JP3453397B2

JP3453397B2 - Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得られる精製耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ

Info

Publication number: JP3453397B2
Application number: JP35575192A
Authority: JP
Inventors: ドナルド・ジー・コーム; フランシーン・パーラー; レベツカ・クセラ; ヒユーミン・コン; ウイリアム・イー・ジヤツク
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1992-12-18
Publication date: 2003-10-06
Anticipated expiration: 2018-10-06
Also published as: DE69232511T2; EP0547359B1; DE69232511D1; EP0547359A1; JPH05328969A; DE547359T1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は極めて耐熱性の酵素に関
する。さらに具体的には、本発明はＰｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ種から得られる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ修復及び
複製に関与する一群の酵素である。大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
のような中温性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離
に関して広範な研究がなされてきた。例えば、Ｂｅｓｓ
ｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５７）２３
３：１７１−１７７及びＢｕｔｔｉｎとＫｏｒｎｂｅｒ
ｇＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６６）２４１：５
４１９−５４２７を参照されたい。

【０００３】大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉから単離されるＤＮＡ
ポリメラーゼの例としては、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、
及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらの
酵素は、例えばニックトランスレーションによるＤＮＡ
の標識化、ｃＤＮＡクローニングにおける第二鎖ｃＤＮ
Ａ合成、及びＤＮＡ合成を含めた組換えＤＮＡ技術への
種々の用途を有する。Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（１９８２）を参照されたい。

【０００４】近年、米国特許第４，６８３，１９５号、
第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号
は、核酸配列を増幅し、検出し及び／又はクローニング
するための方法における上記の酵素の使用を開示してい
る。一般にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる
この方法は、存在する核酸配列を増幅するためにポリメ
ラーゼ、２つのプライマー及びヌクレオチドトリホスフ
エートの使用を必要とする。

【０００５】上記のいくつかのＤＮＡポリメラーゼは、
合成が１塩基対選択段階のみの結果である場合に有する
ものよりはるかに高い正確さでＤＮＡ複製を行なうプル
ーフリーディング機能を提供する３′−５′エキソヌク
レアーゼ活性を有する（Ｂｒｕｔｌａｇ，Ｄ．とＫｏｒ
ｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７
２）２４７：２４１−２４８）。３′−５′プルーフリ
ーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリ
メラーゼは、プルーフリーディング活性を持たないＤＮ
Ａポリメラーゼと比較した場合、実質的に低い塩基取り
込みエラー率を示す（Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２：１８７３−
１８８０）。

【０００６】例えばＴｈｅｒｍｕｓＡｑｕａｔｉｃｕ
ｓのような好熱性細菌からのＤＮＡポリメラーゼの単離
及び精製に関しても研究が行なわれてきた。Ｃｈｉｅ
ｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７６）１
２７：１５５０〜１５５７は、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＹＴ１株から８０℃の至適温度を有するＤＮＡポリメ
ラーゼの単離及び精製を開示している。Ｃｈｉｅｎらの
精製法は、４段階方法を包含する。これらの段階は粗抽
出物の調製、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラ
フィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、及びＤ
ＮＡセルロース上でのクロマトグラフィーを包含する。
Ｋａｌｅｄｉｎ，ら，Ｂｉｏｋｈｙｍｉｙａｙ（１９８
０）４５：６４４〜６５１もＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＹＴ１株細胞からのＤＮＡポリメラーゼの単離及び精製
を開示している。Ｋａｌｅｄｉｎらの精製方法は、６段
階方法を包含する。これらの段階は、粗抽出物の単離、
硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡＥ−セルロースクロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイト上での分画、ＤＥＡ
Ｅ−セルロース上での分画、及び一重鎖ＤＮＡセルロー
ス上でのクロマトグラフィーを包含する。

【０００７】米国特許第４，８８９，８１８号は、一重
鎖ＤＮＡセルロース上でのクロマトグラフィーの代わり
にホスホセルロースクロマトグラフィー工程を加えてＫ
ａｌｅｄｉｎの方法と実質的に同じ方法により調製され
る約８６，０００〜約９０，０００ダルトンの分子量を
有するＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓからの精製耐熱性ＤＮＡ
ポリメラーゼ、即ちＴａｑポリメラーゼを開示してい
る。さらに、欧州特許出願第０２５８０１７号は、上記
のＰＣＲ法に使用するための好ましい酵素としてＴａｑ
ポリメラーゼを開示している。

【０００８】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは５′−３′ポ
リメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機能を有する一
方、３′−５′プルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼ機能を持たないことが研究により示された（Ｌａｗｙ
ｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８
９）２６４：１１，ｐ．６４２７〜６４３７；Ｂｅｒｎ
ａｄ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：２１９）。
その結果、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは塩基取り込み
エラーを起こしやすく、ある種の応用へのその使用を望
ましくないものにしている。例えば、増幅された遺伝子
をクローニングする試みは、遺伝子のいずれかのコピー
が無作為の間違った取り込みによりエラーを含み得るた
め、問題となる。複製サイクルの間にエラーが起こる場
合には（例えば、初期複製サイクルにおいて）、増幅さ
れた全ＤＮＡが間違って取り込まれた塩基を含有し得
る、すなわち、突然変異型遺伝子産物を生じる。さら
に、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼが１００℃で数分以下
の耐熱性を有することが研究により示された。したがっ
て、より高い熱安定性及び関連する３′から５′へのエ
キソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有するＤ
ＮＡポリメラーゼを、科学界は緊急に必要としている。
このような酵素の１つである、海底の熱出口（ｔｈｅｒ
ｍａｌｖｅｎｔｓ）近くの１００℃近くの温度で生育
する原始細菌であるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓからのＤＮＡポリメラーゼが最近単離さ
れ、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローニングされた。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、一般に
入手可能なＤＮＡポリメラーゼよりも高い耐熱性を有す
る３′−５′プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ
活性を示す精製ＤＮＡポリメラーゼを得ること及び生産
することが、当業界では依然として望まれている。この
ような酵素の入手可能性は、上記のＤＮＡポリメラーゼ
法を改良することだろう。さらに、それは、このような
ＤＮＡポリメラーゼが組換えＤＮＡ技術により生産され
た場合には有用であろう。これにより、ポリメラーゼの
高純度の商業的量の生産が可能になるだろう。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の要約本発明により、ＤＮＡの重合を触媒する、Ｐｙｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ種（ｓｐ．）から得られる耐熱性酵素が提供さ
れる。２０１０メートルの海底熱出口から単離された原
始細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得られる耐熱
性酵素は、約９２，０００〜９７，０００ダルトンの見
掛けの分子量、１００℃で約８時間の半減期、及び９５
℃で２３時間の半減期を有するＤＮＡポリメラーゼであ
る。

【００１１】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種から得られる９
２，０００〜９７，０００ダルトンの耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡが単離されたが、これは本
発明の耐熱性酵素を得るための別の手段を提供する。

【００１２】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＤＮＡポリメラー
ゼは、３′−５′プルーフリーディングエキソヌクレア
ーゼ活性を有する。本発明に従って、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓ種ＤＮＡポリメラーゼの３′−５′プルーフリーデ
ィング活性は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから得られるＤ
ＮＡポリメラーゼの２．５倍であることが判明した。そ
の結果、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＤＮＡポリメラーゼ
は、Ｔａｑポリメラーゼのような３′−５′プルーフリ
ーディングエキソヌクレアーゼ機能を持たない耐熱性ポ
リメラーゼよりもはるかに高い正確さを有するにちがい
ない。さらに、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＤＮＡポリメラ
ーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりも、９６℃〜１０３℃
の温度で実施的により高い耐熱性又は半減期を有する。

【００１３】好ましい実施態様の詳細な説明本発明はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＧＢ−Ｄ株から
得られるＤＮＡポリメラーゼである耐熱性酵素に関す
る。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．は、ＷｏｏｄｓＨ
ｏｌｅＯｃｅａｎｏｇｒａｐｈｉｃＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅの深海潜水可能な潜水艦Ａｌｖｉｎを用いてＨｏｌ
ｇｅｒＪａｎｎａｓｃｈが水深，２０１０メートルの
コルテス（Ｃｏｒｔｅｚ）海の海底熱出口から単離し
た。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＧＢ−Ｄ株の試料
（原始細菌ＮＥＢ＃７３２）は、ブダペスト条約下
で、１９９１年１０月１日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託さ
れ、ＡＴＣＣ受託番号第５５２３９号が付与された。

【００１４】この生物Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．
は、６５℃〜１０３℃の生育範囲を有する極めて好熱性
の硫黄代謝性原始細菌である。

【００１５】無傷のタンパク質を回収するために、Ｂｅ
ｌｋｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８
５）１４２：１８１〜１８６（この記載内容は参照とし
て本明細書中に含めるものとする）に記載された技法の
ような任意の好適な技術を用いて増殖させ得る。すなわ
ち、その細胞を、９５℃で２日間、１５ｍｌのネジ蓋付
き試験管中、１０ｍｇ／ｍｌの硫黄及び０．０１Ｍシ
ステインを含有する上記のＢｅｌｋｉｎらが記載の培地
で増殖させる。大量の細胞を必要とする場合には、１リ
ットルのネジ蓋付き瓶を用いて、滅菌後、新鮮な１０ｍ
ｌ培養物を接種して、９０℃〜９５℃で２日間増殖させ
る。

