JP4446498B2 - タンパク質融合による切頭型耐熱性dnaポリメラーゼの過発現及び精製 - Google Patents
タンパク質融合による切頭型耐熱性dnaポリメラーゼの過発現及び精製 Download PDFInfo
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、耐熱性Bst DNAポリメラーゼI、及び切頭型(truncated)耐熱性DNAポリメラーゼを組換えDNA技術やタンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
DNAは大半の生物の遺伝物質である。DNAポリメラーゼはDNAの複製や修復に関与する酵素である。細菌、酵母及びヒトを含む種々の生物に由来するDNAポリメラーゼの単離や特性分析に関しては広範な研究が行われている。
【0003】
DNAポリメラーゼは、基本的な重合機能の他に、そのポリペプチドのN末端ドメインに5’→3’又は3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を含み得る。両方のエキソヌクレアーゼが存在する場合、5’→3’エキソヌクレアーゼドメインがN末端に存在し、その次に3’→5’エキソヌクレアーゼドメイン及びC末端ポリメラーゼドメインが来る。ニックトランスレーションや修復のためには、進行する(advancing)DNAポリメラーゼの経路内にあるDNAを5’→3’方向に切り出しする5’→3’エキソヌクレアーゼが必要である。ミスマッチのヌクレオチドを3’→5’方向に切り出しして正しく修復するには3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が必要である。配列の比較により3種の3’→5’エキソヌクレアーゼ(Exo I、II、III)が同定された(Blanco等,(1991)Gene, 100, 27−38)。
【0004】
耐熱性真正細菌や耐熱性古細菌から幾つかの耐熱性DNAポリメラーゼが単離された。これらのポリメラーゼは、その耐熱性を基準にして3つのグループに分けることができる。高度好熱菌から単離されたDNAポリメラーゼは100℃で安定である。例えば、Thermococcus litoralis由来のVent(登録商標)DNAポリメラーゼは100℃で2時間の半減期を有し、このことは100℃で2時間インキュベートした後に、Ventポリメラーゼの重合活性の半分が保持されることを意味している(Kong等, J. Biol. Chem. 268:1965−1975(1993),同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。超耐熱性のThermus aquaticusから単離されたTaq DNAポリメラーゼは95℃で1.6時間の半減期を有する(Kong等,J. Biol. Chem.,上掲(1993),同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。Bst DNAポリメラーゼIは第3のグループである中度好熱菌に属し、65℃で安定である。
【0005】
Bst DNAポリメラーゼは最初Stenesh及びRoe(Stenesh及びRoe Biochim. Biophys. Acta 272:156−6(1972))によって単離され、Kaboev等(J. Bacteriol., 145:21−6(1981))は更にBst DNAポリメラーゼを精製し、このポリメラーゼが分子量76kDaで、5’→3’及び3’→5’の両方のエキソヌクレアーゼ活性を有すると結論付けた(上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。ポリメラーゼに対するエキソヌクレアーゼの相対活性は非常に低く、Kaboevはそれが汚染によるものであり得るとコメントとした。Sellman等(Sellmann等,J. Bacteriol.,174:4350−4355(1992),同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)は、エキソヌクレアーゼ活性を持たない95kDaのBst DNAポリメラーゼを精製した。Bst DNAポリメラーゼはクローニングされたように思えるが(Epicentre Technologyのカタログ)、クローニング手順や配列情報に関する刊行物は入手できない。Epicentre Technologiesは、5’→3’及び3’→5’の両方のエキソヌクレアーゼ活性がrBst DNAポリメラーゼ中に存在すると報告している。
【0006】
耐熱性DNAポリメラーゼは分子生物学や医薬研究で非常に有用である。例えば、Taq DNAポリメラーゼの耐熱性は、DNA増幅(Lawyer, J. Biol. Chem.,264:6427−6437(1989),同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)のためのポリメラーゼ連鎖反応法(米国特許第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,800,159号)の収率、特異性、自動化及び有用性に大きく寄与した。他の具体例は、Bst DNAポリメラーゼの大断片(Bst L.F.)のDNA配列決定のための使用である(Ye, Scientia Sinica, 30:503−506(1987);McClary, DNA SEQ. 1:173−180(1991)、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。耐熱性Bstポリメラーゼを用いることにより、配列決定反応を高温(65℃)で行って二次構造を壊し、オートラジオグラム上で均一なバンド強さと低いバックグラウンドを得ることができる。Bst L.F.は、Becton DickinsonのG. Terrance Walker等によって開発された等温指数的DNA増幅技術である鎖置換増幅法(Strand Displacement Amplification)(SDA)でも使用され得る。例えば、Walker等, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:392−396(1992)(同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)を参照されたい。
【0007】
Bst DNAポリメラーゼのN末端ドメインをズブチリシン(プロテイナーゼ)による部分消化によって重合ドメインから分離して、E. coli Pol Iのクレノー断片に類似する75kDa DNAポリメラーゼドメイン(「大断片」と称する)を産生することができる(Ye, Scientia Sinica, 上掲(1987)、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。ズブチリシンを使用してBst L.F.を産生することができるが、ズブチリシンによってBstポリメラーゼが非特異的分解を起こすため、その有効性は低い。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
従って、これまでに産生されたもので見られる欠点や無効性を克服するBstI DNAポリメラーゼ(その大断片を含む)の新規製造方法が必要となる。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明は、耐熱性Bst DNAポリメラーゼI、及び切頭型耐熱性DNAポリメラーゼを組換えDNA技術やタンパク質融合技術を用いて商業的に有用な量製造する方法に関する。
【0010】
