JPH05284971A - Dnaポリメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Dnaポリメラーゼ遺伝子

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JPH05284971A
JPH05284971A JP11240092A JP11240092A JPH05284971A JP H05284971 A JPH05284971 A JP H05284971A JP 11240092 A JP11240092 A JP 11240092A JP 11240092 A JP11240092 A JP 11240092A JP H05284971 A JPH05284971 A JP H05284971A
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JP11240092A
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Yoshizumi Ishino
良純 石野
Takashi Uemori
隆司 上森
Yoshiyo Fujita
佳代 藤田
Ikunoshin Katou
郁之進 加藤
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Takara Shuzo Co Ltd
Original Assignee
Takara Shuzo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なDNAポリメラーゼ遺伝子を特定し、
該遺伝子を用いた該新規なDNAポリメラーゼの遺伝子
工学的製造法を提供する。 【構成】 配列表の配列番号1又は2で表される塩基配
列である2種のDNAポリメラーゼ遺伝子。当該遺伝子
を含有させた組換え体プラスミドを導入させた形質転換
体を培養し、該培養物からDNAポリメラーゼを採取す
るDNAポリメラーゼの製造方法。 【効果】 このDNAポリメラーゼは、遺伝子工学研究
用試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、DNAポリメラーゼ遺
伝子及び遺伝子工学研究用試薬として有用な酵素である
DNAポリメラーゼの製法に関する。
【0002】
【従来の技術】今まで遺伝子工学研究用試薬として一般
に利用されているDNAポリメラーゼには、大腸菌DN
Aポリメラーゼ、その改変型であるクレノウ断片、T4
ファージ由来DNAポリメラーゼ、T7ファージ由来D
NAポリメラーゼ、サーマスアクアティカス由来耐熱性
DNAポリメラーゼ〔タック( Taq )ポリメラーゼ〕等
がある。これらの酵素は、その有する性質に応じて特定
のDNAの標識化や、DNA塩基配列決定法などにそれ
ぞれ利用されている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】一般にDNAポリメラ
ーゼはその起源による酵素特異性を有しており、その特
性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カルドテ
ナックス( Bacillus caldotenax )は生育至適温度が約
70℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のDNA
ポリメラーゼは高温で安定であることが予想され、遺伝
子工学研究用試薬として有用な用途が期待される。しか
しながら、これまで該DNAポリメラーゼについての詳
細は明らかでなく、その製造法も確立されていない。ま
た、この酵素の遺伝子構造やアミノ酸配列についても不
明であり、遺伝子の単離及び当該遺伝子をベクターに結
合して遺伝子工学的に発現させる方法についても明らか
にされていない。本発明の目的は、新規なDNAポリメ
ラーゼ遺伝子を特定し、該DNA断片を含有させた組換
体プラスミドを導入させた形質転換体を用いた新規なD
NAポリメラーゼの遺伝子工学的製造法を提供すること
にある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明はDNAポリメラーゼ遺伝子に関する
発明であって、DNAポリメラーゼ遺伝子が、配列表の
配列番号1で表される塩基配列であることを特徴とす
る。また、本発明の第2の発明は他のDNAポリメラー
ゼ遺伝子に関する発明であって、DNAポリメラーゼ遺
伝子が、配列表の配列番号2で表される塩基配列である
ことを特徴とする。そして、本発明の第3の発明はDN
Aポリメラーゼの製造方法に関する発明であって、第1
の発明又は第2の発明のDNAポリメラーゼ遺伝子を含
有させた組換体プラスミドを導入させた形質転換体を培
養し、該培養物からDNAポリメラーゼを採取すること
を特徴とする。
【0005】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
に使用する菌株としてはDNAポリメラーゼを産生する
菌株であれば何でもよく、例として、バチルス・カルド
テナックスYT−G株〔ドイッチェ ザムルンク フォ
ン ミクロオルガニスメン( Deutsche Sammlung von M
ikroorganismen )の保存菌株:DSM406〕がある。
【0006】本発明に係る形質転換体及びDNAポリメ
ラーゼは次に例示する工程により得ることができる。 (1)バチルス・カルドテナックスから染色体DNAを
抽出する。 (2)DNAポリメラーゼに共通な領域の情報を基に配
列表の配列番号3及び配列番号4に示すDNAポリメラ
ーゼ遺伝子増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作成
し、(1)で得たDNAを鋳型としてポリメラーゼ チ
ェイン リアクション(PCR)を行う。 (3)(1)で得たDNAを適当な制限酵素で切断し、
