JP3761197B2

JP3761197B2 - 新規ｄｎａポリメラーゼ

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Publication number: JP3761197B2
Application number: JP52420697A
Authority: JP
Inventors: 隆司上森; 良純石野; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-26
Publication date: 2006-03-29
Anticipated expiration: 2016-12-26
Also published as: CN1209170A; AU1209897A; CN1552869A; EP0870832A4; EP0870832A1; AU717156B2; CA2241170A1; WO1997024444A1; KR19990076834A; US6395526B1; KR100443780B1; CN1137266C

Description

技術分野
本発明は遺伝子工学用試薬として有用なＤＮＡポリメラーゼ及びその製造方法、さらにそれをコードする遺伝子に関する。
背景技術
ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、ＤＮＡ塩基配列決定法、標識化、部位特異的変異導入法などに広く利用されている。また最近ではポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の開発により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが注目を集め、ＰＣＲ法に適した種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、商品化されている。
現在知られているＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配列の共通性から大きく４つのファミリーに分類することができ、中でもファミリーＡ（ポルＩ型酵素）とファミリーＢ（α型酵素）が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼは概ね類似した生化学的特性を有しているが、詳細に比較すると個々の酵素によって基質特異性、基質アナログの取込み、プライマー伸長性の強さ及び速度、ＤＮＡ合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性の付随、温度、ｐＨなどの至適反応条件、また阻害剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがってこれまで実験操作に応じてそれぞれ現存する中で最も適した性質を有するＤＮＡポリメラーゼが選ばれ利用されている。
発明の開示
本発明の目的は、上記のどのファミリーにも属さず、現存するＤＮＡポリメラーゼが有しない生化学的特性をもった新規なＤＮＡポリメラーゼを提供することにある。例えばプライマー伸長活性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は相反する性質とされており、現存するＤＮＡポリメラーゼでプライマー伸長活性の強い酵素は合成の忠実性にとって重要な校正機能である３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しない。また校正機能が優れているものはプライマー伸長活性が弱い。したがって、強い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しながらプライマー伸長活性が強いＤＮＡポリメラーゼの開発は、試験管内でのＤＮＡ合成に大いに役立つものである。
本発明の他の目的は、このような新規なＤＮＡポリメラーゼの製造方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を提供することにある。
本発明者らは鋭意研究の結果、超好熱性古細菌であるピロコッカスフリオサスから新規のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を見出し、これをクローニングすることによって２種の新規タンパク質が共存により活性を示す新規ＤＮＡポリメラーゼ活性を持つことを明らかにした。更にこれらの遺伝子を導入した形質転換体を作製してこの複合型ＤＮＡポリメラーゼを大量生産することに成功し、本発明を完成した。
即ち、本発明の要旨は、
（１）以下の性質を有することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ、
▲１▼ 一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがアニーリングした複合体を基質としてポリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化ＤＮＡを基質とした場合に比べて高い活性を示す。
▲２▼ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
▲３▼ λ−ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を以下の条件で行った場合、約２０キロ塩基対のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。
ＰＣＲの条件：
（ａ）反応液組成：１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、３．５ｍＭＭｇＣｌ₂、７５ｍＭＫＣｌ、４００μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００、５．０ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ、１０ｐmole／５０μｌプライマーλ１（配列表の配列番号８）、およびプライマーλ１１（配列表の配列番号９）、３．７単位／５０μｌＤＮＡポリメラーゼを含む。
（ｂ）反応条件：９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行う。
（２）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較してＤＮＡ合成時の誤りの頻度が低いことを特徴とする前記（１）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（３）ゲルろ過法による分子量が約２２０キロダルトン、あるいは約３８５キロダルトンである前記（１）又は（２）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（４）２種のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク（第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクおよび第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク）の共存により活性を示すことを特徴とする前記（１）〜（３）いずれか記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（５）第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクおよび第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が、それぞれ約９０，０００ダルトン、約１４０，０００ダルトンであることを特徴とする前記（４）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（６）前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする前記（４）又は（５）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（７）前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする前記（４）又は（５）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（８）前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であり、かつ前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクが、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物であることを特徴とする前記（４）又は（５）記載のＤＮＡポリメラーゼ、
（９）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのアミノ酸配列からなる、前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク、
（１０）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換した実質的に同等の活性を有する機能的同等物としてのアミノ酸配列からなる、前記（４）又は（５）に記載のＤＮＡポリメラーゼを構成する第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク、
（１１）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードすることを特徴とする、前記（９）に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（１２）配列表の配列番号２に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、前記（９）に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（１３）配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいは配列番号３のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列からなり、かつ第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードすることを特徴とする、前記（１０）に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（１４）配列表の配列番号４に示される塩基配列の全部又は一部を含むか、あるいはこの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列からなることを特徴とする、前記（１０）に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、
（１５）前記（１１）又は（１２）に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子と、前記（１３）又は（１４）に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法、並びに
（１６）前記（１１）又は（１２）に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体と、前記（１３）又は（１４）に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、該培養物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクを混合してＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１で得られたコスミドクローンNo．２６４とコスミドクローンNo．４９１に挿入されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
第２図は、プラスミドｐＦＵ１００１に挿入されたＸｂａＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
第３図は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨを示す図である。
第４図は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を示す図である。
第５図は、本発明のＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す図である。
第６図は、本発明のＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性を示すオートラジオグラムの図である。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびその構成タンパク
本発明のＤＮＡポリメラーゼの一例は、以下の性質を有するものである。
▲１▼ 一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがアニーリングした複合体を基質としてポリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化ＤＮＡ（ＤＮase I処理仔牛胸腺ＤＮＡ）を基質とした場合に比べて高い活性を示す。
▲２▼ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
▲３▼ 至適ｐＨ：６．５〜７．０（リン酸カリウム緩衝液中、７５℃）。
▲４▼ ８０℃、３０分の熱処理後に約８０％の残存活性を示す。
▲５▼ また、λ−ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を行った場合、他の酵素の添加なしに約２０キロ塩基対のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。ＰＣＲの条件は次のとおりである。
（イ）ＰＣＲ反応液組成：１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２），３．５ｍＭＭｇＣｌ₂，７５ｍＭＫＣｌ，４００μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．１％トリトンＸ−１００（Triton X-100）、５．０ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ、１０ｐmole／５０μｌプライマーλ１（配列表の配列番号８）、およびプライマーλ１１（配列表の配列番号９）、３．７単位／５０μｌＤＮＡポリメラーゼを含む。ここで、ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、次のようにして決定される。活性を測定しようとする試料を含む反応液［２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，６０ｎＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（アマシャム社製）］５０μｌを調製し、７５℃で１５分間反応させ、そのうちの４０μｌをＤＥペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５％Ｎａ₂ＨＰＯ₄で洗浄を５回行った後にＤＥペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、３０分間あたりに１０ｎｍｏｌの［³Ｈ］ｄＴＭＰを基質ＤＮＡに取り込む酵素量を酵素１単位とする。
