JP2003506048A

JP2003506048A - 古細菌複製補助因子及び使用方法

Info

Publication number: JP2003506048A
Application number: JP2001514139A
Authority: JP
Inventors: ハールバットホグレフ，ホーリー; マリークライン，ジャニス; ジョーハンセン，コニー; シー．ボーンズ，マイケル
Original assignee: ストラタジーン
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2003-02-18
Also published as: WO2001009347A2; EP1208210A2; WO2001009347A9; US7442766B2; AU6385800A; US20090221029A1; WO2001009347A3; US20050003401A1

Abstract

(57)【要約】本願発明は、複製補助因子をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。本発明は、超好熱性古細菌ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離及び精製した新規ＤＮＡ複製補助因子をも提供する。本発明は、その反応に前記複製補助因子の添加を含む、核酸ポリメラーゼ反応のさまざまな促進方法をも提供する。本願発明は、前記複製補助因子を利用する、着目の核酸の合成、増幅、及び突然変異誘導の方法をさらに提供する。本願発明は、少なくとも１の前記複製補助因子を含むキットをも提供する。本願発明は、少なくとも１の複製補助因子を含むさまざまな方法に有用なキットをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願情報本願発明は、あらゆる目的のために全てが援用されるところの、１９９９年７
月３０日出願、米国特許仮出願第６０／１４６，５８０号の出願日の利益を、請
求する。

【０００２】本発明の背景及び概要本発明は、核酸の複製、増幅、及びシークエンシングに関する。さらに、本願
発明は、重合反応におけるポリメラーゼ活性を促進する新規タンパク質に関する
。

【０００３】インビトロ重合技術は、バイオテクノロジー及び医薬の分野に莫大な利益をも
たらした。重合反応により核酸を操作できることは、遺伝子の特徴づけ及び（こ
れだけに制限されることなく、ＤＮＡのシークエンシング、突然変異誘導、合成
、標識、及び増幅を含む）分子クローニング、対立遺伝子変異の測定、並びにさ
まざまな疾患及び症状（例えばＢ型肝炎）の検出及び検査から多岐にわたる技術
をひじょうに容易にする。

【０００４】ひじょうに重要なインビトロ重合技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）
である。この方法は、着目の核酸を素早く、そして指数関数的に複製及び増幅す
る。ＰＣＲは、通常は高温により、鋳型ＤＮＡを変性し、相補ＤＮＡ鎖に対して
対向プライマーをアニールし、そしてＤＮＡポリメラーゼによってアニールした
プライマーを伸長するサイクルをくり返すことにより実行される。ＰＣＲの多数
のサイクルは、前記鋳型ＤＮＡの指数関数的な増幅をもたらす。

【０００５】残念なことに、ＰＣＲには制約がある。これらの制約は：１）ヌクレオチド取
込みの速度、２）ヌクレオチド取込みの正確さ、３）増幅される分子の長さ、及
び４）ポリメラーゼの特異性により範囲が定められる。

【０００６】さまざまなＰＣＲ改良法が存在する。１の方法は、反応条件、例えばpH、ｄＮ
ＴＰ濃度又は反応温度を最適化することである。他の方法は、ＰＣＲ反応の特異
性を増すか、それとも産生量が増すさまざまな化学的な化合物、例えばホルムア
ミド（Sarkar, G., et al., Nucl. Acids Res. 18 : 7465 (1990))、塩化テトラ
メチルアンモニウム及びジメチルスルフォキシド（Chevet et al., Nucl. Acids
Res. 23 : 3343-3344 (1995); Hung et al., Nucl. Acids Res. 18 : 4953 (19
90))の添加である。他の試みは、さまざまなタンパク質、例えば複製補助因子の
添加を含む。ＤＮＡ複製に含まれることで知られる複製補助因子は、ＰＣＲ産物
の産生量及び特異性を増加させもする。例えば、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）一本鎖Ｄ
ＮＡ結合タンパク質、例えばｓｓｂは、プライマー伸長反応及びＰＣＲ反応の産
生量及び特異性増加のために使用される（例えば米国特許第５，４４９，６０３
号、及び同第５，５３４，４０７号を参照のこと）。他のタンパク質、Ｔ４ファ
ージの第３２遺伝子タンパク質は、より長いＤＮＡ断片を増幅する能力の向上を
もたらす（Schwartz et al., Nucl. Acids Res. 18 : 1079 (1990)）。

【０００７】ＰＣＲの簡便性及び特異性を促進する重要な変更は、Ｅ．コリＤＮＡｐｏｌ
Ｉのクレノー断片の代わりのサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑ
ｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼの使用である（Saiki et al.,
science 230 : 1350-1354 (1988)）。この耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、
くり返された酵素添加の必要性を回避し、アニーリング及びプライマー伸長温度
の上昇を許し、それにより特異性を高める。さらに、この変更は、プライマーと
その鋳型との間の結合の特異性を高める。しかしながら、Ｔａｑポリメラーゼは
、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をもたないために、根本的な欠点を有する
。したがって、Ｔａｑポリメラーゼは、増幅産物の末端に組込まれた不正確なヌ
クレオチドを削除できない。この制約のために、Ｔａｑ−ＰＣＲ反応の厳密さは
、典型的には損なわれる。それゆえに、当業者は、３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性をもつ、他の耐熱性ポリメラーゼを捜している。

【０００８】３′→５′エキソヌクレアーゼ活性をもつポリメラーゼは、古細菌（ａｒｃｈ
ａｅｂａｃｔｅｒｉａ）（ａｒｃｈａｅａ）中に見出される。古細菌は、生物の
第３の界（ｋｉｎｇｄｏｍ）であり、真核生物及び細菌（真正細菌）と異なる。
多くの古細菌は、ひじょうに高温、すなわち１００℃において生育可能な、好熱
性細菌様生物である。上述の古細菌の１つが、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｆ
ｕ）である。Ｐｆｕからの単量体ポリメラーゼは、望ましい３′→５′エキソヌ
クレアーゼ活性をもち、そして高温で着目の核酸を合成することが確認されてい
る（Lumdberg et al., Gene 108 : 1-6 (1991); Cline et al., Nucl. Acids Re
s. 24 : 3546-3551 (1996) (このポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼと呼ばれ
る）。２つのサブユニット（ＤＰ１／ＤＰ２）を有し、そしてＰ．フリオサスｐ
ｏｌIIと呼ばれる、２次ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐ．フリオサス内に確認される
。参考文献１及び１５を参照のこと。このポリメラーゼのこの活性は、補助因子
の添加により、重合反応を促進することもできる。

【０００９】古細菌内に存在するある天然タンパク質、すなわちＰＥＦ（ポリメラーゼ促進
因子）は、デオキシウラシル・トリフォスファターゼ（ｄＵＴＰａｓｅ）活性を
表し、そしてＰｆｕポリメラーゼ活性を促進する（１９９８年１０月１日に公開
された、国際公開特許出願第ＷＯ９８／４２８６０；米国特許出願第０８／８２
２，７７４号、及び同第０８／９５７，７０９）。ＤＮＡ重合反応においてデオ
キシウラシル含有ＤＮＡの存在は、ポリメラーゼ活性を阻害する（Lasken et al
., J. Biol. Chem. 271 : 17692-17696 (1996)）。具体的に言うと、通常のＰＣ
Ｒ反応の経過の間に、ｄＣＴＰを、ｄＵＴＰに脱アミノ化し、それによりデオキ
シウリジンを新規合成ＤＮＡの中に挿入する。この新規合成ＤＮＡが増幅鋳型と
して使用される場合、前記デオキシウリジンの存在が、Ｐｆｕポリメラーゼを阻
害する。前記古細菌ＡＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）はｄＵＴＰの取り込みを妨げ、そし
てそれによりＰｆｕポリメラーゼ阻害を回避する。したがって、古細菌ｄＵＴＰ
ａｓｅは、Ｐｆｕポリメラーゼ活性を最適化する。

【００１０】ある態様により、本発明は、これだけに制限することなく、Ｐｆｕポリメラー
ゼを含む古細菌ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を促進する方法及び物質を提供
する。ある態様は、特定の真核生物タンパク質、例えばＤＮＡヘリックスをほど
き、そしてそれにより鋳型一本鎖ＤＮＡを提供する、ヘリカーゼ酵素；得られた
鋳型一本鎖ＤＮＡに結合し、そして安定化させる、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質
（例えばＲＦＡ）；ポリメラーゼとプライムされた鋳型一本鎖ＤＮＡの間の相互
作用を安定させ、そして（「プロセシビティー」としても知られる）長いＤＮＡ
鎖の合成を促進する、「スライディング・クランプ（ｓｌｉｄｉｎｇｃｌａｍ
ｐ）」タンパク質（例えば増殖細胞核抗原つまりＰＣＮＡ）；ＰＣＮＡタンパク
質を集合させる「クランプ−ローディング（ｃｌａｍｐ−ｌｏａｄｉｎｇ）」タ
ンパク質複合体（例えばＲＦＣ）；ＤＮＡ結合活性、ＤＮＡ刺激されたＡＴＰａ
ｓｅ活性、及び３′→５′ヘリカーゼ活性を備える、ミニクロモソーム維持タン
パク質（ＭＣＭｓ）；複製起点複合体（ＯＲＣ）との相互作用を通して複製起点
に結合し、そしてＭＣＭ（ｓ）のローディングを促進するタンパク質、ＣＤＣ６
；並びにエンドヌクレアーゼ特有の構造、及び５′エキソヌクレアーゼである、
フラップ・エンドヌクレアーゼ−１（ＦＥＮ−１）の同等物であることができる
ところの、１以上の古細菌複製補助因子を含む。