【００１６】細胞増殖後、酵素を単離及び精製するため
の１つの好ましい方法を、以下の多段階方法を用いて成
し遂げる：先ず、凍結している場合には融解し、好適な
緩衝液、例えば緩衝液Ａ（１０ｍＭのＫＰＯ₄緩衝液，
ｐＨ７．４；１．０ｍＭのＥＤＴＡ，１．０ｍＭのベー
タメルカプトエタノール）中に懸濁し、超音波処理し
て、遠心分離する。次に、上清を、Ａｆｆｉｇｅｌｂ
ｌｕｅカラム（Ｂｉｏｒａｄ）のような核酸と結合する
タンパク質に対する高親和性を有するカラムに通す。Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．の上清溶液中に存在する核
酸、及び多数のタンパク質がカラムから素通りし、カラ
ム容量の数倍の量の約７．０のｐＨの低塩緩衝液でカラ
ムを洗浄してそれらの物質を除去する。洗浄後、緩衝液
Ａに溶解した０．１〜２．０ＭＮａＣｌのような直線勾
配で酵素を溶離する。ピークＤＮＡポリメラーゼ活性を
透析し、ホスホセルロースカラムに載置する。このカラ
ムを洗浄し、緩衝液Ａ中の０．１〜１．０ＭＮａＣｌの
ような直線匂配で酵素活性を溶出させる。ピークＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を透析し、ＨＰＬＣモノ−Ｓカラム
（陽イオン交換体）に載置する。酵素を、緩衝液Ａに溶
解した０．０５〜１．０ＭＮａＣｌのような直線勾配で
溶離する。酵素は、この段階で純度約５０％である。

【００１７】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．から得られ
るＤＮＡポリメラーゼの見掛けの分子量は、分子量９
７，４００と定められたホスホリラーゼＢのような公知
の分子量のタンパク質標準と比較した場合、約９２，０
００〜９７，０００ダルトンである。しかしながら、極
度の好熱性細菌であるＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．の
ＤＮＡポリメラーゼは、完全に変性しないために又はそ
の他の固有の特性のために、異常な相対分子量位置に電
気泳動される、と理解されるべきである。本発明の耐熱
性酵素の正確な分子量は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓ
ｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコード配列から確定し
得る。溶離物質の分子量は、任意の方法、例えばタンパ
ク質分子量マーカーを用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確定し得
る。

【００１８】ポリメラーゼ活性は、好ましくはＤＮＡｓ
ｅ処理又は活性化ＤＮＡ中への放射標識デオキシヌクレ
オチドの取り込みにより測定する；その後のＤＮＡ基質
からの非取り込みデオキシヌクレオチドの分離後、ポリ
メラーゼ活性はＤＮＡを含有する酸不溶性画分中の放射
能の量に比例する（Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５８）２３３：１６３．この
記載内容は、参照として本明細書中に含めるものとす
る）。

【００１９】１００℃での本発明のＤＮＡポリメラーゼ
の半減期は約８時間、９５℃では約２３時間である。Ｄ
ＮＡポリメラーゼの熱安定性又は半減期は、ＢＳＡを含
有する反応用緩衝液の存在下で問題の温度で予備インキ
ュベーションして決定し得る。１２時間までの範囲の予
め決めた間隔で、少量のアリコートを取り出し、ＤＮＡ
基質、ｄＮＴＰｓ及びＢＳＡを含有する反応用緩衝液に
添加して、上記の方法を用いてポリメラーゼ活性に関し
てアッセイする。

【００２０】本発明の耐熱性酵素は、この酵素をコード
する遺伝子がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ゲノムＤＮＡ
からクローニングされたものであるので、組換えＤＮＡ
技術により産生してもよい。この遺伝子の部分的ＤＮＡ
配列は、配列番号１として配列表中に記載されている。
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼに関
する完全コード配列は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ，ＮＥＢ＃
７２０中のｐＵＣ１９中の約５ＫｂのＢａｍＨＩ制限断
片から得られる。この大腸菌株は、ブダペスト条約下
で、１９９１年１０月１日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託さ
れ、ＡＴＣＣ受託番号第６８７２３号が付与された。

【００２１】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼのクローニング組換え型のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメ
ラーゼの製造は一般に、以下の工程を包含する：活性型
のポリメラーゼ、即ちその天然型のポリメラーゼ、又は
天然型ポリメラーゼから切断されても切断されなくても
よい、及び、ポリメラーゼ活性に作用しても作用しなく
てもよい他の配列との融合体としてのポリメラーゼ、を
コードするＤＮＡを単離する。次に、該遺伝子は、原核
生物又は真核生物宿主／ベクター系での発現のために適
切な調節配列と操作可能なように結合されても結合され
なくてもよい。ベクターは、好ましくは好適な宿主中で
の形質転換及び保持に必要な全機能をコードし、また、
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ポリメラーゼ発現のため
の選択可能マーカー及び／又は調節配列をコードし得
る。ベクターは、好適な宿主を形質転換するために用い
られる。活性な組換え耐熱性ポリメラーゼは、連続的に
又は発現誘導後に、形質転換された宿主培養により製造
し得る。活性な耐熱性ポリメラーゼは、宿主細胞内か
ら、又はタンパク質が細胞膜を通って分泌される場合に
は培地から回収し得る。

【００２２】上記の工程の各々は多数の方法で達成し得
るが、本発明に従って、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．
ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをクローニング
するために、大腸菌中でのポリメラーゼ自身の調節配列
からのポリメラーゼの発現は高レベルの遺伝子発現を引
き起こす。

【００２３】本発明により、少なくとも１つの介在配列
がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺
伝子内に存在することが発見された。本発明のＰｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓｓｐ．ポリメラーゼＤＮＡ及びタンパク
質配列と、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ及びタンパク質とを比較
して、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓの介在配列が保存されたｐ
ｏｌ αモチーフ領域ＩＩＩ内にあり、配列番号１のヌ
クレオチド１８３９で開始することを確定した。

【００２４】クローニングベクター本発明の実施に有用なベクターは、以下の制御特性のい
くつか又はすべてを提供することによりＰｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓｓｐ．ポリメラーゼの種々の程度の制御発現を
提供する必要がある：（１）ポリメラーゼの開始部に直
接隣接するか又は融合タンパク質としての、転写開始部
位又はプロモーター、（２）遺伝子発現させたり（ｏ
ｎ）止めたり（ｏｆｆ）するために用い得るオペレータ
ー、（３）翻訳を改善するためのリボソーム結合部位、
及び（４）安定性を改善するための転写又は翻訳停止部
位。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ポリメラーゼのクロ
ーニング及び発現に用いられる適切なベクターとして
は、例えばファージ及びプラスミドが挙げられる。ファ
ージの例としては、λｇｔ１１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、λ
ＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＺａｐＩＩ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。プラスミドの例と
しては、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ）、ｐＧＷ７（ＡＴＣＣＮｏ．４０１６６）、
ｐＥＴ３Ａ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ，（１９
８７）５６：１２５〜１３５）、及びｐＥＴ１１Ｃ（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９
０）１８５：６０〜８９）が挙げられる。

【００２５】形質転換及び感染標準プロトコールが、形質転換、ファージ感染及び細胞
培養に関して存在する（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ（１９８２））。プラスミド形質転換
のために用い得る多数の大腸菌株のうち、好ましい株と
しては、ＪＭ１０１（ＡＴＣＣＮｏ．３３８７６）、
ＸＬ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＲＲＩ（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１３４３）、及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓ
Ｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１
９９０），上掲）が挙げられる。大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ
ＸＬ１、ＥＲ１５７８及びＥＲ１４５８株（Ｒａｌｅｉ
ｇｈら，Ｎ．Ａ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８８）１６：
１５６３〜１５７５）は、λファージ用に使用し得る株
であり、Ｙ１０８９はλｇｔ１１溶原性のために用い得
る。Ｙ１０８９における一過性溶原菌を調製する場合
（Ａｒａｓｕら，ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰａｒａｓ
ｉｔｏｌｏｇｙ（１９８７）６４：２８１〜２８９）、
ファージの一回大量投与により又は溶原性宿主との同時
培養により、培養物をλｇｔ１１組換えファージで感染
させる。感染Ｙ１０８９細胞は、好ましくは溶解−欠陥
宿主／ファージ系内で組換えタンパク質の増大を生じさ
せるインデューサーＩＰＴＧの存在下で３７℃で増殖さ
せる。

【００２６】ゲノムＤＮＡライブラリーの作製及び耐熱
性ポリメラーゼのスクリーニングＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子から調製した放射性プローブとの
交差ハイブリダイゼーションによるＰｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓゲノムＤＮＡライブラリーのプロービング（精査）に
より、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子での同定及び単離が可能になった。

【００２７】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡは、
Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９
８２）（この記載内容は、参照として本明細書中に含め
るものとする）が記載した方法により単離し得る。一旦
単離されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡは、無
作為断片又は制限酵素断片としてゲノムライブラリーを
作製するのに用い得る。後者の方法が好ましい。好まし
くは、ＢａｍＨＩ部分は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（上
掲）に記載されているような標準ＤＮＡ制限技術を用い
て、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ゲノムＤＮＡから調
製される。他の制限酵素、例えばＳａｌＩ及びＸｂａＩ
を用いてもよい。

【００２８】本発明に従って抗体又はＤＮＡプローブ
（ＹｏｕｎｇとＤａｖｉｓ，ＰＮＡＳ（１９８３）８
０：１１９４〜１１９８；Ｍａｎｉａｔｉｓら，上掲）
を用いて、プラスミド及びファージをスクリーニングす
るための方法が利用できるけれども、ファージ系は良好
に働く傾向があり、したがって一次ライブラリーに好ま
しいことが判明した。

【００２９】ゲノムライブラリーは、コロニー又はプラ
ークハイブリダイゼーション法（Ｍａｎｉａｔｉｓら，
上掲）を用いて、又は抗体プラーク反応性（Ｙｏｕｎｇ
とＤａｖｉｓ，上掲）を用いてスクリーニングし得る。
コロニー又はプラークハイブリダイゼーション法におい
ては、プローブは、標識化の標準的方法、例えば関連の
ある生物、例えばＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓからのポリメ
ラーゼ遺伝子の無作為プライミング又はニックトランス
レーションにより形成される（Ｍａｎｉａｔｉｓら，上
掲）。ゲノムライブラリーは、所望の厳格さに応じた条
件下で標識プローブを用いてハイブリダイゼーションさ
れる。