（ロ）ＰＣＲ反応条件：９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行なう。
▲６▼ 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長活性、ＤＮＡ合成の正確性のいずれもがＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較して優れている。即ち、本発明のＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応の伸長性、例えばＰＣＲ法において増幅できるＤＮＡの鎖長や、その反応の正確性（ＤＮＡ合成時に起こる誤りの頻度が低いこと）は、ともに代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えば宝酒造社製のTakaRa Taq）に比べ優れている。
本発明のＤＮＡポリメラーゼの分子量は、ゲルろ過法により約２２０キロダルトン、あるいは約３８５キロダルトンであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では約９０，０００ダルトン、約１４０，０００ダルトンに相当する２本のバンドで示され、２種のタンパクより構成される酵素である。本発明では約９０，０００ダルトンのもの（後述のＯＲＦ３に相当する）を第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクと呼び、約１４０，０００ダルトンのもの（後述のＯＲＦ４に相当する）を第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクと呼ぶ。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクと第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとが、１：１又は１：２のモル比で非共有結合的に複合体を形成しているものと推定される。
本発明のＤＮＡポリメラーゼを構成する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。また、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクは、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。
ここで本明細書に記載の「機能的同等物」とは、以下のようなものをいう。天然に存在するタンパクにはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のタンパクの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパクと実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があってもその機能や活性については大きな違いが認められないものを機能的同等物と呼ぶ。ここで変異したアミノ酸の数は、実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものであるかぎり特に限定されるものではないが、１以上、例えば１又は数個、より具体的には１〜約１０個の変異（欠失、挿入、付加、置換等）などが例示される。
人為的にタンパクのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。たとえば、大腸菌で発現されたタンパクのＮ末端に存在するメチオニン残基は多くの場合メチオニンアミノペプチダーゼの作用により除去されるとされているが、タンパクの種類によってはその除去が完全には行われず、メチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生成される。しかしこのメチオニン残基の有無はタンパクの活性には影響を与えない場合が多い。また、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中のあるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている［サイエンス（Science）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）］。
さらに、遺伝子工学的にタンパクの生産を行う際には融合タンパクとして発現させることがしばしば行われる。たとえば目的タンパクの発現量を増加させるためにＮ末端に他のタンパク由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的タンパクのＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖を付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することによる目的タンパクの精製を容易にすることなどが行われている。したがって本発明のＤＮＡポリメラーゼとは一部異なったアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼであっても、それが本発明のＤＮＡポリメラーゼと本質的に同等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲内に属するものである。
（２）本発明のＤＮＡポリメラーゼの遺伝子
本発明のＤＮＡポリメラーゼを構成する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号２に示される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡが挙げられる。即ち、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部を含むＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号２に示される塩基配列の一部を含むＤＮＡであっても、第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列は本発明の範囲内である。また、配列番号１のアミノ酸配列において、１以上の例えば１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換などされたアミノ酸配列からなり、かつ第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードするＤＮＡも挙げられる。また、さらにこれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、かつ第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列も本発明の範囲内である。また、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号４に示される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡが挙げられる。即ち、配列番号３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部を含むＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号４に示される塩基配列の一部を含むＤＮＡであっても、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列は本発明の範囲内である。また、配列番号３のアミノ酸配列において、１以上の例えば１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換などされたアミノ酸配列からなり、かつ第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードするＤＮＡも挙げられる。また、さらにこれらの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、かつ第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパクをコードする塩基配列も本発明の範囲内である。
ここで、「第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパク」、あるいは「第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとしての機能を有するタンパク」とは、これらの２種のタンパク質が共存した場合、前記の▲１▼〜▲６▼に示された各種の理化学的性質を有するＤＮＡポリメラーゼ活性を与える性質を有するタンパクをいう。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能」とは、プローブとともに０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中、５０℃にて１２〜２０時間インキュベートした後に、プローブとハイブリダイズしていることをいう。
ここで本明細書に記載の「アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ」なる用語について説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類づつが存在することが知られている。したがってあるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。遺伝子は自然界において必ずしも安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。遺伝子上の塩基配列に変異が起こってもそこにコードされたアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。したがってある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子ができていく可能性は否定できない。
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば遺伝子工学的なタンパクの生産において、目的のタンパクをコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合にはタンパクの発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパクの高発現を図ることが行われている（例えば、特公平７−１０２１４６号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は、人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。したがって本発明中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する遺伝子ではなくても、それが本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該遺伝子は本発明に包含されるものである。
（３）本発明のＤＮＡポリメラーゼの製造方法
本発明者らは、超好熱性古細菌であるピロコッカスフリオサスから新規のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を見出し、これをクローニングすることによって該遺伝子上に２種のタンパク質が共存により活性を示す新規なＤＮＡポリメラーゼがコードされていることを明らかにした。本発明では、これらの遺伝子を導入した形質転換体を作製して本発明のＤＮＡポリメラーゼを大量生産することが可能である。この場合、前記のような第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子と、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取する方法でもよく、また、第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体と、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、培養物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクを混合することによりＤＮＡポリメラーゼを採取する方法であってもよい。
ここで、「第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子と、第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体」とは、それぞれの遺伝子を含有する２つの発現ベクターで同時形質転換されたものであってもよく、あるいは両方の遺伝子が１つの発現ベクターに組み込まれてそれぞれのタンパクが発現できるように調製された形質転換体であってもよい。
（４）本発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング、得られたクローンの解析、発現産物であるＤＮＡポリメラーゼの理化学性質、活性、ＰＣＲ法への適用などについて、以下に詳細に説明する。
本発明に使用する菌株としては、特に限定されるものではないが、例えば、ピロコッカス属に属する菌株としてピロコッカスフリオサス（Pyrococcus furiosus）ＤＳＭ３６３８株が挙げられ、該菌株はドイッチェザムルンクフォンミクロオルガニスメンウントツェルクルチェウレンＧｍｂＨより入手可能である。本発明者らは該菌株を適当な増殖培地で培養し、培養物の粗抽出液を調製してポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った場合に、ゲル内でＤＮＡポリメラーゼ活性を示すタンパク質のバンドが数種類存在することを発見した事から、それぞれに対応する遺伝子が存在すると考えられた。即ち、新規ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子及びその産物は次に例示する工程によりクローニングすることができる。
▲１▼ ピロコッカスフリオサスからＤＮＡを抽出する、
▲２▼ ▲１▼のＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、プラスミド、コスミドなどをベクターとしてＤＮＡライブラリーを作製する、
▲３▼ ▲２▼で調製したライブラリーを大腸菌に導入し、外来遺伝子を発現させることにより各クローンの粗抽出液を集めたプロテインライブラリーを作製する、
▲４▼ ▲３▼で調製したプロテインライブラリーを用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、活性を有する粗抽出液を与えた大腸菌クローンから外来ＤＮＡを取り出す、
▲５▼ 取り出したプラスミドまたはコスミド中に含まれているピロコッカスフリオサスＤＮＡ断片を解析し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すタンパク質がコードされている領域を絞っていく、
▲６▼ ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すタンパク質がコードされていると考えられる領域の塩基配列を決定し、タンパク質の一次構造を推定する、
▲７▼ ▲６▼で推定したタンパク質が大腸菌中でより発現しやすい型になるように発現用プラスミドを構築し、産生されたタンパク質を精製して性質を解析する。