【００１１】ある態様により、本発明は、超好熱性古細菌ピロコッカス・フリオサスから単
離及び精製された新規ＤＮＡ複製補助因子を提供する。ある態様において、前記
単離タンパク質は、真核生物又は原核生物ＤＮＡ複製タンパク質、ＰＣＮＡ、Ｒ
Ｆ−Ｃサブユニット、ＲＦＡ，ＦＥＮ−１，ＣＤＣ６、並びにこれだけに制限さ
れることなく、ヘリカーゼ２〜８、ｄｎａ２、及びＭＣＭを含むヘリカーゼの耐
熱性相同体である。

【００１２】ある態様により、本願発明は、これらの新規複製補助因子及びアナログ、又は
ポリヌクレオチドの縮合変異体をコードする、単離及び精製ポリヌクレオチドを
も含む。

【００１３】ある態様において、前記ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲ
ＮＡ、部分的な又は完全な合成ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡでありうる。開示の
あらゆる核酸配列の相補ＤＮＡ及びＲＮＡが、本発明の意図した範囲の中にある
ことは、当業者に理解されるであろう。

【００１４】ある態様により、本発明は、複製補助因子をコードするポリヌクレオチドを含
むベクター及び上記ベクターを含む宿主細胞を含む。ある態様により、本発明は
、それら宿主細胞内で発現されたポリペプチドを含む。さらに、本願発明は、前
記宿主細胞及びそれらの産物だけでなく、上述の宿主細胞を用いた、着目のポリ
ペプチドの製造方法をも提供する。組換えにより製造されたポリペプチドと同様
に、本発明の単離及び精製ポリペプチドは、本発明の範囲の中にある。

【００１５】ある態様により、本発明は、その反応への１以上の複製補助因子の添加を含む
核酸ポリメラーゼ反応を促進する方法を含む。

【００１６】ある態様において、ただ１つの古細菌複製補助因子を、核酸ポリメラーゼ反応
内に加えるであろう。他の態様において、因子の併用物を、加えうる。

【００１７】ある態様において、古細菌ｄＵＴＰａｓｅは、ポリメラーゼ反応をさらに促進
するために、１以上の複製補助因子と併用されうる。

【００１８】ある態様により、核酸ポリメラーゼ反応を促進するための組成物を、提供する
。これらの組成物は、単独でかそれとも他の古細菌ポリペプチドとともに、例え
ばＰＣＮＡ，ＲＦＣ，ＲＦＣ−Ｐ５５，ＲＦＣ−Ｐ３８，ＲＦＡ，ＭＣＭ，ＣＤ
Ｃ６，ＦＥＮ−１、リガーゼ、ｄＵＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ２〜８、及びヘリカ
ーゼｄｎａ２を含む古細菌ポリペプチドを含む。ある態様において、古細菌ポリ
ペプチドは、ピロコッカス属又はサーモコッカス属の仲間からであるか又はその
中に見出されるポリペプチドに一致する。他の態様において、前記ポリペプチド
は、ピロコッカス・フリオサスからであるか又はその中に見出されるポリペプチ
ドと相同である。ある態様において、前記組成物は、例えば耐熱性ポリメラーゼ
及び３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを含む１以上のポリ
メラーゼをさらに含む。これらの新規組成物を含む核酸ポリメラーゼ反応を促進
する方法をも提供する。

【００１９】ある態様において、本願発明は、古細菌ポリメラーゼ及び古細菌複製補助因子
の利用を含む、核酸の合成方法をも提供する。

【００２０】ある態様により、本発明は、古細菌ポリメラーゼ及び古細菌補助因子の利用を
含む、着目の核酸の増幅、突然変異誘導又は標識の方法を含む。

【００２１】本発明の方法のある態様において、前記古細菌ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメ
ラーゼである。これら方法のある態様において、前記古細菌ポリメラーゼは、他
のポリメラーゼ、例えばＴａｑ，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｃａ，Ｔ
ｆｉｌ，Ｔｂｒ又はＴｔｈポリメラーゼと併用されうる。これら方法の他の態様
において、古細菌ｄＵＴＰａｓｅを、ポリメラーゼ活性を促進するために含むこ
ともできる。

【００２２】本発明の方法のある態様において、前記古細菌ポリメラーゼは、Ｐ．フリオサ
スｐｏｌIIポリメラーゼである。他の態様において、Ｐ．フリオサスｐｏｌIIポ
リメラーゼは、２次ポリメラーゼと併用される。ある態様において、２次ポリメ
ラーゼは、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠く、例えば、これだけに制限
されることのない、Ｔａｑ，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｔｔｈ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｆｉ
ｌ，Ｔｃａ又はＴｂｒポリメラーゼである。

【００２３】ある態様において、本願発明は、前記方法の実施に使用されるキットをも提供
する。

【００２４】ある態様において、本願発明は、古細菌ポリメラーゼ及び少なくとも１の古細
菌複製補助因子を含むキットをも提供する。

【００２５】ある態様において、これらのキットは、古細菌ｄＵＴＰａｓｅ及びたぶん他の
ポリメラーゼ、例えばＴａｑをも含むであろう。

【００２６】一方、本発明の組成物は、特にＰＣＲへの適用に有用であり、上述の組成物は
一般的な核酸ポリメラーゼ反応に対する有用性を有する。例えば、これだけに制
限されることのない、核酸の合成、標識、増幅又は突然変異誘導である。したが
って、本発明は、ＰＣＲへの適用に制限されることを意図しない。

【００２７】本発明の態様の詳細な記載本発明は、古細菌からの新規ＤＮＡ複製補助因子をコードする、単離及び精製
したポリヌクレオチドを提供する。ある態様において、複製補助因子又はポリペ
プチドは、ピロコッカス種又は近縁の古細菌種サーモコッカスからである。これ
らの複製補助因子は、真核生物ＤＮＡ複製補助因子ＰＣＮＡ，ＲＦＣサブユニッ
ト、ＲＦＡ，ＣＤＣ６，ＦＥＮ−１、及びこれだけに制限されることなく、ＭＣ
Ｍを含むヘリカーゼの熱耐性相同体でありうる。耐熱性は、前記ポリペプチドが
５０℃で少なくとも３０分の生物学的半減期をもつことを、意味する。

【００２８】本明細書に用いる「単離及び精製したポリヌクレオチド」は、天然ポリヌクレ
オチドに自然に随伴する、少なくとも１の他の核酸配列から物質的に分離された
ところの核酸である。

【００２９】これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡ，ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形状、
例えばオリゴヌクレオチド、アンチセンス及びセンス鎖を含み、さらに化学的又
は生化学的修飾ヌクレオチド、例えば突然変異ヌクレオチド又はシステイン標識
ヌクレオチドをも含みうる。用語ゲノムＤＮＡが、コード領域又はエクソンだけ
でなく、プロモーター、エンハンサー、イントロン、及び他の制御要素をも含む
ことを、当業者は、理解するであろう。上述の領域は、本分野で一般的に知られ
、そして当業者に知られた方法により同定されうる。例えばこれだけに制限され
ることなく、組換え技術及び分子生物学（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）技術により作
製された組換えポリヌクレオチドをも提供する。例えばこれに制限されることな
く、固相合成処理により作製された、完全な又は部分的な合成ポリヌクレオチド
配列も、本発明の範囲の中に存在する。例えばCurrent Protocols in Molecular
Biology, including supplements through July 2000, John Wiley & Sons; Cu
rrent Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2000, John Wiley & Sonsを参照
のこと。

【００３０】たとえ天然の配列を有するポリヌクレオチドでも、利用されることができ、こ
のポリヌクレオチドは、例えば欠失、置換、挿入により変更されうる。当業者は
、生物学的活性を維持するタンパク質をコードするであろうところの、配列にお
ける適当な変更を知っているであろう。ある好ましい態様において、ポリヌクレ
オチドは、異なる保存性アミノ酸置換をコードするように変更されうる。保存性
アミノ酸置換は、これだけに制限されることなく、与えられたアミノ酸が、例え
ば類似した生理学的又は生化学的特徴を有する残基により置き替えられうる、変
更を含む。上述の保存性置換の例は、これだけに制限されることなく、１の脂肪
族残基の他のものとの、例えばＩｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ又はＡｌａのお互いの置
換；１の極性残基の他のものとの、例えばＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ又は
ＧｌｎとＡｓｎの間の置換；１の芳香族残基の他のものとの、例えばＰｈｅ，Ｔ
ｒｐ又はＴｙｒのお互いの置換を含む。例えば類似した疎水性の特徴をもつ全て
の残基の置換を含む、他の保存性置換が、よく知られる。Biochemistry : A Pro
blems Approach, (Wood, W.B., Wilson, J.H., Benbow, R.W., and Hood, L.E.,
eds.) Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA (1981), pa
ge 14-15を参照のこと。