具体的には、好ましい一実施態様では、3’→5’エキソヌクレアーゼを含まず、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を含んでいる点で、これまでに報告されたBstポリメラーゼとは異なるBstI DNAポリメラーゼを提供する。他の好ましい実施態様では、5’→3’エキソヌクレアーゼを不活化してもよい。本発明は更に、組換えDNA技術やタンパク質融合技術を用いたBst DNAポリメラーゼIの大断片の独特の製造方法を提供する。タンパク質融合系では、クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードするmalE遺伝子の下流のpMALベクター内に挿入すると、MBP融合タンパク質が発現される(Guan, C等,(1987)Gene 67,21−30; Maina, C.V.等,(1988)Gene 74,365−373,同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。この技術は、多量の融合タンパク質を発現するために強いPtacプロモーターとMBP翻訳開始シグナルを使用する。次いで、MBPの一ステップ親和性精製により融合タンパク質を精製することができる(Kellerman及びFerenci(1982)Methods in Enzymol. 90, 459−463,同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。
【0011】
1つの好ましいアプローチによれば、本発明のBst DNAポリメラーゼIをBacillus stearothermophilusからほぼ均質になるまで精製し、そのN末端の最初の21アミノ酸残基の配列を決定した。このアミノ酸配列に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドを作製した。Bst Pol I遺伝子の3’末端ヌクレオチド配列を決定するために逆PCRを実施した。Bst染色体DNAをNgoMI又はSau3AIで消化し、次いでT4リガーゼを用いて連結して環を形成した。使用する2個のプライマーは、遺伝子の3’末端付近の642bp DNA断片の配列データを用いて設計した。この断片を、Pol I様DNAポリメラーゼ中に保存されたアミノ酸配列モチーフの存在に基づいてクローニングした。PCR断片のヌクレオチド配列を決定し、BstPol I遺伝子の3’末端を同定した。5’末端及び3’末端両方のヌクレオチド配列を決定した後に、全Bst Pol I遺伝子をPCRにより増幅し、これをpET21a発現ベクター内にクローニングした。耐熱性Bst Pol Iを組換えプラスミドを含むE.coli中で産生し、その後全Bst Pol I遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。Bst DNAポリメラーゼをズブチリシンで部分消化して、BstポリメラーゼIの大断片を生成した。ズブチリシンで部分消化した断片を生成し、この大断片のN末端アミノ酸配列を決定した。その後、切頭型(truncated)遺伝子をE.coli内に発現させようとしたが失敗した。切頭型mRNA又はタンパク質はin vivoで不安定であると考えられる。更には、Bst大断片はホロ酵素に比べてE. coli宿主に対して致死的であり、クローニングに際し問題となった。このような問題を克服し、更には精製ステップを簡略化するために、MBP融合タンパク質を産生することによって転写mRNAを安定化させるか又はより安定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造することを期待して、5’末切頭型Bst Pol I遺伝子をpMAL−c2ベクター内にクローニングした。実際、融合タンパク質及び大きな切断Bst断片は共に65℃で活性を有した。
【0012】
【発明の実施の形態】
Bst Pol I大断片の製造について本明細書に記載する好ましい方法は以下のステップからなる:
1. Bst DNAポリメラーゼIをBacillus stearothermophilusから精製する。この生物は好熱菌であって、増殖温度範囲は45℃〜70℃である。細胞増殖後、以下のような複数ステッププロセスを用いてBst DNAポリメラーゼIを精製する。まず、細胞を緩衝液A(20mMKPO4緩衝液,pH6.5;1mM EDTA;10mM β−メルカプトエタノール)中に懸濁させ、超音波処理し、遠心分離にかける。KPO4濃度は上清中200mMに調整し、次いで上清を、DEAEセファロースカラムのような核酸に対して高い親和性を示すカラムに通す。上清溶液中に存在する核酸はDEAEに結合するため、核酸はKPO4塩濃度200mMでカラムを素通りするタンパク質と分離される。素通りしたタンパク質をヘパリンセファロースカラムに添加する。カラムを洗浄し、DNAポリメラーゼ酵素活性を緩衝液A中0→0.7M KClのような直線勾配で溶離する。緩衝液B(20mM トリス−HCl,pH7.4;0.5mM EDTA;10mM β−メルカプトエタノール)中でピークDNAポリメラーゼ活性を透析し、Q−セファロースカラムに添加する。酵素活性を緩衝液B中0.025→1M KClのような直線勾配で溶離する。再度、DNAポリメラーゼのピーク活性を透析し、ヘパリンTsk1カラム(Toso Haas)に添加する。酵素を、緩衝液B中0.025→1MKCl直線勾配で溶離する。この段階での酵素純度は約95%である(図1)。
【0013】
2. ステップ1で得たBst Pol I酵素を、Matsudaira, J. Biol. Chem. 262:10035−10038(1987)の手順に従って電気泳動及びエレクトロブロッティングに付す。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。膜をクーマシーブルーR−250で染色し、90kDaの主タンパク質バンドを切り出し、Waite−Rees等, J. Bacteriol., 173:5207−5219(1991)の手順に従って連続的に分解させた。上記文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする。90kDaタンパク質の最初の21残基はMet−Lys−Lys−Lys−Leu−Val−Leu−Ile−Asp−Gly−Asn−Ser−Val−Ala−Tyr−Arg−Ala−Phe−Phe−Ala−Leu(配列番号3)である。Bst Pol I遺伝子のE.coli内へのクローニング及び発現を行うために、制限酵素(XbaI)クローニング部位及びリボソーム結合部位を含む縮重プライマー(プライマーA)をアミノ酸配列に基づいて作製する。
【0014】
3. Bst Pol I遺伝子がPCRによって直接クローニングされ得るように3’末端ヌクレオチド配列を決定するために、NgoMI及びSau3AIで切断/自己連結したB. stearothermophilusゲノムDNA鋳型から逆PCR産物を増幅させる。NgoMIで消化、自己連結したBstDNAを鋳型として使用した反応では、寸法が約0.95kbの断片が得られる。Sau3AIで消化、自己連結したBst DNAを鋳型として使用した反応では、寸法が約1.5kbの断片が得られる。0.95kb及び1.5kbの2つの増幅DNAバンドをアガロースゲルから切り出し、直接DNAの配列決定に付す。終結コドン(TAA)がNgoMIで消化/自己連結した配列中180塩基対に見出され、これはBst DNAポリメラーゼI遺伝子の終結コドンであると考えられる。Bst Pol I遺伝子の3’末端にアニーリングする、NotIクローニング部位を含む他のプライマー(プライマーB)を作製する。
【0015】