これに対して(2)で得たDNA断片をプローブとして
スクリーニングを行い、目的とするDNA断片を回収す
る。 (4)ベクターを制限酵素で開裂し、この開裂部位に
(3)で得たDNA断片を結合させる。 (5)DNA断片を結合させたベクターを宿主に導入
し、目的のDNA断片を含む形質転換体を選択する。 (6)(5)で得た形質転換体からプラスミドを取出
し、目的のDNA断片を切り出して制限酵素地図を基に
目的の遺伝子全体を含む連続した一本の断片に再編成
し、これを(4)と同様の要領で発現ベクターに結合さ
せる。 (7)(6)で得た目的のDNA断片を含む発現ベクタ
ーを(5)と同じ要領で宿主に導入し、形質転換体を得
る。 (8)(7)で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
DNAポリメラーゼを生産する。 (9)(6)で得た発現型プラスミドからエキソヌクレ
アーゼIII を用いた欠損株作製法によりDNAポリメラ
ーゼ産生情報内の5′→3′エキソヌクレアーゼ情報部
分を欠失させた変異型DNAポリメラーゼ発現ベクター
を作製する。 (10)(9)で得た発現ベクターを宿主に導入し、形質
転換体を得る。 (11)(10)で得た形質転換体を培養し、培養菌体より
変異型DNAポリメラーゼを生産する。
【0007】上記DNA供与体であるバチルス カルド
テナックスYT−G株(DSM406)由来DNAは7
0℃で振とう培養した該培養菌体より抽出する。抽出、
精製、制限酵素による切断等は公知の方法を用いること
ができ、当該方法の詳細は1982年 コールドスプリ
ング ハーバー ラボラトリー発行、T.マニアティス
(T.Maniastis ) ほか著、モレキュラー クローニン
グ、ア ラボラトリーマニュアル( Molecular Clonin
g, A Laboratory Manual )第75〜178頁に記載さ
れている。
【0008】目的のDNA断片を選択する方法として
は、まず公知のDNAポリメラーゼのアミノ酸配列を比
較し、共通のアミノ酸配列を示す領域を基にしてオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを合成する。ポリメラーゼの
アミノ酸配列については例えばジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー( Journal of BiologicalCh
emistry ) 第264巻、第4255〜4263頁(19
89)に記載されているものを参考にすることができ
る。
【0009】本発明者らは共通のアミノ酸配列に基づく
配列表の配列番号3及び配列番号4に示す2種のオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、バチルス カルドテナ
ックスDNAを鋳型に用いて、PCR法により特異的な
DNA断片を増幅することを見出し、得られた断片に塩
基配列から推定されるアミノ酸配列が公知の他のDNA
ポリメラーゼと類似していることを発見した。したがっ
て、該DNA断片をプローブに用いてハイブリダイゼー
ションを行うことにより目的のDNAを選択することが
できる。ハイブリダイゼーションによる選択の方法自体
は公知の方法、例えば前記モレキュラー クローニン
グ、ア ラボラトリー マニュアル、第309頁に記載
の方法を用いることができる。サザンハイブリダイゼー
ション法により、目的のDNAポリメラーゼ遺伝子がバ
チルス カルドテナックスDNAのどの制限酵素断片上
に存在するかを分析し、次に選択した制限酵素例えばE
coRI、BamHI、HincII 、HindIII、Xho
I、PstI、PvuIIなどを用いて分解したバチルス
カルドテナックスDNAをプラスミドベクターに組込
む。プラスミドベクターとしては公知のものが使用で
き、例えばpUC18、pUC19、pTV118Nな
どが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ま
た組込ませる手段についても公知の方法が利用でき、D
NAリガーゼを用いた酵素反応で組込ませればよい。
【0010】次いで組換えプラスミドを宿主大腸菌に導
入させるが、宿主大腸菌としては、形質転換能を有する
ものであれば野生株、変異株のいずれも使用できるが、
制限系変異株で修飾系野生株(r- ,m+ )であること
が望ましい。導入の手段自体は公知の方法、例えば前記
モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニ
ュアル 第250頁(1982)を用いることができ
る。このようにして目的のDNA断片を宿主に導入さ
せ、プラスミドベクターの特性、例えばpUC18の場
合アンピシリン耐性を有するコロニーを選択することに
よりクローン化されたDNAの集団を調製することがで
きる。次に上記集団の中から目的の断片を有するクロー
ンを選択する。選択の方法はベクターの種類によってコ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションを用いればよく、方法自体は公知のものであ
る。
【0011】選択した3種類のクローン体よりそれぞれ
が所有するHincII 断片、HindIII断片、XhoI断片
について制限酵素分解により詳細な解析の結果を基に上
記3断片を試験管内で再編成し、一本の連続したDNA
断片とし、該DNA断片を発現ベクターpTV118N
に組込んで目的のクローンを得た。該プラスミドをpU
I101と命名した。プラスミドpUI101を有する
大腸菌を培養し、菌体の粗抽出液を得た。該抽出液は6
0℃、20分処理後も十分量のDNAポリメラーゼ活性
を示し、発現ベクターのみを有する大腸菌粗抽出液では
このような活性を有しないことより、pUI101上に
耐熱性DNAポリメラーゼ産生情報が存在し、かつ、大
腸菌内で該情報を有する遺伝子が発現していると結論し
た。