【００３１】さまざまな種類のｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーは、本発明のポリヌクレ
オチドの天然起源として、スクリーニングされうるか、又は上述の核酸は、例え
ばＰＣＲによる、ゲノムＤＮＡ又は他の天然起源の中に存在する配列の増幅によ
り提供されうる。例えばPCR Protocols : A Guide to Methods and Application , Innis, M., et al., eds., Academic Press : San Diego (1990)を参照のこと
。古細菌複製補助因子をコードするゲノム・ポリヌクレオチドは、付加的な非コ
ード塩基対又はインテイン（ｉｎｔｅｉｎｓ）を含むことができ、そして当業者
は、上述のポリヌクレオチドをどのように得るか知っているであろう。ゲノムＤ
ＮＡ配列を得る１つの方法は、既知のＤＮＡ配列の全部又は一部によって、ゲノ
ム・ライブラリーを探索することによる。得られたゲノムＤＮＡ配列は、機能性
タンパク質をコードすることが望ましい。

【００３２】本願発明のある態様において、複製補助因子をコードする単離ポリヌクレオチ
ドの核酸配列は得られ、そしてさまざまな目的に使用されうる。ある態様におい
て、本発明は、以下の：古細菌ＰＣＮＡ、古細菌ＲＦＣサブユニットＰ３８タン
パク質、古細菌ＲＦＣサブユニットＰ５５、古細菌ＲＦＣサブユニットＰ９８、
古細菌ＲＦＡ、古細菌ＣＤＣ６、古細菌ＦＥＮ−１、及びさまざまな古細菌ヘリ
カーゼをコードする、単離及び精製したポリヌクレオチドを含む。ある態様によ
り、本発明は、Ｐｆｕ内に存在する、９つの異なるヘリカーゼ、すなわちヘリカ
ーゼ２−８、ＭＣＭ、及びヘリカーゼｄｎａ２を含む。ピロコッカス種及びサー
モコッカス種の他の仲間からの相同体ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列も
、本発明の範囲の中にある。

【００３３】本明細書において使用される、用語「ＰＣＮＡ」を、真核生物においてＤＮＡ
ポリメラーゼを鋳型ＤＮＡに固定する役割から、「クランプ」又は「スライディ
ング・クランプ」タンパク質と呼ぶこともできる。

【００３４】ある態様において、用語「ＲＦＣサブユニット」は、これだけに制限されるこ
となく、分子量約５５キロダルトン（kDa ）及び約３８kDa のタンパク質又はそ
れぞれ図１０及び図１１に説明するアミノ酸配列を有するサブユニットを含む。
これらのサブユニットは、本明細書において「Ｐ５５」及び「Ｐ３８」と呼ばれ
る。これらのサブユニットは、１の大サブユニット及び少なくとも１の小サブユ
ニットをもつ複合体の一部である。Ｐ５５は、大サブユニット、そしてＰ３８は
小サブユニットと考えられる。前記ＲＦＣＰ９８サブユニットは、Ｐ３８サブ
ユニット及びＰ３８タンパク質の機能的形状から外されるインテイン配列を含む
。

【００３５】本願発明は、さまざまな複製補助因子、例えば古細菌ＰＣＮＡ、古細菌ＲＦＣ
サブユニットＰ３８タンパク質、古細菌ＲＦＣサブユニットＰ５５、古細菌ＲＦ
Ａ、古細菌ＣＤＣ６、古細菌ＦＥＮ−１、並びにヘリカーゼ２−８、ヘリカーゼ
ｄｎａ２、及びＭＣＭを含む、さまざまな古細菌ヘリカーゼのアミノ酸配列をコ
ードする、単離及び精製ポリヌクレオチドをさらに提供する。

【００３６】本明細書に記載のポリヌクレオチドは、天然型とは異なる、例えば天然型の全
アミノ酸より少ないアミノ酸を含む、欠失アナログ、１以上の、他の残基に置き
換えられたアミノ酸をもつ、置換アナログ、及び天然配列に１以上のアミノ酸を
加えた、付加アナログであるところの、複製補助因子を含む、さまざまな古細菌
ポリペプチドのポリペプチド・アナログ又は誘導体をコードする核酸配列をも含
む。これらのさまざまなアナログは、前記古細菌ポリペプチド因子の生物学的特
性のいくつか又は全てを共有する。先に特筆したとおり、当業者は、好適なアナ
ログを設計しうるであろう。ある好ましい態様において、保存性アミノ酸置換が
、作られるであろう。ある態様において、前記アナログは、天然配列に対して７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％一致又は相同であろ
う。

【００３７】パーセント一致は、アミノ酸又は核酸配列の間の関係を含む。当業者は、特定
の方法により検討されるギャップ（ｇａｐ）アライメントにより、２以上の配列
の間のあらゆる点で等しい整合のパーセントを決定する。前記パーセント一致は
、視覚的検査及び／又は数学的計算により決定する。あるいは、２つの核酸配列
のパーセント一致は、Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12 : 387, 1984）に
記載の、そしてUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)か
ら入手できるＧＡＰコンピューター・プログラム、バージョン６．０を用いて、
配列情報を比較することにより決定されうる。前記ＧＡＰプログラムに関して好
ましい初期設定パラメーターは、以下のものを含む：（１）Schwartz and Dayho
ff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical R
esearch Foundation, pp. 353-358, 1979 に記載のとおり、（一致には１、そし
て不一致には０の値を含む）ヌクレオチドについての単一の比較母体、並びにGr
ibskov及びBurgess, Nucl. Acids Res. 14 : 6745, 1986 、の加重比較母体；（
２）それぞれのギャップには３．０のペナルティー、そしてそれぞれのギャップ
におけるそれぞれの符号には付加的な０．１０のペナルティー；そして（３）末
端のギャップには、ペナルティーなし。当業者により使用される、配列比較の他
のプログラムが、使用されることもできる。

【００３８】ある態様において、ポリヌクレオチドは、適度な又は高いストリンジェント条
件下、天然コード核酸の相補体に対し又は天然アミノ酸配列を有するタンパク質
をコードする核酸に対してハイブリダイズするものでありうる。本明細書で使用
されるように、適度なストリンジェンシー条件は、例えばＤＮＡの長さに基づい
て当業者によって容易に決定されうる。前記基本的な条件は、Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1, pp. 1. 101-104, Co
ld Spring Harbor Laboratory Press, (1989）に説明され、そしてニトロセルロ
ース膜の前洗浄液５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０mM ＥＤＴＡ（pH８．
０）の使用、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、約４２℃での（又は他の類似
のハイブリダイゼーション溶液、例えば５０％ホルムアミド含有Ｓｔａｒｋ’ｓ
溶液で約４２℃での）ハイブリダイゼーション条件、及び０．５×ＳＳＣ、０．
１％ＳＤＳ、約６０℃の洗浄条件を含む。高いストリンジェンシー条件は、例
えばＤＮＡの長さに基づいて、当業者によって容易に決定されることもできる。
一般的に上述の条件は、先のとおりハイブリダイゼーション条件と定義され、そ
して０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、約６８℃での洗浄をともなう。温度及
び洗浄溶液の塩濃度は、要因、例えばプローブの長さに従って、必要に応じて調
節されうることを、当業者は理解するであろう。

【００３９】ある態様において、ポリヌクレオチドは、特にアミノ酸配列が知られている場
合、遺伝子コードにおける重複性（縮重）のために、天然の核酸配列とは異なる
配列をもちうる。当業者は、多くのアミノ酸が、２以上の異なるコドンによりコ
ードされていること、及びこれらの縮重するコドンを含むと同時に天然核酸配列
とは異なるポリヌクレオチドが、それにもかかわらず、同じアミノ酸配列をコー
ドすることを、理解するであろう。さらに、制限部位の作製又は個々の系におけ
る発現の最適化のために、ポリヌクレオチド配列内へのさまざまなコドン置換を
導入することは、望ましいことである。上述の縮重変異体及び置換されたポリヌ
クレオチドは、本発明の範囲の中にある。

【００４０】本願発明において使用されるポリヌクレオチドは、普通は少なくとも約１５個
のヌクレオチドを含む。ある態様において、ヌクレオチドの数は、生物学的に活
性な複製補助因子の発現のため又は複製補助因子をコードする核酸配列に対する
プローブのために、あるいは核酸のプライミングのために必要とされる最小限の
長さである。上述の最小限の長さは、慣例の分子生物学の技術又は本明細書に記
載された技術を用いて、当業者により容易に決定されうる。

【００４１】ポリヌクレオチド操作技術は、一般的にSambrook et al., Molecular Cloning
: A Laboratory Manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s 1989) に記載される。上述の技術の利用において有用な試薬、例えば制限酵素
は、本分野において広く知られ、そして商人、例えばストラタジーン社（Strata
gene）（La Jolla, CA）から市販されている。

【００４２】これらのポリヌクレオチドは、核酸プローブ及びプライマーとして使用されう
る。上述のプローブ及びプライマーは、他の古細菌複製補助因子のスクリーニン
グ又は他の種の相同的な複製補助因子のスクリーニングに有用であろう。前記プ
ローブ及びプライマーは、単離核酸を含むことができ、さらに検出可能な標識、
例えばレポーター分子を含むことができる。

