことができ、本発明遺伝
子のＤＮＡ配列の決定は、ジデオキシ法〔Sanger,F. e
t. al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A., 74, 5463-5467
(1977)〕等や市販のシークエンスキットを用いる方法
等に従うことができる。

【００１０】また、目的遺伝子の選出方法としては、サ
ザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリダイゼ
ーション法〔何れもSouthern,E.M., J.Mol.Biol., 98,
503-517 (1975)〕等を採用できる。その他ＤＮＡを取扱
う各種の遺伝子工学的手法は、いずれもモレキュラーク
ローニング〔Maniatis,T., Fritsch,E.F. and Sambroo
k,J., Molecular Cloning A Laboratory Manual/second
edition, Cold SpringHarbor Laboratory N.Y. (198
8)〕に従い実施できる。

【００１１】また本発明遺伝子は、その遺伝情報に基づ
いて、これを例えばホスファイト・トリエステル法（Na
ture, 310, 105 (1984) ）等の常法に従って化学合成す
ることもでき、更に公知の確立されたサーモリシン遺伝
子やその前駆体をコードする遺伝子を利用して、上記遺
伝情報に従ってこれらをサイトスペシフィック・ミュー
タジェネシス等に従い改変する方法等によっても製造す
ることができる。

【００１２】かくして得られる本発明遺伝子は、配列番
号：１で表わされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配
列を有すること、殊に該アミノ酸配列において、成熟サ
ーモリシン蛋白のＮ末端アミノ酸Ile を第１番目として
数えて１４０番目のVal がAla に置換されたアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ配列（即ち、ＧＴＣがＧＣＣに変
異されたＤＮＡ）を有していることにより特徴付けられ
る。

【００１３】より詳しくは、これは配列番号：２で表わ
されるＤＮＡ配列を有している。即ち、本発明遺伝子は
２００９ベースの長さを持ち、サーモリシン遺伝子と同
じ１６４４ベース（５４８アミノ酸残基に相当）からな
る一つの大きなオープンリーディングフレーム（２８８
位〜１９３１位）を有している。該リーディングフレー
ム中、成熟サーモリシンＴＹ１４０遺伝子は、９８４位
〜１９３１位に存在し、その上流の配列は、プレ配列及
びプロ配列（全２３２アミノ酸残基に相当）である。ま
た、上記配列番号：２に示すＤＮＡ配列中、１９４５位
〜１９７５位は目的遺伝子のターミネーター構造である
と考えられる。

【００１４】本発明遺伝子は、これを利用して遺伝子組
換え技術により、変異型サーモリシンＴＹ１４０を製造
できる。より詳しくは、本発明遺伝子が宿主細胞中で発
現できるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞
に導入して形質転換し、該形質転換株を培養することに
より、所望酵素を収得でき、該酵素は常法に従って、例
えば塩析法、遠心分離法、浸透圧ショック法、超音波破
砕法、限外濾過法、ゲル濾過法、吸着クロマトグラフィ
ー法、イオン交換クロマトグラフィー法、高速液体クロ
マトグラフィー法等により分離、精製できる。

【００１５】かくして得られる本発明酵素、即ち変異型
サーモリシンＴＹ１４０は、前記したように、そのアミ
ノ酸配列中１４０番目のアミノ酸残基がAla であること
に基づいて、該アミノ酸残基がVal であるサーモリシン
とは異なり且つ該サーモリシンからは予期できない立体
構造をとり、これに基づいてサーモリシンとは顕著に異
なる特有の基質特異性を有し、また温度安定性、大豆蛋
白等の分解産物の苦みの低減効果等を奏し得、これらの
点で工業的利用、殊に食品分野での利用に非常に有用で
ある。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。

【００１７】

【実施例１】本例においては、サーモリシン生産菌であ
るバチルス・サーモプロテォリティカス・ロッコ、その
変異株である変異型サーモリシンＴＹ１４０生産菌及び
シークエンス用宿主菌であるエッシェリヒア・コリー
（E.coli JM109）を使用した。

【００１８】既にクローニングされ塩基配列の決定され
ているサーモリシン遺伝子（ドイツ特許DE3929531A1 参
照）の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用プライマーとし
て、下記表１に示す塩基配列のＰＮ及びＰＣを、ファル
マシア社製ＤＮＡ合成機ジーンアセンブラープラスを用
いてホスホアミダイト法により合成した。