上記ＤＮＡ供与体であるピロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３８は超好熱性古細菌であり、９５℃で嫌気培養する。増殖した菌体を破砕してＤＮＡを抽出、精製する方法、また得られたＤＮＡを制限酵素で切断する方法等は公知の方法を用いる事ができ、当該方法の詳細は１９８２年コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis）ほか著、モレキュラークローニング，アラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第７５〜１７８頁に記載されている。
ＤＮＡライブラリーを作製するにあたっては、例えば、トリペルヘリックスコスミドベクター（ストラタジーン社製）を使用することができる。ピロコッカスフリオサスのＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化し、密度勾配遠心分離を行って得られる長鎖のＤＮＡ断片を該ベクターのＢａｍＨＩサイトにライゲーションし、イン・ビトロ・パッケージングを行う。こうして作製されたＤＮＡライブラリーより得られた形質転換体をそれぞれ個別に培養し、集菌後、超音波処理により菌体を破砕し、熱処理を行って宿主大腸菌の有するＤＮＡポリメラーゼを失活させた後、遠心分離を行って耐熱性タンパクを含む上清を得ることができる。該上清はコスミドプロテインライブラリーと命名され、その一部を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定することによりピロコッカスフリオサス由来のＤＮＡポリメラーゼを発現するクローンを得ることができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定法は公知の方法を用いることができ、当該方法はハーパーアンドロー社発行、Ｄ．Ｒ．デービス（Ｄ．Ｒ．Davis）編集のＤＮＡポリメラーゼフロムエシェリヒアコリ（DNA polymerase from Escherichia coli）第２６３〜２７６頁（Ｃ．Ｃ．リチャードソン著）に記載されている。
ピロコッカスフリオサスのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子としてはすでにそのうちの一種類を本発明者らがクローニングし、その構造を明らかにしており、ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research）第２１巻２５９−２６５頁（１９９３）に記載されている。該遺伝子による翻訳産物は７７５アミノ酸からなる分子量約９０，０００ダルトンのポリペプチドであり、そのアミノ酸配列中には明らかにα型ＤＮＡポリメラーゼの保存配列が含まれている。また実際にこの遺伝子産物の示すＤＮＡポリメラーゼ活性はα型ＤＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤であるアフィディコリンによって阻害されるという性質を有するものであり、本発明のＤＮＡポリメラーゼとは異なる。したがって、得られた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すクローンの中から上記の既存の遺伝子を除去するには各クローンの含有するコスミドを分解し、上記の遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしないクローンを選択すればよい。こうして得られた新規なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するクローンより分解されるコスミドについてその挿入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を作製することができる。次に、得られた制限酵素地図をもとに該ＤＮＡ断片を種々の領域に分断し、それぞれをプラスミドベクターにサブクローニングし、大腸菌に導入して発現される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定することによって該ＤＮＡ断片上のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の位置を調べることができる。こうしてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が含まれる約１０キロ塩基対のＸｂａＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片を得ることができる。
該ＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミドを有する組換え大腸菌は、その粗抽出液中に９０℃２０分間処理後も十分量のＤＮＡ合成活性を有し、該ＤＮＡ断片が組み込まれていないプラスミドはこのような活性を有しないことより、該ＤＮＡ断片上に耐熱性ポリメラーゼ産生情報が存在し、かつ大腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると結論される。該ＤＮＡ断片がｐＴＶ１１８Ｎベクター（宝酒造社製）に組み込まれたプラスミドはプラスミドｐＦＵ１００１と命名され、また、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９はEscherichia coli JM109／pFU1001と命名、表示され、平成７年８月１１日（原寄託日）より、ブタペスト条約のもと、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５５７９として寄託されている。
プラスミドｐＦＵ１００１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、たとえばジデオキシ法によって決定することができる。さらに、得られた塩基配列を解析することにより、その塩基配列中のタンパクをコードしうる領域、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を推定することができる。
プラスミドｐＦＵ１００１に挿入された約１０キロ塩基対のＸｂａＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片の塩基配列のうち８４５０塩基対分の配列を配列表の配列番号５に示す。該塩基配列中には６ケの連続したＯＲＦが存在しており、５’側より順にＯＲＦ１，ＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ５，ＯＲＦ６と命名されている。図２に上記ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片の制限酵素地図、および該断片上に存在するＯＲＦの位置を示す（図中左側よりＯＲＦ１〜ＯＲＦ６）。
上記の６つのＯＲＦのどれにもこれまでに知られているＤＮＡポリメラーゼのどれかと相同性を示す配列は見られない。しかしながらＯＲＦ１とＯＲＦ２中にはサッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）で発見されているＣＤＣ６タンパク質、またシゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomyces pombe）で発見されているＣＤＣ１８タンパク質と相同性のある配列が存在している。ＣＤＣ６，ＣＤＣ１８は酵母菌において細胞周期のＤＮＡ合成期（Ｓ期）への移行に必要なタンパク質でＤＮＡ複製開始を調節するタンパク質ではないかと予想されている。またＯＲＦ６は酵母のＤＮＡ障害の修復及び体細胞分裂期、減数分裂期の組換えに働くことが知られているＲＡＤ５１タンパク質とその減数分裂期特異的ホモログであるＤｍｃ１タンパク質と相同性がある配列を有している。ＲＡＤ５１タンパク質をコードする遺伝子も細胞周期のＧ１期からＳ期に移行するところでその発現が誘導されることが知られている。他のＯＲＦ３，ＯＲＦ４，ＯＲＦ５については相同性のある配列を有する既知のタンパク質は発見されない。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性が上記のどのＯＲＦに由来するかを、各種領域を欠失させたＤＮＡ断片を挿入した組換えプラスミドを作製し、該プラスミドで形質転換した形質転換体の耐熱性ポリメラーゼ活性を測定することにより、調べることができる。上記の約１０キロ塩基対のＸｂａＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片よりＯＲＦ１，ＯＲＦ２を欠いたもの、あるいはＯＲＦ５，ＯＲＦ６を欠いたものを挿入した組換えプラスミドで形質転換された形質転換体は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を保持しているが、ＯＲＦ３、あるいはＯＲＦ４が欠けたものでは活性が失われる。このことからＯＲＦ３、あるいはＯＲＦ４にＤＮＡポリメラーゼ活性がコードされていることが予想される。
ＯＲＦ３，ＯＲＦ４のどちらにＤＮＡポリメラーゼがコードされているかは、それぞれのＯＲＦを別々に挿入した組換えプラスミドを作製し、得られる形質転換体について耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性の発現を調べることによって調べることができる。意外にも、ＯＲＦ３、あるいはＯＲＦ４を単独で含む形質転換体のどちらから得られた粗抽出液にもごくわずかのＤＮＡポリメラーゼ活性しか認められない。しかし両抽出液を混合した場合にはＯＲＦ３，ＯＲＦ４の両方を含む形質転換体と同様の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性が得られることから、本発明の新規ＤＮＡポリメラーゼはこの２つのＯＲＦの翻訳産物の働きを必要とするものであることが示される。この２種のタンパクが複合体を形成してＤＮＡポリメラーゼ活性を示すのか、あるいはその一方が他方を修飾して活性型の酵素に変換するのかはＤＮＡポリメラーゼの分子量を測定することによって知ることができる。該ＤＮＡポリメラーゼの分子量をゲル濾過法で測定した結果より、上記の２種のタンパクが複合体を形成していることがわかる。
配列表の配列番号２にＯＲＦ３の塩基配列、配列番号１に該塩基配列より推定されるＯＲＦ３由来の翻訳産物、すなわち第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクのアミノ酸配列をそれぞれ示す。また、配列表の配列番号４にＯＲＦ４の塩基配列、配列番号３に該塩基配列より推定されるＯＲＦ４由来の翻訳産物、すなわち第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクのアミノ酸配列をそれぞれ示す。
本発明のＤＮＡポリメラーゼはＯＲＦ３およびＯＲＦ４を組み込まれた組換えプラスミドで形質転換された形質転換体、たとえばEscherichia coli JM109／pFU1001を通常の培養条件、たとえば１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル，酵母エキス５ｇ／リットル，ＮａＣｌ５ｇ／リットル，ｐＨ７．２）中で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。該ポリメラーゼは上記の培養菌体より、たとえば超音波処理、熱処理、および陰イオン交換カラム（RESOURCE Ｑカラム，ファルマシア社製）、ヘパリンセファロースカラム（HiTrap Heparin，ファルマシア社製）、ゲル濾過カラム（Superose ６ＨＲ，ファルマシア社製）などを用いたクロマトグラフィーを行うことにより、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でほぼ２種のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクの２本のバンドだけを示すまで精製することができる。また、上記のようにＯＲＦ３，ＯＲＦ４をそれぞれ単独で含む形質転換体を個別に培養した後、得られた培養菌体、それらの粗抽出液、あるいは精製されたＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクを混合することによっても目的のＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。２種のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクを混合する場合には特別な操作は必要なく、それぞれの形質転換体の抽出液、またはそれらから精製された両タンパク質を適当量ずつ、単に混ぜ合わせるだけで活性を有するＤＮＡポリメラーゼを得ることができる。
このようにして得られた本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約９０，０００ダルトン、約１４０，０００ダルトンに相当する２本のバンドを示し、これらはそれぞれ第１および第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクに対応する。
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、図３に示されるようにリン酸カリウム緩衝液中、７５℃においてｐＨ６．５〜７．０付近に至適ｐＨを示す。また、該ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を種々の温度で測定した場合には７５〜８０℃で高い活性を示すが、これより高い温度では活性測定の基質に用いる活性化ＤＮＡの二重鎖構造が破壊されるため、該酵素の活性にとっての正確な至適温度は測定されていない。該ＤＮＡポリメラーゼは高い熱安定性を有しており、図４に示されるように８０℃、３０分間の熱処理の後も８０％以上の残存活性を保持している。この熱安定性は該酵素のＰＣＲ法での使用を可能にする。また、α型ＤＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤として知られているアフィディコリン（aphidicolin）の影響を調べた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの活性は２ｍＭのアフィディコリン存在下においても阻害を受けない。
精製されたＤＮＡポリメラーゼの生化学的特性を解析したところ、本発明のＤＮＡポリメラーゼは試験管内で非常に優れたプライマー伸長活性を有している。表１に示されるように一本鎖ＤＮＡにプライマーがアニーリングした形の基質（Ｍ１３−ＨＴ Primer）を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した場合には、通常の活性測定に用いられる活性化ＤＮＡ（ＤＮase Ｉ処理仔牛胸腺ＤＮＡ）に比べて高いヌクレオチド取り込み活性が得られる。上記のＭ１３−ＨＴ Primer基質を使用した他のＤＮＡポリメラーゼとのプライマー伸長能力の比較を行なうと、本発明のＤＮＡポリメラーゼは既知のピロコッカスフリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ，ストラタジーン社製）やサーマスアクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Taq，宝酒造社製）に比べて優れた伸長活性を示す。更にこの反応系中に競合基質となる活性化ＤＮＡを加えた場合には、上記の２種のＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性が強く阻害されるのに対して本発明のＤＮＡポリメラーゼはより軽度の阻害しか受けず、該酵素がプライマー伸長型の基質に高い親和性を持つことが示される（図６）。