【００４３】本願発明のある態様において、当業者は、本明細書に開示されたポリヌクレオ
チドを使用した、ウィルス又はプラスミドＤＮＡベクターを製造することもでき
る。前記意図したベクターは、さまざまなウィルス・ベクターを含む。いくつか
の一般的に使用された例は、これだけに制限されることなく、プラスミド、バク
テリオファージ、レトロウィルス、バキュロウィルス、及びアデノウィルスであ
る。前述のベクターは、複製起点（ＯＲＩ）又は自己複製配列（ＡＲＳ）、発現
調節配列、例えばプロモーター及びエンハンサー配列、そしてタンパク質プロセ
ッシング情報部位、例えばＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、リ
ボソーム結合部位、及びｍＲＮＡ安定化配列をコードする核酸と連結されうる。
前述のベクター及びそれらの構築方法は、本分野でよく知られている。例えばSa
mbrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Pouwels et al., Cloning Vector
s : A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985);“Gene Expression Te
chnology”Methods in Enzymology, V. 185, D.V. Goeddel, ed. Academic Pres
s Inc., San Diego, CA (1990);及び“Viral Vectors : Gene Therapy and Neur
oscience Applications”(Kaplitt, M.G., and Loewy, A.D., eds.) Academic P
ress, San Diego, CA (1995)を参照のこと。

【００４４】これらのポリヌクレオチドは、選択された非哺乳類宿主、例えば原核生物又は
非哺乳類の真核生物の宿主細胞における、前記ポリヌクレオチドの「好ましい」
発現のための、コドンの取り込みを含みうる。

【００４５】ベクターは、宿主細胞内に、本願発明のポリヌクレオチドを導入するために使
用されうる。典型的には、これらのベクターは、古細菌複製補助因子をコードす
るポリヌクレオチドに使用可能な状態で結合された、転写及び翻訳開始調節配列
をも含みうる。これらのベクターは、宿主細胞内における前述の因子の産生を助
長にするであろう。

【００４６】ある態様において、前記ポリヌクレオチドによりコードされた複製補助因子を
生産するために、適当なプロモーター及び適合した宿主細胞が選ばれうる。適合
した細胞株及び発現ベクターの例は、本分野においてよく知られている。あるよ
く知られた宿主細胞は、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）及びＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような原核生物である。原核宿主細胞、例えばＥ．コリにおいて、ポ
リペプチドは、上述の原核宿主細胞において組換えポリペプチドの発現を助長す
る、Ｎ末端メチオニン残基を含みうる。前記Ｎ末端メチオニンは、発現した組換
えポリペプチドから切断される。真核宿主細胞の例は、酵母、真菌、植物、昆虫
、両生類、鳥類又は哺乳類の細胞でありうる。例えば、“Gene Expression Tech
nology”Methods in Enzymology, V. 185, D.V. Goeddel, ed. Academic Press
Inc., San Diego, CA (1990)を参照のこと。

【００４７】ある態様において、当業者は、形質転換細胞を容易に検出できるようにするよ
うな、前記宿主細胞系又はベクター内において選択可能標識を利用しうる。ある
態様において、前述の標識は、前記細胞が形質転換された後、検出可能にする。
１つの例は、これだけに制限されることなく、抗生物質耐性を含む。

【００４８】当業者は、特にそれらの情報を論じるマニュアルを含む、多くの刊行物を考慮
して、好適な宿主細胞内に、好適な発現系を構築しうる。

【００４９】本願発明は、好適な宿主細胞内において、複製補助因子をコードするポリヌク
レオチドを含むベクターの発現による古細菌複製補助因子の産生方法及びそこで
発現された産物の精製方法を提供する。前述の宿主細胞を用いる、前述のポリヌ
クレオチドを発現するための技術は、本技術分野においてよく知られている。例
えばSambrook et al. (1989)を参照のこと。

【００５０】本願発明は、前記方法により産生された組換えタンパク質をも提供する。

【００５１】本発明は、これだけに制限されることなく、古細菌ＰＣＮＡ、古細菌ＲＦＣ−
Ｐ３８、古細菌ＲＦＣ−Ｐ５５、古細菌ＲＦＡ、古細菌ＣＤＣ６、古細菌ＦＥＮ
−１、並びに古細菌ヘリカーゼ、例えばヘリカーゼｄｎａ２、ヘリカーゼ２〜８
、及び古細菌ＭＣＭを含む単離及び精製された古細菌複製補助因子をも提供する
。

【００５２】ある態様において、これらの補助因子は、複製補助因子の一次構造のコンフォ
メーションの一部又は全てを、そして生物学的特性を有する。

【００５３】本明細書で使用される場合、用語「単離及び精製されたポリペプチド」は、そ
のポリペプチドを自然に伴う少なくとも１の他のタンパク質から分離されるポリ
ペプチドを示す。ポリペプチドは、タンパク質及び少なくとも２のアミノ酸を含
むペプチド配列を含む。

【００５４】前記複製補助因子の天然の対立型に加えて、本願発明は、ポリペプチド・アナ
ログ又は断片をも含む。当業者は、前記複製補助因子のアナログ及び断片を発現
する、核酸配列を容易に設計しうる。例えば当業者は、よく知られた部位指定突
然変異誘導技術を用いて、前述のアナログ又は断片をコードするポリヌクレオチ
ドを生み出す。それらのアナログ及び断片は、１以上の、例えばこれだけに制限
されることなく、核酸ポリメラーゼ反応又は重合体の形成を促進する、天然複製
補助因子の生物学的機能を有するであろう。

【００５５】さらに、本願発明は、核酸ポリメラーゼ反応に使用する少なくとも１の古細菌
ポリペプチドを含む組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「核酸ポリ
メラーゼ反応」は、これだけに制限されることなく、着目の核酸の部位指定突然
変異誘導、増幅、標識、及び合成を含みうるＰＣＲに基づく反応を含む。

【００５６】本発明のある態様において、前記組成物は、少なくとも１のポリメラーゼをさ
らに含む。前述のポリメラーゼは、これだけに制限されることなく、Ｐｆｕポリ
メラーゼ、Ｐ．フリオサスｐｏｌIIポリメラーゼ、及び／又はＴａｑポリメラー
ゼを含みうる。異なるポリメラーゼの混合、例えばＴａｑ及びＰｆｕポリメラー
ゼの混合もまた、本発明の範囲の中にある。

【００５７】ある態様において、前記ポリペプチドは、耐熱性古細菌ポリメラーゼである。
前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、古細菌、例えばピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種ＧＢ−Ｄ、ピロコッカス種菌株（コダカラエンシス（ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ））ＫＯＤ１、ピロコッカス・ウォエシイ（ｗｏｅｓｉｉ）、ピ
ロコッカス・アビシイ（ａｂｙｓｉｉ）、ピロコッカス・ホリコシイ（ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、ピロディクティウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍｏｃｃｕｌｔｕｍ）、アルキオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓｆｕｌｇｉｄｕｓ）、スルフォロブス・ソルファタニクス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｎｉｃｕｓ）又はアシドカルダリウス（ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、スルフォロブス・アシドカルダリウム（ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス種９ディグリース・ノース（９ｄｅｇｒｅ
ｅｓＮｏｒｔｈ）−７、サーモコッカス種ＪＤＦ−３、サーモコッカス・ゴル
ゴナリウス（ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、メタノバクテリウム・サーモオートト
ロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、メタノコッカス・ジャナスチイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノコッカス・ボルテ（ｖｏｌｔａｅ）、サーモ
プラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、サーモコッカス・フミコランス（ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）、ピロバクラム
・アイスランディカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、ア
エロピラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍｐｅｒｎｉｘ）、デスルフロコ
ッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌株Ｔｏｋ、及びサーモコッカス種
ＴＹ由来でありうる。それから前記古細菌ＤＮＡポリメラーゼが得られうるとこ
ろの関連した古細菌は、Archaea : A Laboratory Manual (Robb, F.T and Place
, A.R., eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
, 1995)中にも記載される。

【００５８】ある態様により、前記ポリメラーゼは、Ｐｆｕポリメラーゼ又はＰ．フリオサ
スｐｏｌIIポリメラーゼに関する。Ｐ．フリオサス複製因子のもつ機能と類似す
るＰｆｕポリメラーゼに関係する市販の酵素は；KOD (Toyoba), pfx (Life Tech
nologies Inc.), Vent (New England Biolabs), Deep Vent (New England Biola
bs), Pwo (Roche Molecular Biochemicals）、及びサーモコッカス・ゴルゴナリ
ウスからのＴｇｏ（Ｔａｑポリメラーゼと混合したポリメラーゼを含む、GC RIC
H OCR System and High Fidelity PCR Master Mix, Roche Molecular Biochemic
als)である。さらには、Ｐ．フリオサスｐｏｌIIサブユニットに対してＤＮＡ配
列相同性を示す遺伝子を含む古細菌が、参考文献中に記載される（Makinjemi, M
. et al. (1999) Trends in Biochem., Sci. 24 : 14-16; Ishino et al. (1998
) J. Bacteriol., 180 2232-6)。Ｐ．フリオサスｐｏｌIIとの配列相同性を有す
るそれらの古細菌ポリメラーゼは、本明細書に記載の複製補助因子の有する機能
と類似してもいる。