【００１９】

【表１】

【００２０】尚、ＰＮは制限酵素Eco RI切断点を、また
ＰＣはXba I 切断点をそれぞれ有するように設計した。

【００２１】上記２種のプライマーを用い、変異型サー
モリシンＴＹ１４０生産菌に由来する染色体ＤＮＡを鋳
型として、ＰＣＲ法を実施した。該ＰＣＲ法は、ＰＣＲ
用反応液としてジーンＡＭＰ ＰＣＲリエージェントキ
ット（Gene AMP PCR Reagentkit, 宝酒造社製）を、温
度コントローラーとしてアステック社製ＰＣ−７００を
それぞれ使用して、９２℃１分、５５℃２分及び７２℃
３分を１サイクルとして、３０サイクルにて実施した。

【００２２】上記ＰＣＲ反応により生じた産物をアガロ
ースゲル電気泳動により観察して、所望の２ｋｂ前後の
大きさをもつＤＮＡバンドを確認した。尚この時、他に
マイナーなバンドは観察されなかった。

【００２３】上記ＰＣＲ断片をアガロースゲルから、抽
出、精製し、直接シークエンスの試料とした。

【００２４】上記試料につき、ジデオキシシークエンス
法〔Sanger,F., et al., Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.
A., 74, 5463-5467 (1977)〕により、シークエンス反応
を行なって塩基配列を決定した。この反応は、オートリ
ードシークエンスキット（ファルマシア社製）を用い
て、蛍光標識されたＭ１３ユニバーサルプライマーから
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼにより反応を開始し、次いで該
反応により合成されたＤＮＡ断片をファルマシア社製Ｄ
ＮＡシークエンサー（A.L.F. DNA Sequencer）を用いて
解読した。

【００２５】上記シークエンス法において、最初にＰＣ
Ｒ断片を各種制限酵素により切断して得られた簡単な制
限酵素地図を図１に示す。また図１には、上記シークエ
ンス法に採用したシークエンス ストラテジィーを併記
する。

【００２６】上記ストラテジィーに従い決定されたサー
モリシンＴＹ１４０遺伝子の塩基配列は、配列表に配列
番号：２として示す通りである。

【００２７】該配列表より、本発明遺伝子は、その５′
端側及び３′端側にそれぞれ開始コドンＡＴＧ及び終止
コドンＴＡＡを有し、且つ１６４４ベース（５４８アミ
ノ酸残基に相当）の長いオープンリーディングフレーム
を有することが確認された。また、該遺伝子の有するプ
ロモーター領域、シグナル配列及びプレ・プロ領域は、
既に報告されているサーモリシン遺伝子と同一の塩基配
列を有することも確認された。

【００２８】成熟サーモリシン蛋白をコードする遺伝子
領域においては、サーモリシンＴＹ１４０遺伝子が該サ
ーモリシン遺伝子と異なる箇所は唯一つであり、これは
ＴがＣに置換されたもので、その結果、サーモリシンの
１４０番目（成熟サーモリシン蛋白のＮ末端アミノ酸Il
e を第１番目として）のVal がAla に置換する変異が認
められた。

【００２９】しかるに、上記１４０番目のVal は、サー
モリシンにおいて２つのドメインの間（クレフト）部分
に位置し、酵素の活性中心付近に存在するアミノ酸残基
であり、また該Val 140 付近には、サブサイトとされる
Val 139 やＺｎイオンが結合するとされるHis 142 、Hi
s 146 も存在しており、その位置（１４０）は、サーモ
リシンがプロテアーゼとして作用するための機能に関与
する重要な共通領域内にあり、該Val 140 は該酵素の重
要なアミノ酸残基と考えられたのに対して、該Val 140
をAla に置換した本発明酵素は、実に驚くべきことに、
サーモリシンの活性を維持保有し、しかも、上記位置の
アミノ酸残基の置換（変異）に基づいて、予期できない
立体構造上の変化を受け、これに基づいてサーモリシン
とは顕著に異なる基質特異性を有し、また温度安定性、
大豆蛋白等の分解産物の苦みの低減効果等を奏し得たの
である。

