JPH05176766A - Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を特定し、
該遺伝子を用いた該新規なＤＮＡポリメラーゼの遺伝子
工学的製造法を提供する。 【構成】 図面の図１又は図２で表される制限酵素地図
を有し、その長さが約2.２ｋｂ又は約3.５ｋｂである２
種のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。当該遺伝子を含有させ
た組換体プラスミドを導入させた形質転換体を培養し、
該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取するＤＮＡポリ
メラーゼの製造方法。 【効果】 このＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子工学研究
用試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
ＤＮＡポリメラーゼの製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮ
Ａポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４
ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（ Taq)ポリメラーゼ〕等
がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特定
のＤＮＡの標識化や、ＤＮＡ塩基配列決定法などにそれ
ぞれ利用されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一般にＤＮＡポリメラ
ーゼはその起源による酵素特異性を有しており、その特
性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カルドテ
ナックス（ Bacillus caldotenax )は生育至適温度が約
７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＤＮＡ
ポリメラーゼは高温で安定であることが予想され、遺伝
子工学研究用試薬として有用な用途が期待される。しか
しながら、これまで該ＤＮＡポリメラーゼについての詳
細は明らかでなく、その製造法も確立されていない。ま
た、この酵素の遺伝子構造やアミノ酸配列についても不
明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベクターに結
合して遺伝子工学的に発現させる方法についても明らか
にされていない。本発明の目的は、新規ＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子を特定し、該ＤＮＡ断片を含有させた組換え
体プラスミドを導入させた形質転換体を用いた新規なＤ
ＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が、図面の図
１で表される制限酵素地図を有し、その長さが約２．２
kbであることを特徴とする。また、本発明の第２の発明
は他のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する発明であっ
て、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が、図面の図２で表され
る制限酵素地図を有し、その長さが約３．５kbであるこ
とを特徴とする。そして、本発明の第３の発明はＤＮＡ
ポリメラーゼの製造方法に関する発明であって、第１の
発明又は第２の発明のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有
させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を培養
し、該培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを
特徴とする。

【０００５】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス・カルド
テナックスＹＴ−Ｇ株〔ドイッチェ ザムルンク フォ
ン ミクロオルガニスメン（ Deutsche Sammlung von M
ikroorganismen )の保存菌株：ＤＳＭ４０６〕がある。

【０００６】本発明に係る形質転換体及びＤＮＡポリメ
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 （１）バチルス・カルドテナックスから染色体ＤＮＡを
抽出する。 （２）ＤＮＡポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号１及び配列番号２に示すＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、（１）で得たＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション（ＰＣＲ）を行う。 （３）（１）で得たＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、
これに対して（２）で得たＤＮＡ断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするＤＮＡ断片を回収す
る。 （４）ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
（３）で得たＤＮＡ断片を結合させる。 （５）ＤＮＡ断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のＤＮＡ断片を含む形質転換体を選択する。 （６）（５）で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のＤＮＡ断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを（４）と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 （７）（６）で得た目的のＤＮＡ断片を含む発現ベクタ
ーを（５）と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 （８）（７）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
ＤＮＡポリメラーゼを生産する。 （９）（６）で得た発現型プラスミドからエキソヌクレ
アーゼIII を用いた欠損株作製法によりＤＮＡポリメラ
ーゼ産生情報内の５′→３′エキソヌクレアーゼ情報部
分を欠失させた変異型ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクター
を作製する。 （10）（９）で得た発現ベクターを宿主に導入し、形質
転換体を得る。 （11）（10）で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
変異型ＤＮＡポリメラーゼを生産する。

【０００７】上記ＤＮＡ供与体であるバチルス カルド
テナックスＹＴ−Ｇ株（ＤＳＭ４０６）由来ＤＮＡは７
０℃で振とう培養した該培養菌体より抽出する。抽出、
精製、制限酵素による切断等は公知の方法を用いること
ができ、当該方法の詳細は１９８２年 コールドスプリ
ング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス
（Ｔ．Maniastis ) ほか著、モレキュラー クローニン
グ、ア ラボラトリーマニュアル（ Molecular Clonin
g, Ａ Laboratory Manual )第７５〜１７８頁に記載さ
れている。