また、本発明のＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲ法に使用した場合には極めて優れた性能を示す。ＰＣＲ法に繁用されるサーマスアクアティカス由来のＤＮＡポリメラーゼは単独では１０キロ塩基対以上のＤＮＡ断片を増幅することは困難であり、他のＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることによってのみ２０キロ塩基対以上のＤＮＡ断片の増幅を行なうことができる［プロシーディングスオブザナショナルアカデミーオブサイエンスオブザＵＳＡ（Proceedings of the National Academy of Science of the USA），第９１巻，第２２１６−２２２０頁（１９９４）］。また、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを利用して増幅できるＤＮＡの鎖長は最大でも３キロ塩基対程度までと言われている。これに対して本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、他の酵素の添加なしに該酵素単独で２０キロ塩基対のＤＮＡ断片の増幅が可能である。
さらに本発明のＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が付随しており、ＤＮＡポリメラーゼ活性に対するエキソヌクレアーゼ活性の強さは、その活性が強いためにＤＮＡ合成の正確性が非常に高いことが知られているＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの活性比に匹敵する（図５）。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼについて測定されたＤＮＡ合成反応中に起こる誤りの頻度は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのものよりも低い。上記した種々の性質は本発明のＤＮＡポリメラーゼがＰＣＲ法などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであることを示すものである。
また本発明により新規ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が発見されたことは、以下のような興味深い知見も提供する。本発明者らは新規ＤＮＡポリメラーゼをコードするＯＲＦ３，４の遺伝子を含む領域が細胞内でどの様に転写されるのかを知るため、ピロコッカスフリオサス細胞より調製したＲＮＡ画分をノザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法及びプライマー伸長法により分析すると、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ６は一つのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）としてＯＲＦ１のすぐ上流から転写されていることが確認される。この事からＯＲＦ１，２の細胞内での産生はＯＲＦ３，４と同じ制御を受けていると予想され、ＯＲＦ１，２，５，６が酵母のＤＮＡ複製開始の調節に関与するＣＤＣ６，ＣＤＣ１８と配列上の相同性があることと考え合わせると本発明の新規ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製にとって重要なＤＮＡポリメラーゼである可能性が高い。更にピロコッカスフリオサスの属する古細菌のＤＮＡ複製系は真核細胞のそれに近いことが予想されるので真核生物ではこれまでにまだ発見されていない複製にとって重要なＤＮＡポリメラーゼとして本発明のＤＮＡポリメラーゼに類似した酵素が存在する事も考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼに類似の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、ピロコッカスフリオサスと同じ超好熱性古細菌に属する細菌、たとえばピロコッカス（Pyrococcus）属に属するピロコッカスフリオサス以外の菌、ピロディクティウム（Pyrodictium）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、スタフィロサーマス（Staphylothermus）属等に属する細菌においても生産されていることが期待される。これらの酵素が本発明のＤＮＡポリメラーゼと同様に２つのＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクより構成されている場合には、これらの酵素のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクの一方と、もう一方のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクに相当する本発明のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとを組み合わせることによっても同様のＤＮＡポリメラーゼ活性が発現されることが期待される。
上記の超好熱性古細菌の生産する、本発明のＤＮＡポリメラーゼに類似の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列に関して、本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列との間に相同性が存在することが期待される。したがって本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をプローブとしたハイブリダイゼーションによって上記の好熱性古細菌より得られたＤＮＡ断片を適当な微生物に導入し、前記のコスミドプロテインライブラリーと同様の方法で調製した熱処理ライゼート中のＤＮＡポリメラーゼ活性を適当な方法で調べることにより、本発明のＤＮＡポリメラーゼの塩基配列と同一ではないが同様の酵素活性を持つ本酵素類似の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を得ることができる。
上記のハイブリダイゼーションは以下の条件で行うことができる。すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベート終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１×までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまで洗浄する。
さらに、本発明により単離された遺伝子、もしくはその塩基配列の一部をプライマーに用い、上記の好熱性古細菌より得られたＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応で得られたＤＮＡ断片、あるいが該断片をプローブとしたハイブリダイゼーションによって上記の好熱性古細菌より得られたＤＮＡ断片を適当な微生物に導入し、上記と同様にＤＮＡポリメラーゼ活性を調べることにより、本発明のＤＮＡポリメラーゼの活性と同一ではないが、同様の活性を持つ、本酵素類似の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を得ることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。なお、実施例中の％は重量％を意味する。
実施例１
（１）ピロコッカスフリオサスのゲノムＤＮＡの調製
ピロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３８の培養は以下のとおりに行った。
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ₄０．００３％、ＮａＣｌ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄０．０００１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％、ＺｎＳＯ₄０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ₄）₂０．１ｐｐｍ、Ｈ₃ＢＯ₃０．１ｐｐｍ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．２５ｐｐｍの組成の培地を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み、溶存酵素を除去した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
つぎに、集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４ｍｌに懸濁し、この懸濁液に０．８ｍｌのリゾチーム［５ｍｇ／ｍｌ、０．２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］、２ｍｌの０．２ＭＥＤＴＡを加えて、２０℃で１時間保温した後、２４ｍｌのＳＥＴ溶液［１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）］を加え、さらに、５％ＳＤＳ４ｍｌ、プロティナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）４００μｌを加え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約３．２ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）コスミドプロテインライブラリーの作製
ピロコッカスフリオサスＤＳＭ３６３８のゲノムＤＮＡ４００μｇをＳａｕ３Ａ１で部分消化し、密度勾配超遠心法により、３５〜５０ｋｂにサイズ分画した。つぎに、トリプルヘリックスコスミドベクター（ストラタジーン社製）１μｇをＸｂａＩ消化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化し、さらに、ＢａｍＨＩ消化して上記の分画された３５〜５０ｋｂのＤＮＡ１４０μｇと混合してライゲーションを行い、ガイガーパック・ゴールド（ストラタジーン社製）を用いたイン・ビトロ・パッケージング法によってピロコッカスフリオサスのゲノムＤＮＡのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケージングし、ライブラリーを調製した。ついで、得られたライブラリーの一部を用いてイー・コリＤＨ５αＭＣＲに形質導入し、得られた形質転換体のうち数個を選んでコスミドＤＮＡを調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認したのち、改めて、上記のライブラリー中から約５００個の形質転換体を選び、それぞれ別個に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１５０ｍｌのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０１ｍｌに懸濁し、１００℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い、さらに、もう一度１００℃、１０分間熱処理した。遠心後の上清として得られるライゼートをコスミドプロテインライブラリーとした。
（３）ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定
