JP4023855B2 - 耐熱性を増強したグルコースイソメラーゼを提供する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
異性化糖製造において利用されうるグルコースイソメラーゼは、本酵素が固定化酵素（菌体とともに固定化される場合を含め）として高い温度で長時間連続して利用されることから、酵素的性質が優れているとともに酵素の熱安定性が高いことが工業上重要であり、一般的に耐熱性酵素が求められている。本発明は工業上有用なグルコースイソメラーゼの耐熱性を改善する方法を提供し、本発明の方法で改良したグルコースイソメラーゼはグルコースからフラクトースへの工業的異性化方法に有用に利用することが出来る。
【０００２】
【従来の技術】
上述したごとく異性化糖製造において利用されうるグルコースイソメラーゼは、酵素的性質が優れていることとともに酵素の熱安定性が高いことが工業上重要であり、一般的に耐熱性酵素が選択され用いられている。しかし、さらに安定に長時間連続して利用出来る酵素が望まれることは自明であり、その問題点を改良することは工業上極めて重大な意義を持つ。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】
そのためには、さらに耐熱性に優れた酵素を分離、選択することでも可能であるが、本発明者らは蛋白質工学技術を用いて既存の有用な性質を持った酵素をより耐熱性に改変することで、より安定に長期間有効に使用し得るグルコースイソメラーゼを開発する方法を考案した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
酵素蛋白質を構成するアミノ酸のうち、ある特定のアミノ酸を他の特定のアミノ酸に変換することにより酵素の性質を改良することが出来る。その一般的な方法として変異によって得た変異酵素の中から、選抜により優良な酵素を取得し、その酵素の変異部位のアミノ酸配列を知る方法が考えられる。さらに蛋白質工学といわれる技術により目的酵素の遺伝子を改変し、計画的に特定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に変換することにより酵素の性質を改良することが出来る。今日、蛋白質工学技術を応用して実用酵素の性質を改変することが比較的容易に行なわれるようになった。この技術の有用性は、酵素蛋白質を構成するアミノ酸配列に計画的に変更を加えることにより、望ましい方向にのみ酵素の性質を改変して行ける可能性を持つことである。
【０００５】
本発明はそれらの技術を工業上有用な酵素であるグルコースイソメラーゼに適用し、放線菌およびその類縁微生物、なかでも相互にアミノ酸の保存性が高いStreptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの、次の配列
に示すアミノ酸配列のうち251 番目および 252 番目のアミノ酸（Ｎ末端から 2 番目のセリン（Ｓ）を 1 番目としている）がリジン（Ｋ）およびタイロシン（Ｙ）であるグルコースイソメラーゼのタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換することにより、グルコースイソメラーゼの耐熱性を増強する方法、あるいはその他の方法で作製した変異と本発明を組み合わせて、グルコースイソメラーゼの耐熱性を増強する方法を提供する。
【０００６】
【発明の具体的な説明】
グルコースイソメラーゼ遺伝子のクローニング
工業生産に用いられることの出来るグルコースイソメラーゼ生産菌としては、いくつかの微生物が知られているが、その中で放線菌に属するものではStreptomyces（ストレプトミセス）、Ampllariella（アンプラリエーラ）、Actinoplanes（アクチノプラネス）が周知である。それらの中で我々は本発明を特にStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩに適用した。なぜならば、図２に示すようにStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩでは本発明を適用し、変換すべきアミノ酸配列が酵素の一次配列上で非常に良く保存されている故である。Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子のクローニング方法は、既に知られている一般的な遺伝子クローニング法、例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）に記載の方法などが例示される、によって得ることができる。
【０００７】
部位特異的変異による遺伝子改変と変異グルコースイソメラーゼの生産
酵素タンパクの特定の位置のアミノ酸配列を変換することにより、酵素の性質を改変することは蛋白質工学の技術を用いて容易に行なうことが出来る。クローニングされた遺伝子に部位特異的な変異を導入する方法は様々な方法が考案されているが、種々の方法を市販キットを用いることで実施出来る。
部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子から生産されるＧＩは、その酵素的性質を試験するため簡便に精製、取得する必要がある。そのためには遺伝子組換え、その他の操作が容易なE.coliで部位特異的変異を導入した遺伝子を発現させることが有効である。しかしながら、Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子の発現に必要なプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配列などはE.coliでは直接機能しないため、部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子の構造のうち、遺伝子の発現に必要なプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配列などはE.coliで効率的に機能するＤＮＡ配列と置き換える必要がある。 我々は、そのために公知の発現ベクターpTrc99A（ファルマシアバイオテク）のプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配合を利用したが、その他にも同様の発現ベクターの利用が可能である。さらに、これらのベクターと部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子との連結には、適当な位置に存在する制限酵素サイトを利用することや、合成ＤＮＡリンカーを用いる方法、あるいはＰＣＲ法によりＤＮＡ塩基配列を付加、改変することにより、結合に必要なＤＮＡ塩基配列を新規に導入することにより行なうことが出来る。