【００３０】以下、本発明の変異型サーモリシンＴＹ１
４０の有する特有の基質特異性等につき、これをサーモ
リシンと比較検討した試験例を挙げる。

【００３１】尚、各例において用いた変異型サーモリシ
ンＴＹ１４０及びサーモリシンは、之等の生産菌を用い
て、遠藤の方法〔Endo,S., J.Pharmentation Tech., 4
0, 346-353 (1962)〕によって調製した。

【００３２】

【試験例１】 温度安定性試験 （１）試験方法 ２ｍＭ ＣａＳＯ₄ 、５．２６ｍＭ ＮａＣｌ及び１
０．５３ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ８．０）を含む緩衝液
１９ｍｌを口径２４ｍｍ試験管（容量３０ｍｌ）に量り
とり、ゆるくＮｏ．５のゴム栓をして、６０、６５及び
７０℃の恒温槽で１０分間予熱した。これに供試酵素液
（１０ＫＰＵ／ｍｌ）１ｍｌを吹き込み、よく混合し、
１５秒以内に約３ｍｌをすばやく採取し、氷水中で冷却
した。３０、６０、９０及び１２０分後に、同様にして
内容液約３ｍｌを採取し、氷水中で冷却した。採取後の
残存力価を測定し、試験前の力価に対する残存活性
（％）を算出した。

【００３３】（２）結果 得られた結果を図２に示す。

【００３４】該図より、変異型サーモリシンＴＹ１４０
は、サーモリシンに比べてより温度安定性が優れたもの
であることが明らかである。

【００３５】

【試験例２】 蛋白分解試験基質として大豆蛋白及びカ
ゼインを利用し、之等に対する各酵素の分解試験を次の
通り実施した。

【００３６】（１）大豆蛋白の分解（可溶化） 脱脂大豆粉（１００メッシュ）２０ｇと蒸留水２００ｍ
ｌとを、オートクレーブ処理（１２１℃、１５分間）
し、水酸化ナトリウムにてｐＨを８に調整後、この液中
に各酵素試料のそれぞれ１００００ＰＵ（大豆１ｇに対
して５００ＰＵとなる濃度）を添加し、６５℃で２４時
間、次いで１００℃で１５分間作用させた。その後、遠
心分離（１０Ｋｒｐｍ×１５分間）して、遠心上清とし
ての大豆蛋白可溶化液を得た。

【００３７】（２）カゼインの分解 ミルクカゼイン（ハマルステン氏法）２ｇを５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌ中に、１００℃で
５分間を要して熱溶解し、この液中に各酵素試料のそれ
ぞれ１０００ＰＵ（カゼイン１ｇに対して５００ＰＵと
なる濃度）を添加し、６５℃で２４時間、次いで１００
℃で１５分間作用させて、カゼイン分解液を得た。

【００３８】（３）分解物の遊離アミノ酸の測定 上記（１）及び（２）で得られた各液につき、それらの
遊離アミノ酸含量（ミリモル／リットル）を測定した。
結果を下記表２に示す。

【００３９】

【表２】

【００４０】（４）大豆蛋白液の可溶化率（窒素可溶化
率） 上記（１）で得た大豆蛋白液の可溶化率（窒素可溶化
率）を求めた結果、変異型サーモリシンＴＹ１４０は、
５２．１％であり、サーモリシンは５３．４％であっ
た。

【００４１】（５）苦み試験 上記（１）及び（２）で得られた各液につき、それぞれ
８人のパネルにより変異型サーモリシンＴＹ１４０を用
いた場合とサーモリシンを用いた場合の何れがより苦み
を感じるかを官能試験した結果、大豆蛋白の分解物の場
合は、両者は蛋白の可溶化率が同程度であるにもかかわ
らず、サーモリシンを用いた場合に苦みを感じるとした
パネルが７／８であり、変異型サーモリシンＴＹ１４０
を用いた場合の方が苦みは低減していた。

【００４２】また、カゼイン分解物の場合もサーモリシ
ンを用いた場合に苦みを感じるとしたパネルが８／８で
あり、変異型サーモリシンＴＹ１４０を用いた場合の方
が顕著に苦みは低減していた。特にカゼイン分解物は、
一般に苦みが著しいものとして知られており、本発明酵
素はかかる苦みを顕著に低減した蛋白分解物を製造でき
る点より、殊に食品分野での利用に有利である。