【００５９】ある態様において、前記古細菌因子は、耐熱性真正細菌ポリメラーゼと一緒に
使用されるか又は真正細菌ポリメラーゼと古細菌ポリメラーゼの混合物と一緒に
使用される。耐熱性真正細菌ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼのｐｏｌＩ，
ｐｏｌII又はｐｏｌIII クラスに結びつけられうる。耐熱性ｐｏｌＩＤＮＡポ
リメラーゼは、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種〔アクアティクス（ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、フラブス（ｆｌａｖｕｓ）、サーモヒルス（ｔｈｅｒｍｏｈｉｌｕｓ）ＨＢ−８、ルバー（ｒｕｂｅｒ）、ブロキアヌス（ｂｒｏｋｉａｎｕｓ）、カ
ルドフィウス（ｃａｌｄｏｐｈｉｕｓ）ＧＫ１４、フィリホルミス（Ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）〕、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種〔ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カルドテネックス（ｃａｌｄｏｔｅｎｅｘ）ＹＴ−Ｇ、カルドベラクス（ｃａｌｄｏｖｅｌａｘ）ＹＴ−Ｆ〕、及び
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ）中に発見
された。真正細菌ｐｏｌＩ酵素に関連した、市販の耐熱性酵素は、Taq (Stratag
ene) Tth (Perkin Elmer), Hot Tub/Tfl (Amersham), Klen Taq (Clone Tech),
Stoffel fragment (Perkin Elmer), UITma (Perkin Elmer), DynaZyme (Finnzym
es), Bst (New England Biolabs)、及びBca (Panvera）を含む。耐熱性ｐｏｌII
I ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Huang, et al. (1999) J . Mol. Evol. 48 : 756-69）及びサーマス・サーモフィルス（参考文献１３）に
示されたが、しかし他の好熱性真正細菌由来でありえた。付加的な好熱性真正細
菌は、参照文献：“Thermophilic Bacteria,”Kristjansson, J.K., CRC Press,
Inc., Boca Raton, Florida, 1992に記載される。

【００６０】ある態様において、前記核酸ポリメラーゼ反応をさらに促進するために、本発
明は、前記組成物中に古細菌ｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）をも含みうる。

【００６１】核酸ポリメラーゼ反応を促進する通例の方法と異って、本願発明は、少なくと
も１の古細菌複製補助因子を含む組成物の利用を含む、核酸ポリメラーゼ反応を
促進する方法の開示をもする。前述の方法は、着目の核酸の合成、増幅又は突然
変異誘導を促進するであろう。

【００６２】ある態様により、補助因子を含む、前記古細菌ポリペプチドは、あらゆる核酸
重合反応を促進する。前述の重合反応は、プライマー伸長反応、ＰＣＲ、突然変
異誘導、等温性の増幅、ＤＮＡシークエンシング、及びプローブ標識を含む。前
述の方法は、本分野でよく知られている。促進は、ヌクレオチドの取り込みの刺
激及び鋳型からのポリメラーゼの解離の減少により提供されうる。その上、促進
は、核酸鋳型における障害、例えば二次構造及び二重鎖ＤＮＡの減少により提供
されうる。ＲＦＡ，ＭＣＭ、及びヘリカーゼのような補助因子の追加を通じた、
前述の障害の克服又は改善は、重合反応がより正確に又は効率的に起こることを
許すことができ、あるいはより低い変性／伸長温度又は等温性の温度の使用を許
す。ＲＦＡ，ＭＣＭ、及びヘリカーゼは、長い対象の合成を助長することで、核
酸ポリメラーゼ反応の促進をもするであろう。ある態様により、ポリメラーゼ反
応は、これだけに制限されることなく、例えばＦＥＮ−１のようなヌクレアーゼ
により二次構造障害の除去により促進されうる（例えば米国特許出願第０９／４
３０，６９２号、１９９９年１０月２９日出願を参照のこと）。さらに他の態様
において、ＲＦＡ，ＭＣＭ、及びヘリカーゼは、一本鎖ＤＮＡを必要とする、非
重合的な用途において付加的な利益を提供しうる。例えばＲＦＡは、タンパク質
／核酸相互作用の特異性を向上しうる。

【００６３】ある態様により、単独又は他の補助因子とともにＰＣＮＡは、Ｐｆｕの３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性により実行される、エキソヌクレアーゼ反応を促進
しうる。エキソヌクレアーゼ反応は、長い一本鎖ＤＮＡ鋳型の調製に利用される
。促進は、鋳型からのポリメラーゼの解離の減少により提供されうる。

【００６４】重合促進及びエキソヌクレアーゼ反応に加え、ＰＣＮＡは、古細菌ポリメラー
ゼ、例えば、これだけに制限されることなくＰｆｕ又はＰ．フリオサスｐｏｌII
によって仲介され、そして付加的な修復タンパク質、例えばＦＥＮ−１及びリガ
ーゼを典型的に必要とする、修復過程を促進することが予想される。

【００６５】ある態様により、ＰＣＮＡは、補助的核酸鎖への核酸配列の結合に基づく過程
の促進に使用されることもできる。例えば相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖に対する標
識プローブのハイブリダイゼーションは、ライブラリー・スクリーニング、サザ
ン・ブロッティング、ノザン・ブロッティング、チップに基づく検出戦略、及び
Ｑ−ＰＣＲ検出戦略（例えば分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｅａｃｏｎ）ハ
イブリダイゼーション・プローブ）といった方法に使用される。それらの方法は
、本技術分野でよく知られている。例えばSambrook et al. (1989); Current Pr
otocols in Molecular Biology、(付録を含め1993-July, 2000）を参照のこと。
単独又は少なくとも１の他の古細菌ポリペプチドと一緒に、ＰＣＮＡを加えるこ
とによるアニールしたプローブの安定性の増加は、よりストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件、例えばより高い温度及び／又はより低いイオン強度の
使用を許すことにより、ハイブリダイゼーション反応の特異性を向上しうる。プ
ライマー／鋳型相互作用の安定性の増加は、当業者にＲＮＡポリメラーゼ、逆転
写酵素、及び他の核酸重合酵素を用いた、より効率的な重合反応の実施をも許し
うる。

【００６６】ある態様により、組成物及び方法は、これだけに制限されることなく、１以上
の、ＭＣＭ，ＰＣＮＡ，ＲＦＣ−Ｐ３８，ＲＦＣ−Ｐ５５，ＲＦＡ，ＣＤＣ６，
ＦＥＮ−１，ｄＵＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ２、ヘリカーゼ３、ヘリカーゼ４、ヘ
リカーゼ５、ヘリカーゼ６、ヘリカーゼ７、ヘリカーゼ８、及びヘリカーゼｄｎ
ａ２を含む付加的古細菌ポリペプチドとの取り合わせにおいてリガーゼを含む組
成物及び方法は、核酸ポリメラーゼ反応の促進のために提供される。

【００６７】本発明は、対象方法を迅速に実行するために設計されたキットをも提供する。
キットは、その方法を行う、２以上の成分をまとめることで、着目の方法の実行
を早めることに役立つ。キットは、好ましくは、最終使用者による計量の必要性
を最小限に抑えるために、前もって計量した単位量の形で成分を含む。キットは
、好ましくは、１以上の本発明の方法を行うための説明書を含む。好ましくは、
前記キット成分は、お互いに共同で働くために最適化されている。

【００６８】ある態様において、キットは、少なくとも１の古細菌複製補助因子を含み、さ
らにその反応を促進することが知られる他のタンパク質又は化合物を含むかもし
れない、核酸ポリメラーゼ反応実施のために提供される。ある態様において、前
記キットは、１以上のポリメラーゼをも含みうる。ある態様において、前記キッ
トは、着目の核酸の合成、増幅、標識、突然変異誘導又は検出のためにある。

【００６９】本発明のある態様は、以下の実施例に記載される。しかしながら、これらの実
施例は、単に本発明を説明する目的で提供されるものであって、本発明を制限す
るものではない。

【００７０】実施例方法１．ピロコッカス・フリオサスからの補助因子の生産Ａ．ＤＮＡ配列の同定／ＰＣＲプライマー着目のＤＮＡ配列を取り囲むＤＮＡ配列を、おそらく開始及び終止コドンであ
るとして検討した。着目のＤＮＡ配列の大部分を、着目の複製因子をコードする
真核生物遺伝子との類似を通して、古細菌ゲノム・データベース（ピロコッカス
・ホリコシイ、ピロコッカス・フリオサス、メタノコッカス・ジャナスチイ、メ
タノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）によって同定した（参考文献５
参照のこと）。また、ＰＣＮＡのオリゴヌクレオチド配列を、天然タンパク質標
本から単離したタンパク質のＮ末端ペプチド配列決定により同定した（以下参照
のこと）。以下の表１は、前記遺伝子の増幅及びクローニング・ベクターとの結
合末端を作り出すために、修飾されうる配列の作製に使用したＰＣＲプライマー
の一覧である。前記ベクターに合致する配列を下線で示す。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】

【００７３】Ｂ．ＰＣＲ増幅１）手順ＰＣＮＡ，ＲＦＣＰ９８／３８，ＲＦＣＰ５５，ＲＦＡ、並びにヘリカー
ゼｄｎａ２及びヘリカーゼ２−８を、表１のプライマーを用いて、さまざまなＰ
ＣＲ酵素及びポリメラーゼ混合物により増幅した。最適な増幅手順を以下に記載
した。