E.coli用発現ベクターに連結した部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子は、適当なE.coli宿主に形質転換し、その培養菌体から変異ＧＩを回収する。この時使用するE.coli宿主はＧＩ欠損株が望ましく、例えばE.coli HB101などを使用することが出来る。
【０００８】
変異ＧＩの耐熱性試験
E.coli宿主により生産された変異ＧＩは適当な条件下に耐熱性を親株ＧＩと比較し、耐熱性の向上した酵素を選択する。この時、酵素使用条件に併せたpH条件、あるいは活性の発現に効果的な金属イオンの添加などが必要になる。Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩの場合pHは中性付近、金属イオンはＣｏ2+あるいはＭｇ2+イオンを添加して行なった。酵素の耐熱性は一定時間加熱後に酵素の残存活性を求め、親酵素と比較し改善の認められたものを選択した結果、請求項に記載の優良変異酵素を見い出し、本発明を完成させた。以下に、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
【実施例】
実施例１
（耐熱性の増強されたS.griseofuscus ＧＩの作製）
(1)Streptomyces ＧＩの構造、遺伝子あるいはアミノ酸配列などについては、これまでにS.violaceoniger（Argos,P., et al., Biochemistry,18,5698(1979))、S.olivochromogenes（Tiraby,G., et al., Proceedings of the American Society for Microbiology Meeting on Genetics and Molecular Biology of Industrial Microoranisms (1988))、S.rubiginosus(Wong,H.C., et al., J. Bacteriology,173,6849(1991))、S.griseofuscus S41(Kikuti,T., et al., Agric.Biol.Chem.,54,2469(1990))などについて報告がある。
我々はS.griseofuscusから遺伝子をクローン化した。当研究所保存のS.griseofuscusの生産するＧＩを精製し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定したところAgric.Biol.Chem.,54,2469(1990)記載の配列と完全に一致した。そこでAgric.Biol.Chem.,54,2469(1990)記載のＤＮＡ配列を参考に合成ＤＮＡを作成し、それをプローブとしてS.griseofuscusより斉藤および三浦らの方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製し、制限酵素BamHI消化した染色体ＤＮＡから、ショットグンクローニングした。
コロニーハイブリダイゼーション陽性クローンからプラスミドＤＮＡを調整したところ5.6kbのＤＮＡ断片が確認された。常法によりＤＮＡ塩基配列を決定したところ、ＧＩ構造遺伝子全領域と考えられる配列が見い出された。ＧＩタンパク質開始アミノ酸をコードする開始コドンＡＴＧから終始コドンＴＴＧまでの塩基配列を図３に記載した。
【００１０】
(2)クローニングしたＧＩ遺伝子のE.coliでの発現
クローニングしたStreptomycesのＧＩ遺伝子は、遺伝子組換え操作を容易とするため、および部位特異的変異の導入により作製した変異遺伝子由来の変異ＧＩを容易に取得するためE.coli発現ベクターに連結してE.coliに導入し、発現させた。E.coli発現ベクターとの連結は、StreptomycesのＧＩ遺伝子の開始コドンＡＴＧを含む領域にＰＣＲ法を用いて制限酵素NcoIサイトを作製し、E.coli発現ベクターpTrc99AのNcoIサイトの下流に連結した。その結果、S.griseofusus ＧＩの場合、第４図に示すようにＧＩのＮ末端アミノ酸が１アミノ酸のみ変化した。同様にしてS.albus ＧＩの場合、図に示すようにＮ末端アミノ酸が１アミノ酸のみ変化した。
【００１１】
(3)遺伝子改変による変異ＧＩの作製
252番アミノ酸タイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）へ変異させるためには図５(1)に示した合成ＤＮＡプローブを用いた。このプローブを用いて部位特異的にＧＩ遺伝子の252番アミノ酸タイロシン（Ｙ）をコードする塩基配列ＴＡＣをフェニルアラニン（Ｆ）をコードするＴＴＣに変異させた。変異にはT7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit (United States Biochemical社）を用い、方法はそのプロトコールに従った。
【００１２】
(4)変異部位の確認
ＤＮＡ塩基配列の確認はサンガーのダイデオキシ法により行い、アミノ酸配列の確認はリジルエンドペプチダーゼによって部分消化した変異ＧＩから回収したペプチッド断片をアミノ酸シーケンサー（476A パーキンエルマー社）を用いてアミノ酸シーケンスして確認した。
【００１３】
(5)変異ＧＩの取得
作製した変異ＧＩは、変異ＧＩ遺伝子を導入したキシロースイソメラーゼ欠損E.coli HB101(xyl5)をIPTG添加条件下に培養し、得られた培養菌体を超音波破砕した後、その遠心上清から回収した。遠心上清は60〜70℃で10分間加熱してE.coli由来の非耐熱性蛋白を変性凝集させ、遠心により除いた。この上清液をpH7.5およびpH6.0の条件下でＤＥＡＥ陰イオンクロマトグラフィーを２回行なうことにより精製、取得した。
【００１４】
(6)252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの耐熱性試験
252Ｙ→Ｆ変異ＧＩはＣｏ2+を0.1mM濃度に添加した条件下に90℃で1〜3時間加熱し、加熱後残存活性を測定した。親ＧＩ酵素も同様に試験し、無処理の場合との活性の残存率を相対値で表して比較した。その結果Ｙ→Ｆ変異ＧＩは酵素の熱変性による酵素活性の半減するまでに要する時間（熱失活の半減期）が2.2倍に延長されていた。その結果は図６にグラフとして示した。
【００１５】
実施例２
