JP3046142B2 - Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents
Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
ＤＮＡポリメラーゼの製法に関する。
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
ＤＮＡポリメラーゼの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼ〕
等がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特
定のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法などにそ
れぞれ利用されている。一般にＤＮＡポリメラーゼはそ
の起源による酵素特異性を有しており、その特性を生か
した利用法がある。例えばバチルス ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）は生育至適温度が約６５℃である好熱性
細菌である。この細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの単離
・精製についてはジャーナル オブ バクテリオロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）、第１４５巻、第２１〜２６頁（１９８１）に記載
されている。また、該ＤＮＡポリメラーゼをプロテアー
ゼであるズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）で処理
して５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する領域を
除去したラージフラグメントの調製及びそのジデオキシ
シークエンス法への応用について、サイエンティア シ
ニカ（ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ）第３０巻、第
５０３〜５０６頁（１９８７）に記載されている。ま
た、ジデオキシシークエンス法における該ＤＮＡポリメ
ラーゼと他のＤＮＡポリメラーゼとの比較についてはバ
イオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１
１巻、第７６〜８７頁（１９９１）に記載されている。
上記記載例より該ＤＮＡポリメラーゼは大腸菌由来ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ クレノウ断片と同様の性質を高温で
示すことが知られている。
に利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼ〕
等がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特
定のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法などにそ
れぞれ利用されている。一般にＤＮＡポリメラーゼはそ
の起源による酵素特異性を有しており、その特性を生か
した利用法がある。例えばバチルス ステアロサーモフ
ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓ）は生育至適温度が約６５℃である好熱性
細菌である。この細菌由来のＤＮＡポリメラーゼの単離
・精製についてはジャーナル オブ バクテリオロジー
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）、第１４５巻、第２１〜２６頁（１９８１）に記載
されている。また、該ＤＮＡポリメラーゼをプロテアー
ゼであるズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）で処理
して５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する領域を
除去したラージフラグメントの調製及びそのジデオキシ
シークエンス法への応用について、サイエンティア シ
ニカ（ＳＣＩＥＮＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ）第３０巻、第
５０３〜５０６頁（１９８７）に記載されている。ま
た、ジデオキシシークエンス法における該ＤＮＡポリメ
ラーゼと他のＤＮＡポリメラーゼとの比較についてはバ
イオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１
１巻、第７６〜８７頁（１９９１）に記載されている。
上記記載例より該ＤＮＡポリメラーゼは大腸菌由来ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ クレノウ断片と同様の性質を高温で
示すことが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これま
で該ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列に
ついては不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベ
クターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法につい
ても明らかにされていない。本発明の目的は、新規なＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該ＤＮＡ断片を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を用い
た新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提
供することにある。
で該ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造やアミノ酸配列に
ついては不明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベ
クターに結合して遺伝子工学的に発現させる方法につい
ても明らかにされていない。本発明の目的は、新規なＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、該ＤＮＡ断片を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を用い
た新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提
供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸
配列をコードしていることを特徴とする。また、本発明
の第２の発明はＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関する
発明であって、第１の発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体を培養
し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを
特徴とする。
発明の第１の発明はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸
配列をコードしていることを特徴とする。また、本発明
の第２の発明はＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関する
発明であって、第１の発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体を培養
し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを
特徴とする。
【０００５】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス ステア
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）がある。
に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス ステア