【００３０】抗体／プラーク法を用いてゲノム発現ライ
ブラリーをスクリーニングする場合は、Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓｓｐ．調節領域が大腸菌中で機能するか否かが
不明確であるため、λｇｔ１１及びλＺａｐＩＩのよ
うなすべての必要な発現調節領域を供給するファージベ
クターが抗体スクリーニングには好ましい。λＤＡＳＨ
のＢａｍＨＩ部位又はλｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位
中にＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡをクローニン
グすることにより、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ポリ
メラーゼは、λｇｔ１１におけるベータ−ガラクトシダ
ーゼとの融合タンパク質として又はそれ自体の内在性プ
ロモーターから発現され得る。

【００３１】一旦形成されると、発現ライブラリーは抗
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ抗血
清を用いて、又はそれが利用できない場合には密接に関
連した生物（即ち別の極度の耐熱性細菌であるＴｈｅｒ
ｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリ
メラーゼに対する抗体により、ＹｏｕｎｇとＤａｖｉ
ｓ，ＰＮＡＳ（１９８３）（上掲に記載されているよう
な標準抗体プラークハイブリダイゼーション法を用い
て、スクリーニングし得る。

【００３２】いずれかの方法を用いて、一部又は全遺伝
子をコードする、一旦確認されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡを次に、例えばｐＢ
Ｒ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、Ｍ１３又はｐＵＣ
１９中にサブクローニングし得る。所望により、例えば
Ｓａｎｇｅｒジデオキシ鎖終止法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．，Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．＆Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．
Ｒ．ＰＮＡＳ（１９７７）７４：５４６３〜５４６７）
により、ＤＮＡ配列を決定し得る。

【００３３】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡ及びその発現の確認Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼをコ
ードするＤＮＡ配列が得られたということを確定するた
めのいくつかの方法がある。これらの例としては、例え
ば組換えＤＮＡによりコードされるタンパク質の実際の
又は推定上のアミノ−末端配列を天然型のタンパク質と
比較すること、又は組換えＤＮＡが天然型のＰｙｒｏｃ
ｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体
と結合するタンパク質を産生するか否かを測定すること
が挙げられる。さらに、Ｗａｎｇら，ＦＡＳＥＢＪｏ
ｕｒｎａｌ（１９８９）３：１４〜２１による研究は、
ポリメラーゼαファミリーからのＤＮＡポリメラーゼ配
列のある領域がＰｏｌＩ様ポリメラーゼにおける別のグ
ループの保存領域と同様に多数の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）
の間で高度に保存されることを示唆している。その結
果、クローン化遺伝子の推定アミノ酸配列を公知のＤＮ
Ａポリメラーゼ、例えばヒトＤＮＡポリメラーゼα及び
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのアミノ酸配列と比較する
ことにより、これらの領域（ｉｓｌａｎｄｓ）の相同性
の確認により、組換えＤＮＡが実際ＤＮＡポリメラーゼ
をコードするという強力な証拠が提供される。

【００３４】上記のように、本発明に従って、Ｐｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼをコードする
ＤＮＡはｐｏｌ αモチーフ領域ＩＩＩ内にイントロン
すなわち介在配列を含有することが判明した。したがっ
て、大腸菌のような宿主細胞において過発現を増大する
ことを意味するため、イントロンをコードするＤＮＡ配
列を欠失し得る。ＤＮＡ配列を欠失させ、したがってイ
ントロンをｉｎｖｉｔｒｏでスプライシングするため
に用い得る当業者に公知の多数の方法がある。１つの方
法は、スプライス部位又は欠失される領域近くのコード
領域において非反復の制限酵素部位を確認することを包
含する。二本鎖オリゴマーを合成して、２つの制限断片
間のギャップを架橋する。アミノ末端制限断片、架橋オ
リゴ、及びカルボキシ末端制限断片から成る３−部分連
結（３−ｐａｒｔｌｉｇａｔｉｏｎ）により、欠失イ
ントロンをもつ天然型遺伝子が生じる。

【００３５】別の方法は、上記の方法の変法である。イ
ントロン内の、しかしコード配列境界近くに非反復の部
位を有する制限酵素で切断することにより、大部分のイ
ントロンを欠失させる。大部分のイントロンの欠失を含
有する線状プラスミドを一緒に連結する。ｆ１ヘルパー
ファージＩＲ１による重感染により、一本鎖ファージを
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター組換え体から生成す
る。所望の最終配列を有する一本鎖オリゴマーを合成
し、部分的にイントロンを欠失したファージＤＮＡにア
ニーリングする。したがって、残りのイントロンはルー
プが解ける。大腸菌ＣＪ２３６株中で元のファージを産
生することにより、Ｋｕｎｋｅｌの突然変異誘発法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４：
３６７（１９８７））を用いて完全欠失イントロン構築
物を選択し得る。

【００３６】イントロンを欠失させるために用い得るさ
らに別の方法は、ＤＮＡ増幅を用いる。例えば、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９），
Ｖｏｌ．２，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（この記載内容は
参照として本明細書中に含めるものとする）を参照され
たい。すなわち、プライマーを生成して増幅し、次いで
遺伝子のアミノ半分とカルボキシ半分を結合させる。

【００３７】上記の方法を用いてイントロンをｉｎｖ
ｉｔｒｏで欠失させる場合、天然のスプライス部位は不
明である。したがって、当業者は、活性酵素の産生を生
じる、考え得るいくつかの人工的スプライス部位が存在
すると予測するであろう。

【００３８】一旦確認されれば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列
は、欠失イントロンを伴っても伴わなくても、大腸菌に
由来するプラスミド、例えばｐＥＴ３Ａ、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔ又はｐＵＣ１９、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓに由来するプラスミド、例えばｐＵＢ１１
０、ｐＴＰ５及びｐＣ１９４、酵母菌に由来するプラス
ミド、例えばｐＳＨ１９及びｐＳＨ１５、λファージの
ようなバクテリオファージ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのような細菌、レトロウイ
ルスのような動物ウイルス、並びにＢａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓのような昆虫ウイルスといった適切な発現ベクター
中にクローニングされ得る。

【００３９】形質転換及びファージ感染のための標準技
術を用いて、組換えベクターを適切な宿主中に導入す
る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，ＰＮＡＳ（１９７
２）６９：２１１０（この記載内容は参照として本明細
書中に含めるものとする）により記載されたような塩化
カルシウム法は、大腸菌のために用いる。桿菌Ｂａｃｉ
ｌｌｌｕｓの形質転換は、Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ（１９７９）１６８：１１１（この記載内容は参照と
して本明細書中に含めるものとする）の方法に従って実
施する。酵母菌の形質転換は、Ｐａｒｅｎｔら，Ｙｅａ
ｓｔ（１９８５）１：８３〜１３８（この記載内容は参
照として本明細書中に含めるものとする）の方法に従っ
て実施する。ある種の植物細胞は、Ｓｈａｗ，Ｃ．Ｈ．
ら，Ｇｅｎｅ（１９８３）２３：３１５（この記載内容
は参照として本明細書中に含めるものとする）により記
載された方法に従って、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換される。動物細胞の
形質転換は、例えばＶｉｒｏｌｏｇｙ（１９７３）５
２：４５６（その記載内容は参照として本明細書中に含
めるものとする）に記載の方法に従って実施する。Ｂａ
ｃｕｏｌｖｉｒｕｓによる昆虫細胞の形質転換は、例え
ばＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：４７
（その記載内容は参照として本明細書中に含めるものと
する）に記載の方法に従って実施する。

【００４０】使用する宿主細胞に応じて、このような細
胞に適した標準技術を用いて、形質転換体を培養する。
例えば、大腸菌を培養するためには、３０〜４２℃でＬ
Ｂ培地中で中間対数増殖期又は静止期まで細胞を増殖さ
せる。

【００４１】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼは、例えば培養細胞又は培養溶液からの抽出に
より形質転換宿主細胞の培養物から単離及び精製し得
る。

【００４２】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼが培養細胞から抽出される場合、当業界で公知
の方法、例えば遠心分離により、培養後に細胞を採集す
る。次に、採集細胞を適切な緩衝溶液中に懸濁し、超音
波処理、リゾチーム及び／又は凍結融解により破砕す
る。遠心分離及び／又は濾過により、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼを含有する粗抽出物が
得られる。

【００４３】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼが培養溶液中に、即ち単独で又はマルトース結
合タンパク質のような分泌タンパク質との融合タンパク
質として、分泌される場合は、当業界で公知の方法、例
えば遠心分離により、上清を細胞と分離する。

【００４４】培養上清又は細胞抽出物中に含有されるＰ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼの分離
及び精製は、上記の方法により、又は公知の分離及び精
製法を適切に組み合わせて実施し得る。これらの方法と
しては、例えば塩沈殿及び溶媒沈殿のような溶解性を利
用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過及びＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利
用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのよ
うな電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマト
グラフィーのような特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用
する方法、並びに等電点電気泳動のような等電点の差を
利用する方法が挙げられる。

【００４５】組換え体酵素を単離及び精製するための１
つの好ましい方法は、以下のような多段階工程を用いて
達成される：先ず、細胞を、凍結している場合には融解
して、好適な緩衝液、例えば緩衝液Ａ（１００ｍＭＮ
ａＣｌ、２５ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００）中に懸濁し、溶解して、遠心分離す
る。次に透明な粗抽出物を約３０分間、７５℃に加熱す
る。変性タンパク質を遠心分離で除去する。次に上清
を、核酸と結合するタンパク質に対して高親和性を有す
るカラム、例えばＡｆｆｉｇｅｌＢｌｕｅカラム（Ｂ
ｉｏｒａｄ）に通す。カラム容量の数倍量の約７．０の
ｐＨの低塩緩衝を用いてカラムを洗浄することにより、
上清溶液中に存在する核酸及び多数のタンパク質がカラ
ムを素通りし、それにより除去される。洗浄後、酵素を
０．１Ｍ〜１．５ＭのＮａＣｌ緩衝液Ａのような線状勾
配でＤＮＡポリメラーゼ活性を溶離する。活性画分をプ
ールし、透析して、ホスホセルロースカラムに載置す
る。カラムを洗浄し、ＤＮＡポリメラーゼ活性を、緩衝
液Ｂ（１００ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭＫＰＯ₄、
０．１ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ６．８）に溶解した
１．０〜１．０ＭＮａＣｌの線状勾配で溶離する。画
分を採集し、ＢＳＡを各画分に添加する。ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する画分をプールする。得られたＰｙｒ
ｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼを、上記の
標準生成物精製法を用いてさらに精製する。