4. PCR反応を実施すると、予測される2.6kbバンドがアガロースゲル上で観察される。ゲルから2.6kb断片を精製し、次いでNotI及びXbaIで消化し、NotI/XbaIで消化したpET−21aベクター(Novagen, Madison, Wisconsin)内にクローニングする。Bst Pol I遺伝子を含む組換えプラスミドをER2169コンピテント細胞(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)内に形質転換する。65℃で耐熱性のDNAポリメラーゼ活性(約30,000u/g宿主細胞)が中温好性E. coli宿主で観察され、このことはBst Pol I遺伝子のクローニング及び発現に成功したことを示している。中断のない2631bpの読み取り枠(ORF)に相当する全Bst Pol I遺伝子のヌクレオチド配列を決定する(図2A、2B、2C)。2631bp遺伝子は分子量計算値99,007.67の876アミノ酸タンパク質をコードし、この分子量は10→20%ポリアクリルアミド勾配ゲル上で観察された約97kDaの分子量と一致する(図1)。
【0016】
5. Bst DNAポリメラーゼIをプロテアーゼズブチリシンで消化すると、Bst大断片(Bst L.F.)が産生されることが観察された。Bst L.F.は5’→3’エキソヌクレアーゼドメインの欠如した切頭型ポリメラーゼであり、DNAの配列分析で非常に有用な酵素である(Ye及びHong, Scientia Sinica, 30:503−506(1987)、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。ズブチリシンを使用してBst L.F.を産生することができるが、ズブチリシンによってBstポリメラーゼの非特異的分解が生じるために有効性は低い。本発明によれば、Bst L.F.を5’末端に欠失を有するBst Pol I遺伝子から直接産生する方がズブチリシン消化よりも効果的であり、このズブチリシン消化はDNAの配列決定や鎖置換増幅法(Walker等、上掲)のような用途でより有用である。しかしながら、Bst L.F.のクローニング及び発現のための独創的な実験は失敗した。転写されるmRNA、又は切頭型遺伝子から翻訳されるタンパク質はin vivoで不安定であると考えられる。更には、Bst大断片はE. coli宿主に対して非常に致死的であり、ポリメラーゼ活性が低いか又はポリメラーゼ活性を持たない変異体だけが選択されたと考えられる。このような問題を克服するために、MBP−Bst L.F.融合タンパク質を産生することによって転写mRNAを安定化させるか又はより安定したもしくはほとんど致死的ではない翻訳タンパク質を製造することを期待して、5’末端切頭型Bst Pol I遺伝子をpMAL−c2ベクター内にクローニングした。
【0017】
Bst L.F.のN末端境界部分を解明するために、精製したBst DNAポリメラーゼI(図1)を適量のズブチリシンで消化し、次いでズブチリシンで消化した大きな断片を、トリス−トリシン10→20%ポリアクリルアミド勾配ゲル(Novex, San Diego, California)上の電気泳動に付し、次いでエレクトロブロッティングした(Matsudaira,J. Biol. Chem, 262:10035−10038(1987)、同文献の内容は参考として本明細書の一部を構成するものとする)。BstL.F.に相当する約67kDaのタンパク質バンドを切り出し、N末端タンパク質の配列決定に付した(Waite−Rees等,上掲)。67kDaタンパク質の最初の7残基はAla−Glu−Gly−Glu−Lys−Pro−Leu(配列番号4)に相当し、これはズブチリシン切断部位がAla289〜Ala290の間に位置することを示している(図2A、2B、2C)。大断片のN末端アミノ酸配列は、クローニングしたBst Pol I遺伝子から推定されるアミノ酸配列に適合する(図2A、2B、2C)。
【0018】
この配列に基づいて、FspI制限酵素部位を含むプライマー(プライマーC)を、Bst L.F.の開始部に相当する868〜890位の部位でBst Pol I遺伝子にアニーリングするように設計する(図2A、2B、2C)。XbaI部位を有する他のプライマー(プライマーD)を、前記遺伝子の3’末端にアニーリングするように設計する。PCRを実施して、Bst大断片をコードする5’末端−切頭型Bst Pol I遺伝子を増幅させる。Bst大断片の予想される寸法に相当する1.8kbのDNA断片を増幅させる。1.8kbの断片をFspI(ブラント末端)及びXbaIによって切断し、次いでXmnI(ブラント末端)及びXbaIで切断したpMAL−c2ベクター(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)内にクローニングする。クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードする(E. coli由来の)pMAL−c2 malE遺伝子のすぐ下流に導入すると、MBP−Bst L.F.融合タンパク質が発現される(図3)。組換えプラスミドをE. coli RRI細胞(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)内に形質転換する。このプラスミドを含む細胞を超音波処理し、遠心分離にかける。ここでも65℃で好熱性のDNAポリメラーゼ活性(約130,000u/g宿主細胞)が中温好性宿主で観察され、このことはMBP−Bst融合タンパク質が65℃で活性を有することを示している。
【0019】
7. ステップ6の上清を(実施例VIで詳述する)アミロース親和性カラムに添加する。核酸及び他の全ての宿主細胞タンパク質(MBP−Bst融合タンパク質は除く)をカラムに通し、カラムをカラム容量の数倍の緩衝液C(200mM NaCl;20mMトリス−HCl,pH7.4;1mM EDTA;1mM DTT)で洗浄して除去する。MBP−Bst L.F.融合タンパク質を緩衝液C中の10mMマルトースで溶離する。溶離した融合タンパク質をS−100サイズ排除カラムで更に精製して、遊離MBPを排除する。
【0020】
8. 精製したMBP−Bst融合タンパク質を因子Xaプロテアーゼ(NewEngland Biolabs #800−10)で切断することができる。因子Xaの切断後、110kDaのMBP−Bst L.F.融合タンパク質が分解し、予想される67kDaのBst L.F.及び40kDaのMBPが得られた(図3)。MBP−Bst L.F.融合タンパク質及び因子Xaで切断したBst L.F.は共に活性を有するが、因子Xaで切断したBst L.F.(45,300u/mg)は融合タンパク質(6,300u/mg)の約7倍の比活性を有する。融合体の比活性が低いために、MBP−Bst融合タンパク質中の耐中温性MBPが65℃で熱変性を起こし得る。切断したBst L.F.は耐熱性があり比活性もより高いので、産生のための好ましい酵素となるはずである。
【0021】
9. 因子Xa及び切断した遊離MBPを除去するために、65℃で20分間インキュベートして因子Xa消化体に熱負荷を加え、次いで緩衝液E(50mM NaCl;20mM トリス−HCl pH7.8;0.1mM EDTA;1mM DTT)に平衡化したSource−Q(Pharmacia Biotech)カラムに添加する。酵素を緩衝液D中50mM→600mM NaClの直線勾配で溶離する。Bst L.F.を7倍容量の緩衝液F(20mM KPO4,pH6.9;0.1mM EDTA;1mM DTT)で希釈し、緩衝液G(50mM NaCl, 20mM KPO4,pH6.9;0.1mM EDTA;1mM DTT)に平衡化した1cm×10cmのヘパリン−TSK5PWガード樹脂カラムに添加する。酵素を緩衝液F中50mM→600mMNaClの直線勾配で溶離する。酵素含有画分をSDS−PAGEで調べると、予想分子量が67,000で純度が90%以上であることが判明した(図4)。この組換えBst L.F.の比活性は100,800u/mgである。
【0022】
本明細書に記載する組換えBst L.F.は複製中に鎖置換することが可能で、5’→3’及び3’→5’のいずれのエキソヌクレアーゼ活性も有さない(図6)。これは、Bst Pol Iが3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有することを示すEpicentre(Madison, Wisconsin)のカタログに記載のものとは異なる。