【００７４】ＰＣＲ反応混合物：１０μｌ１０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．８μｌ１００mM 全ｄＮＴＰｓ３μｌ混合プライマー（１００ng／μｌの各プライマー）１．５μｌＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１μｌゲノム又はプラスミドＤＮＡ（約１００ng／μｌ）８３．７μｌ水２）温度サイクルサンプルを、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（商標）温度サイクラー（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ）により増幅した。使用した伸長時間は、増幅産物サイズに比例した。
最も望ましくは、伸長時間は、１キロ塩基対当り２分である。アニーリング温度
は、Ｔｍ（融解温度）５０℃〜６０℃で、通常設計されるプライマーの長さ及び
組成から決定した。標準的温度サイクルの構成を以下に一覧した：９５℃ １分間１サイクル以下の３ステップを、連続的に行ない、かつ、３０サイクルくり返す：９５℃、１分間；５０℃、１分間；７２℃、２分間／kb標的遺伝子。

【００７５】Ｃ．ＰＣＲ産物のクローニング１）ＰＣＲ産物の精製３〜１０のＰＣＲ反応物を、各ＤＮＡ配列について生じた。前記ＰＣＲ産物を
混合し、そしてその説明書に従って、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｔｒａｔａＰｒ
ｅｐ（商標）ＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔにより精製した。前記
精製産物を、アガロースゲル（１％アガロース／１×ＴＢＥ）において調べ、産
物サイズ及び同種性を確認した。前記ゲルを、臭化エチジウムにより染色し、可
視化した。偽のバンドが存在した場合、正しいサイズの産物を、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅのＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｋｉｔにより単離した。

【００７６】２）挿入物の調製（連結独立クローニング（ＬｉｇａｔｉｏｎＩｎｄｅｐｅ
ｎｄｅｎｔＣｌｏｎｉｎｇ）（ＬＩＣ）法）３５μｌの精製ＰＣＲ産物を、以下のものを含む反応液に加えた：５μｌ１０×クローン化Ｐｆｕ緩衝液１μｌ２５mM ｄＡＴＰ１μｌクローン化Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ）そして各反応液の容量を、８μｌの水によって５０μｌにした。前記サンプルを
、ＲｏｄｏＣｙｃｌｅｒ（商標）温度サイクラー内、７２℃で２０分間インキ
ュベートした。この過程は、デオキシ・アデニン・ヌクレオチドに出会うまで前
記ＰＣＲ産物の３′末端の塩基を除去する、前記ポリメラーゼの３′→５′エキ
ソヌクレアーゼ活性を許す。前記反応液中のｄＡＴＰの存在は、前記ＰＣＲ産物
のさらなるエキソヌクレアーゼ加水分解による分解を妨げ、そしてそのむき出し
の５′突出は、ｐＣＡＬｎＥＫベクターと正確にアニールする。このベクターは
、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手でき、そして前記調製した挿入に対し
て相補的なアニーリング末端の作製に使用される。

【００７７】３）アニーリング前記処理したＰＣＲ産物を、まず室温にもどし、次に４０μｌの各調製挿入物
を、４０ngの前記ＬＩＣ準備済ｐＣＡＬｎＥＫベクターを含む別々のチューブに
加えた。サンプルを、混合し、室温で１６時間アニールさせた。

【００７８】Ｄ．形質転換アニールしたベクター／挿入物を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＥｐｉｃｕｒｉａ
ｎｃｏｌｉ（商標）ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（商標）ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎ
ｔｃｅｌｌという名称のコンピテント細胞内に形質転換し、そしてＬＢ−アン
ピシリン・プレートにより選択した。ＬＢ培地は、当業者により理解されるであ
ろう一般的に使用される試薬である。ＬＢ−アンピシリン・プレートを以下のも
のを混合することにより作製した：１０ｇ塩化ナトリウム５ｇ酵母抽出物１０ｇトリプトン１０ｇアガロース最終的な容量１ｌまで水を加える。オートクレーブにかける。５５℃まで冷ま
す。１００μｇ／mlの濃度までアンピシリンを加える。よく混ぜる。プレート当
たり約２５ml注ぎ込む。

【００７９】高次コイルＤＮＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＳｔｒａｔａＰｒｅｐ（商標）
ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔにおいて推奨された指示を用いて形
質転換体から分離した。前記プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰ
ｌｕｓ（商標）又はＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細
胞を形質転換するために使用した。これらの細胞を、ＬＢ−アンピシリン・プレ
ートにより再度選択した。

【００８０】Ｅ．組換えタンパク質の調製１）組換えタンパク質の細菌による発現前記形質転換体を、多数のリットルバッチによりオーバーナイトの培養から、
適度の通気をともない３７℃で、好ましくは、１００μｇ／mlのＴｕｒｂｏＡ
ｍｐ（商標）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により補足された
ＬＢ培地中で育てた。前記培養が、０．６〜１．０のＯＤ₆₀₀ 値に達したときに
、前記細胞を、１mM ＩＰＴＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により誘導し、そして
同じ方法で２時間〜オーバーナイト（１６時間）インキュベートした。誘導は、
前記ベクターに、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）アミノ・タグと一緒に
組換えタンパク質の産生を引き起こす。前記誘導された細胞を、遠心分離により
回収し、そして−２０℃で保存した。

【００８１】いくつかのヘリカーゼ・クローンは、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内で不安定なよ
うであるこれらのヘリカーゼを含む高次コイルプラスミドを、ＢＬ２１Ｃｏｄｏｎ
Ｐｌｕｓ（商標）細胞内に形質転換し、そしてＢＬ２１細胞内のタンパク質の重
要な産生を提供するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む、バクテリオファー
ジＬａｍｂｄａＣＥ６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と一緒にインキュベートした
。５〜１０mlの３×１０¹⁰プラーク形成単位（pfu ）／mlの（ＬａｍｂｄａＣ
Ｅ６Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供された
説明書に従って作製した）ＬａｍｂｄａＣＥ６ストックを、適度な通気をとも
なう、３７℃での４時間の５００ml培養の誘導に使用した。

【００８２】２）組換えタンパク質の精製凍結細胞を、カルシウム結合緩衝液：５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．０）、１
５０mM ＮａＣｌ、１mM酢酸マグネシウム、及び２mM ＣａＣｌ₂ と同一か又は
類似の緩衝液中に、約０．２５ｇ／mlの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液を、Ｂｒ
ｏｎＳｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒ２５０により８０％のデューティー・サイクル
（ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ）で、そして出力レベル５で４５秒間の超音波処理に３
回当てた。前記懸濁液を、超音波処理を実施していない間、冷却のために氷上に
放置した。前記ライゼートを、２６．８９０ｇでの遠心分離により清澄化した。

【００８３】前記清澄化したライゼートを、緩衝液により平衡化した１mlのカルモジュリン
・アガロース（ＣＡＭアガロース）に加えた。組換えタンパク質を、ゆるやかな
攪拌をともなう４℃でのインキュベートにより、前記ＣＢＰタグを介してＣＡＭ
アガロース（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に結合させた。２時間後、前記反応液を、
ＣＡＭアガロース及び組換えタンパク質を回収するために３０００×ｇで５分間
遠心分離した。前記ライゼートの上清を除き、そして前記ＣＡＭアガロースを、
先に記載した３０００×ｇ５分間の遠心分離によるＣＡＭアガロースの回収が
次に続く、５０mlのカルシウム結合緩衝液中への樹脂を再懸濁により、少なくと
も１回洗浄した。前記ＣＡＭアガロースを、ディスポーザブル１５mlカラムに移
し、詰め込み、そして次に少なくとも５０mlのカルシウム結合緩衝液により洗浄
した。組換えタンパク質を、５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．０）、１５０mM Ｎ
ａＣｌ、２mM ＥＧＴＡと同一か又は類似の緩衝液を使用することによりカラム
から溶出した。類似の緩衝液は、２mM ＥＧＴＡを含み、そして塩要求量は、タ
ンパク質間で変わる。あるタンパク質は、１ＭＮａＣｌを含む緩衝液を用いる
高いイオン強度での溶出を必要とした。ＳＤＳ泳動色素（Ｎｏｖｅｘ）と一緒に
トリス−グリシン４〜２０％アクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用いて、
タンパク質を、サイズ及び純度について評価した。ゲルを、銀又はＳｙｐｒｏ
Ｏｒａｎｇｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）により染色した。