【0012】プラスミドpUI101の構築工程を図1
に示す。DNAポリメラーゼ遺伝子はプラスミドpUI
101の約3.5kbのNcoI断片中にコードされてお
り、該NcoI断片の制限酵素地図を図2に、塩基配列
を配列表の配列番号5に示す。
【0013】pUI101で形質転換された大腸菌で最
も増殖能のよかった宿主HB101を選択し、それは E
scherichia coli HB101/pUI101と表示し
て、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第3
721号(FERM BP−3721)として寄託され
ている。
【0014】pUI101を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性DNAポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性DNAポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば、超音波処理、熱処理、ジエ
チルアミノエチル(DEAE)セルロースカラムクロマ
トグラフィー、ホスホセルロースカラムクロマトグラフ
ィーの各処理を行い、DNAポリメラーゼをSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で
単一バンドを示すまで精製することができる。
【0015】得られたDNAポリメラーゼはSDS−P
AGEで約10万ダルトンの分子量を示すポリペプチド
であり、DNA合成活性、3′→5′エキソヌクレアー
ゼ活性のほかに5′→3′エキソヌクレアーゼ活性を有
している。精製タンパク質のアミノ酸分析を行い、その
N末端のアミノ酸配列を決定することができる。その配
列を配列表の配列番号6に示す。このアミノ酸配列、分
子量等より前述NcoI断片中の配列表の配列番号2に
示す翻訳可能領域を、本発明のDNAポリメラーゼの構
造遺伝子と決定し、該DNAポリメラーゼの全アミノ酸
配列を明らかにした。そのアミノ酸配列を配列表の配列
番号7に示す。
【0016】大腸菌DNAポリメラーゼIの例よりみ
て、該5′→3′エキソヌクレアーゼ活性はポリペプチ
ド鎖のアミノ末端側の1つのドメインに存在することが
推測されることから、pUI101上のバチルス カル
ドテナックス由来のDNA断片から部分的に一定部分を
欠失させたプラスミドを作製し、それらを再度大腸菌に
導入してDNA合成活性を示し、かつ5′→3′エキソ
ヌクレアーゼ活性を有しないクローンを選択した。欠失
プラスミドの作製法は公知でありジーン( Gene )第28
巻、第351〜359頁(1982)に記載されている
ヘニコフ ( Henicoff ) の方法を用いることができる。
選択されたプラスミドをpUI205と命名し、形質転
換された大腸菌は、Escherichia coli HB101/p
UI205と表示して工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第3720号(FERM BP−372
0)として寄託されている。
【0017】pUI205を保有する大腸菌を培養し、
耐熱性DNAポリメラーゼを大量に発現させた培養菌体
より耐熱性DNAポリメラーゼの採取を行うことができ
る。培養菌体より、例えば前述の方法により精製を行い
SDS−PAGEで単一バンドを示すまでDNAポリメ
ラーゼを精製することができる。
【0018】得られたDNAポリメラーゼはSDS−P
AGEで約6万7千ダルトンの分子量を示すポリペプチ
ドであり、DNA合成活性、3′→5′エキソヌクレア
ーゼ活性を有するが、5′→3′エキソヌクレアーゼ活
性を有しない変異型DNAポリメラーゼである。精製タ
ンパク質のアミノ酸分析を行い、そのN末端のアミノ酸
配列を決定することができる。その配列を、配列表の配
列番号8に示す。配列表の配列番号7に示したアミノ酸
配列のうち、アミノ酸番号1のMetからアミノ酸番号
284のLysまでの284アミノ酸が欠失しているこ
とを確認し、該変異型DNAポリメラーゼの遺伝子配列
及び全アミノ酸配列を明らかにした。配列表の配列番号
1に変異型DNAポリメラーゼの塩基配列、配列表の配
列番号9にアミノ酸配列を示す。
【0019】以上のようにして得られた組換え大腸菌 E
scherichia coli HB101/pUI101及び Esche
richia coli HB101/pUI205の培養液1mlか
らそれぞれ127単位、212単位のDNAポリメラー
ゼが得られ、工業的な製造が可能になった。
【0020】
【実施例】以下に本発明の実施例を挙げるが、本発明は
これら実施例に限定されるものではない。
【0021】実施例1 (1)バチルス カルドテナックス染色体DNAの調製 バチルス カルドテナックスYT−G株を125mlのL
培地(バクトトリプトン10g/l、酵母エキス5g/
l、NaClの5g/l、pH7.2)で65℃一夜振
とう培養し、集菌した菌体を4mlの25%ショ糖、0.
05M トリス−HCl(pH8.0)に懸濁し、リゾ
チーム(5mg/ml)を800μl加えて20℃1時間放
置した。SET溶液〔20mM トリス−HCl(pH
8.0)、1mM EDTA、150mM NaCl〕を2
4ml加えた後、5%SDS溶液を4mlとプロティナーゼ
K(10mg/ml)を400μl加えて37℃、1時間放
置した。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、エタ
ノールを加えて長鎖DNAを不溶化し、滅菌したつまよ
うじで巻取って回収した。以上の操作により3.1mgの
DNAが得られた。
【0022】(2)PCRを用いた特異的DNA断片の
増幅 配列表の配列番号3及び配列番号4に示した2種類のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドをそれぞれ100pmolと