【００４６】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼの安定化及びその用途長期保存のために、本発明の耐熱性酵素は、以下の緩衝
液中に保存する：０．０５ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍ
ＫＰＯ₄（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＤＴＡ及び５
０％グリセロール中に−２０℃で保存する。本発明のＰ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼは、こ
のような酵素が必要な又は望ましい任意の目的のために
用い得る。例えば、ｃＤＮＡクローニングにおける第二
鎖ｃＤＮＡ合成及びＤＮＡ合成を含めた組換えＤＮＡ技
術に用い得る（Ｍａｎｉａｔｉｓら，上掲を参照のこ
と）。

【００４７】本発明のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｄ
ＮＡポリメラーゼは、３′−５′エキソヌクレアーゼ機
能を不活性化するために化学的に又は遺伝学的に修飾し
得るし、このような修飾酵素が望ましい任意の目的、例
えばＤＮＡ合成に用い得る。

【００４８】例えば、遺伝学的修飾Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を無作為に突然変
異誘発し、次にポリメラーゼ活性の損失を伴わずにエキ
ソヌクレアーゼ活性を損失した突然変異体をスクリーニ
ングすることにより、単離し得る。あるいは、遺伝学的
に修飾したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメ
ラーゼは、好ましくはＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ＰＮＡ
Ｓ（１９８５）８２：４８８〜４９２（その記載内容は
参照として本明細書中に含めるものとする）に記載され
た特定部位突然変異法を用いて単離される。

【００４９】さらに、本発明のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼは、例えば米国特許第４，６
８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８
００，１５９号に開示された手法により、ＤＮＡを増幅
するために用いてもよい。

【００５０】

【実施例】以下の実施例は、実施するのが好ましい本発
明の実施態様を説明するために与えられる。これらの実
施例は例示的なものであり、請求の範囲に記載されたも
のを除いて、本発明を限定するものではないと理解され
るべきである。

【００５１】実施例ＩＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種からの耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼの精製Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＧＢ−Ｄ株（ＡＣＴＴ
Ｎｏ．５５２３９）を、９４℃で２日間、８本の１リッ
トル瓶中の１０ｇ／ｌの硫黄元素を含有する、Ｂｅｌｋ
ｉｎら（上掲）により記載された培地中で増殖させた。
細胞を室温に冷却し、未使用硫黄を捨てて分離し、遠心
分離により採集して、−７０℃で保存した。細胞の収率
は１．４ｇ／ｌであった。

【００５２】上記のようにして得られた１１．５ｇの細
胞を、０．１ＭのＮａＣｌを含有する２８ｍｌの緩衝液
Ａ（１０ｍＭＫＰＯ₄緩衝液，ｐＨ７．４；０．１ｍ
ＭＥＤＴＡ，０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノー
ル）に懸濁して、４℃で５分間、超音波処理した。溶解
物を１５，０００ｇで４℃で３０分間遠心分離した。上
清溶液を１８ｍｌのＡｆｆｉｇｅｌｂｌｕｅカラム
（Ｂｉｏｒａｄ）に通した。次に、カラムを、０．１Ｍ
ＮａＣｌを含有する５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。
カラムを、緩衝液Ａに溶解した３００ｍｌの０．１〜
２．０ＭＮａＣｌの線状勾配で溶離した。ＤＮＡポリ
メラーゼは、約１．３ＭＮａＣｌで単一ピークとして
溶離し、適用した活性の９０％を示した。ＤＮＡポリメ
ラーゼ（２５ｍｌ）のピーク活性を、１００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含有する１リットルの緩衝液Ａに対して透析し、
次に、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａで平衡
化した１５ｍｌのホスホセルロースカラムに載置した。
カラムを、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ
５０ｍｌで洗浄し、緩衝液Ａに溶解した０．１〜１．０
ＭのＮａＣｌの線状勾配２００ｍｌを用いて酵素活性を
溶離した。活性は０．６ＭＮａＣｌの位置で単一ピー
クとして溶離し、適用した活性の７０％を示した。プー
ルした活性（４２ｍｌ）を５００ｍｌの緩衝液Ａに対し
て透析し、２５ｍｌのＤＥＡＥカラムに載置した。カラ
ムを、０．１ＭＮａＣｌを含有する緩衝液Ａ５０ｍ
ｌで洗浄し、酵素活性の２／３がカラムを素通りした。
活性画分をプールし（３０ｍｌ）、１．０ｍｌのＨＰＬ
Ｃモノ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に載置して、
０．０５〜１．０ＭＮａＣｌの緩衝液Ａ中の線状勾配
１００ｍｌで溶離した。活性は０．２２ＭＮａＣｌで
単一ピークとして溶離し、適用した活性の８０％を示し
た。

【００５３】精製Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ポリメ
ラーゼを、前記のようＳＤＳ１０〜２０％ポリアクリ
ルアミドゲル中で電気泳動し、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢ
ｌｕｅ又はコロイド染色（ＩＳＳＰｒｏｂｌｕｅ）で
染色して、タンパク質を検出した。わずかに染まったタ
ンパク質バンドが、約９２，０００〜９７，０００ダル
トンで観察された；この分子量測定は、同一ゲル上で以
下のマーカータンパク質（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）：ミオシン２
００，０００ダルトン；ホスホリラーゼＢ９７，４０
０ダルトン；ＢＳＡ６８，０００ダルトン；卵白アル
ブミン４３，０００ダルトン；カルボン酸アンヒドラ
ーゼ２９，０００ダルトン；ｂ−ラクトグロブリン
１８，４００ダルトン；リゾチーム１４，３００ダル
トンの移動と比較して得られた。

【００５４】実施例ＩＩＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子のクローニングＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子から調製した放射性プローブを用
いたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムＤＮＡライブラリーの
交差ハイブリダイゼーションにより、Ｐｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの同定及び
単離が可能になった。これは、下記のようにして達成さ
れた。

【００５５】制限酵素がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムラ
イブラリーの調製に最も有用であることを確定するため
に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡを、Ｅｃｏ
ＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで完全に切断し
た。このＤＮＡを、、以下のように調製したＤＮＡプロ
ーブを用いてアガロースゲル電気泳動し（図１のＡ）、
かつサザーンハイブリダイゼーションに掛けた（図１の
Ｂ）。市販のランダムプライミングキット（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）中に鋳型と
してＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｂｐ１〜１２７４。バクテ
リオファージＮＥＢ＃６１８，ＡＴＣＣＮｏ．４０７
９４から得られる）の第一ＥｃｏＲＩ断片約１μｇを含
有する反応混合物を３７℃で１時間インキュベートし
て、高い特異活性を有するＤＮＡプローブを精製した。
プローブを、中等度に厳格な条件（ハイブリダイゼーシ
ョン：５０℃，４× ＳＥＴ，０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム，ｐＨ７，０．１％ピロリン酸ナトリウム，０．１
％ＳＤＳ，１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液で一夜；洗浄条
件；３×２０〜３０分，４５℃，０．１×ＳＥＴ，０．
１Ｍリン酸ナトリウム，ｐＨ７，０．１％ピロリン酸ナ
トリウム，０．１％ＳＤＳ。Ｍａｎｉａｔｉｓら上掲）
下で上記で調製したＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮ
Ａに対してハイブリダイゼーションした。約５Ｋｂの単
一主バンドが、ＢａｍＨＩで切断したＰｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓＤＮＡで検出された。ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩはこのプローブを用いて多数のバンドを示した
が、これはこれらの酵素がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓポリメ
ラーゼ遺伝子内で切断されたことを示す。

【００５６】これらの結果に基づいて、ファージベクタ
ーλＤＡＳＨ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｂａ
ｍＨＩゲノムライブラリーを作製した。Ｐｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓＤＮＡの部分的及び完全ＢａｍＨＩ消化物を調製
した。部分的及び完全ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡの混合物
を、λＤＡＳＨのＢａｍＨＩ部位に連結した。この連
結混合物をメーカーの指示に従ってＧｉｇａｐａｃｋ
Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージ
ングし、大腸菌ＥＲ１４５８上にプレーティングした。
パッケージングしたファージライブラリーは、１ｘ１０
⁶ファージ／ｍｌを含有した。

【００５７】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子（ＮＥＢ＃６１９，ＡＴＣＣＮｏ．４０７
９５から入手可能）の３つの断片（配列番号２，ｂｐ
１〜１２７４，１６５６〜２６６０及び３０６９〜３７
３７）の³²Ｐ−標識ＤＮＡプローブを、ランダムプライ
マーキット（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．）を用いて調製した。プローブをＢｅｎｔ
ｏｎ＆Ｄａｖｉｓの方法に従って用いて（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、上掲）、上記のハイブリダイゼーション条
件を用いて、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓゲノムライブラリー
をスクリーニングした。約１％のプラークが陽性であっ
て、１０個の陽性プラークを摘み取って、３回再感染及
び再プレーティングして（９０〜１００％のプラークが
各々の単離物に関して陽性になるまで）精製した。ファ
ージの平板溶解物（Ｍａｎｉａｔｉｓ，上掲）を各単離
物から調製し、これを用いて大腸菌培養物を感染させ
た。０．１ｍｌの各平板溶解物を０．２ｍｌの細胞と混
合した（ＯＤ６００：２）。細菌細胞を溶解直前に収
穫し、０．０５ＭＮａＣｌ、０．０１ＭＴｒｉｓ
（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００及び２００μｇ／ｍｌのリゾチー
ム（３容量／細胞容量）中に懸濁し、約１分間、又は細
胞溶解が生じるまで３７℃に加熱した。溶解抽出物をた
だちに７５℃で３０分間加熱し、遠心分離して、上清溶
液を、上記の方法に従って耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活
性に関してアッセイした。１０個の単離物のうち３個は
有意のポリメラーゼ活性を示し、最高の活性を示すクロ
ーン（Ｂ９）をさらに調べた。