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）がある。
【０００６】本発明に係る形質転換体及びＤＮＡポリメ
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 （１）バチルス・ステアロサーモフィラスから染色体Ｄ
ＮＡを抽出する。 （２）ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号１及び配列番号２に示すＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション（ＰＣＲ）を行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。 （４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。 （５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを（４）と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 （７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 （１）バチルス・ステアロサーモフィラスから染色体Ｄ
ＮＡを抽出する。 （２）ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号１及び配列番号２に示すＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション（ＰＣＲ）を行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。 （４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。 （５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを（４）と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 （７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。
【０００７】上記ＤＮＡ供与体であるバチルス ステア
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）由来ＤＮＡは５５℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は公
知の方法を用いることができ、当該方法の詳細は１９８
２年 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発
行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）ほか
著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第７５〜１７
８頁に記載されている。
ロサーモフィラス ＩＡＭ １１００１（ＡＴＣＣ８０
０５）由来ＤＮＡは５５℃で振とう培養した該培養菌体
より抽出する。抽出、精製、制限酵素による切断等は公
知の方法を用いることができ、当該方法の詳細は１９８
２年 コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発
行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｓｔｉｓ）ほか
著、モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第７５〜１７
８頁に記載されている。
【０００８】目的のＤＮＡ断片を選択する方法として
は、まず公知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２６４
巻、第４２５５〜４２６３頁（１９８９）に記載されて
いるものを参考にすることができる。
は、まず公知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２６４
巻、第４２５５〜４２６３頁（１９８９）に記載されて
いるものを参考にすることができる。
【０００９】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号１及び配列番号２に示す２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス ステアロサ
ーモフィラスＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により特
異的なＤＮＡ断片を増幅することを見出し、得られた断
片に塩基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他の
ＤＮＡポリメラーゼと類似していることを発見した。し
たがって、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行うことにより目的のＤＮＡを選択する
ことができる。ハイブリダイゼーションによる選択の方
法自体は公知の方法、例えば前記モレキュラー クロー
ニング、ア ラボラトリー マニュアル、第３０９頁に
記載の方法を用いることができる。サザンハイブリダイ
ゼーション法により、目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
がバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡのどの制限
酵素断片上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵
素例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩなどを用
いて分解したバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡ
をプラスミドベクターに組込む。プラスミドベクターと
しては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵ
Ｃ１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるがこれらに限
定されるものではない。また組込ませる手段についても
公知の方法が利用でき、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素反
応で組込ませればよい。
配列表の配列番号１及び配列番号２に示す２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス ステアロサ
ーモフィラスＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により特
異的なＤＮＡ断片を増幅することを見出し、得られた断
片に塩基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他の
ＤＮＡポリメラーゼと類似していることを発見した。し
たがって、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行うことにより目的のＤＮＡを選択する
ことができる。ハイブリダイゼーションによる選択の方
法自体は公知の方法、例えば前記モレキュラー クロー
ニング、ア ラボラトリー マニュアル、第３０９頁に
記載の方法を用いることができる。サザンハイブリダイ
ゼーション法により、目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
がバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡのどの制限
酵素断片上に存在するかを分析し、次に選択した制限酵
素例えばＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩなどを用
いて分解したバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡ
をプラスミドベクターに組込む。プラスミドベクターと
しては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵ
Ｃ１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられるがこれらに限
定されるものではない。また組込ませる手段についても
公知の方法が利用でき、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素反
応で組込ませればよい。
【００１０】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ−，ｍ＋）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ−，ｍ＋）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。
【００１１】選択した３種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するＨｉｎｃＩＩ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ断片、Ｘ
ｈｏＩ断片について制限酵素分解により詳細な解析の結
果を基に上記３断片を試験管内で再編成し、一本の連続
したＤＮＡ断片とし、該ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴ
Ｖ１１８Ｎに組込んで目的のクローンを得た。該プラス
ミドをｐＵＩＦ１０１と命名した。プラスミドｐＵＩＦ
１０１を有する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得
た。該抽出液は６０℃、２０分処理後も十分量のＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を示し、発現ベクターのみを有する大
腸菌粗抽出液ではこのような活性を有しないことより、
ｐＵＩＦ１０１上に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報
が存在し、かつ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発
現していると結論した。
が所有するＨｉｎｃＩＩ断片、ＨｉｎｄＩＩＩ断片、Ｘ
ｈｏＩ断片について制限酵素分解により詳細な解析の結
果を基に上記３断片を試験管内で再編成し、一本の連続
したＤＮＡ断片とし、該ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴ
Ｖ１１８Ｎに組込んで目的のクローンを得た。該プラス
ミドをｐＵＩＦ１０１と命名した。プラスミドｐＵＩＦ
１０１を有する大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得
た。該抽出液は６０℃、２０分処理後も十分量のＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を示し、発現ベクターのみを有する大
腸菌粗抽出液ではこのような活性を有しないことより、
ｐＵＩＦ１０１上に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報
が存在し、かつ、大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発
現していると結論した。
【００１２】プラスミドｐＵＩＦ１０１の構築工程を図
１に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はプラスミドｐＵ
ＩＦ１０１の約３．５ｋｂのＮｃｏＩ断片にコードされ
ており、ジデオキシ法にて配列表の配列番号３に示され
る該ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定した。その結果、本
発明者らによって発明され平成４年４月６日に特許出願
された「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」明細書に記載され
ている、バチルス カルドテナックス由来のＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の塩基配列と比べて、１７箇所の塩基置
換、７塩基の欠失、及び１塩基の挿入が認められた。
１に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はプラスミドｐＵ
ＩＦ１０１の約３．５ｋｂのＮｃｏＩ断片にコードされ
ており、ジデオキシ法にて配列表の配列番号３に示され
る該ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定した。その結果、本
発明者らによって発明され平成４年４月６日に特許出願
された「ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子」明細書に記載され
ている、バチルス カルドテナックス由来のＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子の塩基配列と比べて、１７箇所の塩基置
換、７塩基の欠失、及び１塩基の挿入が認められた。
【００１３】ｐＵＩＦ１０１で形質転換された大腸菌で
最も増殖能のよかった宿主ＨＢ１０１を選択し、それは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＵ
ＩＦ１０１と表示して、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１２２３９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２
３９）として寄託されている。
最も増殖能のよかった宿主ＨＢ１０１を選択し、それは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＵ
ＩＦ１０１と表示して、工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第１２２３９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２
３９）として寄託されている。
【００１４】ｐＵＩＦ１０１を保有する大腸菌を培養
し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養
菌体より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことが
できる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの各処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で単一バンドを示すまで精製することができる。
し、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養
菌体より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことが
できる。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、
ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムク
ロマトグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの各処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）で単一バンドを示すまで精製することができる。
【００１５】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約１０万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。
ＡＧＥで約１０万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。
【００１６】前述のバチルス カルドテナックス由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子との相同性、また分子量等より
前述ＮｃｏＩ断片中の配列表の配列番号４に示す翻訳可
能領域を、本発明のＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子と
決定し、該ＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を明ら
かにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示
す。その結果、前述のバチルス カルドテナックス由来
のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比べて２アミノ
酸の置換及び１アミノ酸の欠失が認められた。
ＮＡポリメラーゼ遺伝子との相同性、また分子量等より
前述ＮｃｏＩ断片中の配列表の配列番号４に示す翻訳可
能領域を、本発明のＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子と
決定し、該ＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を明ら
かにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示
す。その結果、前述のバチルス カルドテナックス由来
のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比べて２アミノ
酸の置換及び１アミノ酸の欠失が認められた。
【００１７】以上のようにして得られた形質転換体Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１／ｐＵＩ
Ｆ１０１の培養液１ｍｌから５００単位のＤＮＡポリメ
ラーゼが得られ、工業的な製造が可能になった。
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ １０１／ｐＵＩ
Ｆ１０１の培養液１ｍｌから５００単位のＤＮＡポリメ
ラーゼが得られ、工業的な製造が可能になった。
【００１８】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
これら実施例に限定されるものではない。
【００１９】実施例１ （１）バチルス ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡ
の調製 バチルス ステアロサーモフィラス ＩＡＭ １１００
１（ＡＴＣＣ８００５）を１リットルのＬ培地（バクト
トリプトン１０ｇ／ｌ）酵母エキス５ｇ／ｌ）ＮａＣｌ
の５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振とう培養し、
集菌した菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、０．０５Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（５
ｍｇ／ｍｌ）を８００μｌ加えて２０℃１時間放置し
た。ＳＥＴ溶液〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕を２
４ｍｌ加えた後、５％ＳＤＳ溶液を４ｍｌとプロティナ
ーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加えて３７℃、
１時間放置した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の
後、エタノールを加えて長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌し
たつまようじで巻取って回収した。以上の操作により
１．７ｍｇのＤＮＡが得られた。
の調製 バチルス ステアロサーモフィラス ＩＡＭ １１００
１（ＡＴＣＣ８００５）を１リットルのＬ培地（バクト
トリプトン１０ｇ／ｌ）酵母エキス５ｇ／ｌ）ＮａＣｌ
の５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振とう培養し、
集菌した菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、０．０５Ｍ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾチーム（５
ｍｇ／ｍｌ）を８００μｌ加えて２０℃１時間放置し
た。ＳＥＴ溶液〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ〕を２
４ｍｌ加えた後、５％ＳＤＳ溶液を４ｍｌとプロティナ
ーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を４００μｌ加えて３７℃、
１時間放置した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の
後、エタノールを加えて長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌し
たつまようじで巻取って回収した。以上の操作により
１．７ｍｇのＤＮＡが得られた。
【００２０】（２）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ１００ｐｍｏ
ｌとバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡ１ｎｇを
用いて全量１００μｌで９５℃３０秒、５５℃１分、７
２℃２分のＰＣＲを３０サイクル行った。５μｌをとり
アガロースゲル電気泳動で分析した結果、６００塩基対
のＤＮＡ断片が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片
をＳｍａＩで開環したＭ１３ファージｍｐ１８ベクター
に組込みジデオキシ法により塩基配列を分析した。
増幅 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ１００ｐｍｏ
ｌとバチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡ１ｎｇを
用いて全量１００μｌで９５℃３０秒、５５℃１分、７
２℃２分のＰＣＲを３０サイクル行った。５μｌをとり
アガロースゲル電気泳動で分析した結果、６００塩基対
のＤＮＡ断片が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片
をＳｍａＩで開環したＭ１３ファージｍｐ１８ベクター
に組込みジデオキシ法により塩基配列を分析した。
【００２１】（３）ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡを１つの酵素
につき５μｇ用いてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ
Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中
のＤＮＡをナイロン膜に移し、上記ＰＣＲにより得た６
００塩基対のＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行った。プローブはランダムプライミン
グ法により放射性標識した。ハイブリダイゼーションは
６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００
μｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ中で６５℃５時間行った。１
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、
Ｘ線フィルムに感光し、オートラジオグラムをとった。
伝子の検索 バチルス ステアロサーモフィラスＤＮＡを１つの酵素
につき５μｇ用いてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ
Ｉで分解し、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル中
のＤＮＡをナイロン膜に移し、上記ＰＣＲにより得た６
００塩基対のＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダ
イゼーションを行った。プローブはランダムプライミン
グ法により放射性標識した。ハイブリダイゼーションは
６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００
μｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ中で６５℃５時間行った。１
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、