（耐熱性の増強したS.albus ＧＩの作製）
(1)S.albus ＧＩ遺伝子のクローニング
当研究所保存のS.albusより、S.griseofuscus ＧＩの遺伝子の一部（SphI-SphI 2.6kb）を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ＧＩ遺伝子をPstI断片としてクローニングした。コロニーハイブリダイゼーション陽性クローンからS.griseofuscus ＧＩあるいは上述した公表されているＧＩ遺伝子に相同な配列を持つ遺伝子断片を見い出した。
【００１６】
(2)変異ＧＩの取得と耐熱性試験
クローニングしたS.albus ＧＩ遺伝子はＤＮＡ塩基配列を決定し、上述のS.griseofuscus ＧＩ遺伝子と比較したところ、S.griseofuscus ＧＩの252番タイロシン（Ｙ）と相同の位置と考えられる253番目タイロシン（Ｙ）の近傍に図２に示したように保存されたアミノ酸配列が存在していた。
そこで、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様にしてＹ→Ｆ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。その結果、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様に90℃加熱による残存活性の半減期が約2倍に延長された。
S.albus ＧＩ以外のStreptomyces ＧＩでもS.griserofuscus ＧＩの252番タイロシン（Ｙ）の位置と相同な領域と考えられる領域のアミノ酸配列は良く保存されており、例えば第２図に示すようにS.olivochromogenesおよびS.violaceonigerなどが例示される。また、Streptomyces由来のＧＩ間の酵素蛋白全領域にわたる一次配列上の相同性は、上述した文献（Agric.Biol.Chem.,54,2469(1990)）等に示されている結果からも高い相同性を持っていることが知られている。従って、実施例１および２で示すことの出来た効果は、ここに例示したS.griseofuscusおよびS.albus ＧＩに特異的な現象ではなく、広くStreptmyces ＧＩに普遍的に適応出来る方法であることは明瞭である。
【００１７】
実施例３
（252Ｙ→Ｆ変異S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
図５(2)に示した合成ＤＮＡプローブを用いて実施例１の場合と同様にして、耐熱性の増強した252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの252番目アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）のＮ末端側（251番目）アミノ酸のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換した変異酵素を作製した。作製した親酵素に2ヶ所のアミノ酸置換を導入した251Ｋ→Ｒ，252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの耐熱性を実施例１の場合と同様に試験したところ、第６図に示すように親酵素に比べ大きく耐熱性が低下した。この結果は、本発明によって得られる効果は252番目アミノ酸をタイロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）とすることによって得られることは、実施例１および２の結果から明かであるが、同様にそのＮ末端側（251番目）アミノ酸がリジン（Ｋ）であることがより有効であることを示している。またこのことは実施例４に示す結果からも明らかである。
【００１８】
実施例４
（S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
図５(3)に示した合成ＤＮＡプローブを用いて実施例１の場合と同様にして、S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩを作製した。作製した251Ｋ→Ｒ変異ＧＩの耐熱性を実施例１の場合と同様に試験したところ、第６図に示すように実施例３で作製した親酵素に2ヶ所のアミノ酸置換を導入した251Ｋ→Ｒ，252Ｙ→Ｆ変異ＧＩと比べてもさらに大きく耐熱性が低下した。
【００１９】
本例および実施例３の結果から本発明によって得られる効果は、フェニルアラニン（Ｆ）に変換すべき位置（S.griseofuscus ＧＩの場合は252番目）のタイロシン（Ｙ）のＮ末端側のアミノ酸はリジン（Ｋ）であることがより望ましいが、変換すべきタイロシン（Ｙ）のＮ末端側のアミノ酸がリジン（Ｋ）とは異なったアミノ酸であった場合（少なくとも本例および実施例３に示すようにアルギニン（Ｒ）であっても）にもタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換することで耐熱性を向上させることが出来ることを示している。
【００２０】
実施例５
（253Ｙ→Ｆ変異S.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
実施例３に示したS.griseofuscus ＧＩの場合と同様にして、実施例２で作製した253Ｙ→Ｆ変異S.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換した変異酵素252Ｋ→Ｒ，253Ｙ→Ｆ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。
その結果、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様に親酵素に比べ90℃加熱における活性の半減期が約60％に低下した。
【００２１】
実施例６
（252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したS.albus ＧＩ）
実施例４に示したS.griseofuscus ＧＩの場合と同様にしてS.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換した変異酵素252Ｋ→Ｒ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。
その結果、実施例５で作製した252Ｋ→Ｒ，253Ｙ→Ｆ変異ＧＩよりもさらに耐熱性が低下することが明らかになった。
【００２２】