【0023】
10. エキソヌクレアーゼ活性アッセイを実施して、本発明のBst DNAポリメラーゼIと関連するエキソヌクレアーゼ活性の方向性を決定する。5’−32P及び3’−3H末端ラベルを用いて線状PUC19 DNA基質を調製し、BstポリメラーゼIと共に、また対照としてVent、E. coli Pol I及びTaq DNAポリメラーゼを用いてインキュベートする間の2つのラベルの可溶化を監視する。Ventは3’→5’エキソヌクレアーゼを有し、結果として3Hラベルを可溶化する。Taqは5’→3’エキソヌクレアーゼを有し、従って32Pラベルを可溶化する。E. coli Pol Iは5’→3’及び3’→5’の両方のエキソヌクレアーゼを有し、従ってE. coli Pol Iと共にインキュベートする間に32P及び3Hの両方のラベルが可溶化する。Bst Pol Iと共にインキュベートすると、Taqと同様に32Pラベルだけが可溶化し、このことはBst Pol Iが5’→3’エキソヌクレアーゼを有するが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は欠如していることを示している(図5)。配列データは、Bst Pol Iが3’→5’エキソヌクレアーゼドメイン中に「DXE」exoIモチーフを持たないことを示しており、これは本発明のエキソヌクレアーゼアッセイデータと一致していた。
【0024】
Bst Pol Iには3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が欠如していることを更に確かめるために、3’末端にG:Aミスマッチを含むプライマーでアニーリングしたM13ssDNAを用いて、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼアッセイを実施する。3’→5’エキソヌクレアーゼを有するVent DNAポリメラーゼはミスマッチのGを効果的に除去し、次いでプライマーを伸長して、より高い相対的ポリメラーゼ活性を得ることができる(図6、Vent exo+)。Taqポリメラーゼは3’→5’エキソヌクレアーゼを持たず、従ってミスマッチを修正することができず、相対的ポリメラーゼ活性は5分の1である(図6、Taq)。Taqと同様に、Bstの相対的ポリメラーゼ活性も低く、このことはBstにはミスマッチのGの除去に必要な3’→5’エキソヌクレアーゼ活性が欠如しており、このため3’末端が、伸長されたDNAポリメラーゼとなり得ることを示している。
【0025】
実施することが好ましい本発明の実施態様を以下の実施例で説明する。本実施例は例示的であり、本発明は特許請求の範囲に記載する範囲を除いて以下の実施例に限定されるものではない。
【0026】
【実施例】
実施例1
B. stearothermophilus DNAポリメラーゼI遺伝子のクローニング
1. 逆(inverse)PCRを用いてのBst Pol I遺伝子の3′末端の決定
1反応当たり1.2μgのB. stearothermophilusゲノムDNAを用いて、複数の個別管内で制限消化を行なった。前記DNAを45μlのNEBuffer Sau3AI(New England Biolabs NEBuffer Sau3AI=100mM NaCl、10mMビストリスプロパン−HCl、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール; pH7.0@25℃)に加えた混合物に、50UのSau3AI(New England Biolabs, #169)を添加した。前記DNAを45μlのNEBuffer 4(New England Biolabs NEBuffer 4=50mM酢酸カリウム、20mMトリス−酢酸塩、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオトレイトール; pH7.9@25℃)に加えた混合物には、50UのNgoMI(New England Biolabs, #564)を添加した。Sau3AI反応混合物には100μg/mlのBSAを含有させた。いずれの反応混合物も最終体積を50μlとした。両消化物を37℃で1時間インキュベートした。消化物から制限酵素を、フェノール(1回)及びクロロホルム(2回)での抽出によって除去した。各消化物に5μlの3M酢酸ナトリウム及び100μlの95%エタノール/5%イソプロパノールを添加することによってDNAを沈澱させ、これを遠心によって回収した。DNAを個別管内で500μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液(New EnglandBiolabs T4 DNAリガーゼ緩衝液=50mMトリス−HCl pH7.8、10mM MgCl2、10mMジチオトレイトール、1mM ATP、25μg/μl BSA)中に再懸濁させ、3,000UのT4 DNAリガーゼ(New England Biolabs, #202)を添加した。両連結反応混合物を16℃で一晩、次いで72℃で20分間インキュベートした。
【0027】
次に、自己連結したBstゲノムDNAを、DNAポリメラーゼ遺伝子の3′末端を位置決めする逆PCR反応において鋳型として用いた。上述のように消化し、かつ自己連結させたDNA各10ng、200μM dNTP、50ngの順方向(forward)プライマー[5′GATTTAGCGGCACGGCTGAAAGAA3′(配列番号5)]及び50ngの逆方向(reverse)プライマー[5′CTGCAAAACTGCGGACGTTGA3′(配列番号6)]を49.5μlのThermoPol緩衝液(New EnglandBiolabs ThermoPol緩衝液=10mM KCl、20mMトリス−HCl pH8.8@25℃、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100)に加えたものを用いて、個別管内でPCR反応を生起させた。順方向及び逆方向プライマーはBstゲノムDNAに、互いから55塩基対離隔してアニールし、これらのプライマーはDNAを反対方向へ伸長させるように設計してある。
【0028】
プライマー設計の基としたDNA配列はBst DNAポリメラーゼI遺伝子の、予めpGEM−Tベクター[Promega, #A362A(Promega, Madison, Wisconsin)]中へクローニングし、かつ配列決定した(Sanger等, PNAS 74, pp.5463−5467, 1977; この開示は本明細書中に参考として含まれる)642塩基対断片に由来した。各反応混合物に2.5UのTaq DNAポリメラーゼ[Perkin Elmer, N801−0046(Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey)]を添加し、最終体積を50μlとした。上述のものと同じ反応混合物中に各鋳型を10ngずつ用いて、付加的な4種のPCR反応も生起させた。しかし、これらの反応では、2種のプライマーの各一方を2種のDNA鋳型のそれぞれと共にインキュベートした(4種の反応)。これらの反応の生成物は、2箇所における同一プライマーアニーリング及び前記2箇所の間の領域の増幅によって創出されるバックグラウンドを表わす。
【0029】
いずれのPCR反応でも、最初のセグメントは94℃で2分間のサイクル1回から成った。後続PCRセグメントはそれぞれ、94℃で0.5分間、62℃で1分間及び72℃で2分間のサイクル20回、並びに94℃で0.5分間、62℃で1分間及び72℃で4分間のサイクル10回から成った。最後のセグメントは、72℃で2分間及び25℃で10分間のサイクル1回から成った。各50μl反応混合物から20μlを取り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けて増幅が生起したかどうかを判定した。Sau3AIで消化し、かつ自己連結させたBst DNAを鋳型として用いた反応混合物では、約1.5kbの大きさの増幅断片が得られた。NgoMIで消化し、かつ自己連結させたBst DNAを鋳型として用いた反応混合物では、約0.95kbの大きさの増幅断片が得られた。これら二つの断片は、4種のバックグラウンド反応で創出されたいずれの断片にも対応しなかった。