【００５８】ファージＤＮＡをＢ９から単離し、挿入Ｄ
ＮＡを制限酵素消化によって調べた。Ｓａ１Ｉによる
消化は、λＤＡＳＨの予測された２本のアーム＋１５Ｋ
ｂ挿入物を生じた。ＢａｍＨＩによる消化は、λＤＡ
ＳＨの２本のアーム＋７、４．８及び３Ｋｂの３挿入断
片を生じた。これらの断片の各々をアガロースゲル電気
泳動により精製し、溶離して、ｐＵＣ１９のＢａｍＨ
Ｉ部位に連結した。連結混合物を用いて、プラスミドが
挿入物を含有する場合に白色コロニーを生じ、指示寒天
培地（Ｘ−ｇａｌ＋ＩＰＴＧ）上に挿入物を含有しない
場合に青色コロニーを与える大腸菌ＥＲ２２０７を形質
転換した。白色コロニー突然変異体は、７Ｋｂ断片を用
いて得た。３つの白色コロニー及び２７の青色コロニー
は４．８Ｋｂ断片を、２０白色及び２１青色コロニー形
質転換体は３Ｋｂ断片を用いて得られた。３つの４．８
Ｋｂ白色コロニー形質転換体はすべて、熱安定なＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を発現した。３Ｋｂ断片を有する形質
転換体はいずれも熱安定なポリメラーゼ活性を発現しな
かった。４．８ＫｂＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＤＮＡ断片
を有する３コロニーはすべて耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
に関してほぼ同一の特異的活性を有し、１つをさらに研
究するために採取した（ＮＥＢ＃７２０）。ＮＥＢ＃７
２０と呼ばれるこのクローンは、ブダペスト条約下で、
１９９１年１０月１日にＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１
ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，
Ｍａｒｙｌａｎｄ）に受託番号ＡＴＣＣＮｏ．６８７
２３として寄託した。ＮＥＢ＃７２０は、ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性１７００単位／細胞１ｇを生じ、この酵素の
大量生産に用いられた。

【００５９】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を含有する４．８ＫｂＢａｍＨＩ断
片の制限エンドヌクレアーゼマップを図２に示す。この
遺伝子の部分ＤＮＡ配列は配列表に配列番号１として記
載されている。本発明のＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．
ポリメラーゼＤＮＡ及びタンパク質配列とＴｈｅｒｍｏ
ｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ
ＤＮＡ及びタンパク質配列とを比較することにより、少
なくとも１つの介在配列がＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子内に存在することを見出した。Ｐｙ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ介在配列は保存されたｐｏｌ αモチ
ーフ領域ＩＩＩ内にあり、配列番号１のヌクレオチド１
８３９で開始する。

【００６０】実施例ＩＩＩ組換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラー
ゼの精製大腸菌ＮＥＢ＃７２０（ＡＣＴＴＮｏ．６８７２３）
を、３７℃で、１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵
母菌抽出物、５ｇ／ｌのＮａＣｌ及び１００ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含有する培地中で２５リットルの発酵槽
内で増殖させ、０．３ｍＭＩＰＴＧを用いて中間指数
増殖期で誘導し、さらに４時間インキュベートした。細
胞を遠心分離により採集して、−７０℃で保存した。

【００６１】９２ｇの細胞を、融解し、緩衝液Ａ（１０
０ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＫＰＯ₄，ｐＨ７．４，
０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００及び２００μｇ／ｍｌリゾチーム）に懸濁して
全容量を３５０ｍｌとした。混合液が極めて粘性になる
まで細胞を３７℃でインキュベートして溶解した（約５
分間）。粗抽出物を直ちに７５℃で３０分加熱した。変
性大腸菌タンパク質を遠心分離により取り出し、上清溶
液をＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの単離に用いた。

【００６２】上清溶液を０．３ＭＮａＣｌ溶液とし、
Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗中に作ったＤＥＡＥセルロースカラ
ム２×３０ｃｍに通して、核酸を除去し、Ａｆｆｉ−Ｇ
ｅｌＢｌｕｅクロマトグラフィーカラム４×１０ｃｍ
（１２５ｍｌ）に通して、０．３ＭＮａＣｌ、０．０
１ＭＫＰＯ₄（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する３００ｍｌ溶液で洗浄し、次いで同一緩衝液
に溶解した０．３〜２．０ＭＮａＣｌの１５００ｍｌ
勾配で溶離した。

【００６３】カラム画分をＤＮＡポリメラーゼ活性に関
してアッセイした。簡単に説明すると、１〜４μｌの画
分を、３０μＭの各ｄＮＴＰ及び³Ｈ−標識ＴＴＰ、
０．５ｍｇ／ｍｌ活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡ及び１００μ
ｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡを含有する５０μｌのＤＮＡ
ポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（２４℃でｐＨ８．８）、１０ｍＭ
（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄及び０．１％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で７５℃で５〜１０分イ
ンキュベートした。アッセイ混合液をＷｈａｔｍａｎ
３ｍｍフィルターにかけて濾液を１０％ＴＣＡで３回、
その後冷エタノールで２回洗浄した。フィルターを乾燥
後、ＤＮＡへの³Ｈ−ＴＴＰ取り込みを示す結合放射能
を測定した。活性画分をプールし、０．１ＭＮａＣ
ｌ、０．０１ＭＫＰＯ₄（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡに対して透析し、次いでホスホセルロースカ
ラム４×１２ｃｍ（１５０ｍｌ）に通して、カラムを同
一緩衝液３００ｍｌで洗浄し、０．１〜１．５ＭＮａ
Ｃｌの線状勾配で溶離した。活性画分をプールし、等容
量のＨ₂Ｏで希釈し、１．０ｍｌのＰｈａｒｍａｃｉａ
ＨＰＬＣＭｏｎｏＱカラムに通して、０．０５〜
１．０ＭＮａＣｌの線状勾配６０ｍｌで溶離した。活
性画分をプールし、−２０℃で保存した。Ｐｙｒｏｃｏ
ｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｏｏｍａｓ
ｓｉｅＢｌｕｅ染色ゲルの肉眼的評価により測定した
場合にこの段階で純度約５０％であって、７０，０００
〜１００，０００単位／ｍｇのＤＮＡ合成に対する特異
的活性を有し、粗抽出物中に存在する酵素活性の８％を
示した。精製ポリメラーゼは実質的に汚染ＤＮＡ及び汚
染ヌクレアーゼを含有しなかった。

【００６４】ＤＮＡポリメラーゼ活性は、図３の９２，
０００〜９７，０００ＫｄのＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌ
ｕｅ染色の主バンドに対応した。これは、以下の方法で
測定される。ＳＤＳ１０〜２０％ポリアクリルアミド
ゲルにおける電気泳動後及びＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌ
ｕｅでの染色前に、ゲルを、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
に一夜浸漬して、２００ｍｌづつ３回取り換えて、ゲル
からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を除去し、それ
を非イオン洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と置換する。
最終洗浄後、ゲルを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に２
時間浸して、次に紙タオルで手短に乾かし、ガラス板上
に広げる。ゲルをＷｈａｔｍａｎＮｏ．５４濾紙片で
被い、³²Ｐ−ｄＣＴＰ（１０〜２０×１０⁶ｃｐｍ／μ
ｍｏｌｅ）を含有する０．３ｍｌのアッセイ緩衝液を濾
紙中央に添加した。液体を濾紙の縁に向けて拡散させた
後、第二のガラス板を濾紙の上に置き、ガラス−ゲル−
濾紙−ガラスサンドイッチをテープで一緒にぴったり貼
り付けて、７５℃で６０分間インキュベートした。濾紙
をゲルからはずして、１ｍＭｄＣＴＰを含有する１０
％ＴＣＡで３回（３０分づつ洗浄）、イソプロパノール
で２回洗浄した。濾紙を風乾し、Ｘ線フィルムに一夜露
出させた。現像した場合に、フィルム上の黒点は染色ゲ
ル上の９２，０００〜９７，０００ＫｄＣｏｏｍａｓ
ｓｉｅＢｌｕｅバンド上に二重焼き付けされるが、こ
れは図３のゲル上の主バンドがＤＮＡポリメラーゼであ
ることを示す。

【００６５】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓから得られる密接に関連したＤＮＡポリメラーゼ
に対して調製した抗体を用いた精製組換えタンパク質の
ウエスターンブロット分析（Ｔｏｗｂｉｎら，ＰＮＡＳ
（１９７９））は、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色
バンドと同じ９２，０００〜９７，０００Ｋｄの位置
に、また、ゲル上のほぼ同じ位置に主バンドを示した
（図４）。

【００６６】実施例ＩＶ３′−５′プルーフリーディング活性の測定１．デオキシヌクレオチドの非存在又は存在に対する
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡの反応ポリメラーゼに関連したエキソヌクレアーゼ活性のレベ
ルは、デオキシヌクレオチドに対して非常に異なる反応
（又は応答）を示す。非プルーフリーディング５′−
３′エキソヌクレアーゼはデオキシヌクレオチドの存在
によって影響を受ける付随的重合によって１０倍又はそ
れ以上刺激されるが、一方プルーフリーディング３′−
５′エキソヌクレアーゼは付随的重合により完全に阻害
される（Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．，ＡＲＢ（１９６７）
３６：６４５）。

【００６７】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリ
メラーゼ又は、十分特性化されたエキソヌクレアーゼ機
能を有するポリメラーゼ（Ｔ４ポリメラーゼ，Ｋｌｅｎ
ｏｗ断片）を、重合緩衝液（７０ｍＭＴｒｉｓ，２４
℃でｐＨ８．８）、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）
に溶解した１μｇの³Ｈ−チミジン標識二本鎖ＤＮＡ
（１０⁵ＣＰＭ／μｇ）と共にインキュベートした。７
０℃（好熱性ポリメラーゼ）又は３７℃（中温性ポリメ
ラーゼ）で３時間（実験１）又は４時間（実験２）のイ
ンキュベーション時間後、酸可溶性放射標識塩基を測定
することにより、エキソヌクレアーゼにより加水分解さ
れた塩基を定量した。