実施例５および６の結果は、実施例３および４で示した結果がS.griseofuscusＧＩにのみ限定された現象ではなく、酵素蛋白一次配列上の相同性の高いStreptomyces ＧＩに共通した現象であることを示しており、本発明の効果が広く相同性の高いＧＩに適用可能な有用な方法であることを示していることは明らかである。
一方、本発明と同様に蛋白質工学技術を用いてＧＩの耐熱性の改善を行なったことが報告されているActinoplanes missouriensisの場合（Nadir,T., et al., Biochem.,31,2239(1992)）、第２図に示すように本発明で変異を導入した領域と相同と考えられる領域のうちS.griseofuscus ＧＩ（252番目）およびS.albus ＧＩ（253番目）でタイロシン（Ｙ）である位置は親酵素でフェニルアラニン（Ｆ）であるが、そのＮ末端側253番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換すると耐熱性が向上することが報告されている。しかし、その結果は、本発明の実施例３、４、５および６で示した結果と全く異なった結果であり、従って本発明の独自性および新規性になんらの影響を与えるものでないことは明瞭である。
【００２３】
実施例７
（複数の変異を組み合わせることにより耐熱の向上したＧＩ）
上述したようにS.griseofuscus ＧＩの252番目のアミノ酸残基および酵素の構造、即ちアミノ酸配列の相同性の高いＧＩ、特にStreptomyces由来のＧＩにおいてS.griseofuscus ＧＩの252番目タイロシン（Ｙ）に相当すると考え得る位置の、例えばS.albus ＧＩでは253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）へ変換することにより耐熱性を大きく向上させることが出来ることを示した。さらにこの変異と他の位置に導入した変異との組み合わせにより、一層の耐熱性の向上を計ることも可能である。一例を実験例として示す。
【００２４】
A.missouriensisの場合319番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換すると耐熱性が向上すると報告されている（Biochem.,31,2239(1992)）。相当する位置の（Ｋ）の存在をS.griseofuscus ＧＩで検索したところ、312番目のリジン（Ｋ）が相当すると考えられた（第７図）。S.griseofuscus ＧＩの252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの312番目リジン（Ｋ）をコードする遺伝子の配列をＡＡＧからＡＧＧに部位特異的変異法により変換し、変異酵素252Ｙ→Ｆ，312Ｋ→Ｒ変異ＧＩを作製し、耐熱性を試験したところ図に示すように耐熱性は252Ｙ→Ｆ変異ＧＩよりもさらに向上した。従って、252Ｙ→Ｆ変異に他の変異を組み合わせることによりさらに耐熱性を向上させられることが示された。
【００２５】
【発明の効果】
グルコースイソメラーゼは工業的には固定化酵素として長時間連続して使用されるという特性上から、酵素的本質が優良であることとともに高い熱安定性を持つことが要求される。本発明によって提供されるグルコースイソメラーゼは、高度に耐熱性が増強されることにより酵素の安定性が向上し、工業上より有用な異性化糖製造方法を提供することが出来る。さらに、本発明で改善が期待できるグルコースイソメラーゼは、工業的に有用に使用されている放線菌およびその類縁微生物、なかでもStreptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの改良に特に有効であり、工業上特に有用な効果が期待できる方法を提供する。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Streptomyces griseofuscusのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）の遺伝子配列から推定される全アミノ酸配列をアミノ酸一文字表記で示す。図中の番号は本酵素のＮ末端アミノ酸であるセリン（Ｓ）を1番とした時のアミノ酸残基番号である。また、図中の下線で示した配列はアミノ酸シークエンスにより部分的に決定したアミノ酸配列と一致した配列を示している。
【００２７】
【図２】 各種Streptomyces ＧＩおよびA.missouriensis ＧＩの部分アミノ酸配列の相同性を比較した図である。
【００２８】
【図３】 S.griseofuscusのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）の全遺伝子配列を示す。
【００２９】
【図４】 1)はS.griseofuscus ＧＩ遺伝子をE.coliで生産するときに変化するＧＩＮ末端のアミノ酸配列を示す。
2)はS.albus ＧＩ遺伝子をE.coliで生産するときに変化するＧＩＮ末端のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
【図５】 1)はS.griseofuscus ＧＩの252番目およびS.albus ＧＩの253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
2)はS.griseofuscus ＧＩの252番目およびS.albus ＧＩの253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換し、さらにS.griseofuscus ＧＩ遺伝子の251番目およびS.albus ＧＩの252番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
3)はS.griseofuscus ＧＩの312番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
【００３１】
【図６】 各変異酵素を90℃で図に示した時間加熱したときの各変異ＧＩの残存活性を示す。
【００３２】
【図７】S.griseofuscus ＧＩの312番目のアミノ酸リジン（Ｋ）近傍のアミノ酸配列の相同性をA.missouriensis ＧＩと比較した図。
【産業上の利用分野】