ＤＮＡポリメラーゼ活性測定には仔牛胸腺ＤＮＡ（ワージントン社製）をＤＮase Ｉ処理によって活性化したもの（活性化ＤＮＡ）を基質として用いた。ＤＮＡの活性化およびＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、ハーパーアンドロー社発行、Ｄ．Ｒ．デービス（Ｄ．Ｒ．Davis）編集のDNAポリメラーゼフロムエシェリヒアコリ（ＤＮＡ polymerase from Escherichia coli）第２６３−２７６頁（Ｃ．Ｃ．リチャードソン著）に記載の方法で行った。
酵素活性測定は以下の方法で行った。すなわち、活性を測定しようとする試料を含む反応液［２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，６０ｎＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（アマシャム社製）］５０μｌを調製し、７５℃で１５分間反応させた。そのうちの４０μｌをＤＥペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５％Ｎａ₂ＨＰＯ₄で洗浄を５回行った後にＤＥペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって３０分間あたりに１０ｎｍｏｌの［³Ｈ］ｄＴＭＰを基質ＤＮＡに取り込む酵素量を酵素１単位とした。
（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むコスミドクローンの選択
反応溶液として２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），２ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，６０ｎＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（アマシャム社製）を用意し、この溶液４５μｌに対してコスミドプロテインライブラリーの各抽出液より１μｌを５クローンずつ、即ち５μｌを１反応分として加え、７５℃で１５分反応させた後、各４０μｌ分をＤＥペーパーにスポットし、５％Ｎａ₂ＨＰＯ₄で洗浄を５回行い、ＤＥペーパー上に残っている放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。５クローンを１グループとした一次測定により活性が認められたグループは、続いて５クローンを１クローンずつに分け二次測定を行った。コスミドＤＮＡライブラリー中に既知のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むものは予め該遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションテストより、クローンＮｏ．５７，１５４，１６２，３６３であることが分かっていることから、これら以外のクローンでＤＮＡ合成活性を含むクローンとしてＮｏ．４１，１５３，２６４，４６２，４９１の５クローンが発見された。
（５）制限酵素地図の作製
上記の５クローンについてコスミドを分離し、それぞれをＢａｍＨＩで分解してその泳動パターンを調べてみると互いに共通するバンドが何本か見られ、この５クローンはオーバーラップしながらすこしずつずれた領域を組込んでいることが予想された。そこでクローンＮｏ．２６４と４９１の挿入ＤＮＡ断片について制限酵素地図を作製した。両クローンから調製したコスミドを各種制限酵素で切断した結果、適当な大きさの断片に切断されたＫｐｎＩ，ＮｏｔＩ，ＰｓｔＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ（いずれも宝酒造社製）についてそれぞれ切断位置を決定した結果、図１に示すような地図が得られた。
（６）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のサブクローニング
図１に示した制限酵素地図をもとにクローン２６４あるいは４９１由来のコスミドより１０キロ塩基対前後の種々のＤＮＡ断片を切り出し、ｐＴＶ１１８ＮまたはｐＴＶ１１９Ｎベクター（宝酒造社製）にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドによる形質転換体について耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した結果、約１０キロ塩基対のＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片に強い耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを産生する遺伝子があることが判明した。そこで該ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片がｐＴＶ１１８Ｎベクターに組み込まれたものをプラスミドｐＦＵ１００１と命名し、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９をEscherichia coli JM109／pFU1001と命名した。
実施例２
新規ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例１で得られたプラスミドｐＦＵ１００１よりＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む上記ＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片をもう一度ＸｂａＩで切り出し、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑末端化した後、新たなｐＴＶ１１８ＮベクターをＳｍａＩで開環したものと連結して欠損変異体作製用プラスミドを調製し、挿入断片の方向性によってそれぞれｐＦＵ１００２，ｐＦＵ１００３と命名した。これらプラスミドを用いて挿入ＤＮＡ断片の両端から順次欠損変異体を作製した。作製にはHenikoffの方法（ジーン（Gene）第２８巻、第３５１−３５９頁）を応用したKilo-Sequence用Deletion kit（宝酒造社製）を利用した。３’突出型、５’突出型制限酵素としてはそれぞれＰｓｔＩ，ＸｂａＩを利用した。得られた種々の欠損変異体を鋳型としてBcaBESTジデオキシシークエンスキット（宝酒造社製）を用いたジデオキシ法により挿入断片の塩基配列を決定した。
配列表の配列番号５に得られた塩基配列のうち８４５０塩基対分の配列を示す。該塩基配列を解析した結果、タンパクをコードしうる６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が見い出され、配列表の配列番号５に示される塩基配列の塩基番号１２３−６１４（ＯＲＦ１），６１１−１３８１（ＯＲＦ２），１３８４−３２２２（ＯＲＦ３），３２２５−７０１３（ＯＲＦ４），７０６８−７６９７（ＯＲＦ５），７７１１−８３８５（ＯＲＦ６）の位置にそれぞれ存在していた。図２にプラスミドｐＦＵ１００１に組み込まれた約１０キロ塩基対のＸｂａＩ−ＸｂａＩＤＮＡ断片の制限酵素地図、および該断片上の上記のＯＲＦの位置を示す。
また、上記の種々の欠損変異体を用いて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定したところ、上流から欠損させても下流から欠損させてもＯＲＦ３およびＯＲＦ４の領域まで欠損がおよぶとＤＮＡポリメラーゼ活性が失なわれることが示された。これよりＯＲＦ３およびＯＲＦ４の翻訳産物がＤＮＡポリメラーゼ活性の発現に重要であることが示された。配列表の配列番号２にＯＲＦ３の塩基配列、配列番号１に該塩基配列から推定されるＯＲＦ３の翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ示す。また、配列表の配列番号４にＯＲＦ４の塩基配列、配列番号３に該塩基配列から推定されるＯＲＦ４の翻訳産物のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
実施例３
精製ＤＮＡポリメラーゼ標品の調製
実施例１で得られたEscherichia coli JM109／pFU1001をアンピシリンが１００μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）５００ｍｌで培養した。培養液の濁度が０．６Ａ₆₀₀に達した時、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに１６時間培養を行った。集菌後、菌体を３７ｍｌのソニケーションバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２．４ｍＭＰＭＳＦ（フェニルメタンスルフォニルフルオライド）に懸濁し、超音波破砕機にかけた。１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離により４２ｍｌの粗抽出液を上清として回収し、これを８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後再度１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離を行って３３ｍｌの熱処理酵素液を得た。次にこの溶液をバッファーＡ（５０ｍＭリン酸カリウム，ｐＨ６．５，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，１０％グリセロール）８００ｍｌを外液として２時間×４回透析した。透析後の酵素液３２ｍｌをバッファーＡで平衡化したRESOURSE Qカラム（ファルマシア社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用いてクロマトグラフィーを行った。展開は０→５００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により行った。ＤＮＡポリメラーゼ活性は３４０ｍＭＮａＣｌのところで溶出された。
活性のある画分を集めて得られた１０ｍｌの酵素溶液を限外濾過により脱塩、濃縮し、バッファーＡ＋１５０ｍＭＮａＣｌに溶解した３．５ｍｌの酵素溶液とし、同じバッファーで平衡化したHi Trap Heparinカラム（ファルマシア社製）に供した。ＦＰＬＣシステムを用いて１５０→６５０ｍＭＮａＣｌ直線濃度勾配により展開し、４００ｍＭＮａＣｌのところに溶出された活性画分を得た。この画分５ｍｌを限外濾過により脱塩、濃縮を繰り返し、１２０μｌの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５、２ｍＭ２−メルカプトエタノール、７５ｍＭＮａＣｌ溶液にまで濃縮した。この溶液を同じバッファーで平衡化したSuperose６ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＤＮＡポリメラーゼ活性は保持時間３４．７分および３８．３分の位置に溶出された。同一条件での分子量マーカーの溶出位置との比較の結果より、これらの活性はそれぞれ約３８５キロダルトン、約２２０キロダルトンの分子量を持つと予想された。これらの分子量はＯＲＦ３の翻訳産物とＯＲＦ４の翻訳産物とが１：２のモル比で複合体を形成した場合、および１：１のモル比で複合体を形成した場合に相当する。しかしながら高分子量になるほど分子量の測定誤差が大きくなることから、前者については２種の翻訳産物が２：２のモル比で複合体を形成している可能性も否定できない。
実施例４
（１）ＤＮＡポリメラーゼの生化学的特性