【０００８】目的のＤＮＡ断片を選択する方法として
は、まず公知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー（ Journal of BiologicalCh
emistry ) 第２６４巻、第４２５５〜４２６３頁（１９
８９）に記載されているものを参考にすることができ
る。

【０００９】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号１及び配列番号２に示す２種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス カルドテナ
ックスＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲ法により特異的な
ＤＮＡ断片を増幅することを見出し、得られた断片に塩
基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他のＤＮＡ
ポリメラーゼと類似していることを発見した。したがっ
て、該ＤＮＡ断片をプローブに用いてハイブリダイゼー
ションを行うことにより目的のＤＮＡを選択することが
できる。ハイブリダイゼーションによる選択の方法自体
は公知の方法、例えば前記モレキュラー クローニン
グ、ア ラボラトリー マニュアル、第３０９頁に記載
の方法を用いることができる。サザンハイブリダイゼー
ション法により、目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がバ
チルス カルドテナックスＤＮＡのどの制限酵素断片上
に存在するかを分析し、次に選択した制限酵素例えばＥ
ｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨincII 、ＨindIII、Ｘｈｏ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕIIなどを用いて分解したバチルス
カルドテナックスＤＮＡをプラスミドベクターに組込
む。プラスミドベクターとしては公知のものが使用で
き、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＴＶ１１８Ｎな
どが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ま
た組込ませる手段についても公知の方法が利用でき、Ｄ
ＮＡリガーゼを用いた酵素反応で組込ませればよい。

【００１０】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株（ｒ^- ，ｍ⁺ ）であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第２５０頁（１９８２）を用いることができ
る。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばｐＵＣ１８の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたＤＮＡの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。

【００１１】選択した３種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するＨincII 断片、ＨindIII断片、ＸｈｏＩ断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記３断片を試験管内で再編成し、一本の連続したＤＮＡ
断片とし、該ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＴＶ１１８Ｎ
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをｐＵ
Ｉ１０１と命名した。プラスミドｐＵＩ１０１を有する
大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液は６
０℃、２０分処理後も十分量のＤＮＡポリメラーゼ活性
を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液では
このような活性を有しないことより、ｐＵＩ１０１上に
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ産生情報が存在し、かつ、大
腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると結論し
た。

【００１２】プラスミドｐＵＩ１０１の構築工程を図３
に示す。ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子はプラスミドｐＵＩ
１０１の約３．５kbのＮｃｏＩ断片中にコードされてお
り、該ＮｃｏＩ断片の制限酵素地図を図２に示す。

【００１３】ｐＵＩ１０１で形質転換された大腸菌で最
も増殖能のよかった宿主ＨＢ１０１を選択し、それは E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１と表示し
て、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３
７２１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）として寄託され
ている。

【００１４】ｐＵＩ１０１を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムクロマ
トグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグラフ
ィーの各処理を行い、ＤＮＡポリメラーゼをＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で
単一バンドを示すまで精製することができる。

【００１５】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約１０万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、その
Ｎ末端のアミノ酸配列を決定することができる。その配
列を配列表の配列番号３に示す。このアミノ酸配列、分
子量等より前述ＮｃｏＩ断片中の翻訳可能領域を、本発
明のＤＮＡポリメラーゼの構造遺伝子と決定した。

【００１６】大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの例よりみ
て、該５′→３′エキソヌクレアーゼ活性はポリペプチ
ド鎖のアミノ末端側の１つのドメインに存在することが
推測されることから、ｐＵＩ１０１上のバチルス カル
ドテナックス由来のＤＮＡ断片から部分的に一定部分を
欠失させたプラスミドを作製し、それらを再度大腸菌に
導入してＤＮＡ合成活性を示し、かつ５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性を有しないクローンを選択した。欠失
プラスミドの作製法は公知でありジーン( Gene )第２８
巻、第３５１〜３５９頁（１９８２）に記載されている
ヘニコフ ( Henicoff ) の方法を用いることができる。
選択されたプラスミドをｐＵＩ２０５と命名し、形質転
換された大腸菌は、Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐ
ＵＩ２０５と表示して工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第３７２０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２
０）として寄託されている。プラスミドｐＵＩ２０５中
の約2.２kbのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図
を図１に示す。