異性化糖製造において利用されうるグルコースイソメラーゼは、本酵素が固定化酵素（菌体とともに固定化される場合を含め）として高い温度で長時間連続して利用されることから、酵素的性質が優れているとともに酵素の熱安定性が高いことが工業上重要であり、一般的に耐熱性酵素が求められている。本発明は工業上有用なグルコースイソメラーゼの耐熱性を改善する方法を提供し、本発明の方法で改良したグルコースイソメラーゼはグルコースからフラクトースへの工業的異性化方法に有用に利用することが出来る。
【０００２】
【従来の技術】
上述したごとく異性化糖製造において利用されうるグルコースイソメラーゼは、酵素的性質が優れていることとともに酵素の熱安定性が高いことが工業上重要であり、一般的に耐熱性酵素が選択され用いられている。しかし、さらに安定に長時間連続して利用出来る酵素が望まれることは自明であり、その問題点を改良することは工業上極めて重大な意義を持つ。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】
そのためには、さらに耐熱性に優れた酵素を分離、選択することでも可能であるが、本発明者らは蛋白質工学技術を用いて既存の有用な性質を持った酵素をより耐熱性に改変することで、より安定に長期間有効に使用し得るグルコースイソメラーゼを開発する方法を考案した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
酵素蛋白質を構成するアミノ酸のうち、ある特定のアミノ酸を他の特定のアミノ酸に変換することにより酵素の性質を改良することが出来る。その一般的な方法として変異によって得た変異酵素の中から、選抜により優良な酵素を取得し、その酵素の変異部位のアミノ酸配列を知る方法が考えられる。さらに蛋白質工学といわれる技術により目的酵素の遺伝子を改変し、計画的に特定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に変換することにより酵素の性質を改良することが出来る。今日、蛋白質工学技術を応用して実用酵素の性質を改変することが比較的容易に行なわれるようになった。この技術の有用性は、酵素蛋白質を構成するアミノ酸配列に計画的に変更を加えることにより、望ましい方向にのみ酵素の性質を改変して行ける可能性を持つことである。
【０００５】
本発明はそれらの技術を工業上有用な酵素であるグルコースイソメラーゼに適用し、放線菌およびその類縁微生物、なかでも相互にアミノ酸の保存性が高いStreptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの、次の配列
【０００６】
【発明の具体的な説明】
グルコースイソメラーゼ遺伝子のクローニング
工業生産に用いられることの出来るグルコースイソメラーゼ生産菌としては、いくつかの微生物が知られているが、その中で放線菌に属するものではStreptomyces（ストレプトミセス）、Ampllariella（アンプラリエーラ）、Actinoplanes（アクチノプラネス）が周知である。それらの中で我々は本発明を特にStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩに適用した。なぜならば、図２に示すようにStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩでは本発明を適用し、変換すべきアミノ酸配列が酵素の一次配列上で非常に良く保存されている故である。Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子のクローニング方法は、既に知られている一般的な遺伝子クローニング法、例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Molecular Cloning,A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laboratory,1989）に記載の方法などが例示される、によって得ることができる。
【０００７】
部位特異的変異による遺伝子改変と変異グルコースイソメラーゼの生産
酵素タンパクの特定の位置のアミノ酸配列を変換することにより、酵素の性質を改変することは蛋白質工学の技術を用いて容易に行なうことが出来る。クローニングされた遺伝子に部位特異的な変異を導入する方法は様々な方法が考案されているが、種々の方法を市販キットを用いることで実施出来る。
部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子から生産されるＧＩは、その酵素的性質を試験するため簡便に精製、取得する必要がある。そのためには遺伝子組換え、その他の操作が容易なE.coliで部位特異的変異を導入した遺伝子を発現させることが有効である。しかしながら、Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子の発現に必要なプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配列などはE.coliでは直接機能しないため、部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子の構造のうち、遺伝子の発現に必要なプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配列などはE.coliで効率的に機能するＤＮＡ配列と置き換える必要がある。 我々は、そのために公知の発現ベクターpTrc99A（ファルマシアバイオテク）のプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼ結合配合を利用したが、その他にも同様の発現ベクターの利用が可能である。さらに、これらのベクターと部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子との連結には、適当な位置に存在する制限酵素サイトを利用することや、合成ＤＮＡリンカーを用いる方法、あるいはＰＣＲ法によりＤＮＡ塩基配列を付加、改変することにより、結合に必要なＤＮＡ塩基配列を新規に導入することにより行なうことが出来る。
E.coli用発現ベクターに連結した部位特異的変異を導入したStreptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩ生産遺伝子は、適当なE.coli宿主に形質転換し、その培養菌体から変異ＧＩを回収する。この時使用するE.coli宿主はＧＩ欠損株が望ましく、例えばE.coli HB101などを使用することが出来る。
【０００８】
変異ＧＩの耐熱性試験