バチルス カルドテナックスDNA1ngを用いて全量1
00μlで95℃30秒、55℃1分、72℃2分のP
CRを30サイクル行った。5μlをとりアガロースゲ
ル電気泳動で分析した結果、600塩基対のDNA断片
が特異的に増幅していた。このDNA断片をSmaIで
開環したM13ファージmp18ベクターに組込みジデ
オキシ法により塩基配列を分析した。
【0023】(3)ゲノミックサザン法による目的の遺
伝子の検索 バチルス カルドテナックスDNAを1つの酵素につき
5μg用いてEcoRI、BamHI、HindIII、Hin
cII 、XhoI、PstI、PvuIIで分解し、アガロ
ースゲル電気泳動に供した。ゲル中のDNAをナイロン
膜に移し、上記PCRにより得た600塩基対のDNA
断片をプローブに用いてハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブはランダムプライミング法により放射性標
識した。ハイブリダイゼーションは6×SSC、1%S
DS、5×デンハーツ溶液、100μg/ml子牛胸腺D
NA中で65℃5時間行った。1×SSC、0.1%S
DS溶液中で1時間洗浄した後、X線フィルムに感光
し、オートラジオグラムをとった。
【0024】(4)DNAポリメラーゼ遺伝子を含むD
NA断片のクローン化 ゲノミックサザン分析で陽性を示したHindIII(2.4
0kb)、HincII (1.45kb)及びXhoI(2.1
kb)DNA断片をプラスミドベクター中にクローン化す
るため、バチルス カルドテナックスDNAをそれぞれ
100μgずつ、HindIII、HincII 、XhoIで分解
し、目的の大きさのDNAをアガロースゲルより回収し
た。回収はガラスビーズ吸着法を用いた。pTV118
Nプラスミドをそれぞれ同じ酵素で開環し、アルカリ性
ホスファターゼで末端のリン酸基を除去したベクターを
加えてDNAリガーゼにより結合した後、大腸菌JM1
09に導入した。得られた組換体の集団の中からコロニ
ーハイブリダイゼーションによって目的のクローンを選
択した。ナイロン膜上に生育させた組換体のコロニー5
0個〜200個を0.5N 水酸化ナトリウム、1.5
M 塩化ナトリウム溶液で変性させた後、1M トリス
−HCl、1.5M 塩化ナトリウム(pH7.0)溶
液で中和し、紫外線照射でファージDNAを膜上に固定
した。プローブ調製及びハイブリダイゼーションの条件
はゲノミックサザン分析に準じた。
【0025】(5)クローン化断片に制限酵素分析及び
DNAポリメラーゼ遺伝子の再編成 得られた3種類のDNA断片について制限酵素地図を作
製した結果、上記3断片はHincII −HindIII−Xho
Iの順にそれぞれ重なり合い、連続して染色体DNA上
に存在することが判明した。必要以外の連結ができるだ
け起こらないように制限酵素切断部位を選択し、図1に
示すように、3種のDNA断片とベクターpTV118
Nを同時に連結させ、DNAポリメラーゼ遺伝子を含む
約3.5kbのDNA断片を組込んだプラスミドを構築
し、pUI101と命名した。なお、図1はpUI10
1の構築を示す工程図である。また図2は、pUI10
1にクローニングされているDNAポリメラーゼ遺伝子
を含むNcoI DNA断片の制限酵素地図を示す図で
ある。次に該プラスミドで大腸菌HB101株を形質転
換し、形質転換体 Escherichia coli HB101/pU
I101(FERM BP−3721)を得た。
【0026】(6)形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 上記組換えプラスミドpUI101を有する大腸菌HB
101(FERM BP−3721)をアンピシリンが
100μg/mlの濃度で存在するL培地5mlに植菌し3
7℃で培養した。培養液の濁度が0.6(A600 )のと
き、誘導物質であるイソプロピル−β−D−チオガラク
トシド(IPTG)を添加し、更に15時間培養を行っ
た。培養液1mlから集菌し、50mM トリス−HCl
(pH8.0)、25%スクロース溶液で洗浄した。同
じ溶液に再溶解した後、同量のリシス溶液〔50mMトリ
ス−HCl(pH7.5)、25%ショ糖、60mM ス
ペルミジン・一塩酸、20mM 塩化ナトリウム、12mM
DTT〕を加え、4℃で45分間静置した。更に5%
(w/v)トリトン−100( Triton−100)を20
μl加え、37℃で5分間静置した後、遠心分離により
上清を回収し、60℃、20分静置した後再度遠心分離
した上清を回収し、粗抽出液とした。
【0027】(7)DNAポリメラーゼ活性測定 反応溶液として67mM リン酸カリウム(pH7.
4)、6.7mM 塩化マグネシウム、1mM 2−メルカ
プトエタノール、20μM 活性化DNA、33μM
dATP、dCTP、dGTP、TTP、60nM
3H〕TTPを用意し、この溶液150μlに対して
適当量の粗抽出液を加え、60℃、5分反応させた後、
50mM ピロリン酸、10%トリクロロ酢酸を1ml加え
て反応を停止させた。氷中で5分間静置した後、全量を
ガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。10%TC
Aで数回洗浄した後、70%エタノールで置換し、フィ
ルターを乾燥して液体シンチレーションカウンターでフ
ィルター上の放射活性を測定した。1mlの培養液から1
27単位のDNAポリメラーゼが得られた。
【0028】(8)プラスミドpUI101を導入した
大腸菌による耐熱性DNAポリメラーゼの生産 大腸菌HB101/pUI101の菌体2.2gより精
製を開始し、実施例1−(6)で示した方法により20
mlの粗抽出液を得た。これらを60℃で30分間インキ
ュベートした後、熱変性したタンパク質を遠心分離した
(12000rpm 、10分)。この上清に硫酸アンモニ
ウムを加えていき、30〜80%飽和で沈殿する画分を
とってDE緩衝液〔50mM トリス−HCl pH7.