【００１７】ｐＵＩ２０５を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば前述の方法により精製を行い
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを示すまでＤＮＡポリメ
ラーゼを精製することができる。

【００１８】得られたＤＮＡポリメラーゼはＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで約６万７千ダルトンの分子量を示すポリペプチ
ドであり、ＤＮＡ合成活性、３′→５′エキソヌクレア
ーゼ活性を有するが、５′→３′エキソヌクレアーゼ活
性を有しない変異型ＤＮＡポリメラーゼである。精製タ
ンパク質のアミノ酸分析を行い、そのＮ末端のアミノ酸
配列を決定することができる。その配列を、配列表の配
列番号４に示す。

【００１９】以上のようにして得られた組換え大腸菌 E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１及び Esche
richia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５の培養液１mlか
らそれぞれ１２７単位、２１２単位のＤＮＡポリメラー
ゼが得られ、工業的な製造が可能になった。

【００２０】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。

【００２１】実施例１ （１）バチルス カルドテナックス染色体ＤＮＡの調製 バチルス カルドテナックスＹＴ−Ｇ株を１２５mlのＬ
培地（バクトトリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌの５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）で６５℃一夜振
とう培養し、集菌した菌体を４mlの２５％ショ糖、０．
０５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、リゾ
チーム（５mg／ml）を８００μｌ加えて２０℃１時間放
置した。ＳＥＴ溶液〔２０mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）、１mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ〕を２
４ml加えた後、５％ＳＤＳ溶液を４mlとプロティナーゼ
Ｋ（１０mg／ml）を４００μｌ加えて３７℃、１時間放
置した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタ
ノールを加えて長鎖ＤＮＡを不溶化し、滅菌したつまよ
うじで巻取って回収した。以上の操作により３．１mgの
ＤＮＡが得られた。

【００２２】（２）ＰＣＲを用いた特異的ＤＮＡ断片の
増幅 配列表の配列番号１及び配列番号２に示した２種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ１００pmolと
バチルス カルドテナックスＤＮＡ１ngを用いて全量１
００μｌで９５℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分のＰ
ＣＲを３０サイクル行った。５μｌをとりアガロースゲ
ル電気泳動で分析した結果、６００塩基対のＤＮＡ断片
が特異的に増幅していた。このＤＮＡ断片をＳｍａＩで
開環したＭ１３ファージｍｐ１８ベクターに組込みジデ
オキシ法により塩基配列を分析した。

【００２３】（３）ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス カルドテナックスＤＮＡを１つの酵素につき
５μｇ用いてＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨindIII、Ｈin
cII 、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕIIで分解し、アガロ
ースゲル電気泳動に供した。ゲル中のＤＮＡをナイロン
膜に移し、上記ＰＣＲにより得た６００塩基対のＤＮＡ
断片をプローブに用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブはランダムプライミング法により放射性標
識した。ハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ、１％Ｓ
ＤＳ、５×デンハーツ溶液、１００μｇ／ml子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中で６５℃５時間行った。１×ＳＳＣ、０．１％Ｓ
ＤＳ溶液中で１時間洗浄した後、Ｘ線フィルムに感光
し、オートラジオグラムをとった。

【００２４】（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したＨindIII（２．４
０kb）、ＨincII （１．４５kb）及びＸｈｏＩ（２．１
kb）ＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス カルドテナックスＤＮＡをそれぞれ
１００μｇずつ、ＨindIII、ＨincII、ＸｈｏＩで分解
し、目的の大きさのＤＮＡをアガロースゲルより回収し
た。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。ｐＴＶ１１８
Ｎプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性
ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベクターを
加えてＤＮＡリガーゼにより結合した後、大腸菌ＪＭ１
０９に導入した。得られた組換え体の集団の中からコロ
ニーハイブリダイゼーションによって目的のクローンを
選択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロニー
５０個〜２００個を０．５Ｎ 水酸化ナトリウム、１．
５Ｍ 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、１Ｍ トリ
ス−ＨＣｌ、１．５Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）
溶液で中和し、紫外線照射でファージＤＮＡを膜上に固
定した。プローブ調製及びハイブリダイゼーションの条
件はゲノミックサザン分析に準じた。