Ｘ線フィルムに感光し、オートラジオグラムをとった。
【００２２】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したＨｉｎｄＩＩＩ
（２．４０ｋｂ）、ＨｉｎｃＩＩ（１．４５ｋｂ）及び
ＸｈｏＩ（２．１ｋｂ）ＤＮＡ断片をプラスミドベクタ
ー中にクローン化するため、バチルス ステアロサーモ
フィラスＤＮＡをそれぞれ１００μｇずつ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＮＸｈｏＩで分解し、目的の大き
さのＤＮＡをアガロースゲルより回収した。回収はガラ
スビーズ吸着法を用いた。ｐＴＶ１１８Ｎプラスミドを
それぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性ホスファターゼ
で末端のリン酸基を除去したベクターを加えてＤＮＡリ
ガーゼにより結合した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。得られた組換体の集団の中からコロニーハイブリダ
イゼーションによって目的のクローンを選択した。ナイ
ロン膜上に生育させた組換体のコロニー５０個〜２００
個を０．５Ｎ 水酸化ナトリウム、１．５Ｍ 塩化ナト
リウム溶液で変性させた後、１Ｍ トリス−ＨＣｌ、
１．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液で中和
し、紫外線照射でファージＤＮＡを膜上に固定した。プ
ローブ調製及びハイブリダイゼーションの条件はゲノミ
ックサザン分析に準じた。
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したＨｉｎｄＩＩＩ
（２．４０ｋｂ）、ＨｉｎｃＩＩ（１．４５ｋｂ）及び
ＸｈｏＩ（２．１ｋｂ）ＤＮＡ断片をプラスミドベクタ
ー中にクローン化するため、バチルス ステアロサーモ
フィラスＤＮＡをそれぞれ１００μｇずつ、ＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＮＸｈｏＩで分解し、目的の大き
さのＤＮＡをアガロースゲルより回収した。回収はガラ
スビーズ吸着法を用いた。ｐＴＶ１１８Ｎプラスミドを
それぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性ホスファターゼ
で末端のリン酸基を除去したベクターを加えてＤＮＡリ
ガーゼにより結合した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。得られた組換体の集団の中からコロニーハイブリダ
イゼーションによって目的のクローンを選択した。ナイ
ロン膜上に生育させた組換体のコロニー５０個〜２００
個を０．５Ｎ 水酸化ナトリウム、１．５Ｍ 塩化ナト
リウム溶液で変性させた後、１Ｍ トリス−ＨＣｌ、
１．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液で中和
し、紫外線照射でファージＤＮＡを膜上に固定した。プ
ローブ調製及びハイブリダイゼーションの条件はゲノミ
ックサザン分析に準じた。
【００２３】（５）クローン化断片に制限酵素分析及び
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた３種類のＤＮＡ断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記３断片はＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＸｈｏＩの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色
体ＤＮＡ上に存在することが判明した。必要以外の連結
ができるだけ起こらないように制限酵素切断部位を選択
し、図１に示すように、３種のＤＮＡ断片とベクターｐ
ＴＶ１１８Ｎを同時に連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を含む約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を組込んだプラス
ミドを構築し、ｐＵＩＦ１０１と命名した。なお、図１
はｐＵＩＦ１０１の構築を示す工程図である。次に該プ
ラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換
体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ
ＵＩＦ１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３９）を得た。
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた３種類のＤＮＡ断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記３断片はＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＸｈｏＩの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色
体ＤＮＡ上に存在することが判明した。必要以外の連結
ができるだけ起こらないように制限酵素切断部位を選択
し、図１に示すように、３種のＤＮＡ断片とベクターｐ
ＴＶ１１８Ｎを同時に連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子を含む約３．５ｋｂのＤＮＡ断片を組込んだプラス
ミドを構築し、ｐＵＩＦ１０１と命名した。なお、図１
はｐＵＩＦ１０１の構築を示す工程図である。次に該プ
ラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換
体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐ
ＵＩＦ１０１（ＦＥＲＭ Ｐ−１２２３９）を得た。
【００２４】（６）形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記組換えプラスミドｐＵＩＦ１０１を有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１（ＦＥＲＭＰ−１２２３９）をアンピシリンが
１００μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬ培地５ｍｌに植菌
し３７℃で培養した。培養液の濁度が０．６
（Ａ６００）のとき、誘導物質であるイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１
５時間培養を行った。培養液１ｍｌから集菌し、５０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％スクロース
溶液で洗浄した。同じ溶液に再溶解した後、同量のリシ
ス溶液〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５
％ショ糖、６０ｍＭ スペルミジン・一塩酸、２０ｍＭ
塩化ナトリウム、１２ｍＭ ＤＴＴ〕を加え、４℃で
４５分間静置した。更に５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１０
０（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を２０μｌ加え、３７℃で
５分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、６０
℃、２０分静置した後再度遠心分離した上清を回収し、
粗抽出液とした。
製 上記組換えプラスミドｐＵＩＦ１０１を有する大腸菌Ｈ
Ｂ１０１（ＦＥＲＭＰ−１２２３９）をアンピシリンが
１００μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬ培地５ｍｌに植菌
し３７℃で培養した。培養液の濁度が０．６
（Ａ６００）のとき、誘導物質であるイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１
５時間培養を行った。培養液１ｍｌから集菌し、５０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％スクロース