0、2mM 2−メルカプトエタノール、10%グリセロ
ール、4μM フェニルメタンスルホニルフルオリド
(PMSF)〕で透析した後、同じ緩衝液で平衡化した
DE52(ワットマン社)カラム15mlに添加し0mM〜
300mM NaClの直線濃度勾配で溶出して分画し、
実施例1−(7)に従ってDNAポリメラーゼ活性を調
べた。次に活性画分を集めてDE緩衝液で透析し、DE
緩衝液で平衡化したP−11(ワットマン社)カラム1
5mlに添加した。次に0mM〜300mM NaCl直線濃
度勾配で溶出し活性画分を集めた。P11画分の酵素標
品をSDS−PAGEで分析したところ、分子量約10
万ダルトンの単一バンドを与えた。
【0029】(9)アミノ酸シークエンサーによるN末
端アミノ酸配列の決定 実施例1−(8)で得られた酵素標品をアミノ酸シーク
エンサーにかけ、配列表の配列番号6に示すN末端アミ
ノ酸配列を決定した。
【0030】実施例2 (1)部分欠失プラスミドの作製 DNAポリメラーゼタンパクのアミノ末端側のドメイン
に存在すると推定される5′→3′エキソヌクレアーゼ
活性を消失させるために、遺伝子の5′側から部分的に
欠失させたプラスミドを作製した。エキソヌクレアーゼ
III を用いた方法を用いるため、まずpUI101に挿
入されている約3.5kbのNcoI断片を切り出し、平
滑末端化した後pTV118NのHincII 部位に組込ん
だプラスミドを作製した。次にベクター中の3′突出型
酵素KpnIと5′突出型の酵素XbaIとで二重切断
し、エキソヌクレアーゼIII を作用させて3′突出側へ
のみ分解反応を行わせ、マングビーン( Mung Bean)ヌ
クレアーゼで平滑末端とした後DNAリガーゼで再環状
化した。エキソヌクレアーゼIII の反応時間を制御する
ことによって種々の大きさの欠失変異体が得られた。ま
た再環状化の前にNcoIリンカーを連結することによ
り開始コドンが必ず適当な位置に入るようになり、欠失
された位置によって翻訳枠が3分の1の確率で合うよう
に構築した。上記のように操作したプラスミドを大腸菌
に導入し、得られた形質転換体から任意に20クローン
を選択し、粗抽出液を調製して耐熱性DNAポリメラー
ゼ活性を調べた。60℃においてDNA合成活性のある
ものについて塩基配列を解析した。活性のあった5クロ
ーンより1つを選んでその所有する組換えプラスミドを
pUI205と命名した。pUI205には図3に示す
約2.2kbのDNA断片が組込まれていた。次に該プラ
スミドで大腸菌HB101を形質転換し、形質転換体 E
scherichia coli HB101/pUI205(FERM
BP−3720)を得た。なお、図3は、pUI20
5にクローニングされているDNAポリメラーゼ遺伝子
の制限酵素地図を示す図である。
【0031】(2)形質転換体の培養及び粗抽出液の調
製 実施例1−(6)の方法に準じ上記形質転換体(FER
M BP−3720)を培養し粗抽出液を調製した。
【0032】(3)DNAポリメラーゼ活性の測定 実施例1−(7)の方法に準じ上記粗抽出液のDNAポ
リメラーゼ活性を測定した。1mlの培養液から212単
位のDNAポリメラーゼが得られた。
【0033】(4)5′→3′エキソヌクレアーゼ活性
の測定 基質としてプラスミドpBR322をPvuIIで切断し
て得られる322塩基対の断片を〔γ32−P〕ATPと
ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化したものを調製し
た。67mM リン酸カリウム(pH7.4)、6.7mM
塩化マグネシウム、1mM 2−メルカプトエタノール
を含む溶液中に実施例2−(2)の酵素標品と上記基質
を混合し60℃で5分反応させた後、エタノールを加え
て基質DNAを沈殿させた。上清中に存在する放射活性
を液体シンチレーションカウンターで測定することによ
りエキソヌクレアーゼによる分解物の量を求めた。上記
酵素標品には5′→3′エキソヌクレアーゼ活性は認め
られなかった。
【0034】(5)プラスミドpUI205を導入した
大腸菌による耐熱性DNAポリメラーゼの生産 実施例1−(8)方法に準じ、大腸菌HB101/pU
I205の菌体から酵素標品を得た。本酵素標品をSD
S−PAGEで分析したところ分子量約6万7千ダルト
ンの単一バンドを与えた。
【0035】(6)アミノ酸シークエンサーによるN末
端アミノ酸配列の決定 実施例1−(9)の方法に準じ、配列表の配列番号8に
示すN末端アミノ酸配列を決定した。
【0036】実施例3 (1)DNAポリメラーゼの構造遺伝子を含むバチルス
カルドテナックス染色体DNA断片の塩基配列の決定 実施例2−(1)で示した方法に従い種々の大きさの欠
失変異体のセットを調製し、それらを鋳型にしてジデオ
キシ法により塩基配列を解読していった。得られたデー
タをつなぎ合せ、最終的に配列表の配列番号5に示すp
UI101より切り出されたNcoI−NcoI断片全
長の塩基配列を決定した。また、pUI205には、配
列表の配列番号5に示すpUI101のNcoI断片の
うち、塩基番号1032〜3252の部分が挿入されて
いた。実施例1−(9)及び実施例2−(6)で決定し
たN末端アミノ酸配列と本実施例で決定した塩基配列よ
り、本発明のDNAポリメラーゼの構造遺伝子及びアミ
ノ酸配列を明らかにすることができた。
【0037】
【発明の効果】以上詳細に説明したように本発明により
新規なDNAポリメラーゼの存在が明らかとなり、遺伝
子工学研究用試薬として有用なDNAポリメラーゼの遺
伝子工学的製造法が提供された。
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:1779 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源:生物名:バチルス カルドテナックス(Bacillus
caldotenax) 株名:YT-G(DSM406) 配列: ATG GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG 45 GCA TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC 90 AAG GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT 135 GCG CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT 180 TTC CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC 225 TGG CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG 270 CGC GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC 315 GTT TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG 360 CAA GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC 405 GAA GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG 450 CGG GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC 495 AAG GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG 540 CTG CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG 585 CCG TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA 630 GTG GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG 675 CAG CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA 720 GAA TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT 765 GAA AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC 810 TCC ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG 855 ATC GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG 900 CAG TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT 945 ACA AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC 990 GGA CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT 1035 CGG CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG 1080 GAG TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG 1125 TTG CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA 1170 GCG TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC 1215 ATT TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT 1260 CAG GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT 1305 TAC GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT 1350 GAA TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG 1395 TAT ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG 1440 ACG ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC 1485 CGC AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC 1530 ACG CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG 1575 ATC GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC 1620 CTT TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA 1665 GAA GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG 1710 CAA GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC 1755 GGC TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA 1779 配列番号:2 配列の長さ:2631 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源:生物名:バチルス カルドテナックス(Bacillus