【００２５】（５）クローン化断片に制限酵素分析及び
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた３種類のＤＮＡ断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記３断片はＨincII −ＨindIII−Ｘｈｏ
Ｉの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体ＤＮＡ上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図３に
示すように、３種のＤＮＡ断片とベクターｐＴＶ１１８
Ｎを同時に連結させ、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む
約３．５kbのＤＮＡ断片を組込んだプラスミドを構築
し、ｐＵＩ１０１と命名した。なお、図３はｐＵＩ１０
１の構築を示す工程図である。また図２は、ｐＵＩ１０
１にクローニングされているＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
を含むＮｃｏＩ ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図で
ある。次に該プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換し、形質転換体 Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵ
Ｉ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）を得た。

【００２６】（６）組換体の培養及び粗抽出液の調製 上記組換えプラスミドｐＵＩ１０１を有する大腸菌ＨＢ
１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）をアンピシリンが
１００μｇ／mlの濃度で存在するＬ培地５mlに植菌し３
７℃で培養した。培養液の濁度が０．６（Ａ₆₀₀ ）のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク
トシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５時間培養を行っ
た。培養液１mlから集菌し、５０mM トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔５０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％ショ糖、６０mM ス
ペルミジン・一塩酸、２０mM 塩化ナトリウム、１２mM
ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静置した。更に５％
（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００( TritonＸ１００）を２０
μｌ加え、３７℃で５分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、６０℃、２０分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。

【００２７】（７）ＤＮＡポリメラーゼ活性測定 反応溶液として６７mM リン酸カリウム（ｐＨ７．
４）、６．７mM塩化マグネシウム、１mM ２−メルカプ
トエタノール、２０μＭ 活性化ＤＮＡ、３３μＭ ｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、６０nM〔 ³Ｈ〕
ＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して適当量の
粗抽出液を加え、６０℃、５分反応させた後、５０mM
ピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加えて反応を
停止させた。氷中で５分間静置した後、全量をグラスフ
ィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％ＴＣＡで数回
洗浄した後、７０％エタノールで置換し、フィルターを
乾燥して液体シンチレーションカウンターでフィルター
上の放射活性を測定した。１mlの培養液から１２７単位
のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００２８】（８）プラスミドｐＵＩ１０１を導入した
大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１の菌体２．２ｇより精
製を開始し、実施例１−（６）で示した方法により２０
mlの粗抽出液を得た。これらを６０℃で３０分間インキ
ュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離した
（１２０００rpm 、１０分）。この上清に硫酸アンモニ
ウムを加えていき、３０〜８０％飽和で沈殿する画分を
とってＤＥ緩衝液〔５０mM トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．
０、２mM ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロ
ール、４μＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化した
ＤＥ５２（ワットマン社）カラム１５mlに添加し０mM〜
３００mM ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出して分画し、
実施例１−（７）に従ってＤＮＡポリメラーゼ活性を調
べた。次に活性画分を集めてＤＥ緩衝液で透析し、ＤＥ
緩衝液で平衡化したＰ−１１（ワットマン社）カラム１
５mlに添加した。次に０mM〜３００mM ＮａＣｌ直線濃
度勾配で溶出し活性画分を集めた。Ｐ１１画分の酵素標
品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、分子量約１０
万ダルトンの単一バンドを与えた。

【００２９】（９）アミノ酸シークエンサーによるＮ末
端アミノ酸配列の決定 実施例１−（８）で得られた酵素標品をアミノ酸シーク
エンサーにかけ、配列表の配列番号３に示すＮ末端アミ
ノ酸配列を決定した。