実施例３で得られた、ＯＲＦ３とＯＲＦ４の翻訳産物、すなわち第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクと第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとが１：１で複合体を形成したＤＮＡポリメラーゼ標品について、まず至適ＭｇＣｌ₂およびＫＣｌ濃度を求めた。反応系は２０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ７．７，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰに２ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下で０〜２００ｍＭの範囲で２０ｍＭずつＫＣｌ濃度を上げていき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。その結果、ＫＣｌは６０ｍＭのとき最大活性を示した。次に上記反応系に６０ｍＭＫＣｌの存在下、今度はＭｇＣｌ₂を０．５〜２５ｍＭまで２．５ｍＭ毎に比較したところ１０ｍＭで最大活性を示したが、ＫＣｌを含まない場合と比較してみるとその場合は１７．５ｍＭで最大活性を示した。
次に至適ｐＨを調べた。各種ｐＨのリン酸カリウム緩衝液を用い、２０ｍＭリン酸カリウム，１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，６０ｎＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰからなる反応液を調製し、これを用いて７５℃でＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。図３にその結果を示す。図中横軸はｐＨ、縦軸は高分子ＤＮＡに取り込まれた放射活性を示す。図に示されるように本発明のＤＮＡポリメラーゼはｐＨ６．５〜７．０で最大活性を示した。リン酸カリウムにかえてトリス−塩酸を用いた場合にはアルカリ側にいくほど活性が高く、測定に用いた最も高いｐＨであるｐＨ８．０２で最大の活性を示した。
本発明のＤＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下のようにして調べた。精製されたＤＮＡポリメラーゼを２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），２ｍＭ２−メルカプトエタノール，１０％グリセリン，０．１％ウシ血清アルブミン溶液として調製し、種々の温度で３０分間保温した後、残存するＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。図４にその結果を示す。図中横軸は保温温度、縦軸は残存活性を示す。図に示されるように本酵素は８０℃、３０分間の熱処理の後も８０％以上の残存活性を保持していた。
インヒビターの阻害様式を比較するため、α型ＤＮＡポリメラーゼの特異的阻害剤であるアフィディコリン（aphidicolin）を用いてすでに知られているピロコッカスフリオサス由来のα型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ストラタジーン社製）といっしょに阻害のされ方を比べた。２０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ７．７，１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルトカプトエタノール，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化ＤＮＡ，４０μＭｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ存在下でアフィディコリンを０〜２．０ｍＭまで増やしていき、活性の変化を調べたところ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼは１．０ｍＭで２０％まで活性が減少するのに対して本発明の新規ＤＮＡポリメラーゼは２．０ｍＭでも全く阻害されなかった。
（２）プライマー伸長反応
次に本発明のＤＮＡポリメラーゼの基質ＤＮＡの形に対する選択性を比較するため、以下の様な鋳型−プライマーについて調べた。通常の活性測定に用いられる活性化ＤＮＡの他、活性化ＤＮＡを８５℃ ５分間処理して熱変性させたもの（熱変性ＤＮＡ）、Ｍ１３ファージ一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１８ｓｓＤＮＡ、宝酒造社製）に配列表の配列番号６に示す配列の４５塩基の合成デオキシリボオリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニーリングさせたもの（Ｍ１３−ＨＴ Primer）、同じくＭ１３ファージ一本鎖ＤＮＡに配列表の配列番号７に示す配列の１７塩基の合成リボオリゴヌクレオチドをプライマーとしてアニーリングさせたもの（Ｍ１３−ＲＮＡ Primer）、ポリデオキシアデノシン（PolydA，ファルマシア社製）とオリゴデオキシチミジン（OligodT，ファルマシア社製）を２０：１のモル比で混合したもの（PolydA−OligodT），ポリアデノシン（PolyA,ファルマシア社製）とオリゴデオキシチミジンを２０：１のモル比で混合したもの（PolyA−OligodT）を基質として調製した。
これらの基質を活性化ＤＮＡのかわりに用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、活性化ＤＮＡを基質に用いた場合に得られる活性を１００とした時の各基質での相対活性を表１に示す。比較のためにＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Taq，宝酒造社製）についても同様に調べた。表１に示されるように本発明の新規ＤＮＡポリメラーゼは他のＤＮＡポリメラーゼと比較すると活性化ＤＮＡを基質とした場合よりもＭ１３−ＨＴ Primerを用いて得られる活性の方が高く、プライマー伸長反応に対し特に高い適性を有していた。
さらにプライマー伸長活性について詳細な検討を行った。基質としてＭ１３−ＨＴ Primerを用い、プライマーの５’−末端を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社製）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）によって標識したうえで使用した。終濃度０．０５μｇ／μｌの上記基質と、活性化ＤＮＡを基質とした活性測定で０．０５単位を示す量の各種ＤＮＡポリメラーゼを含む１０μｌの反応液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール，２７０μＭｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を調製し、７５℃で１，２，３，４分間反応させた。反応終了後、２μｌの反応停止液（９５％ホルムアミド，２０ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ブロモフェノールブルー，０．０５％キシレンシアノール）を加えて９５℃、３分間の熱変性処理後、反応液のうち２μｌを８Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、オートラジオグラムを作製した。また、競合基質となる活性化ＤＮＡ存在下での伸長活性を調べるため、上記の反応液に終濃度０．４μｇ／μｌの活性化ＤＮＡを加えたものを準備し、上記同様に操作してオートラジオグラムを作製した。得られたオートラジオグラムを図６に示す。
図中、Ｐｏｌ，Ｐｆｕ，Ｔａｑはそれぞれ本発明のＤＮＡポリメラーゼ，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼについて得られた結果を示し、１、２、３、４はそれぞれ反応時間（分）を示す。また、図中−、＋の表示はそれぞれ活性化ＤＮＡ非存在下、および存在下で得られた結果を示す。さらに図中左端のＧ，Ａ，Ｔ，Ｃで示されたレーンは上記と同じ基質を用いたジデオキシ法による鎖停止反応で得られた反応物を泳動したものであり、伸長産物の長さを推定するのに使用した。図に示されるように本発明のＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ，ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに比べてより優れたプライマー伸長活性を示した。また、活性化ＤＮＡ非存在下では比較的高いプライマー伸長活性を示すＴａｑＤＮＡポリメラーゼが大過剰量の活性化ＤＮＡの添加によって顕著に阻害されるのに対し、本発明のＤＮＡポリメラーゼは活性化ＤＮＡによる阻害を受けにくいことが示された。このことから本発明のＤＮＡポリメラーゼが、特に一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがひとつアニーリングした形のプライマー伸長型の基質に対して高い親和性を有していることが確かめられた。
（３）付随するエキソヌクレアーゼ活性の有無
本発明のＤＮＡポリメラーゼに付随するエキソヌクレアーゼ活性を以下のようにして調べた。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性検出用基質として、ｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造社製）をＳｓｐＩ（宝酒造社製）で消化して得られる３８６塩基対のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した後、精製し、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いて５’−末端が³²Ｐで標識されたＤＮＡ断片を調製した。また３’→５’エキソヌクレアーゼ活性検出用基質としてｐＵＣ１１９ベクターをＳａｕ３ＡＩで消化して得られる３４１塩基対のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離した後、精製し、［γ−³²Ｐ］ＣＴＰ（アマシャム社製）とクレノウフラグメント（宝酒造社製）を用いたfill-in反応により３’−末端が³²Ｐ標識されたＤＮＡ断片を調製した。標識ＤＮＡはＮｌＣＫカラム（ファルマシア社製）でゲル濾過して精製し、以下の反応に用いた。これらの標識ＤＮＡ１ｎｇを含む反応液（２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．７），１５ｍＭＭｇＣｌ₂，２ｍＭ２−メルカプトエタノール）に０．０１５単位のＤＮＡポリメラーゼを加えて７５℃で２．５、５、７．５分間反応させた後、エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。上清中に存在する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、エキソヌクレアーゼ活性による分解量を求めた。本発明のＤＮＡポリメラーゼには５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は認められなかったが強い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが示された。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が強いことが知られているＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて同様にして３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を測定し、これらの結果を合わせて図５に示す。