caldotenax) 株名:YT-G(DSM406) 配列: TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 45 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 90 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 135 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 180 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 225 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 270 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 315 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 360 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 405 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 450 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG GCG GTC 495 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 540 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATT CCC GGA GTG CCG GGC 585 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 630 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 675 TTG AAA GAA ACG CTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 720 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 765 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 810 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 855 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 900 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 945 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 990 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1035 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1080 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1125 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1170 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1215 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1260 GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1305 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC AAG 1350 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1395 CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1440 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1485 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1530 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1575 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1620 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1665 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1710 GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG 1755 TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA 1800 AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA 1845 CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG 1890 CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG 1935 TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG 1980 CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG 2025 TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT 2070 TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG 2115 GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC 2160 GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA 2205 TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT 2250 ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG 2295 ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC CGC 2340 AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG 2385 CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC 2430 GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT 2475 TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA 2520 GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA 2565 GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC GGC 2610 TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA 2631 配列番号:3 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) アンチセンス:NO 配列の特徴:1-23 S primer 配列: GAYCCHAACY TSCARAAYAT HCC 23 配列番号:4 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) アンチセンス:YES 配列の特徴:1-21 S primer 配列: KASNAKYTCR TCRTGNACYT G 21 配列番号:5 配列の長さ:3252 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源:生物名:バチルス カルドテナックス(Bacillus
caldotenax) 株名:YT-G(DSM406) 配列: CCATGGATAT ATTACCGTAG CGAGCAAAGT GGGGCGCGGC ACCGTGTTCA CGATCCATTT 60 TCCAAAGCCG GGGCGGTAGC CGGCTTCTTT TTATCATCTC CAACTGAGAA GCCTGCCAT 120 TTTCAGCGTG ACGTGAGCAC GGGATGAATC CGCGCCTCCC ATCATGTTGG GAGAGCGTT 180 AAGGCAAGCC GCAGGCATGG TACAATAGGA CAAGGAAGCA TCCGAGGAGG GATGAGA 237 TTG AAA AAA AAG CTT GTT TTA ATC GAC GGC AGC AGC GTG GCG TAC 282 CGC GCC TTT TTC GCC TTG CCG CTT TTG CAT AAC GAC AAA GGC ATC 327 CAT ACG AAC GCC GTC TAC GGG TTT ACG ATG ATG TTG AAT AAA ATT 372 TTG GCG GAA GAA GAG CCA ACT CAT ATG CTT GTC GCG TTT GAC GCC 417 GGG AAA ACG ACG TTC CGG CAT GAA GCG TTT CAA GAG TAT AAA GGT 462 GGG CGC CAG CAG ACG CCA CCG GAG CTG TCG GAG CAG TTT CCG CTG 507 TTG CGC GAG CTG CTG AGG GCG TAT CGC ATC CCC GCC TAT GAA CTC 552 GAG AAC TAC GAA GCG GAC GAT ATT ATC GGA ACG CTT GCC GCC CGC 597 GCT GAG CAG GAA GGG TTT GAG GTG AAA GTC ATT TCC GGC GAC CGC 642 GAT CTG ACC CAG CTC GCC TCC CCC CAT GTG ACG GTG GAC ATT ACG 687 AAA AAA GGG ATT ACC GAT ATC GAA CCG TAC ACG CCG GAG GCG GTC 732 CGC GAA AAA TAC GGC TTA ACT CCG GAA CAA ATC GTT GAT TTG AAA 777 GGA TTG ATG GGC GAC AAA TCG GAC AAC ATT CCC GGA GTG CCG GGC 822 ATC GGG GAA AAG ACG GCG GTC AAG CTG CTC AGG CAA TTC GGC ACG 867 GTC GAA AAC GTG CTT GCC TCC ATT GAC GAG ATC AAA GGC GAA AAG 912 TTG AAA GAA ACG CTG CGC CAA CAC CGG GAG ATG GCG CTG TTA AGC 957 AAA AAG CTC GCC GCC ATT CGC CGC GAC GCC CCG GTC GAG CTC TCG 1002 CTT GAT GAC ATC GCC TAT CAA GGG GAA GAC CGG GAG AAA GTG GTC 1047 GCT TTA TTT AAA GAG CTT GGG TTT CAA TCG TTT TTA GAG AAA ATG 1092 GAA TCG CCG TCA TCA GAA GAG GAA AAA CCG CTT GCC AAG ATG GCA 1137 TTT ACG CTT GCT GAC CGC GTG ACG GAG GAG ATG CTT GCC GAC AAG 1182 GCG GCG CTT GTC GTT GAA GTG GTC GAG GAA AAT TAT CAT GAT GCG 1227 CCG ATC GTC GGC ATC GCT GTG GTC AAC GAA CAT GGA CGG TTT TTC 1272 CTG CGC CCG GAG ACG GCG CTT GCC GAT CCG CAG TTT GTC GCC TGG 1317 CTT GGT GAT GAA ACG AAG AAA AAA AGC ATG TTT GAC TCA AAG CGC 1362 GCG GCA GTC GCC TTG AAA TGG AAA GGA ATT GAG CTA TGC GGC