【００３０】実施例２ （１）部分欠失プラスミドの作製 ＤＮＡポリメラーゼタンパクのアミノ末端側のドメイン
に存在すると推定される５′→３′エキソヌクレアーゼ
活性を消失させるために、遺伝子の５′側から部分的に
欠失させたプラスミドを作製した。エキソヌクレアーゼ
III を用いた方法を用いるため、まずｐＵＩ１０１に挿
入されている３．５kbのＮｃｏＩ断片を切り出し、平滑
末端化した後ｐＴＶ１１８ＮのＨincII 部位に組込んだ
プラスミドを作製した。次にベクター中の３′突出型酵
素ＫｐｎＩと５′突出型の酵素ＸｂａＩとで二重切断
し、エキソヌクレアーゼIII を作用させて３′突出側へ
のみ分解反応を行わせ、マングビーン（ MungBean）ヌ
クレアーゼで平滑末端とした後ＤＮＡリガーゼで再環状
化した。エキソヌクレアーゼIII の反応時間を制御する
ことによって種々の大きさの欠失変異体が得られた。ま
た再環状化の前にＮｃｏＩリンカーを連結することによ
り開始コドンが必ず適当な位置に入るようになり、欠失
された位置によって翻訳枠が３分の１の確率で合うよう
に構築した。上記のように操作したプラスミドを大腸菌
に導入し、得られた形質転換体から任意に２０クローン
を選択し、粗抽出液を調製して耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼ活性を調べた。６０℃においてＤＮＡ合成活性のある
ものについて塩基配列を解析した。活性のあった５クロ
ーンより１つを選んでその所有する組換えプラスミドを
ｐＵＩ２０５と命名した。ｐＵＩ２０５には図１に示す
約２．２kbのＤＮＡ断片が組込まれていた。次に該プラ
スミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し、形質転換体 E
scherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７２０）を得た。なお、図１は、ｐＵＩ２０
５にクローニングされているＤＮＡポリメラーゼ遺伝子
の制限酵素地図を示す図である。

【００３１】（２）組換体の培養及び粗抽出液の調製 実施例１−（６）の方法に準じ上記転換体（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３７２０）を培養し粗抽出液を調製した。

【００３２】（３）ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定 実施例１−（７）の方法に準じ上記粗抽出液のＤＮＡポ
リメラーゼ活性を測定した。１mlの培養液から２１２単
位のＤＮＡポリメラーゼが得られた。

【００３３】（４）５′→３′エキソヌクレアーゼ活性
の測定 基質としてプラスミドｐＢＲ３２２をＰｖｕIIで切断し
て得られる３２２塩基対の断片を〔γ³²−Ｐ〕ＡＴＰと
ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化したものを調製し
た。６７mM リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM
塩化マグネシウム、１mM ２−メルカプトエタノール
を含む溶液中に実施例２−（２）の酵素標品と上記基質
を混合し６０℃で５分反応させた後、エタノールを加え
て基質ＤＮＡを沈殿させた。上清中に存在する放射活性
を液体シンチレーションカウンターで測定することによ
りエキソヌクレアーゼによる分解物の量を求めた。上記
酵素標品には５′→３′エキソヌクレアーゼ活性は認め
られなかった。

【００３４】（５）プラスミドｐＵＩ２０５を導入した
大腸菌による耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの生産 実施例１−（８）方法に準じ、大腸菌ＨＢ１０１／ｐＵ
Ｉ２０５の菌体から酵素標品を得た。本酵素標品をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析したところ分子量約６万７千ダルト
ンの単一バンドを与えた。

【００３５】（６）アミノ酸シークエンサーによるＮ末
端アミノ酸配列の決定 実施例１−（９）の方法に準じ、配列表の配列番号４に
示すＮ末端アミノ酸配列を決定した。

【００３６】

【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なＤＮＡポリメラーゼの存在が明らかとなり、遺伝
子工学研究用試薬として有用なＤＮＡポリメラーゼの遺
伝子工学的製造法が提供された。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：NO 配列の特徴：1-23 S primer 配列： GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23 配列番号：２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） アンチセンス：YES 配列の特徴：1-21 S primer 配列： KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21 配列番号：３ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro 20 配列番号：４ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列：

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＵＩ２０５にクローニングされているＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。

【図２】ｐＵＩ１０１にクローニングされているＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。

【図３】ｐＵＩ１０１の構築を示す工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 図面の図１で表される制限酵素地図を有
   し、その長さが約2.２kbであることを特徴とするＤＮＡ
   ポリメラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 図面の図２で表される制限酵素地図を有
   し、その長さが約3.５kbであることを特徴とするＤＮＡ
   ポリメラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載のＤＮＡポ
   リメラーゼ遺伝子を含有させた組換体プラスミドを導入
   させた形質転換体を培養し、該培養物からＤＮＡポリメ
   ラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ
   の製造方法。