図中横軸は反応時間を、縦軸は反応液全体に含まれる放射活性に対する上清に遊離した放射活性の割合を示す。また図中白丸は本発明のＤＮＡポリメラーゼ、黒丸はＰｆｕＤＮＡポリメラーゼについて得られた結果を示す。図に示されるように本発明のＤＮＡポリメラーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が強いためにＤＮＡ合成の忠実度が高いことが知られているＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと同程度の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有することが示された。
（４）ＤＮＡ合成反応の正確性の比較
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の正確性を、ｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造社製）の一部を一本鎖化したもの（ギャップ形成二本鎖プラスミド）を鋳型として調べた。一本鎖ｐＵＣ１１８は大腸菌ＭＶ１１８４（宝酒造社製）を宿主とし、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製）を用いて、１９８９年コールドスプリングハーバーラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（T.Maniatis）ら編集、モレキュラークローニング：アラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning：A Laboratoly Manual 2nd ed.）４．４４〜４．４８に記載の方法で調製した。また二本鎖ＤＮＡはｐＵＣ１１８ベクターをＰｖｕII（宝酒造社製）消化した後にアガロースゲル電気泳動を行い、約２．８キロ塩基対のＤＮＡ断片を回収して調製した。
上記の一本鎖ＤＮＡ１μｇと、二本鎖ＤＮＡ２μｇとを混合して１８０μｌの滅菌蒸留水溶液とし、７０℃、１０分間保温した後、２０μｌの２０×ＳＳＣを加えてさらに６０℃、１０分間静置した。エタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収し、その一部をアガロースゲル電気泳動に供してギャップ形成二本鎖プラスミドが得られていることを確認した。得られたギャップ形成二本鎖プラスミドのうち、１／１０量を含む３０μｌの反応液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を調製し、これを７０℃で３分間保温した後、０．５単位のＤＮＡポリメラーゼを加えて７０℃、１０分間のＤＮＡ合成反応を行った。反応終了後、反応液のうち１０μｌを用いて大腸菌ＤＨ５α（ＢＲＬ社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ、４０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含むＬＢプレート上で３７℃、１８時間培養した。プレート上に出現した白色、および青色にコロニーの数を調べ、ＤＮＡ合成時に誤りが起こっている白色コロニーの出現率を算出した。その結果、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いた場合の出現率（％）は、３．１８％であったのに対し、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いた場合には、出現率が１．６１％とそれよりも低い値を示した。
（５）ＰＣＲへの利用
本発明のＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ反応における性能をＴａｑＤＮＡポリメラーゼと比較するためにλ−ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。本発明のＤＮＡポリメラーゼ用の反応液組成は１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２），３．５ｍＭＭｇＣｌ₂，７５ｍＭＫＣｌ，４００μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，０．０１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），０．１％トリトンＸ−１００（Triton X-100）とし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用の反応液組成は１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３），１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，５０ｍＭＫＣｌ，４００μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰとし、５．０ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ（宝酒造社製）１０ｐmole／５０μｌプライマーλ１、およびプライマーλ１１、３．７単位／５０μｌＤＮＡポリメラーゼを含む反応液５０μｌを調製した。プライマーλ１、およびプライマーλ１１の塩基配列を配列表の配列番号８、および配列番号９にそれぞれ示す。上記の反応液について９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った後、反応液のうちの５μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅されたＤＮＡ断片を確認した。この結果、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたものではＤＮＡ断片の増幅が認められないのに対し、本発明のＤＮＡポリメラーゼでは約２０キロ塩基対のＤＮＡ断片の増幅が確認された。
次に、プライマーをプライマーλ１、及びプライマーλ１０に変更して実験を行った。プライマーλ１０の塩基配列を配列表の配列番号１０に示す。上記同様の反応液組成で２．５ｎｇのλ−ＤＮＡ，１０ｐmoleのプライマーλ１、及びプライマーλ１０、３．７単位のＤＮＡポリメラーゼを含む２５μｌの反応液を調製し、上記同様の反応条件で５サイクル反応させた後、反応液のうちの５μｌをアガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行なうと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼでは特異的な増幅が見られないのに対し、本発明のＤＮＡポリメラーゼでは約１５キロ塩基対のＤＮＡ断片が増幅していることが示された。
実施例５
（１）ＯＲＦ３翻訳産物のみを発現するためのプラスミドの構築
実施例２に記載のプラスミドｐＦＵ１００２（該プラスミドにはベクター上のｌａｃプロモーター下流にＯＲＦ１〜ＯＲＦ６が位置している）をもとにその挿入ＤＮＡ断片のうちＯＲＦ３直後より下流部分を欠失させて作製した変異体プラスミド６−８２を鋳型とし、プライマーＭ４（宝酒造社製）、および配列表の配列番号１１にその塩基配列を示すプライマーＮＯ３を用いたＰＣＲ反応を行った。なおＰＣＲ反応に使用するＤＮＡポリメラーゼには合成反応の正確性が高いＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を用いた。１ｎｇの鋳型ＤＮＡ、２５ｐｍｏｌずつの両プライマー、および２．５単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌのＰＣＲ反応液［２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、１０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．２ｍＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、１％トリトンＸ−１００、０．０１％ＢＳＡ］を調製し、９４℃、０．５分〜５５℃、０．５分〜７２℃、２分を１サイクルとした２５サイクルの反応を行った。増幅された約２キロ塩基対のＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＳｐｈＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、ｐＴＶ１１８Ｎベクター（宝酒造社製）のＮｃｏＩ−ＳｐｈＩサイト間に組み込んだプラスミドｐＦＵ−ＯＲＦ３を作製した。該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片はＯＲＦ３のみを翻訳可能な状態で含んでいる。
（２）ＯＲＦ４翻訳産物のみを発現するためのプラスミドの構築
上記のプラスミドｐＦＵ１００２をもとにその挿入ＤＮＡ断片のうちＯＲＦ４中央部より下流部分を欠失させて作製した変異体プラスミド６−２を鋳型とし、プライマーＭ４、および配列表の配列番号１２にその塩基配列を示すプライマーＮＯ４を用いたＰＣＲ反応を行った。鋳型ＤＮＡをプラスミド６−２に、またプライマーＮＯ３をプライマーＮＯ４にそれぞれ変更した他は上記の実施例５−（１）と同じ条件で反応を行った。増幅されたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約１．６キロ塩基対のＤＮＡ断片を、上記のプラスミドｐＦＵ１００２より単離される約３．３キロ塩基対のＮｈｅＩ−Ｓａｌ断片（ＯＲＦ４の後半部分を含む）とともにｐＥＴ１５ｂベクター（ノバジェン社製）のＮｃｏＩ−ＸｈｏＩサイト間に組み込んだプラスミドｐＦＵ−ＯＲＦ４を作製した。該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片はＯＲＦ４のみを翻訳可能な状態で含んでいる。
（３）ＯＲＦ３、ＯＲＦ４翻訳産物からのＤＮＡポリメラーゼの再構成
上記のプラスミドｐＦＵ−ＯＲＦ３で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＦＵ−ＯＲＦ３、および上記のプラスミドｐＦＵ−ＯＲＦ４で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４、Escherichia coli ＨＭＳ１７４／ｐＦＵ−ＯＲＦ４をそれぞれ個別に培養し、菌体中に発現された両ＯＲＦの翻訳産物を精製した。形質転換体の培養、および粗抽出液の調製は実施例３に記載の方法によった。また両翻訳産物の精製はRESOURCE Ｑ、HiTrap Heparin、Superose ６などのカラムを用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で翻訳産物の挙動を確認することによって行った。こうして精製された両ＯＲＦの翻訳産物はどちらも単独ではＤＮＡポリメラーゼ活性を示さなかったが、この２つを混合した場合には耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ活性が出現することが確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、高いプライマー伸長性と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性とを合わせ持つ新規なＤＮＡポリメラーゼが提供される。該酵素はＰＣＲ法への利用に適しており、遺伝子工学研究用試薬として有用である。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を用いた遺伝子工学的な該酵素の製造も可能となった。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：613
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