【0030】
順方向プライマーと逆方向プライマーとの両方を用いて2種の鋳型を別個に増幅するPCR反応を繰り返した。前回と同じPCR条件を用いたが、いずれの反応も8個の個別管内で、体積50μlの反応混合物中に同等の試薬を用いて生起させた。総量400μlの各反応混合物を、エチジウムブロミド存在下にTAE緩衝液(40mMトリス−酢酸、1mM EDTA)中の1%低温融解アガロースゲル上で行なうアガロースゲル電気泳動に掛けた。適当なバンド(Sau3AIの場合1.5kb、NgoMIの場合0.95kb)を切り取り、別個の管内で65℃に加熱した。アガロースが融解した後、50μlのβ−アガロースI緩衝液(New England Biolabs β−アガロースI緩衝液=10mMビストリス−HCl pH6.5、1mM Na2EDTA)を添加し、管を40℃に冷却した。各反応混合物に4Uのβ−アガロースI(New England Biolabs, #392)を添加した。β−アガロースI処理は40℃で1時間行なった。β−アガロース及びDNAポリメラーゼをフェノール(1回)及びクロロホルム(2回)での抽出によって除去した。50μlの3M酢酸ナトリウム及び1,000μlの95%エタノール/5%イソプロパノールを添加することによってDNAを沈澱させ、これを遠心によって回収した。各DNAペレットを50μlの1×TE(10mMトリス−HCl pH8.0、1mM EDTA)中に再懸濁させ、1μl試料をアガロースゲル電気泳動に掛けてDNA濃度を測定した。両DNA断片を、DNAをポリメラーゼ遺伝子の3′末端方向へ伸長させると考えられる順方向プライマーを用いて配列決定した(Sanger等, PNAS 74, pp.5463−5467, 1977; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。NgoMIで消化し、かつ自己連結させた配列中の180塩基対の位置に終結コドン(TAA)を見出した。
【0031】
2. Bst Pol I遺伝子の増幅
2μgのBst DNAポリメラーゼIをトリス−トリシン10→20%勾配ポリアクリルアミドゲル(Novex, San Diego, California)上での電気泳動に掛け、電気ブロット(electroblot)した(Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, pp.10035−10038, 1987; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。膜をクーマシーブルーR−250で染色し、約97kDaのタンパク質のバンドを切り取り、連続的に分解(sequential degradation)した(Waite−Rees等, J. Bacteriol. 173, pp.5207−5219, 1992; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。97kDaタンパク質の最初の7残基はMet−Lys−Lys−Lys−Leu−Val−Leu(配列番号7)に対応した。プライマーは、Bst DNAポリメラーゼIのN末端アミノ酸配列[5′WTGAARAARAARCTNGTNYT3′(配列番号8)]と、逆PCRから得られた遺伝子の3′末端の配列[5′TCTTATTTNGCATCATACCATGT3′(配列番号9)]とに基づき設計した。150ngのBstゲノムDNAと、100pmolの各プライマーと、200μM dNTPとを98μlのThermoPol緩衝液に添加した。1μl(5U)のTaq DNAポリメラーゼ及び1μl(0.05U)のDeep Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs, #258)を添加してPCR反応(94℃で0.5分間、45℃で1分間及び72℃で3分間のサイクル35回)を開始させた。15μlを取り分け、エチジウムブロミド存在下でのアガロースゲル電気泳動に掛けた。Bst DNAポリメラーゼI遺伝子の予測される大きさに対応する2.6kbの断片が増幅された。残りの85μlを、エチジウムブロミド存在下にTAE緩衝液中の1%低温融解アガロースゲル上で行なうゲル電気泳動に掛け、2.6kb断片を切り取った。DNAを含有する切片をβ−アガロースIで処理し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール及び酢酸ナトリウムで沈澱させ、これらの操作はいずれも先に述べたように行なった。DNAペレットをTE緩衝液中に再懸濁させた。2.6kb断片の制限マッピングを行なって、完全な断片のベクター中へのクローニングを可能にするプライマーの設計がそれによって可能となる単一の制限部位の存在を確認した。NcoI、NotI及びXbaIがDNA断片を切断しなかったので、断片の3′末端にアニールする、NcoI及びNotI部位を有する第一のプライマー[5′TCCATGGCGGCCGCTCTTATTTNGCATCATACCATGT3′(配列番号10)]と、断片の5′末端にアニールする、XbaI部位を有する第二のプライマー[5′ATTCTAGAGGAAACAGACCWTGAARAARAARCTNGTNYT3′(配列番号11)]との二つのプライマーを設計した。2.6kb断片の増幅に用いたのとまさに同じ条件下に、ただし本来のプライマーを上記制限酵素部位を有するプライマーに置き換えてPCR反応を生起させた。総量600μlのPCR反応混合物を収容した同等の管を6本用いた。
【0032】
総ての600μl混合物を1%低温融解アガロースゲル上でのゲル電気泳動に掛け、2.6kbの増幅DNA断片をゲルから切り取った。アガロース中に埋まったDNAを1mlのNEBuffer 2(New England Biolabs NEBuffer 2=10mMトリス−HCl、10mM MgCl2、50mM NaCl、1mM DTT; pH7.9@25℃)に対し、4℃で45分間透析した。次に、アガロースを新しい管に入れ、65℃で10分間融解させた。融解したアガロースゲルを37℃に冷却し、7μlの10mg/mlのBSA、3.5Uのβ−アガロースI(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)及び100UのXbaI(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)を添加した。37℃で1時間インキュベートした後、pH8.0の5M NaCl及び1Mトリスを添加して、NaCl及びトリスの最終濃度をそれぞれ100mM及び50mMとした。その後、XbaI消化物に100UのNotI(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)を添加し、37℃で更に1時間インキュベートした。T7プロモーターを含有するpET−21a(Novagen,Madison, Wisconsin)1μgを45μlのNEBuffer 2(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)中で37℃で1時間、25UのNotI及び50UのXbaIで消化した。先に述べたのと同様に、反応混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈澱させ、60μlの1×TE中に再懸濁させた。400ngのXbaI/NotI消化PCR生成物を45μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液中で100ngのXbaI/NotI消化pET−21aに連結させた。5,000UのT4 DNAリガーゼを添加して最終体積を50μlとし、反応混合物を16℃で4時間インキュベートした。