【００８４】Ｆ．組換えＲＦＣＰ９８クローンからのインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）配列の
削除真核生物ＲＦＣ配列にアライメントすることにより、ＲＦＣＰ９８クローン
がインテイン配列を含むことに気づいた。図８において、インテイン配列を、カ
ッコで示し、そしてこれはヌクレオチド３７４位〜２０２８位に相当する。翻訳
後のインテインの削除について、ＲＦＣサブユニットの予想サイズは、９８kDa
から３８kDa に減少するであろう、そしてこのことから、このＲＦＣサブユニッ
トは、Ｐ３８と呼ばれる。前記ＲＦＣＰ９８クローンからの組換えＰ３８の発
現を改善するために、インテイン末端をコードする配列のすぐ上流と下流にプラ
イマーとして働く５′リン酸修飾したオリゴヌクレオチドを作ることによりイン
テインを削除した（表１中のＲＦＣＰ９８インテイン削除プライマー）。これ
らのプライマーは、インテインとは別の方向を向いている３′末端をもつよう設
計された（逆ＰＣＲ）。鋳型として前記ＲＦＣＰ９８／ｐＣＡＬｎＥＫプラス
ミドを使用することにより、前記プラスミド／挿入配列の全てを、インテイン配
列を除いて増幅した。１（Ｄ）項に記載のとおり、前記ＰＣＲ産物を、Ｓｔｒａ
ｔａＰｒｅｐＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔにより精製し、そし
て形質転換に先立って室温で１６時間連結した。

【００８５】２．タンパク質分析技術Ａ．抗体の調製特異的ＩｇＧを含むウサギ血清を、前記組換え補助因子によりウサギを免疫化
することによって調製した。ＣＢＰタグ融合タンパク質を、以下の免疫化計画を
用いた１〜２羽のニュージーランド白色ウサギの免疫化に使用した：各ウサギに
、完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）に含んだ９０〜２００μｇの（上記
１（Ｅ）（２）項より得られたＣＢＰタグ融合タンパク質を注射し；１８日後に
、各ウサギに不完全フロイント・アジュバント（ＩＦＡ）に含んだ４５〜１００
μｇＣＢＰタグ融合タンパク質の追加免疫注射をし；３９日後に、各ウサギに
ＩＦＡに含んだ４５−１００μｇＣＢＰタグ融合タンパク質の二次追加免疫注
射をし；そして血清サンプルを、４５日後から始めて、そしてその後は随時回収
した。

【００８６】Ｂ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ天然及び組換えタンパク質サンプルを、銀染色又はＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ
（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）のいずれかで染色した、４〜２０％ａ
ｃｒｙｌａｍｉｄｅ／２．６％ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅＴｒｉｓ−Ｇ
ｌｙｃｉｎｅｇｅｌ（ＮＯＶＥＸ）により分析した。タンパク質濃度を、Ｐｉ
ｅｒｃｅのクマシー・ブルー・アッセイ試薬を用いてウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）標準（Ｐｉｅｒｃｅ）と対応して又はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける相対的
染色強度の比較により決定した。

【００８７】Ｃ．ウエスタン・ブロットタンパク質サンプルを、標準的技術を用いた電気ブロットによりＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥからニトロセルロースへ移した。ブロットを、１％Ｂｌｏｔｔｏ／ＴＢＳ
（インスタント・ミルクを含むトリス緩衝化生理的食塩水）により室温で１時間
ブロックし、引き続き１：５００又は１：１０００に希釈した免疫化ウサギ血清
と一緒にインキュベートした（１時間）。ブロットを、０．０１％Ｔｗｅｅｎ
２０（商標）含有ＴＢＳにより３回洗浄した。次に前記ブロットを、ＴＢＳ−
０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）中に１：５００又は１：１０００に希釈
したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧと一緒に０．５〜１時間イ
ンキュベートした。最後に、前記ブロットを、上記同様に洗浄し、そして次に呈
色試薬（１００mMトリス−ＨＣｌ、pH９．５、１００mM ＮａＣｌ、５mM Ｍｇ
Ｃｌ₂ 、０．３mg／ml ＮＢＴ、及び０．１５mg／ml ＢＣＩＰ）中で約１〜１
０分間インキュベートした。前記酵素反応を止め、そして膜を滅菌水により５回
洗浄した。

【００８８】Ｄ．アミノ酸配列分析タンパク質サンプルを電気泳動し、そしてポリビニリデン・ジフルオライド（
ＰＶＤＦ）膜（ＢｉｏＲａｄ）に移した。Ｎ末端アミノ酸配列分析のためにホー
プ（Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）のＢｅｃｋｍａｎＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ−Ｃｉｔｙに送った。

【００８９】３．ゲノム・ライブラリーからの、組換えＲＦＣをコードするＤＮＡの単離（
代替法）ピロコッカス・フリオサス・ゲノム・ライブラリーを、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭ
ＲＦ’Ｅ．Ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上に、プレート当たり約２０００
プラークの密度で平板培養した。Ｄｕｒａｌｏｓｅフィルター（ナイロン裏張り
のニトロセルロース）を、各プレートからの複製リフト（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ
ｌｉｆｔｓ）を取るために使用された。最初のフィルターをプレート上に乗せた
とき、フィルターを通してプレートまで針を刺すことにより位置目印を、付けた
。前記の位置目印を、フィルターを取り除く前にプレートの裏にペンでマークし
た。前記フィルター・リフトを以下のとおり処理した：１．５〜２．０分１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨ２分０．５Ｍトリス（pH８．０）、１．５ＭＮａＣｌ３０秒２×ＳＳＣ、０．２Ｍトリス（pH７．５）処理後、前記フィルターにまだ湿気があるが、とどまっている水は見えなくなる
まで、それらをある程度乾かした。その説明書に従い、「自己連結（Ａｕｔｏｌ
ｉｎｋ）」形式を与えるＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に
より、ＵＶクロスリンク形成によってＤＮＡを、フィルター上に固定した。

【００９０】前記フィルターを、１５mlの以下の溶液中でプレハイブリダイズした：５×ＳＳＣ４０mM ＮａＰＯ₄ （pH６．５）５×デンハート液５％デキストラン硫酸５０％ホルムアミド０．１mg／ml サケ精子ＤＮＡ（使用直前に解離のため煮沸し、そして加えた
）プレハイブリダイゼーションを、４２℃で約２時間行った。

【００９１】以下のプライマーを用いてメタノコッカス・ジャナスチイ・ゲノムＤＮＡから
増幅した２００bpのＰＣＲ産物からプローブを作製した：オリゴ＃５７６：ＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴ（配列番号：）オリゴ＃５７７：ＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＴ（配列番号：）これらのＰＣＲプライマーを、ヒトからのＲＦＣ遺伝子に対して５２％のアミノ
酸一致を示すメタノコッカス・ジャナスチイ遺伝子の配列の２００bp側方の領域
にアニールするように設計した（下記の結果第２項を参照のこと）。

【００９２】前記ＰＣＲ産物を、遊離プライマー、緩衝液、及びヌクレオチドから精製した
。５０ngの前記産物を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｒｉｍｅ−Ｉｔ II Ｒａｎ
ｄｏｍＰｒｉｍｅｒＬａｂｅｌｉｎｇｋｉｔを用いて³²Ｐ−ｄＡＴＰによ
り標識した。前記プローブを、遊離ヌクレオチドから精製した後に、５分間煮沸
し、そしてプレハイブリダイゼーション反応液に加えた。前記プローブ³²Ｐ標識
総量を、毎分２０００万カウント（cpm ）にするように計算した。ハイブリダイ
ゼーション溶液を除く前に４２℃でオーバナイト、ハイブリダイゼーションを続
け、そしてフィルターを０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより６０℃（ひじ
ょうにストリンジェントな条件）で４回洗浄した。そのフィルターをＸ線フィル
ムにオーバナイト晒し、そして両複製フィルター上の強いシグナルをもつ２０個
の一次単離体を選んだ。

【００９３】３つの一次単離体を希釈し、平板培養し、そして上記と同じ方法を用いてスク
リーニングした。２枚のフィルターが陽性ラムダ・クローンを生じた。ブルース
クリプト・プラスミド・クローンを、製造業者の説明書に従って、ＳＯＬＲｃ
ｅｌｌｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内のラムダ・クローンから削除した。前記ク
ローンは、８kb及び１０kbのサイズの挿入物を有する。これらのプラスミド・ク
ローンを、ＨｉｎｄIII により切断し、ブロットし、そして前述の初めの２００
bpメタノコッカス・ジャナスチイゲノムＲＦＣのＰＣＲ増幅産物によりプローブ
した。一方の陽性切断クローンを、単離し、そして挿入物の各末端から配列決定
した。前記配列決定は、２つのＲＦＣ配列、具体的に言うとＣ末端である１の配
列とＮ末端である他の配列を示した。

【００９４】４．天然起源からの補助因子の生産Ａ．Ｐ．フリオサスからの抽出Ｐ．フリオサスＤＳＭ３６３８細胞の発酵を、Archaea : A Laboratory Man
ual, Robb, F.T. (editor-in-chief), Cold Spring Harbor Press, CSH, NY 199
5 に記載の手順を用いて行った。その細胞ペーストを、溶解緩衝液（５０mMトリ
ス−ＨＣｌ（pH８．２）、１mMエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１０mMベ
ータ−メルカプトエタノール（−ＭＥ）、０．５mMフッ化フェニルメチルスルフ
ォニル（ＰＭＳＦ）、及び２mg／mlアプロチニン）に再懸濁し、フレンチプレス
により溶解し、そして超音波処理した。前記超音波処理物を、遠心分離し、そし
て上清をクロマトグラフィー用に回収した。