【００６８】表１に示すように、５′−３′エキソヌク
レアーゼ活性を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、
デオキシヌクレオチドが３０μＭで存在した場合にエキ
ソヌクレアーゼ活性の刺激を示す。しかしながら、３′
−５′プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を
有するポリメラーゼ、例えばＴ４ポリメラーゼ、大腸菌
ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ＤＮＡポリメラーゼは、逆の、デオキシヌクレオチド
の存在に対して阻害反応を示した。

【００６９】

【表１】２．Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ
とＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａポリメラーゼの３′−５′プルーフリーディング活性
の比較Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼの
３′−５′エキソヌクレアーゼ活性をさらに特性化する
ために、両酵素を３′−５′プルーフリーディングエキ
ソヌクレアーゼ活性に関して同一ＤＮＡ重合単位で比較
した（図５）。結果は、等しいＤＮＡ重合単位では、Ｐ
ｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼがＴｈ
ｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリ
メラーゼの２．５倍のエキソヌクレアーゼ活性を有する
ことを示した。これは、ＤＮＡ合成中の正確さ（ｆｉｄ
ｅｌｉｔｙ）がより大きいことを示唆する。

【００７０】実施例ＶＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼ半減
期測定実施例ＩＩＩで上記のように精製したＰｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼを、以下の方法で測定
した。精製組換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡ
ポリメラーゼ（４０単位／ｍｌ）をｄＮＴＰ及びＤＮＡ
を含有しない反応用緩衝液（反応用緩衝液：１０ｍＭ
ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、２ｍＭＭｇ
ＳＯ₄、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。０．１ｍ
ｇ／ｍｌＢＳＡを補充）中で９５又は１００℃で予
備インキュベーションした。図６に示した時点で、酵素
混合物のアリコートを７０℃で、［³Ｈ］標識ｄＮＴＰ
ｓ及びプライム化（ｐｒｉｍｅｄ）Ｍ１３ＤＮＡ基質
（それぞれ、終濃度０．２ｍＭ及び２０ｎＭ）を含有す
る反応緩衝液中に４倍に希釈し、酸不溶性物質中への［
³Ｈ］取り込みの初期速度を監視した。活性は、９５℃
又は１００℃で処理する前に存在する活性に対して表わ
す。