配列番号：２
配列の長さ：1839
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：３
配列の長さ：1263
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：

配列番号：４
配列の長さ：3789
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：５
配列の長さ：8450
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
配列：

配列番号：６
配列の長さ：45
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

配列番号：７
配列の長さ：17
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＲＮＡ）
配列：

配列番号：８
配列の長さ：23
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

配列番号：９
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

配列番号：10
配列の長さ：22
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

配列番号：11
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

配列番号：12
配列の長さ：32
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：

Claims

配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換したアミノ酸配列からなる第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクと、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換したアミノ酸配列からなる第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとから構成され、該２種のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクの共存により、ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すＤＮＡポリメラーゼであって、以下の性質を有することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
（１）一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがアニーリングした複合体を基質としてポリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化ＤＮＡを基質とした場合に比べて高い活性を示す。
（２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
（３） λ−ＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を以下の条件で行った場合、約２０キロ塩基対のＤＮＡ断片を増幅することが可能である。
ＰＣＲの条件：
（ａ）反応液組成：１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、３．５ｍＭＭｇＣｌ₂、７５ｍＭＫＣｌ、４００μＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、０．０１％ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００、５．０ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ、１０ｐmole／５０μｌプライマーλ１（配列表の配列番号８）、およびプライマーλ１１（配列表の配列番号９）、３．７単位／５０μｌＤＮＡポリメラーゼを含む。
（ｂ）反応条件：９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行う。
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、又は置換したアミノ酸配列からなる第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクであって、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとの共存により請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼとして作用する、第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク。
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡであって、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとの共存により請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼとして作用する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
配列表の配列番号２に示される塩基配列、あるいはこの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むＤＮＡであって、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとの共存により請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼとして作用する第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列、あるいは配列番号３のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡであって、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとの共存により請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼとして作用する第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
配列表の配列番号４に示される塩基配列、あるいはこの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含むＤＮＡであって、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクとの共存により請求項１記載のＤＮＡポリメラーゼとして作用する第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
請求項３又は４に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子と、請求項５又は６に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子の両方を含有する形質転換体を培養し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
請求項３又は４に記載の第１のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体と、請求項５又は６に記載の第２のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクをコードする遺伝子を含有する形質転換体とをそれぞれ個別に培養し、該培養物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ構成タンパクを混合してＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法。