【００４３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp 1 5 10 15 Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp 20 25 30 Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr 35 40 45 Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala 50 55 60 Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr 65 70 75 80 Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn 85 90 95 Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn 100 105 110 Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln 115 120 125 Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Ala Ala His Glu Leu 130 135 140 Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu 145 150 155 160 Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val 165 170 175 Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val 180 185 190 Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro 195 200 205 Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr 210 215 220 Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 225 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val 245 250 255 Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr 260 265 270 Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala 275 280 285 Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala 290 295 300 Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys 305 310 315

【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：２００９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomin DNA 起源：バチルス属変異型サーモリシンＴＹ１４０ 配列の特徴 特徴を表す記号：sg peptide 存在位置：288..983 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：984..1931 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TACGAATTCT CATTGGTAGT 20 GACCAAGAAC CAAAATATGT GGCAAAAGAC GAACATCCGC CTCCAACCAT CATCATTGCA 80 GCGAAAGATG AACATCCACC AGCAACGATT ATTTGAAGAG GAATAAGCAA AAAGACAGCT 140 AGTTTTCTAG CTGTCTTTTT TCATGCATAG GAAAATGTGA AAAAAACGTA GGGAATTATC 200 AACTATATCA GACTCTATTT TTCCCAATAC AAATACTGTA AATATTGTGT TAATATTCTA 260 AATACAAAGA ATAAAGGAGG ATGAAAA ATG AAA ATG AAA ATG AAA TTA GCA 311 Met Lys Met Lys Met Lys Leu Ala -232 -230 -225 TCG TTT GGT CTT GCA GCA GGA CTA GCG GCC CAA GTA TTT TTA CCT TAC 359 Ser Phe Gly Leu Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gln Val Phe Leu Pro Tyr -220 -215 -210 AAT GCG CTG GCT TCA ACG GAA CAC GTT ACA TGG AAC CAA CAA TTT CAA 407 Asn Ala Leu Ala Ser Thr Glu His Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln -205 -200 -195 ACC CCT CAA TTC ATC TCC GGT GAT CTG CTG AAA GTG AAT GGC ACA TCC 455 Thr Pro Gln Phe Ile Ser Gly Asp Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser -190 -185 -180 CCA GAA GAA CTC GTC TAT CAA TAT GTT GAA AAA AAC GAA AAC AAG TTT 503 Pro Glu Glu Leu Val Tyr Gln Tyr Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe -175 -170 -165 AAA TTT CAT GAA AAC GCT AAG GAT ACT CTA CAA TTG AAA GAA AAG AAA 551 Lys Phe His Glu Asn Ala Lys Asp Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys -160 -155 -150 -145 AAT GAT AAC CTT GGT TTT ACG TTT ATG CGC TTC CAA CAA ACG TAT AAA 599 Asn Asp Asn Leu Gly Phe Thr Phe Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys -140 -135 -130 GGG ATT CCT GTG TTT GGA GCA GTA GTA ACT GCG CAC GTG AAA GAT GGC 647 Gly Ile Pro Val Phe Gly Ala Val Val Thr Ala His Val Lys Asp Gly -125 -120 -115 ACG CTG ACG GCG CTA TCA GGG ACA CTG ATT CCG AAT TTG GAC ACG AAA 695 Thr Leu Thr Ala Leu Ser Gly Thr Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys -110 -105 -100 GGA TCC TTA AAA AGC GGG AAG AAA TTG AGT GAG AAA CAA GCG CGT GAC 743 Gly Ser Leu Lys Ser Gly Lys Lys Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp -95 -90 -85 ATT GCT GAA AAA GAT TTA GTG GCA AAT GTA ACA AAG GAA GTA CCG GAA 791 Ile Ala Glu Lys Asp Leu Val Ala Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu -80 -75 -70 -65 TAT GAA CAG GGA AAA GAC ACC GAG TTT GTT GTT TAT GTC AAT GGG GAC 839 Tyr Glu Gln Gly Lys Asp Thr Glu Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp -60 -55 -50 GAG GCT TCT TTA GCG TAC GTT GTC AAT TTA AAC TTT TTA ACT CCT GAA 887 Glu Ala Ser Leu Ala Tyr Val Val Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu -45 -40 -35 CCA GGA AAC TGG CTG TAT ATC ATT GAT GCC GTA GAC GGA AAA ATT TTA 935 Pro Gly Asn Trp Leu Tyr Ile Ile Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu -30 -25 -20 AAT AAA TTT AAC CAA CTT GAC GCC GCA AAA CCA GGT GAT GTG AAG TCG 983 Asn Lys Phe Asn Gln Leu Asp Ala Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser -15 -10 -5 ATA ACA GGA ACA TCA ACT GTC GGA GTG GGA AGA GGA GTA CTT GGT GAT 1031 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp 1 5 10 15 CAA AAA AAT ATT AAT ACA ACC TAC TCT ACG TAC TAC TAT TTA CAA GAT 1079 Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp 20 25 30 AAT ACG CGT GGA AAT GGG ATT TTC ACG TAT GAT GCG AAA TAC CGT ACG 1127 Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr 35 40 45 ACA TTG CCG GGA AGC TTA TGG GCA GAT GCA GAT AAC CAA TTT TTT GCG 1175 Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala 50 55 60 AGC TAT GAT GCT CCA GCG GTT GAT GCT CAT TAT TAC GCT GGT GTG ACA 1223 Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr 65 70 75 80 TAT GAC TAC TAT AAA AAT GTT CAT AAC CGT CTC AGT TAC GAC GGA AAT 1271 Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn 85 90 95 AAT GCA GCT ATT AGA TCA TCC GTT CAT TAT AGC CAA GGC TAT AAT AAC 1319 Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn 100 105 110 GCA TTT TGG AAC GGT TCG CAA ATG GTG TAT GGC GAT GGT GAT GGT CAA 1367 Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln 115 120 125 ACA TTT ATT CCA CTT TCT GGT GGT ATT GAT GTG GCC GCA CAT GAG TTA 1415 Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly Gly Ile Asp Val Ala Ala His Glu Leu 130 135 140 ACG CAT GCG GTA ACC GAT TAT ACA GCC GGA CTC ATT TAT CAA AAC GAA 1463 Thr His Ala Val Thr Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu 145 150 155 160 TCT GGT GCA ATT AAT GAG GCA ATA TCT GAT ATT TTT GGA ACG TTA GTC 1511 Ser Gly Ala Ile Asn Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val 165 170 175 GAA TTT TAC GCT AAC AAA AAT CCA GAT TGG GAA ATT GGA GAG GAT GTG 1559 Glu Phe Tyr Ala Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val 180 185 190 TAT ACA CCT GGT ATT TCA GGG GAT TCG CTC CGT TCG ATG TCC GAT CCG 1607 Tyr Thr Pro Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro 195 200 205 GCA AAG TAT GGT GAT CCA GAT CAC TAT TCA AAG CGC TAT ACA GGC ACG 1655 Ala Lys Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr 210 215 220 CAA GAT AAT GGC GGG GTT CAT ATC AAT AGC GGA ATT ATC AAC AAA GCC 1703 Gln Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 225 230 235 240 GCT TAT TTG ATT AGC CAA GGC GGT ACG CAT TAC GGT GTG AGT GTT GTC 1751 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val Val 245 250 255 GGA ATC GGA CGC GAT AAA TTG GGG AAA ATT TTC TAT CGT GCA TTA ACG 1799 Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala Leu Thr 260 265 270 CAA TAT TTA ACA CCA ACG TCC AAC TTT AGC CAA CTT CGT GCT GCC GCT 1847 Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg Ala Ala Ala 275 280 285 GTT CAA TCA GCC ACT GAC TTG TAC GGT TCG ACA AGC CAG GAA GTC GCT 1895 Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Glu Val Ala 290 295 300 TCT GTG AAG CAG GCC TTT GAT GCG GTA GGG GTG AAA TAAAGTGGTA 1941 Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val Lys 305 310 315 TCTCATCAGT GGGGGATTTT TTCCTCCACT GATGTTTTGT TTGTGATCAA TGATGTCAGT 2001 CTAGATAG 2009

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に従い得られる本発明遺伝子断片の制
限酵素地図及びシークエンス法に採用したシークエンス
ストラテジィーである。

【図２】本発明変異型サーモリシンＴＹ１４０の温度安
定性試験の結果を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされ、サーモリシンの
   アミノ酸配列の１４０番目のバリン残基がアラニン残基
   に置換されていることを特徴とする変異型サーモリシン
   ＴＹ１４０。
2. 【請求項２】配列番号：１のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列を含む変異型サーモリシンＴＹ１４０の遺伝
   子。
3. 【請求項３】配列番号：２の塩基配列を有する請求項２
   に記載の遺伝子。