【0033】
100μlのCaCl2コンピテント(Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982; この開示は本明細書中に参考として含まれる)RRI細胞(New England Biolabs)を10μlの連結混合物で形質転換し、アンピシリン(100μg/ml)を含有するLB(ルリアブロス; 1l; トリプトン10g、酵母抽出物5g、170mM NaCl、0.5mMグルコース、0.5mM MgCl2; pH7.2)プレート上で37℃で一晩インキュベートした。コロニーを採取し、2.6kb挿入物に関してミニプラスミド調製物(Wizard Minipreps; DNA精製系; Promega, Madison, Wisconsin)でスクリーニングした。スクリーニングした38個の形質転換体中5個が適正な挿入物を有し、これら適正な挿入物を有する形質転換体のうちの1個から得た1μlのミニプレップDNAを用いて、IPTGで誘導されるとT7 RNAポリメラーゼを産生し得るCaCl2コンピテントER2169細胞(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)50μlを形質転換した。細胞をアンピシリン(100μg/ml)含有LBプレート上に播種し、37℃で一晩インキュベートした。一つのコロニーを採取し、20mlのアンピシリン(100μg/ml)含有LB中でKlett 200の読み取りができるまで37℃で増殖させた。IPTGを最終濃度0.5mMとなるように添加し、細胞を37℃で更に2時間増殖させた。細胞を遠心によって回収し、10mlの音波処理緩衝液(50mM NaCl、10mMトリス pH7.4、0.1mM EDTA、1mM 2−メルカプトエタノール)中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させた。溶解物を遠心によって分離し、かつ65℃で20分間インキュベートして、大腸菌宿主細胞に由来するDNAポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によってペレット化し、上清をBst DNAポリメラーゼI活性に関して、プライミングされた(primed)M13mp18(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)の一本鎖DNA中への3H dTTPの取り込みを定量することによってアッセイした。5μlの上清を、2.86mMの、プライマー#1224(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)をアニールされたM13一本鎖DNA、200μM dATP、dCTP、dGTP、100μM 3H dTTP、100μg/ml BSA、20mMトリス pH8.8、50mM KCl及び10mM MgCl2を含有するBstポリメラーゼアッセイ混合物45μlと共に65℃で5分間インキュベートした。40μlの反応混合物を濾紙(Whatman, 024−1030)にスポットし、濾紙を10%トリクロロ酢酸で3回、100%イソプロパノールで1回洗浄した。濾紙を乾燥し、3H dTTPの取り込みを液体シンチレーション計数によって定量した。1gの誘導ER2169細胞が約30,000UのBst DNAポリメラーゼIを産生することが確認された。
【0034】
実施例2
Bst大断片をコードする5′末端切頭型Bst Pol I遺伝子のクローニング
1. Bst L. F.のN末端境界(border)のズブチリシンでの解明
50μgのBst DNAポリメラーゼIを、140mM K2PO4、3mMβ−メルカプトエタノール、30mM硫酸アンモニウム、及び125μgの仔ウシ胸腺DNAの存在下に室温で5分間ズブチリシン(最終濃度75ng/μl)で消化した。フェニルメチルスルホニルフルオリドを2.4mg/mlの最終濃度で添加することによって消化を停止した。得られたズブチリシン消化BstL. F.を4→20%勾配SDS−PAGEゲル(Daiichi Integrated Separation Systems, Natick, Massachusetts)上での電気泳動によって定量した。2μgのズブチリシン消化BstポリメラーゼIを、トリス−トリシン10→20%勾配ポリアクリルアミドゲル(Novex, San Diego, California)上での電気泳動に掛け、電気ブロットした(Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, pp.10035−10038, 1987; この開示は本明細書中に参考として含まれる)。この67kDa大断片のN末端アミノ酸配列を先に述べたように決定した。67kDaタンパク質の最初の7残基はAla−Glu−Gly−Glu−Lys−Pro−Leu(配列番号12)に対応し、このことはBst L. F.のN末端境界がAla289とAla290との間であることを示している(図2)。この情報に基づき、Bst L. F.の境界の下流にアニールするプライマー[5′AATTTGCGCAGAAGGGGAGAAACCGCTTGA3′(配列番号13)]を設計した。このプライマーはFspI切断部位を有するように設計したので、FspIで消化してpMAL−c2ベクターのXmnI部位に連結させることができた。Bst Pol I遺伝子の3′末端にアニールする、XbaI切断部位を有する別のプライマー[5′TATTCTAGATCTTATTTGGCATCATACCATGT3′(配列番号14)]も設計した。
【0035】
PCRを生起させて、Bst大断片遺伝子を増幅した。392μlのThermoPol緩衝液に400ngの各プライマー及び200μM dNTPを加えたものに1.6μgのBstゲノムDNAを添加した。反応混合物に、40UのTaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer, Branchburg, New Jersey)及び0.4UのDeep Vent DNAポリメラーゼ(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)を添加した。PCRは、94℃で0.5分間、50℃で1分間及び72℃で3分間生起させるサイクルを18回実施した。Bst大断片遺伝子の予測される大きさに対応する1.8kb断片が増幅された。残りのPCR生成物を精製し、FspI及びXbaIで切断した。195ngのFspI/XbaI消化PCR生成物を45μlのT4 DNAリガーゼ緩衝液(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)中で75ngのXmnI/XbaI消化pMAL−c2に連結させた。5,000UのT4 DNAリガーゼを添加し、反応混合物を16℃で4時間インキュベートした。100μlのCaCl2コンピテント(Maniatis等, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 1982; この開示は本明細書中に参考として含まれる)RRI細胞(New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)を10μlの連結混合物で形質転換し、アンピシリン(100μg/ml)を含有するLBプレート上で37℃で一晩インキュベートした。適正な挿入物をミニプラスミド調製物でスクリーニングした。スクリーニングした16個の形質転換体中2個が予測された1.8kb挿入物を有した。クローニングした遺伝子を、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードするpMAL−c2 malE遺伝子(大腸菌由来)の下流に直接挿入し、それによってIPTGで誘導すればMBP−Bst L. F.融合タンパク質が発現されるようにした。正しく構築した組み換えプラスミドを用いて、50μlのCaCl2コンピテントTB1細胞(New England Biolabs,Beverly, Massachusetts)を形質転換した。形質転換プレートから得た単一コロニーを20mlのアンピシリン(100μg/ml)含有LBに接種した。培養がKlett 200に到達した時IPTGを濃度0.5mMとなるように添加し、細胞を37℃で更に2時間増殖させた。