E.coli宿主により生産された変異ＧＩは適当な条件下に耐熱性を親株ＧＩと比較し、耐熱性の向上した酵素を選択する。この時、酵素使用条件に併せたpH条件、あるいは活性の発現に効果的な金属イオンの添加などが必要になる。Streptomyces（ストレプトミセス）由来のＧＩの場合pHは中性付近、金属イオンはＣｏ2+あるいはＭｇ2+イオンを添加して行なった。酵素の耐熱性は一定時間加熱後に酵素の残存活性を求め、親酵素と比較し改善の認められたものを選択した結果、請求項に記載の優良変異酵素を見い出し、本発明を完成させた。以下に、実施例により本発明をより詳細に説明する。
【０００９】
【実施例】
実施例１
（耐熱性の増強されたS.griseofuscus ＧＩの作製）
(1)Streptomyces ＧＩの構造、遺伝子あるいはアミノ酸配列などについては、これまでにS.violaceoniger（Argos,P., et al., Biochemistry,18,5698(1979))、S.olivochromogenes（Tiraby,G., et al., Proceedings of the American Society for Microbiology Meeting on Genetics and Molecular Biology of Industrial Microoranisms (1988))、S.rubiginosus(Wong,H.C., et al., J. Bacteriology,173,6849(1991))、S.griseofuscus S41(Kikuti,T., et al., Agric.Biol.Chem.,54,2469(1990))などについて報告がある。
我々はS.griseofuscusから遺伝子をクローン化した。当研究所保存のS.griseofuscusの生産するＧＩを精製し、そのＮ末端アミノ酸配列を決定したところAgric.Biol.Chem.,54,2469(1990)記載の配列と完全に一致した。そこでAgric.Biol.Chem.,54,2469(1990)記載のＤＮＡ配列を参考に合成ＤＮＡを作成し、それをプローブとしてS.griseofuscusより斉藤および三浦らの方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1963)）により調製し、制限酵素BamHI消化した染色体ＤＮＡから、ショットグンクローニングした。
コロニーハイブリダイゼーション陽性クローンからプラスミドＤＮＡを調整したところ5.6kbのＤＮＡ断片が確認された。常法によりＤＮＡ塩基配列を決定したところ、ＧＩ構造遺伝子全領域と考えられる配列が見い出された。ＧＩタンパク質開始アミノ酸をコードする開始コドンＡＴＧから終始コドンＴＴＧまでの塩基配列を図３に記載した。
【００１０】
(2)クローニングしたＧＩ遺伝子のE.coliでの発現
クローニングしたStreptomycesのＧＩ遺伝子は、遺伝子組換え操作を容易とするため、および部位特異的変異の導入により作製した変異遺伝子由来の変異ＧＩを容易に取得するためE.coli発現ベクターに連結してE.coliに導入し、発現させた。E.coli発現ベクターとの連結は、StreptomycesのＧＩ遺伝子の開始コドンＡＴＧを含む領域にＰＣＲ法を用いて制限酵素NcoIサイトを作製し、E.coli発現ベクターpTrc99AのNcoIサイトの下流に連結した。その結果、S.griseofusus ＧＩの場合、第４図に示すようにＧＩのＮ末端アミノ酸が１アミノ酸のみ変化した。同様にしてS.albus ＧＩの場合、図に示すようにＮ末端アミノ酸が１アミノ酸のみ変化した。
【００１１】
(3)遺伝子改変による変異ＧＩの作製
252番アミノ酸タイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）へ変異させるためには図５(1)に示した合成ＤＮＡプローブを用いた。このプローブを用いて部位特異的にＧＩ遺伝子の252番アミノ酸タイロシン（Ｙ）をコードする塩基配列ＴＡＣをフェニルアラニン（Ｆ）をコードするＴＴＣに変異させた。変異にはT7-GEN In Vitro Mutagenesis Kit (United States Biochemical社）を用い、方法はそのプロトコールに従った。
【００１２】
(4)変異部位の確認
ＤＮＡ塩基配列の確認はサンガーのダイデオキシ法により行い、アミノ酸配列の確認はリジルエンドペプチダーゼによって部分消化した変異ＧＩから回収したペプチッド断片をアミノ酸シーケンサー（476A パーキンエルマー社）を用いてアミノ酸シーケンスして確認した。
【００１３】
(5)変異ＧＩの取得
作製した変異ＧＩは、変異ＧＩ遺伝子を導入したキシロースイソメラーゼ欠損E.coli HB101(xyl5)をIPTG添加条件下に培養し、得られた培養菌体を超音波破砕した後、その遠心上清から回収した。遠心上清は60〜70℃で10分間加熱してE.coli由来の非耐熱性蛋白を変性凝集させ、遠心により除いた。この上清液をpH7.5およびpH6.0の条件下でＤＥＡＥ陰イオンクロマトグラフィーを２回行なうことにより精製、取得した。
【００１４】
(6)252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの耐熱性試験
252Ｙ→Ｆ変異ＧＩはＣｏ2+を0.1mM濃度に添加した条件下に90℃で1〜3時間加熱し、加熱後残存活性を測定した。親ＧＩ酵素も同様に試験し、無処理の場合との活性の残存率を相対値で表して比較した。その結果Ｙ→Ｆ変異ＧＩは酵素の熱変性による酵素活性の半減するまでに要する時間（熱失活の半減期）が2.2倍に延長されていた。その結果は図６にグラフとして示した。
【００１５】
実施例２
（耐熱性の増強したS.albus ＧＩの作製）
(1)S.albus ＧＩ遺伝子のクローニング
当研究所保存のS.albusより、S.griseofuscus ＧＩの遺伝子の一部（SphI-SphI 2.6kb）を含むＤＮＡ断片をプローブとして用いて、ＧＩ遺伝子をPstI断片としてクローニングした。コロニーハイブリダイゼーション陽性クローンからS.griseofuscus ＧＩあるいは上述した公表されているＧＩ遺伝子に相同な配列を持つ遺伝子断片を見い出した。
【００１６】
(2)変異ＧＩの取得と耐熱性試験
クローニングしたS.albus ＧＩ遺伝子はＤＮＡ塩基配列を決定し、上述のS.griseofuscus ＧＩ遺伝子と比較したところ、S.griseofuscus ＧＩの252番タイロシン（Ｙ）と相同の位置と考えられる253番目タイロシン（Ｙ）の近傍に図２に示したように保存されたアミノ酸配列が存在していた。