溶液で洗浄した。同じ溶液に再溶解した後、同量のリシ
ス溶液〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５
％ショ糖、６０ｍＭ スペルミジン・一塩酸、２０ｍＭ
塩化ナトリウム、１２ｍＭ ＤＴＴ〕を加え、４℃で
４５分間静置した。更に５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１０
０（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）を２０μｌ加え、３７℃で
５分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、６０
℃、２０分静置した後再度遠心分離した上清を回収し、
粗抽出液とした。
【００２５】（７）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定 反応溶液として６７ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．
４）、６．７ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０ｎＭ
〔３Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して
適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分反応させた後、
５０ｍＭ ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ｍｌ
加えて反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、全
量をグラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％
ＴＣＡで数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、
フィルターを乾燥して液体シンチレーションカウンター
でフィルター上の放射活性を測定した。１ｍｌの培養液
から５００単位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。
４）、６．７ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０ｎＭ
〔３Ｈ〕ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して
適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分反応させた後、
５０ｍＭ ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ｍｌ
加えて反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、全
量をグラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％
ＴＣＡで数回洗浄した後、７０％エタノールで置換し、
フィルターを乾燥して液体シンチレーションカウンター
でフィルター上の放射活性を測定した。１ｍｌの培養液
から５００単位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。
【００２６】（８）プラスミドｐＵＩＦ１０１を導入し
た大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵＩＦ１０１の菌体３．０ｇより
精製を開始し、実施例１−（６）で示した方法により２
０ｍｌの粗抽出液を得た。これらを６０℃で３０分間イ
ンキュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離
した（１２０００ｒｐｍ、１０分）。この上清に硫酸ア
ンモニウムを加えていき、３０〜８０％飽和で沈殿する
画分をとってＤＥ緩衝液〔５０ｍＭ トリス−ＨＣＩ
ｐＨ７．０、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）〕で透析した後、同じ緩衝液で平
衡化したＤＥ５２（ワットマン社）カラム１５ｍｌに添
加し０ｍＭ〜３００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶
出して分画し、実施例１−（７）に従ってＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を調べた。次に活性画分を集めてＤＥ緩衝液
で透析し、ＤＥ緩衝液で平衡化したＰ−１１（ワットマ
ン社）カラム１５ｍｌに添加した。次に０ｍＭ〜３００
ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し活性画分を集め
た。Ｐ１１画分の酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
たところ、分子量約１０万ダルトンの単一バンドを与え
た。
た大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵＩＦ１０１の菌体３．０ｇより
精製を開始し、実施例１−（６）で示した方法により２
０ｍｌの粗抽出液を得た。これらを６０℃で３０分間イ
ンキュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離
した（１２０００ｒｐｍ、１０分）。この上清に硫酸ア
ンモニウムを加えていき、３０〜８０％飽和で沈殿する
画分をとってＤＥ緩衝液〔５０ｍＭ トリス−ＨＣＩ
ｐＨ７．０、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）〕で透析した後、同じ緩衝液で平
衡化したＤＥ５２（ワットマン社）カラム１５ｍｌに添
加し０ｍＭ〜３００ｍＭ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶
出して分画し、実施例１−（７）に従ってＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を調べた。次に活性画分を集めてＤＥ緩衝液
で透析し、ＤＥ緩衝液で平衡化したＰ−１１（ワットマ
ン社）カラム１５ｍｌに添加した。次に０ｍＭ〜３００
ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し活性画分を集め
た。Ｐ１１画分の酵素標品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
たところ、分子量約１０万ダルトンの単一バンドを与え
た。
【００２７】実施例２ （１）ＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子を含むバチルス
ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡ塩基配列の決定 ジデオキシ法により、配列表の配列番号３に示すｐＵＩ
Ｆ１０１のＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を前述のバチルス カルドテナッ
クス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較し
構造遺伝子を推定することにより、バチルス ステアロ
サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を
推定した。
ステアロサーモフィラス染色体ＤＮＡ塩基配列の決定 ジデオキシ法により、配列表の配列番号３に示すｐＵＩ
Ｆ１０１のＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片の塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を前述のバチルス カルドテナッ
クス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列と比較し
構造遺伝子を推定することにより、バチルス ステアロ
サーモフィラスＤＮＡポリメラーゼの全アミノ酸配列を
推定した。
【００２８】
【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造が明らかとな
り、遺伝子工学研究用試薬として有用なＤＮＡポリメラ