【0036】
細胞を遠心によって回収し、10mlの音波処理緩衝液中に再懸濁させ、音波処理によって溶解させた。溶解物を遠心によって分離し、かつ65℃で20分間インキュベートして、宿主細胞に由来するDNAポリメラーゼを変性させた。変性タンパク質を遠心によってペレット化し、上清をBstポリメラーゼ活性に関して実施例1に述べたようにアッセイした。1gの形質転換TB1細胞が約130,000UのBst大断片を産生することが確認された。Bst L. F.を有する融合構築物のサンプルを、ブダペスト条約に基づき1995年8月2日付でAmerican Type Culture Collectionに寄託し、ATCC受託番号第69877号を付与された。
【0037】
実施例3
Bst DNAポリメラーゼ大断片の精製
ステップ5以外、いずれのステップも4℃で実施した。
【0038】
ステップ1: 粗抽出物の調製
64gの酵素保持(bearing)細胞(NEB #956)を解凍し、緩衝液C(200mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.4、1mMEDTA、1mM DTT)中に再懸濁させた。細胞を8分間の音波処理によって破壊した。抽出物を4℃において、Beckman J2−21遠心機で12,000rpmで30分間遠心した。デカンテーションによって上清を分離した。
【0039】
ステップ2: アミロースアフィニティークロマトグラフィー
ステップ1で得た上清を、緩衝液Cで平衡させた200ml容アミロース(NEB #800−21)カラムに添加した。カラムを2,200mlの緩衝液Cで洗浄し、10mMのマルトースを含有する緩衝液C 800mlで酵素を溶離した。タンパク質ピーク画分をプールし、緩衝液D(500mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.4、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%グリセロール)中への透析で濃縮した。
【0040】
ステップ3: S−100サイズ排除クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Dで平衡させた5cm×90cm S−100(Pharmacia Biotech., Piscataway,New Jersey)カラムに添加した。2,000mlのS緩衝液の添加によって酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGEによって確認し、プールし、緩衝液E(50mM NaCl、20mMトリス−HCl pH7.8、0.1mM EDTA、1mM DTT)中へ透析した。
【0041】
ステップ4: Xa因子プロテアーゼによる融合タンパク質の切断
前ステップで得られた酵素200mg(150ml中)を2mgのXa因子(New England Biolabs #800−10)と共に4℃で22時間インキュベートした。
【0042】
ステップ5: Xa因子への熱負荷付与(heat−stressing)
ステップ4で得られた切断生成物150mlに、65℃で20分間のインキュベーションと、続く4℃への冷却とによって熱負荷を付与した。
【0043】
ステップ6: Source−Qイオン交換クロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を、緩衝液Eで平衡させた1.6cm×10cmSource−Q(Pharmacia Biotech., Piscataway, New Jersey)カラムに添加した。上記と同じ緩衝液中で、150mlの50→600mM直線勾配NaClで酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGEで確認し、プールした。
【0044】
ステップ7: ヘパリン−TSK 5PWガードレジンカラムクロマトグラフィー
前ステップで得られた貯溜物を7倍容量の20mM KPO4(pH6.9)、0.1mM EDTA、1mM DTTで稀釈し、緩衝液G(50mM NaCl、20mM KPO4 pH6.9、0.1mM EDTA、1mM DTT)で平衡させた1cm×10cmヘパリン−TSK 5PWガードレジンカラムに添加した。H緩衝液中で、100mlの50→600mM直線勾配NaClで酵素を溶離した。酵素含有画分をSDS−PAGE(図4)で確認し、プールし、20倍容量の貯蔵緩衝液(50mM KCl、10mMトリス−HCl pH7.5、0.1mM EDTA、1mM DTT)に対して透析した。50μlの反応混合物中の1,000単位を最適反応条件下に4時間インキュベートして確認したところ、酵素調製物は実質的に純粋で、他の汚染酵素/タンパク質を含有せず、かつ検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有しなかった。
【0045】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:2631
配列の型:核酸
鎖の数:不明
トポロジー:不明
配列の種類:タンパク質
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置:1..2631
配列
【0046】
【表1】
【0047】
【表2】
【0048】
【表3】
【0049】
【表4】
【0050】
【表5】
【0051】
【表6】
【0052】
配列番号:2
配列の長さ:876
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:タンパク質
配列
【0053】
【表7】
【0054】
【表8】
【0055】
【表9】
【0056】
【表10】
【0057】
【表11】
【0058】
配列番号:3
配列の長さ:21
配列の型:アミノ酸
トポロジー:不明
配列の種類:タンパク質
配列
【0059】
【表12】
【0060】
配列番号:4
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:不明
配列の種類:タンパク質
配列
【0061】
【表13】
【0062】
配列番号:5
配列の長さ:24
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0063】
【表14】
【0064】
配列番号:6
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0065】
【表15】
【0066】
配列番号:7
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:不明
配列の種類:タンパク質
配列
【0067】
【表16】
【0068】
配列番号:8
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0069】
【表17】
【0070】
配列番号:9
配列の長さ:23
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0071】
【表18】
【0072】
配列番号:10
配列の長さ:37
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0073】
【表19】
【0074】
配列番号:11
配列の長さ:39
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0075】
【表20】
【0076】
配列番号:12
配列の長さ:7