【００７１】図６に示すように、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼの９５℃での半減期は２３
時間、１００℃では８時間であった。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３４２０塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：不明（ｎｏｔｒｅｌｅｖａｎｔ）配列 GGATCCCTCT CTTTTTGGTA ACCCCATACG TCATTCCCTC AACCAAAACT TCAGCATCGT 60 TGCAGTGGTC AGTGTGTCTG TGGGAGATGA AGAGGACGTC GATTTTTCTG GGGTCTATCT 120 TGTATCTCCA CATTCTAACT AACGCTCCAG GCCCAGGATC AACGTAGATG TTTTTGCTCG 180 CCTTAATGAA GAAGCCACCA GTGGCTCTTG CCTGCGTTAT CGTGACGAAC CTTCCACCAC 240 CGCCACCGAG AAAAGTTATC TCTATCATCT CACACCTCCC CCATAACATC ACCTGCTCAA 300 TTTTTAAGCG TTCTTAAAGG CTTAAATACG TGAATTTAGC GTAAATTATT GAGGGATTAA 360 GTATGATACT TGACGCTGAC TACATCACCG AGGATGGGAA GCCGATTATA AGGATTTTCA 420 AGAAAGAAAA CGGCGAGTTT AAGGTTGAGT ACGACAGAAA CTTTAGACCT TACATTTACG 480 CTCTCCTCAA AGATGACTCG CAGATTGATG AGGTTAGGAA GATAACCGCC GAGAGGCATG 540 GGAAGATAGT GAGAATTATA GATGCCGAAA AGGTAAGGAA GAAGTTCCTG GGGAGGCCGA 600 TTGAGGTATG GAGGCTGTAC TTTGAACACC CTCAGGACGT TCCCGCAATA AGGGATAAGA 660 TAAGAGAGCA TTCCGCAGTT ATTGACATCT TTGAGTACGA CATTCCGTTC GCGAAGAGGT 720 ACCTAATAGA CAAAGGCCTA ATTCCAATGG AAGGCGATGA AGAGCTCAAG TTGCTCGCAT 780 TTGACATAGA AACCCTCTAT CACGAAGGGG AGGAGTTCGC GAAGGGGCCC ATTATAATGA 840 TAAGCTATGC TGATGAGGAA GAAGCCAAAG TCATAACGTG GAAAAAGATC GATCTCCCGT 900 ACGTCGAGGT AGTTTCCAGC GAGAGGGAGA TGATAAAGCG GTTCCTCAAG GTGATAAGGG 960 AGAAAGATCC CGATGTTATA ATTACCTACA ACGGCGATTC TTTCGACCTT CCCTATCTAG 1020 TTAAGAGGGC CGAAAAGCTC GGGATAAAGC TACCCCTGGG AAGGGACGGT AGTGAGCCAA 1080 AGATGCAGAG GCTTGGGGAT ATGACAGCGG TGGAGATAAA GGGAAGGATA CACTTTGACC 1140 TCTACCACGT GATTAGGAGA ACGATAAACC TCCCAACATA CACCCTCGAG GCAGTTTATG 1200 AGGCAATCTT CGGAAAGCCA AAGGAGAAAG TTTACGCTCA CGAGATAGCT GAGGCCTGGG 1260 AGACTGGAAA GGGACTGGAG AGAGTTGCAA AGTATTCAAT GGAGGATGCA AAGGTAACGT 1320 ACGAGCTCGG TAGGGAGTTC TTCCCAATGG AGGCCCAGCT TTCAAGGTTA GTCGGCCAGC 1380 CCCTGTGGGA TGTTTCTAGG TCTTCAACTG GCAACTTGGT GGAGTGGTAC CTCCTCAGGA 1440 AGGCCTACGA GAGGAATGAA TTGGCTCCAA ACAAGCCGGA TGAGAGGGAG TACGAGAGAA 1500 GGCTAAGGGA GAGCTACGCT GGGGGATACG TTAAGGAGCC GGAGAAAGGG CTCTGGGAGG 1560 GGTTAGTTTC CCTAGATTTC AGGAGCCTGT ACCCCTCGAT AATAATCACC CATAACGTCT 1620 CACCGGATAC GCTGAACAGG GAAGGGTGTA GGGAATACGA TGTCGCCCCA GAGGTTGGGC 1680 ACAAGTTCTG CAAGGACTTC CCGGGGTTTA TCCCCAGCCT GCTCAAGAGG TTATTGGATG 1740 AAAGGCAAGA AATAAAAAGG AAGATGAAAG CTTCTAAAGA CCCAATCGAG AAGAAGATGC 1800 TTGATTACAG GCAACGGGCA ATCAAAATCC TGGCAAACAG CATTTTACCG GAAGAATGGG 1860 TTCCACTAAT TAAAAACGGT AAAGTTAAGA TATTCCGCAT TGGGGACTTC GTTGATGGAC 1920 TTATGAAGGC GAACCAAGGA AAAGTGAAGA AAACGGGGGA TACAGAAGTT TTAGAAGTTG 1980 CAGGAATTCA TGCGTTTTCC TTTGACAGGA AGTCCAAGAA GGCCCGTGTA ATGGCAGTGA 2040 AAGCCGTGAT AAGACACCGT TATTCCGGAA ATGTTTATAG AATAGTCTTA AACTCTGGTA 2100 GAAAAATAAC AATAACAGAA GGGCATAGCC TATTTGTCTA TAGGAACGGG GATCTCGTTG 2160 AGGCAACTGG GGAGGATGTC AAAATTGGGG ATCTTCTTGC AGTTCCAAGA TCAGTAAACC 2220 TACCAGAGAA AAGGGAACGC TTGAATATTG TTGAACTTCT TCTGAATCTC TCACCGGAAG 2280 AGACAGAAGA TATAATACTT ACGATTCCAG TTAAAGGCAG AAAGAACTTC TTCAAGGGAA 2340 TGTTGAGAAC ATTACGTTGG ATTTTTGGTG AGGAAAAGAG AGTAAGGACA GCGAGCCGCT 2400 ATCTAAGACA CCTTGAAAAT CTCGGATACA TAAGGTTGAG GAAAATTGGA TACGACATCA 2460 TTGATAAGGA GGGGCTTGAG AAATATAGAA CGTTGTACGA GAAACTTGTT GATGTTGTCC 2520 GCTATAATGG CAACAAGAGA GAGTATTTAG TTGAATTTAA TGCTGTCCGG GACGTTATCT 2580 CACTAATGCC AGAGGAAGAA CTGAAGGAAT GGCGTATTGG AACTAGAAAT GGATTCAGAA 2640 TGGGTACGTT CGTAGATATT GATGAAGATT TTGCCAAGCT TCTTGGCTAC TATGTGAGCG 2700 AGGGAAGTGC GAGGAAGTGG AAGAATCAAA CTGGAGGTTG GAGTTACACT GTGAGATTGT 2760 ACAACGAGAA CGATGAAGTT CTTGACGACA TGGAACACTT AGCCAAGAAG TTTTTTGGGA 2820 AAGTCAAACG TGGAAAGAAC TATGTTGAGA TACCAAAGAA AATGGCTTAT ATCATCTTTG 2880 AGAGCCTTTG TGGGACTTTG GCAGAAAACA AAAGGGTTCC TGAGGTAATC TTTACCTCAT 2940 CAAAGGGCGT TAGATGGGCC TTCCTTGAGG GTTATTTCAT CGGCGATGGC GATGTTCACC 3000 CAAGCAAGAG GGTTCGCCTA TCAACGAAGA GCGAGCTTTT AGTAAATGGC CTTGTTCTCC 3060 TACTTAACTC CCTTGGAGTA TCTGCCATTA AGCTTGGATA CGATAGCGGA GTCTACAGGG 3120 TTTATGTAAA CGAGGAACTT AAGTTTACGG AATACAGAAA GAAAAAGAAT GTATATCACT 3180 CTCACATTGT TCCAAAGGAT ATTCTCAAAG AAACTTTTGG TAAGGTCTTC CAGAAAAATA 3240 TAAGTTACAA GAAATTTAGA GAGCTTGTAG AAAATGGAAA ACTTGACAGG GAGAAAGCCA 3300 AACGCATTGA GTGGTTACTT AACGGAGATA TAGTCCTAGA TAGAGTCGTA GAGATTAAGA 3360 GAGAGTACTA TGATGGTTAC GTTTACGATC TAAGTGTCGA TGAAGATGAG AATTTCCTTG 3420 配列番号：２配列の長さ：５８３７塩基対配列の型：核酸鎖の数：トポロジー：不明配列 GAATTCGCGA TAAAATCTAT TTTCTTCCTC CATTTTTCAA TTTCAAAAAC GTAAGCATGA 60 GCCAAACCTC TCGCCCTTTC TCTGTCCTTC CCGCTAACCC TCTTGAAAAC TCTCTCCAAA 120 GCATTTTTTG ATGAAAGCTC ACGCTCCTCT ATGAGGGTCA GTATATCTGC AATGAGTTCG 180 TGAAGGGTTA TTCTGTAGAA CAACTCCATG ATTTTCGATT TGGATGGGGG TTTAAAAATT 240 TGGCGGAACT TTTATTTAAT TTGAACTCCA GTTTATATCT GGTGGTATTT ATGATACTGG 300 ACACTGATTA CATAACAAAA GATGGCAAGC CTATAATCCG AATTTTTAAG AAAGAGAACG 360 GGGAGTTTAA AATAGAACTT GACCCTCATT TTCAGCCCTA TATATATGCT CTTCTCAAAG 420 ATGACTCCGC TATTGAGGAG ATAAAGGCAA TAAAGGGCGA GAGACATGGA AAAACTGTGA 480 GAGTGCTCGA TGCAGTGAAA GTCAGGAAAA AATTTTTGGG AAGGGAAGTT GAAGTCTGGA 540 AGCTCATTTT CGAGCATCCC CAAGACGTTC CAGCTATGCG GGGCAAAATA AGGGAACATC 600 CAGCTGTGGT TGACATTTAC GAATATGACA TACCCTTTGC CAAGCGTTAT CTCATAGACA 660 AGGGCTTGAT TCCCATGGAG GGAGACGAGG AGCTTAAGCT CCTTGCCTTT GATATTGAAA 720 CGTTTTATCA TGAGGGAGAT GAATTTGGAA AGGGCGAGAT AATAATGATT AGTTATGCCG 780 ATGAAGAAGA GGCCAGAGTA ATCACATGGA AAAATATCGA TTTGCCGTAT GTCGATGTTG 840 TGTCCAATGA AAGAGAAATG ATAAAGCGTT TTGTTCAAGT TGTTAAAGAA AAAGACCCCG 900 ATGTGATAAT AACTTACAAT GGGGACAATT TTGATTTGCC GTATCTCATA AAACGGGCAG 960 AAAAGCTGGG AGTTCGGCTT GTCTTAGGAA GGGACAAAGA ACATCCCGAA CCCAAGATTC 1020 AGAGGATGGG TGATAGTTTT GCTGTGGAAA TCAAGGGTAG AATCCACTTT GATCTTTTCC 1080 CAGTTGTGCG AAGGACGATA AACCTCCCAA CGTATACGCT TGAGGCAGTT TATGAAGCAG 1140 TTTTAGGAAA AACCAAAAGC AAATTAGGAG CAGAGGAAAT TGCCGCTATA TGGGAAACAG 1200 AAGAAAGCAT GAAAAAACTA GCCCAGTACT CAATGGAAGA TGCTAGGGCA ACGTATGAGC 1260 TCGGGAAGGA ATTCTTCCCC ATGGAAGCTG AGCTGGCAAA GCTGATAGGT CAAAGTGTAT 1320 GGGACGTCTC GAGATCAAGC ACCGGCAACC TCGTGGAGTG GTATCTTTTA AGGGTGGCAT 1380 ACGCGAGGAA TGAACTTGCA CCGAACAAAC CTGATGAGGA AGAGTATAAA CGGCGCTTAA 1440 GAACAACTTA CCTGGGAGGA TATGTAAAAG AGCCAGAAAA AGGTTTGTGG GAAAATATCA 1500 TTTATTTGGA TTTCCGCAGT CTGTACCCTT CAATAATAGT TACTCACAAC GTATCCCCAG 1560 ATACCCTTGA AAAAGAGGGC TGTAAGAATT ACGATGTTGC TCCGATAGTA GGATATAGGT 1620 TCTGCAAGGA CTTTCCGGGC TTTATTCCCT CCATACTCGG GGACTTAATT GCAATGAGGC 1680 AAGATATAAA GAAGAAAATG AAATCCACAA TTGACCCGAT CGAAAAGAAA ATGCTCGATT 1740 ATAGGCAAAG GGCTATTAAA TTGCTTGCAA ACAGCATCTT ACCCAACGAG TGGTTACCAA 1800 TAATTGAAAA TGGAGAAATA AAATTCGTGA AAATTGGCGA GTTTATAAAC TCTTACATGG 1860 AAAAACAGAA GGAAAACGTT AAAACAGTAG AGAATACTGA AGTTCTCGAA GTAAACAACC 1920 TTTTTGCATT CTCATTCAAC AAAAAAATCA AAGAAAGTGA AGTCAAAAAA GTCAAAGCCC 1980 TCATAAGACA TAAGTATAAA GGGAAAGCTT ATGAGATTCA GCTTAGCTCT GGTAGAAAAA 2040 TTAACATAAC TGCTGGCCAT AGTCTGTTTA CAGTTAGAAA TGGAGAAATA AAGGAAGTTT 2100 CTGGAGATGG GATAAAAGAA GGTGACCTTA TTGTAGCACC AAAGAAAATT AAACTCAATG 2160 AAAAAGGGGT AAGCATAAAC ATTCCCGAGT TAATCTCAGA TCTTTCCGAG GAAGAAACAG 2220 CCGACATTGT GATGACGATT TCAGCCAAGG GCAGAAAGAA CTTCTTTAAA GGAATGCTGA 2280 GAACTTTAAG GTGGATGTTT GGAGAAGAAA ATAGAAGGAT AAGAACATTT AATCGCTATT 2340 TGTTCCATCT CGAAAAACTA GGCCTTATCA AACTACTGCC CCGCGGATAT GAAGTTACTG 2400 ACTGGGAGAG ATTAAAGAAA TATAAACAAC TTTACGAGAA GCTTGCTGGA AGCGTTAAGT 2460 ACAACGGAAA CAAGAGAGAG TATTTAGTAA TGTTCAACGA GATCAAGGAT TTTATATCTT 2520 ACTTCCCACA AAAAGAGCTC GAAGAATGGA AAATTGGAAC TCTCAATGGC TTTAGAACGA 2580 ATTGTATTCT CAAAGTCGAT GAGGATTTTG GGAAGCTCCT AGGTTACTAT GTTAGTGAGG 2640 GCTATGCAGG TGCACAAAAA AATAAAACTG GTGGTATCAG TTATTCGGTG AAGCTTTACA 2700 ATGAGGACCC TAATGTTCTT GAGAGCATGA AAAATGTTGC AGAAAAATTC TTTGGCAAGG 2760 TTAGAGTTGA CAGAAATTGC GTAAGTATAT CAAAGAAGAT GGCATACTTA GTTATGAAAT 2820 GCCTCTGTGG AGCATTAGCC GAAAACAAGA GAATTCCTTC TGTTATACTC ACCTCTCCCG 2880 AACCGGATCG GTGGTCATTT TTAGAGGCGT ATTTTACAGG CGATGGAGAT ATACATCCAT 2940 CAAAAAGGTT TAGGCTCTCA ACAAAAAGCG AGCTCCTTGC AAATCAGCTT GTGTTCTTGC 3000 TGAACTCTTT GGGAATATCC TCTGTAAAGA TAGGCTTTGA CAGTGGGGTC TATAGAGTGT 3060 ATATAAATGA AGACCTGCAA TTTCCACAAA CGTCTAGGGA GAAAAACACA TACTACTCTA 3120 ACTTAATTCC CAAAGAGATC CTTAGGGACG TGTTTGGAAA AGAGTTCCAA AAGAACATGA 3180 CGTTCAAGAA ATTTAAAGAG CTTGTTGACT CTGGAAAACT TAACAGGGAG AAAGCCAAGC 3240 TCTTGGAGTT CTTCATTAAT GGAGATATTG TCCTTGACAG AGTCAAAAGT GTTAAAGAAA 3300 AGGACTATGA AGGGTATGTC TATGACCTAA GCGTTGAGGA TAACGAGAAC TTTCTTGTTG 3360 GTTTTGGTTT GCTCTATGCT CACAACAGCT ATTACGGCTA TATGGGGATA CCTAAGGCAA 3420 GATGGTACTC GAAGGAATGT GCTGAAAGCG TTACCGCATG GGGGAGACAC TACATAGAGA 3480 TGACGATAAG AGAAATAGAG GAAAAGTTCG GCTTTAAGGT TCTTTATGCG GACAGTGTCT 3540 CAGGAGAAAG TGAGATCATA ATAAGGCAAA ACGGAAAGAT TAGATTTGTG AAAATAAAGG 3600 ATCTTTTCTC TAAGGTGGAC TACAGCATTG GCGAAAAAGA ATACTGCATT CTCGAAGGTG 3660 TTGAAGCACT AACTCTGGAC GATGACGGAA AGCTTGTCTG GAAGCCCGTC CCCTACGTGA 3720 TGAGGCACAG AGCGAATAAA AGAATGTTCC GCATCTGGCT GACCAACAGC TGGTATATAG 3780 ATGTTACTGA GGATCATTCT CTCATAGGCT ATCTAAACAC GTCAAAAACG AAAACTGCCA 3840 AAAAAATCGG GGAAAGACTA AAGGAAGTAA AGCCTTTTGA ATTAGGCAAA GCAGTAAAAT 3900 CGCTCATATG CCCAAATGCA CCGTTAAAGG ATGAGAATAC CAAAACTAGC GAAATAGCAG 3960 TAAAATTCTG GGAGCTCGTA GGATTGATTG TAGGAGATGG AAACTGGGGT GGAGATTCTC 4020 GTTGGGCAGA GTATTATCTT GGACTTTCAA CAGGCAAAGA TGCAGAAGAG ATAAAGCAAA 4080 AACTTCTGGA ACCCCTAAAA ACTTATGGAG TAATCTCAAA CTATTACCCA AAAAACGAGA 4140 AAGGGGACTT CAACATCTTG GCAAAGAGCC TTGTAAAGTT TATGAAAAGG CACTTTAAGG 4200 ACGAAAAAGG AAGACGAAAA ATTCCAGAGT TCATGTATGA GCTTCCGGTT ACTTACATAG 4260 AGGCATTTCT ACGAGGACTG TTTTCAGCTG ATGGTACTGT AACTATCAGG AAGGGAGTTC 4320 CAGAGATCAG GCTAACAAAC ATTGATGCTG ACTTTCTAAG GGAAGTAAGG AAGCTTCTGT 4380 GGATTGTTGG AATTTCAAAT TCAATATTTG CTGAGACTAC TCCAAATCGC TACAATGGTG 4440 TTTCTACTGG AACCTACTCA AAGCATCTAA GGATCAAAAA TAAGTGGCGT TTTGCTGAAA 4500 GGATAGGCTT TTTAATCGAG AGAAAGCAGA AGAGACTTTT AGAACATTTA AAATCAGCGA 4560 GGGTAAAAAG GAATACCATA GATTTTGGCT TTGATCTTGT GCATGTGAAA AAAGTCGAAG 4620 AGATACCATA CGAGGGTTAC GTTTATGACA TTGAAGTCGA AGAGACGCAT AGGTTCTTTG 4680 CAAACAACAT CCTGGTACAC AATACTGACG GCTTTTATGC CACAATACCC GGGGAAAAGC 4740 CTGAACTCAT TAAAAAGAAA GCCAAGGAAT TCCTAAACTA CATAAACTCC AAACTTCCAG 4800 GTCTGCTTGA GCTTGAGTAT GAGGGCTTTT ACTTGAGAGG ATTCTTTGTT ACAAAAAAGC 4860 GCTATGCAGT CATAGATGAA GAGGGCAGGA TAACAACAAG GGGCTTGGAA GTAGTAAGGA 4920 GAGATTGGAG TGAGATAGCT AAGGAGACTC AGGCAAAGGT TTTAGAGGCT ATACTTAAAG 4980 AGGGAAGTGT TGAAAAAGCT GATGAAGTTG TTAGAGATGT TGTAGAGAAA ATAGCAAAAT 5040 ACAGGGTTCC ACTTGAAAAG CTTGTTATCC ATGAGCAGAT TACCAGGGAT TTAAAGGACT 5100 ACAAAGCCAT TGGCCCTCAT GTCGCGATAG CAAAAAGACT TGCCGCAAGA GGGATAAAAG 5160 TGAAACCGGG CACAATAATA AGCTATATCG TTCTCAAAGG GAGCGGAAAG ATAAGCGATA 5220 GGGTAATTTT ACTTACAGAA TACGATCCTA GAAAACACAA GTACGATCCG GACTACTACA 5280 TAGAAAACCA AGTTTTGCCG GCAGTACTTA GGATACTCGA AGCGTTTGGA TACAGAAAGG 5340 AGGATTTAAG GTATCAAAGC TCAAAACAAA CCGGCTTAGA TGCATGGCTC AAGAGGTAGC 5400 TCTGTTGCTT TTTAGTCCAA GTTTCTCCGC GAGTCTCTCT ATCTCTCTTT TGTATTCTGC 5460 TATGTGGTTT TCATTCACTA TTAAGTAGTC CGCCAAAGCC ATAACGCTTC CAATTCCAAA 5520 CTTGAGCTCT TTCCAGTCTC TGGCCTCAAA TTCACTCCAT GTTTTTGGAT CGTCGCTTCT 5580 CCCTCTTCTG CTAAGCCTCT CGAATCTTTT TCTTGGCGAA GAGTGTACAG CTATGATGAT 5640 TATCTCTTCC TCTGGAAACG CATCTTTAAA CGTCTGAATT TCATCTAGAG ACCTCACTCC 5700 GTCGATTATA ACTGCCTTGT ACTTCTTTAG TAGTTCTTTT ACCTTTGGGA TCGTTAATTT 5760 TGCCACGGCA TTGTCCCCAA GCTCCTGCCT AAGCTGAATG CTCACACTGT TCATACCTTC 5820 GGGAGTTCTT GGGATCC 5837