ーゼの遺伝子工学的製造法が提供された。
新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子構造が明らかとな
り、遺伝子工学研究用試薬として有用なＤＮＡポリメラ
ーゼの遺伝子工学的製造法が提供された。
【００２９】
【００３０】 配列番号：１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＮＯ 配列の特徴：１−２３ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： ＧＡＹＣＣＨＡＡＣＹ ＴＳＣＡＲＡＡＹＡＴ ＨＣＣ
２３
２３
【００３１】 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：ＹＥＳ 配列の特徴：１−２１ Ｓ ｐｒｉｍｅｒ 配列： ＫＡＳＮＡＫＹＴＣＲ ＴＣＲＴＧＮＡＣＹＴ Ｇ ２
１
１
【００３２】 配列番号：３ 配列の長さ：３２４６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：生物名：バチルス ステアロサーモフィラス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ） 株名：ＩＡＭ１１００１（ＡＴＣＣ８００５） 配列：
ｌｕｓ） 株名：ＩＡＭ１１００１（ＡＴＣＣ８００５） 配列：
【００３３】配列番号：４ 配列の長さ：２６２８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：生物名：バチルス ステアロサーモフィラス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ） 株名：ＩＡＭ１１００１（ＡＴＣＣ８００５） 配列：
ｌｕｓ） 株名：ＩＡＭ１１００１（ＡＴＣＣ８００５） 配列：
【００３４】配列番号：５ 配列の長さ：８７６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＵＩＦ１０１の構築を示す工程図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ. 145，Ｎｏ．１（1981）ｐ．21−26 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅ ｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ，Ｎｏ．90（1990）ｐ．214 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 264，Ｎｏ．７（1989）ｐ．4255−4263 ＦＡＳＥＢ（ＦＥＤ．ＡＭ．ＳＯＣ. ＦＯＲ ＥＸＰ．ＢＩＯＬ．）ＪＯＵＲ ＮＡＬ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１（1992, Ｊａｎ．）ｐ．Ａ216 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/54 C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ
Claims (4)
- 【請求項１】 配列表の配列番号５に示されるアミノ酸
配列をコードしていることを特徴とするＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 配列表の配列番号４の塩基配列で示され
る請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。 - 【請求項３】 プラスミドｐＵＩＦ１０１より単離され
る請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子を組込んだプラスミドで形質転
換した形質転換体を培養し、該培養物からＤＮＡポリメ
ラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13140092A JP3046142B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-04-27 | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13140092A JP3046142B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-04-27 | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05304964A JPH05304964A (ja) | 1993-11-19 |
| JP3046142B2 true JP3046142B2 (ja) | 2000-05-29 |
Family
ID=15057094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13140092A Expired - Fee Related JP3046142B2 (ja) | 1992-04-27 | 1992-04-27 | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3046142B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014157377A1 (ja) | 2013-03-26 | 2014-10-02 | 株式会社ニッポンジーン | 遺伝子多型の識別に用いるプライマーとプローブのセットおよびその利用 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6100078A (en) * | 1994-04-01 | 2000-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Purified DNA polymerase from bacillus stearothermophilus ATCC 12980 |
| US5814506A (en) * | 1995-08-02 | 1998-09-29 | New England Biolabs, Inc. | Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion |
| US5736373A (en) * | 1996-09-23 | 1998-04-07 | Becton, Dickinson And Company | Thermostable DNA polymerase from Bacillus pallidus |
| CN1301838A (zh) * | 1999-12-24 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——dna聚合酶13和编码这种多肽的多核苷酸 |
-
1992
- 1992-04-27 JP JP13140092A patent/JP3046142B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏ．９０（１９９０）ｐ．２１４ |
| ＦＡＳＥＢ（ＦＥＤ．ＡＭ．ＳＯＣ．ＦＯＲ ＥＸＰ．ＢＩＯＬ．）ＪＯＵＲＮＡＬ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１（１９９２，Ｊａｎ．）ｐ．Ａ２１６ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１４５，Ｎｏ．１（１９８１）ｐ．２１−２６ |
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６４，Ｎｏ．７（１９８９）ｐ．４２５５−４２６３ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014157377A1 (ja) | 2013-03-26 | 2014-10-02 | 株式会社ニッポンジーン | 遺伝子多型の識別に用いるプライマーとプローブのセットおよびその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05304964A (ja) | 1993-11-19 |
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