配列の型:アミノ酸
トポロジー:不明
配列の種類:タンパク質
配列
【0077】
【表21】
【0078】
配列番号:13
配列の長さ:30
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0079】
【表22】
【0080】
配列番号:14
配列の長さ:32
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列
【0081】
【表23】
【図面の簡単な説明】
【図1】精製したBst DNAポリメラーゼIを分子量標準と共に示す10→20%勾配SDS−PAGEゲルを示す説明図である。
【図2A】Bst DNAポリメラーゼI遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列(配列番号2)を示す。ズブチリシン切断部位を「*」によって示し、またN末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。
【図2B】Bst DNAポリメラーゼI遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列(配列番号2)を示す。ズブチリシン切断部位を「*」によって示し、またN末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。
【図2C】Bst DNAポリメラーゼI遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)及び前記遺伝子がコードするタンパク質配列(配列番号2)を示す。ズブチリシン切断部位を「*」によって示し、またN末端タンパク質配列によって確認されたアミノ酸配列は下線を付して示す。
【図3】 Xa因子によるMBP−Bst L. F.融合タンパク質の切断を示す電気泳動写真である。レーン1〜4は切断されていないS−100貯溜物(それぞれ約2.7、5.4、10.7及び21.4μg)を示す。レーン5〜8は、Xa因子プロテアーゼ(重量比1%)によって4℃で18時間インキュベートして切断された同量の融合タンパク質を示す。レーンMの分子量マーカーは、212、158、116、97.2、66.4、55.6、42.7、36.5、26.6、20.0、14.3及び6.5kDaである。融合タンパク質は約110kDaに対応する。Xa因子プロテアーゼは約39kDaに対応する。Bstポリメラーゼ大断片は約67kDaに対応し、MBP部分は約42.7kDaに対応する。
【図4】 Xa因子による切断後の精製Bst L. F.を示す10→20%勾配SDS−PAGEゲルの電気泳動写真である。レーン1は約4μgの最終精製Bstポリメラーゼ大断片タンパク質を示す。レーン8の分子量マーカーは、212、158、116、97.2、66.4、55.6、42.7、36.5、26.6、20.0、14.3及び6.5kDaである。Bstポリメラーゼ大断片は約67kDaに対応する。
【図5】Bst Pol Iエキソヌクレアーゼの方向性を測定するエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。5′→3′及び3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を、3′末端を3Hで標識し、5′末端を32Pで標識したEcoRI消化pUC19を用いて測定する。pUC19をEcoRIで消化し、4塩基5′突出部を残す。クレノウ断片によって突出部に3H dTTPを取り込ませ、即ち3′末端を3Hで標識する。5′末端は、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより32P−γATPでリン酸化(phosphorolate)する。この二重標識基質を、Bst DNAポリメラーゼI、Vent DNAポリメラーゼ及びTaq DNAポリメラーゼそれぞれと共に65℃で、また大腸菌DNAポリメラーゼIと共に37℃で様々な時間インキュベートする。DNAを10%TCAの添加によって沈澱させ、遠心によって回収する。上清中に存在する酸溶解性の放射能を液体シンチレーションによって定量する。3′末端からの3Hの可溶化は3′→5′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。5′末端からの32Pの放出は5′→3′エキソヌクレアーゼ活性の存在を示す。Bst DNAポリメラーゼ(◇)は3′末端から3Hを除去せず、従って3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を欠如するのでTaq DNAポリメラーゼ(〇)に類似する。
【図6】プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。M13mp18一本鎖DNAを、3′末端にG:Aミスマッチを有するプライマーとアニールした。3′→5′エキソヌクレアーゼを有するVent DNAポリメラーゼはミスマッチのGを効率的に除去してプライマーを伸長させ得、その結果相対ポリメラーゼ活性が高くなる(図6の「Vent(exo+)」)。Taqポリメラーゼは3′→5′エキソヌクレアーゼを有せず、従ってミスマッチを修正できないので、1/5の低い相対ポリメラーゼ活性しか有しない(図6の「Taq」)。Taqポリメラーゼ同様、Bst DNAポリメラーゼも低い相対ポリメラーゼ活性しか有せず、このことは、3′末端が伸長したDNAポリメラーゼであり得るように、ミスマッチのGを除去するのに必要な3′→5′エキソヌクレアーゼ活性を有しないことを示している。
Claims (10)
- 配列番号2の完全なBstI DNA ポリメラーゼをコードする単離されたDNAであって、当該単離されたDNAの発現産物が3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離されたDNA。
- 精製されたBstI DNAポリメラーゼ大断片に対応する発現産物をコードする単離されたDNAであって、当該単離されたDNAが配列番号2のアミノ酸290−876をコードし、当該発現産物が完全なBstIポリメラーゼに存在する5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、当該発現産物が鎖置換活性を有することを特徴とする単離されたDNA。
- 請求項1または2に記載の単離されたDNAを含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 配列番号2の組換えBst DNAポリメラーゼI。
- 配列番号2のアミノ酸290−876を含む組換えBstI DNAポリメラーゼ大断片であって、当該大断片が完全なBstI ポリメラーゼに存在する5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、当該大断片が鎖置換活性を有することを特徴とする組換えBstI DNAポリメラーゼ大断片。
- 融合パートナーと融合している請求項5または6に記載の組換えポリメラーゼを含む融合タンパク質。
- 融合パートナーがマルトース結合タンパク質を含む請求項7に記載の融合タンパク質。
- (a)請求項1または2のDNAを単離する工程、
(b)工程(a)の単離されたDNAを融合パートナーに融合する工程、
(c)工程(b)のDNAをクローニングベクターに挿入する工程、
(d)工程(c)のベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
(e)工程(d)の宿主細胞を発現に適した条件下で培養する工程、および
(f)ハイブリッドポリペプチドを回収する工程
を含む、組換えBstI DNAポリメラーゼ大断片を製造する方法。 - 融合パートナーにコードされるタンパク質が糖結合タンパク質を含む請求項9に記載の方法。
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