Ｇ

【図面の簡単な説明】

【図１】図のＡは、ＥｃｏＲＩ（レーン３）、Ｂａｍ
ＨＩ（レーン４）及びＨｉｎｄＩＩＩ（レーン５）
で切断されたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡのエ
チジウムブロミド染色アガロースゲル電気泳動写真であ
る。レーン１は、マーカーとしてＨｉｎｄＩＩＩを有
するλＤＮＡ切片であり、レーン２はマーカーとしてｐ
ＢＲ３２２を有する。図のＢは、Ａと同一ゲルのサザー
ンハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィ写真
である。32_P-DNAプローブは，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕ
ｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼのアミノ
末端部分をコードする１．３ＫｂＥｃｏＲＩ断片から
調製した。ＢａｍＨＩ切断Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓ
ｐ．ＤＮＡはプローブを有する約４〜５Ｋｂの単一バン
ドを与えることに留意されたい。ＨｉｎｄＩＩＩ切断
λＤＮＡの２３Ｋｂバンドがフィルム上にはっきり現れ
るという事実は、そのバンドに存在する大量のＤＮＡに
対する非特異的ハイブリダイゼーションによるものであ
る。プラスミドｐＢＲ３２２が明るく輝くという事実
は、プローブ中の相同配列に依る。

【図２】図２は、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ２２０７（ＮＥ
Ｂ＃７２０）のｐＵＣ１９プラスミド中のＰｙｒｏｃｏ
ｃｃｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝
子を含有する４．８ＫｂＢａｍＨＩ断片の制限部位
マップである。

【図３】図３は、ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色ゲ
ル電気泳動の写真であって、これからＰｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼのおよその分子量を決
定した。レーン１の矢印はポリメラーゼバンドを示す。
レーン２は指示分子量標準を含有する。

【図４】図４は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼとＰｙｒｏｃｏｃｃｕ
ｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼを比較する、電気泳動後
のウエスターンブロットの写真である。レーン１，タン
パク質標準；レーン２，Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓの５０μｇの粗抽出物；レーン３，
２．０μｇの精製組換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．
ＤＮＡポリメラーゼ。矢印はポリメラーゼＩの位置を示
す。

【図５】図５は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｃｏｃｃ
ｕｓｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼの重合及びエキソヌ
クレアーゼ機能の比較である。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｐ．ＤＮＡポリメラーゼがＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ＤＮＡポリメラーゼより２．５倍強いエキソヌクレアー
ゼ活性をもつことを示している。

【図６】図６は、組換えＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．
ＤＮＡポリメラーゼの９５℃（○）及び１００℃
（●）での熱安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者レベツカ・クセラアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01915、ビバリー、ネプチユーン・ストリート・28 (72)発明者ヒユーミン・コンアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01915、ビバリー、アール・イーノン・ストリート・38、アパートメント・208 (72)発明者ウイリアム・イー・ジヤツクアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01984、ウエーナム、メイフラワー・ドライブ・31 (56)参考文献欧州特許出願公開455430（ＥＰ，Ａ１) Ｇｅｎｅ，1991，Ｖｏｌ．108，ｐ. １−６ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/12 C12N 15/09 C12N 15/54

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡの重合を触媒するＰｙｒｏｃｏｃ
ｃｕｓ種ＧＢ−Ｄに由来する精製耐熱性酵素であって、
該酵素が大腸菌ＮＥＢ＃７２０株（寄託番号ＡＴＣＣ＃
６８７２３）から得られることを特徴とする、前記酵
素。
【請求項２】約９２，０００〜９７，０００ダルトン
の分子量を有する請求項１に記載の耐熱性酵素。
【請求項３】３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有
する請求項１に記載の耐熱性酵素。
【請求項４】３′−５′エキソヌクレアーゼ活性が不
活性化されている請求項３に記載の耐熱性酵素。
【請求項５】１００℃で約８時間の半減期を有する請
求項１に記載の耐熱性酵素。
【請求項６】９５℃で約２３時間の半減期を有する請
求項１に記載の耐熱性酵素。
【請求項７】請求項１に記載の耐熱性酵素をコードす
る単離されたＤＮＡであって、該ＤＮＡが配列番号１ま
たは、配列番号１とハイブリダイズしうる配列を含む、
該ＤＮＡ。
【請求項８】請求項７に記載のＤＮＡ配列を含有する
ベクター。
【請求項９】請求項８に記載のベクターで形質転換さ
れた微生物宿主。
【請求項１０】形質転換体がＥ．ｃｏｌｉＮＥＢ＃
７２０（ＡＴＣＣＮｏ．６８７２３）である請求項９に
記載の形質転換体。
【請求項１１】Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤＤ
ＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で請求項９又は
１０のいずれかに記載の形質転換微生物宿主を培養し、
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤＤＮＡポリメラーゼ
を回収することを包含する、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種Ｇ
Ｂ−ＤＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項１２】請求項１１記載の方法により産生され
るＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤＤＮＡポリメラー
ゼ。
【請求項１３】ＤＮＡが介在配列を含有する請求項７
に記載のＤＮＡ配列。