そこで、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様にしてＹ→Ｆ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。その結果、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様に90℃加熱による残存活性の半減期が約2倍に延長された。
S.albus ＧＩ以外のStreptomyces ＧＩでもS.griserofuscus ＧＩの252番タイロシン（Ｙ）の位置と相同な領域と考えられる領域のアミノ酸配列は良く保存されており、例えば第２図に示すようにS.olivochromogenesおよびS.violaceonigerなどが例示される。また、Streptomyces由来のＧＩ間の酵素蛋白全領域にわたる一次配列上の相同性は、上述した文献（Agric.Biol.Chem.,54,2469(1990)）等に示されている結果からも高い相同性を持っていることが知られている。従って、実施例１および２で示すことの出来た効果は、ここに例示したS.griseofuscusおよびS.albus ＧＩに特異的な現象ではなく、広くStreptmyces ＧＩに普遍的に適応出来る方法であることは明瞭である。
【００１７】
実施例３
（252Ｙ→Ｆ変異S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
図５(2)に示した合成ＤＮＡプローブを用いて実施例１の場合と同様にして、耐熱性の増強した252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの252番目アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）のＮ末端側（251番目）アミノ酸のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換した変異酵素を作製した。作製した親酵素に2ヶ所のアミノ酸置換を導入した251Ｋ→Ｒ，252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの耐熱性を実施例１の場合と同様に試験したところ、第６図に示すように親酵素に比べ大きく耐熱性が低下した。この結果は、本発明によって得られる効果は252番目アミノ酸をタイロシン（Ｙ）からフェニルアラニン（Ｆ）とすることによって得られることは、実施例１および２の結果から明かであるが、同様にそのＮ末端側（251番目）アミノ酸がリジン（Ｋ）であることがより有効であることを示している。またこのことは実施例４に示す結果からも明らかである。
【００１８】
実施例４
（S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
図５(3)に示した合成ＤＮＡプローブを用いて実施例１の場合と同様にして、S.griseofuscus ＧＩの251番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩを作製した。作製した251Ｋ→Ｒ変異ＧＩの耐熱性を実施例１の場合と同様に試験したところ、第６図に示すように実施例３で作製した親酵素に2ヶ所のアミノ酸置換を導入した251Ｋ→Ｒ，252Ｙ→Ｆ変異ＧＩと比べてもさらに大きく耐熱性が低下した。
【００１９】
本例および実施例３の結果から本発明によって得られる効果は、フェニルアラニン（Ｆ）に変換すべき位置（S.griseofuscus ＧＩの場合は252番目）のタイロシン（Ｙ）のＮ末端側のアミノ酸はリジン（Ｋ）であることがより望ましいが、変換すべきタイロシン（Ｙ）のＮ末端側のアミノ酸がリジン（Ｋ）とは異なったアミノ酸であった場合（少なくとも本例および実施例３に示すようにアルギニン（Ｒ）であっても）にもタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換することで耐熱性を向上させることが出来ることを示している。
【００２０】
実施例５
（253Ｙ→Ｆ変異S.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したＧＩ）
実施例３に示したS.griseofuscus ＧＩの場合と同様にして、実施例２で作製した253Ｙ→Ｆ変異S.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換した変異酵素252Ｋ→Ｒ，253Ｙ→Ｆ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。
その結果、S.griseofuscus ＧＩの場合と同様に親酵素に比べ90℃加熱における活性の半減期が約60％に低下した。
【００２１】
実施例６
（252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換したS.albus ＧＩ）
実施例４に示したS.griseofuscus ＧＩの場合と同様にしてS.albus ＧＩの252番目アミノ酸リジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）へ置換した変異酵素252Ｋ→Ｒ変異ＧＩを作製し、その変異ＧＩの耐熱性を試験した。
その結果、実施例５で作製した252Ｋ→Ｒ，253Ｙ→Ｆ変異ＧＩよりもさらに耐熱性が低下することが明らかになった。
【００２２】
実施例５および６の結果は、実施例３および４で示した結果がS.griseofuscusＧＩにのみ限定された現象ではなく、酵素蛋白一次配列上の相同性の高いStreptomyces ＧＩに共通した現象であることを示しており、本発明の効果が広く相同性の高いＧＩに適用可能な有用な方法であることを示していることは明らかである。
一方、本発明と同様に蛋白質工学技術を用いてＧＩの耐熱性の改善を行なったことが報告されているActinoplanes missouriensisの場合（Nadir,T., et al., Biochem.,31,2239(1992)）、第２図に示すように本発明で変異を導入した領域と相同と考えられる領域のうちS.griseofuscus ＧＩ（252番目）およびS.albus ＧＩ（253番目）でタイロシン（Ｙ）である位置は親酵素でフェニルアラニン（Ｆ）であるが、そのＮ末端側253番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換すると耐熱性が向上することが報告されている。しかし、その結果は、本発明の実施例３、４、５および６で示した結果と全く異なった結果であり、従って本発明の独自性および新規性になんらの影響を与えるものでないことは明瞭である。