GTT 1407 TCC TTT GAT TTA TTG CTG GCC GCC TAT TTG CTT GAT CCG GCG CAA 1452 GGT GTT GAT GAT GTG GCT GCC GCA GCA AAA ATG AAG CAA TAC GAA 1497 GCG GTG CGC CCG GAT GAA GCG GTG TAT GGC AAA GGG GCG AAG CGG 1542 GCC GTG CCG GAT GAG CCA GTG CTC GCC GAG CAT TTG GTC CGC AAG 1587 GCG GCG GCG ATT TGG GCG CTC GAA CGG CCG TTT TTG GAT GAG CTG 1632 CGC CGC AAC GAA CAA GAT CGG TTG CTC GTC GAG CTC GAG CAG CCG 1677 TTG TCT TCG ATT TTG GCG GAA ATG GAA TTT GCC GGA GTG AAA GTG 1722 GAT ACG AAG CGG CTC GAA CAG ATG GGC GAA GAG CTC GCC GAG CAG 1767 CTG CGC ACG GTC GAG CAG CGC ATT TAT GAG CTC GCC GGC CAA GAA 1812 TTC AAC ATC AAT TCA CCG AAA CAG CTC GGC GTC ATT TTA TTT GAA 1857 AAA CTG CAG CTG CCC GTC TTG AAA AAA AGC AAA ACC GGC TAC TCC 1902 ACT TCG GCG GAT GTG CTT GAA AAA CTT GCG CCT TAT CAC GAG ATC 1947 GTG GAA AAC ATT TTG CAA CAT TAC CGC CAG CTT GGC AAG TTG CAG 1992 TCG ACG TAT ATT GAA GGA TTG CTG AAA GTC GTG CGA CCC GAT ACA 2037 AAG AAG GTG CAT ACG ATT TTC AAT CAG GCG TTG ACG CAA ACC GGA 2082 CGG CTC AGC TCG ACG GAG CCG AAC TTG CAA AAC ATT CCG ATT CGG 2127 CTT GAG GAA GGA CGG AAA ATC CGC CAA GCG TTC GTG CCG TCG GAG 2172 TCT GAT TGG CTC ATT TTC GCT GCC GAC TAC TCG CAA ATT GAG TTG 2217 CGC GTC CTC GCC CAT ATT GCG GAA GAT GAC AAT TTA ATG GAA GCG 2262 TTC CGC CGC GAT TTG GAT ATC CAT ACG AAA ACA GCG ATG GAC ATT 2307 TTC CAA GTG AGC GAG GAC GAA GTG ACG CCC AAC ATG CGC CGT CAG 2352 GCG AAG GCG GTC AAC TTT GGG ATC GTT TAC GGG ATC AGT GAT TAC 2397 GGC TTG GCG CAA AAC TTA AAT ATT TCA CGC AAA GAG GCC GCT GAA 2442 TTC ATC GAG CGC TAC TTC GAA AGC TTC CCT GGC GTG AAG CGG TAT 2487 ATG GAA AAC ATT GTG CAA GAA GCA AAA CAG AAA GGG TAT GTG ACG 2532 ACG CTG CTG CAT CGG CGC CGC TAT TTG CCG GAT ATT ACG AGC CGC 2577 AAC TTC AAC GTC CGC AGC TTT GCT GAA CGG ATG GCG ATG AAC ACG 2622 CCG ATT CAA GGG AGC GCC GCT GAC ATT ATT AAA AAG GCG ATG ATC 2667 GAT CTG AAC GCC AGA CTG AAG GAA GAG CGG CTG CAA GCG CGC CTT 2712 TTG CTG CAG GTG CAT GAC GAG CTC ATT TTG GAG GCG CCG AAA GAA 2757 GAG ATG GAG CGG CTG TGC CGG CTC GTT CCG GAA GTG ATG GAG CAA 2802 GCG GTC ACA CTT CGC GTG CCG CTC AAA GTC GAT TAC CAT TAC GGC 2847 TCG ACA TGG TAT GAC GCG AAA TAAAAAGGAG TCTTGGTGTG TGGATCGCCG 2898 GCACCCCTAA AAGGCCGGTG ATTTAAGGGG AAATACTGCT CTCCAACAGT GTTTCTCAAA 2958 TTGAAAAACC TTGCAACACC ATCACTTCAT TCCTTGTGAT TTCTCATAAA TCAAGCGAAT 3018 CCATTGTTTT TCATCAGCCT TCTAAGAAGG CCTGTGATGG AATGAAAAAG CAGTTTCACA 3078 ACGACTCTTC TCCAGTTGAG AAGCCTTGGG ACATCGAGTC GTCCTTCTCA ACCAACATGA 3138 CCGATTTTGC GAAAATCAGC GTTTCTCACC GGCCTTCTAG GCAGAATCTT TCGGTGCGAC 3198 GATTCTCGGC TGCAACTCGG ATGAATTGGA GCGAAATCAG CTGCCGCCCC ATGG 3252 配列番号:6 配列の長さ:22 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 配列: Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro 20 配列番号:7 配列の長さ:877 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Lys Lys Lys Leu Val Leu Ile Asp Gly Ser Ser Val Ala Tyr 1 5 10 15 Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu His Asn Asp Lys Gly Ile 20 25 30 His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Asn Lys Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Glu Glu Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala 50 55 60 Gly Lys Thr Thr Phe Arg His Glu Ala Phe Gln Glu Tyr Lys Gly 65 70 75 Gly Arg Gln Gln Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Leu 80 85 90 Leu Arg Glu Leu Leu Arg Ala Tyr Arg Ile Pro Ala Tyr Glu Leu 95 100 105 Glu Asn Tyr Glu Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ala Ala Arg 110 115 120 Ala Glu Gln Glu Gly Phe Glu Val Lys Val Ile Ser Gly Asp Arg 125 130 135 Asp Leu Thr Gln Leu Ala Ser Pro His Val Thr Val Asp Ile Thr 140 145 150 Lys Lys Gly Ile Thr Asp Ile Glu Pro Tyr Thr Pro Glu Ala Val 155 160 165 Arg Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro Glu Gln Ile Val Asp Leu Lys 170 175 180 Gly Leu Met Gly Asp Lys Ser Asp Asn Ile Pro Gly Val Pro Gly 185 190 195 Ile Gly Glu Lys Thr Ala Val Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gly Thr 200 205 210 Val Glu Asn Val Leu Ala Ser Ile Asp Glu Ile Lys Gly Glu Lys 215 220 225 Leu Lys Glu Thr Leu Arg Gln His Arg Glu Met Ala Leu Leu Ser 230 235 240 Lys Lys Leu Ala Ala Ile Arg Arg Asp Ala Pro Val Glu Leu Ser 245 250 255 Leu Asp Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Val Val 260 265 270 Ala Leu Phe Lys Glu Leu Gly Phe Gln Ser Phe Leu Glu Lys Met 275 280 285 Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala 290 295 300 Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys 305 310 315 Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala 320 325 330 Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe 335 340 345 Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp 350 355 360 Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg 365 370 375 Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val 380 385 390 Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln 395 400 405 Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu 410 415 420 Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg 425 430 435 Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys 440 445 450 Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu 455 460 465 Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro 470 475 480 Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys Val 485 490 495 Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu Gln 500 505 510 Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu 515 520 525 Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu 530 535 540 Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr Ser 545 550 555 Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile 560 565 570 Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln 575 580 585 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr 590 595 600 Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly 605 610 615 Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg 620 625 630 Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu 635 640 645 Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu 650 655 660 Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala 665 670 675 Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile 680 685 690 Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln 695 700 705 Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 710 715 720 Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala Glu 725 730 735 Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr 740 745 750 Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr 755 760 765 Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg 770 775 780 Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr 785 790 795 Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile 800 805 810 Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu 815 820 825 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu 830 835 840 Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln 845 850 855 Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly 860 865 870 Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 875 配列番号:8 配列の長さ:10 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 配列番号:9 配列の長さ:593 配列の型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列: Met Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met 1 5 10 15 Ala Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp 20 25 30 Lys Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp 35 40 45 Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe 50 55 60 Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala 65 70 75 Trp Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys 80 85 90 Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly 95 100 105 Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala 110 115 120 Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr 125 130 135 Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys 140 145 150 Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg 155 160 165 Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu 170 175 180 Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln 185 190 195 Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val Lys 200 205 210 Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu 215 220 225 Gln Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln 230 235 240 Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe 245 250 255 Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Ser Lys Thr Gly Tyr 260 265 270 Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu 275 280 285 Ile Val Glu Asn Ile Leu Gln His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu 290 295 300 Gln Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp 305 310 315 Thr Lys Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr 320 325 330 Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile 335 340 345 Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser 350 355 360 Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu 365 370 375 Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu 380 385 390 Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp 395 400 405 Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met Arg Arg 410 415 420 Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp 425 430 435 Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala 440 445 450 Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg 455 460 465 Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val 470 475 480 Thr Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser 485 490 495 Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn 500 505 510 Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 515 520 525 Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg 530 535 540 Leu Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys 545 550 555 Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu 560 565 570 Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr 575 580 585 Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys 590
【図面の簡単な説明】
【図1】pUI101の構築を示す工程図である。
【図2】pUI101にクローニングされているDNA
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。
【図3】pUI205にクローニングされているDNA
ポリメラーゼ遺伝子の制限酵素地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田3丁目4番1号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 DNAポリメラーゼ遺伝子が、配列表の
    配列番号1で表される塩基配列であることを特徴とする
    DNAポリメラーゼ遺伝子。
  2. 【請求項2】 DNAポリメラーゼ遺伝子が、配列表の
    配列番号2で表される塩基配列であることを特徴とする
    DNAポリメラーゼ遺伝子。
  3. 【請求項3】 請求項1又は請求項2に記載のDNAポ
    リメラーゼ遺伝子を含有させた組換体プラスミドを導入
    させた形質転換体を培養し、該培養物からDNAポリメ
    ラーゼを採取することを特徴とするDNAポリメラーゼ
    の製造方法。
JP11240092A 1991-06-03 1992-04-06 Dnaポリメラーゼ遺伝子 Pending JPH05284971A (ja)

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EP92304763A EP0517418B1 (en) 1991-06-03 1992-05-27 A method for cloning of a gene for Pol I type DNA polymerase
EP02005743A EP1233061A3 (en) 1991-06-03 1992-05-27 A method for cloning of a gene for pol I type DNA polymerase
DE69233253T DE69233253T2 (de) 1991-06-03 1992-05-27 Verfahren zum Klonieren eines Pol-I-Typ DNS-Polymerase-Gens
US08/208,036 US5436326A (en) 1991-06-03 1994-03-09 Method for cloning of a gene for Pol I type DNA polymerase
US08/428,823 US5753482A (en) 1991-06-03 1995-04-25 Method for cloning of a gene for pol I type DNA polymerase

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