【００２３】
実施例７
（複数の変異を組み合わせることにより耐熱の向上したＧＩ）
上述したようにS.griseofuscus ＧＩの252番目のアミノ酸残基および酵素の構造、即ちアミノ酸配列の相同性の高いＧＩ、特にStreptomyces由来のＧＩにおいてS.griseofuscus ＧＩの252番目タイロシン（Ｙ）に相当すると考え得る位置の、例えばS.albus ＧＩでは253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）へ変換することにより耐熱性を大きく向上させることが出来ることを示した。さらにこの変異と他の位置に導入した変異との組み合わせにより、一層の耐熱性の向上を計ることも可能である。一例を実験例として示す。
【００２４】
A.missouriensisの場合319番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換すると耐熱性が向上すると報告されている（Biochem.,31,2239(1992)）。相当する位置の（Ｋ）の存在をS.griseofuscus ＧＩで検索したところ、312番目のリジン（Ｋ）が相当すると考えられた（第７図）。S.griseofuscus ＧＩの252Ｙ→Ｆ変異ＧＩの312番目リジン（Ｋ）をコードする遺伝子の配列をＡＡＧからＡＧＧに部位特異的変異法により変換し、変異酵素252Ｙ→Ｆ，312Ｋ→Ｒ変異ＧＩを作製し、耐熱性を試験したところ図に示すように耐熱性は252Ｙ→Ｆ変異ＧＩよりもさらに向上した。従って、252Ｙ→Ｆ変異に他の変異を組み合わせることによりさらに耐熱性を向上させられることが示された。
【００２５】
【発明の効果】
グルコースイソメラーゼは工業的には固定化酵素として長時間連続して使用されるという特性上から、酵素的本質が優良であることとともに高い熱安定性を持つことが要求される。本発明によって提供されるグルコースイソメラーゼは、高度に耐熱性が増強されることにより酵素の安定性が向上し、工業上より有用な異性化糖製造方法を提供することが出来る。さらに、本発明で改善が期待できるグルコースイソメラーゼは、工業的に有用に使用されている放線菌およびその類縁微生物、なかでもStreptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの改良に特に有効であり、工業上特に有用な効果が期待できる方法を提供する。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Streptomyces griseofuscusのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）の遺伝子配列から推定される全アミノ酸配列をアミノ酸一文字表記で示す。図中の番号は本酵素のＮ末端アミノ酸であるセリン（Ｓ）を1番とした時のアミノ酸残基番号である。また、図中の下線で示した配列はアミノ酸シークエンスにより部分的に決定したアミノ酸配列と一致した配列を示している。
【００２７】
【図２】 各種Streptomyces ＧＩおよびA.missouriensis ＧＩの部分アミノ酸配列の相同性を比較した図である。
【００２８】
【図３】 S.griseofuscusのグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）の全遺伝子配列を示す。
【００２９】
【図４】 1)はS.griseofuscus ＧＩ遺伝子をE.coliで生産するときに変化するＧＩＮ末端のアミノ酸配列を示す。
2)はS.albus ＧＩ遺伝子をE.coliで生産するときに変化するＧＩＮ末端のアミノ酸配列を示す。
【００３０】
【図５】 1)はS.griseofuscus ＧＩの252番目およびS.albus ＧＩの253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
2)はS.griseofuscus ＧＩの252番目およびS.albus ＧＩの253番目のタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に変換し、さらにS.griseofuscus ＧＩ遺伝子の251番目およびS.albus ＧＩの252番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
3)はS.griseofuscus ＧＩの312番目のリジン（Ｋ）をアルギニン（Ｒ）に変換するための部位特異的変異導入のための合成ＤＮＡプライマーの配列を示す。
【００３１】
【図６】 各変異酵素を90℃で図に示した時間加熱したときの各変異ＧＩの残存活性を示す。
【００３２】
【図７】S.griseofuscus ＧＩの312番目のアミノ酸リジン（Ｋ）近傍のアミノ酸配列の相同性をA.missouriensis ＧＩと比較した図。
Claims (4)
- 次の配列
に示した２５２番目のアミノ酸（Ｎ末端から２番目のセリン（Ｓ）を１番目としている）と酵素化学的に相同の位置にあって、Streptomyces属（ストレプトミセス属）細菌の間で保存性の高いタイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換することにより、Streptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの耐熱性を増強する方法。 - 次の配列、
に示した２５１番目および２５２番目のアミノ酸（Ｎ末端から２番目のセリン（Ｓ）を１番目としている）と酵素化学的に相同の位置にあって、Streptomyces属（ストレプトミセス属）細菌の間で保存性の高いリジン（Ｋ）およびタイロシン（Ｙ）のうち、タイロシン（Ｙ）をフェニルアラニン（Ｆ）に置換することにより、Streptomyces属（ストレプトミセス属）細菌のグルコースイソメラーゼの耐熱性を増強する方法。 - Streptomyces属（ストレプトミセス属）細菌グルコースイソメラーゼの遺伝子を単離取得し、その遺伝子に部位特異的変異を導入することにより、グルコースイソメラーゼに耐熱性を増強するために改良を加える請求項１または２に記載の方法。
- 請求項１乃至３の方法により、改良されたStreptomyces属（ストレプトミセス属）の細菌の耐熱性グルコースイソメラーゼ。
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