【００９５】Ｂ．カラム・クロマトグラフィー前記上清を、５０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．２）、１mM ＥＤＴＡ、及び１０
mM−ＭＥにより平衡化したＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗｃｏ
ｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるカラムクロマトグラフィーにかけた。流
れ出た画分を回収し、pH７．５に調整し、次にＳＰＳｅｐｈａｒｏｓｅＢｉ
ｇＢｅａｄｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）そして緩衝液Ａ（５０mMト
リス−ＨＣｌ（pH７．５）、１mM ＥＤＴＡ、１mMジチオスレイトール（ＤＴＴ
）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｖ／ｖ）ｌｇｅｐａｌＣＡ−
６３０、及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）により平衡化した。前記カ
ラムを、０〜０．２５ＭＫＣｌ勾配／緩衝液Ａにより溶出した。ＤＮＡポリメ
ラーゼ活性を有する画分を、透析し、次にＨｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に供し、そして緩衝液Ｂ（
pH８．２を除いて緩衝液Ａと同じ）により平衡化した。前記カラムを０〜０．３
ＭＫＣｌ勾配／緩衝液Ｂにより溶出した。（以下の５（Ｂ）項に記載の分析を
用いて）活性（ヌクレオチド取り込み）又は（先の２（Ｃ）項に記載のウエスタ
ン・ブロットを用いて）免疫交差反応性を増加させるポリメラーゼを示す画分を
同定した。天然ＰＣＮＡを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからタンパク質を切除するこ
とによりさらに精製した。

【００９６】Ｃ．イムノアフィニティー・クロマトグラフィーイムノアフィニティー・カラムを、製造業者の方法により、ＩｍｍｕｎｏＰｕ
ｒｅＰｌｕｓｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅｃａｔ＃４４８９３）を用いて調製し
た。２ミリリットル（ml）の血清を２mlのキット泳動／結合緩衝液と混合したも
のを、各カラムの調製に使用した。前記カラムを使用する前に、カラムと緩衝液
を室温まで温める。

【００９７】１）抽出物の調製５００mgの凍結Ｐ．フリオサス細胞を、各カラムに用いた。前記細胞を２mlの
溶解緩衝液（５０mlトリス（pH８．０）、１mM ＥＤＴＡ、及び１mM ＤＴＴ）
中に溶解し、そして氷上、２分間２回超音波処理した。前記細胞を、２６，８９
０ｇで１５分間遠心分離し、そして上清を回収した。前記ライゼートを等量の結
合緩衝液（１０mMトリス（pH８．０）、５０mM ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ
８０）と混合した。このライゼートを、４mlのｐｒｏｔｅｉｎＡｂｅａｄ
ｓ（Ｐｉｅｒｃｅｃａｔ＃２０３３３）と一緒にインキュベートすることで前
もって清澄化した、そして結合緩衝液により平衡化した。前記スラリーを、攪拌
しながら４℃で１時間インキュベートした。前記前もって清澄化した抽出物を、
使い捨てカラムの中にそのビーズを詰めることにより回収し、そして透過液を集
めた。前記カラムを２mlの結合緩衝液により洗浄し、そしてその洗浄液を集め、
そして前記透過液と一緒に貯留した。前もって清澄化したライゼートの最終容量
は約６mlである。いくつかの場合において、前記ライゼートをその後プレブリー
ド・ウサギＩｇＧ対照カラムに流し、さらに精製した。

【００９８】２）イムノアフィニティー・クロマトグラフィー前記カラムを、１５mlの結合緩衝液（１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．０）、５
０mM ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）により平衡化し、そして次に６ml
の前処理ライゼートをカラムに供した。前記カラムを１０mlの結合緩衝液により
洗浄し、引き続き１０mlの洗浄緩衝液（１０mMトリス（pH８．０）、５００mM
ＫＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０）により洗浄した。特異的タンパク質を、
溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン、pH２．８）の１mlずつ７回の洗浄により溶出し
た。１mlずつ画分を試験管に集めた。それらを集めた際に、溶出液のpHを上げる
ために５０μｌの１ＭトリスpH９．５を各収集試験管に加えた。着目のタンパク
質の溶出の後、カラムを４mlの１ＭトリスpH８．０そして次に１５mlの結合緩衝
液により洗浄した。

【００９９】５．生化学的アッセイＡ．プライマー伸長アッセイ前記ピロコッカス・フリオサス補助因子を、Ｐｆｕポリメラーゼ及びプライム
された一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを含む核酸ポリメラーゼ反応を促進する能力につい
て試験した。このアッセイの第１のバージョンは、非変性条件下、臭化エチジウ
ム染色を用いて伸長産物の検出のために提供した。このアッセイについて、反応
混合物を以下を含み作った：５ｇ／ml一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｃａｔ＃２７−１５４６−０１）２７５ng／ml ４０−ｍｅｒプライマー（５′ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣ３′）（配列番号：）２００Ｍ各ｄＮＴＰ１× ｃＰｆｕ緩衝液ｗａｔｅｒで２０μｌに調整一本鎖Ｍ１３ＤＮＡをプライマー、緩衝液、及び水と混合した。その混合物を
、２分間９５℃まで加熱し、そしてその後室温まで冷ました。前記反応成分の残
りを加えた。２０μｌの各反応液は、０．０５単位のクローン化Ｐｆｕポリメラ
ーゼ並びにさまざまな量のＰＣＮＡ及びＲＦＣを含んだ。ポリメラーゼ反応のＲ
ＦＣ促進を評価するために、アッセイは、０．０２５μｌのＰ．フリオサスＰＣ
ＮＡ（約１ng）及びさまざまな量の天然Ｐ．フリオサスＲＦＣを含んだ。その反
応液を、７２℃で１５分間インキュベートした。２μｌのＤＮＡ添加色素（５０
％グリセロール、１×ＴＢＥ、０．０５％ブロモフェノール・ブルー＋０．０５
％キシレン・シアノール）を、各サンプルに加え、そして１５μｌの色素含有サ
ンプルを、１％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ（Ｒｅｌｉａｎｔ，ＦＭＣｃａｔ＃
５４９０７）の各ウェルに供し、そして電気泳動した。そのゲルを臭化エチジウ
ムにより染色した。二本鎖Ｍ１３は、二本鎖Ｍ１３ＤＮＡ標準の移動の位置近
似する１２kbマーカーより高分子側に移動した、明るく染色される産物として確
認された。このアッセイにおいて、当業者は、ＰＣＮＡ又はＲＦＣと取り合わせ
たＰＣＮＡをＰｆｕに加えた場合に合成された産物のサイズの増加を調べる。臭
化エチジウム染色は、プライムされた一本鎖Ｍ１３鋳型から産生された二本鎖Ｄ
ＮＡの量に比例する。このゲルに基づくアッセイの第２のバージョンは、変性条
件下、放射線ラベルした伸長産物の検出を許す。前記４０bpプライマーを〔−³² Ｐ〕ＡＴＰ（＞５０００Ci／mmole ）及びＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼによ
り５′末端でリン酸化したことを除いて、同じ鋳型を用いた。その標識オリゴを
、ＮｕｃＴｒａｐｐｒｏｂｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて精製し、そして等しいモル濃度（１００nM）で一
本鎖Ｍ１３とアニールさせた。その反応混合物は以下を含む：９．５ｇ／ml一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５２ng／ml ４０−ｍｅｒプライマー、上記（配列番号：）１００Ｍ各ｄＮＴＰ１×クローン化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ緩衝液そして水で５０μｌに調整一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを、プライマー、緩衝液、及び水と混合した。その混合
物を２分間９５℃まで加熱し、その後室温まで冷ました。前記反応成分の残りを
加えた。各反応液は、希釈したクローン化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ並びに異
なる量のＰＣＮＡ及びＲＦＣを含んだ。反応液を、１〜３０分間の範囲のさまざ
まな時間、７２℃でインキュベートした。その反応を３．３μｌの停止色素（９
５％ホルムアミド／２０mM ＥＤＴＡ／０．０５％ブロモフェノール・ブルー／
０．０５％キシレン・シアノール）添加により止めた。その反応混合物を、次に
６〜８％変性ゲルを用いたポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に供した。そのゲ
ルを乾かし、そして放射線写真撮影フィルムに当てた。過剰量のクローン化Ｐｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼをともなう、３０分間のプライマー伸長の実施により、
完全長の伸長産物のサイズを決定した。

【０１００】Ｂ．ヌクレオチド取り込み刺激補助因子を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ又はＰ．フリオサスｐｏｌII ＤＮ
ＡポリメラーゼによるｄＮＴＰ取り込みを増加させる能力についても試験した。
このアッセイは、ＤＥ８１ろ紙に結合した高分子量ＤＮＡを単離、そしてカウン
トすることによりｐｒｉｍｅｄＭ１３ＤＮＡ内に取り込まれたｄＮＴＰを計
測することを含む。反応混合物を以下のとおり調製した：４ｇ／ml一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２１９ng／ml ４０−ｍｅｒ（上記５（Ａ）項を参照のこと）（配列番号：）１×クローン化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）３００Ｍ各ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ３０ＭｄＴＴＰ５Ｍ ³Ｈ−ＴＴＰ（ＮＥＮＮＥＧ−２２１Ｈ）１０μｌの反応混合物に０．０２５単位クローン化Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）又は０．０５単位Ｐ．フリオサスのいずれかを加えた。Ｐ．フ
リオサスｐｏｌII配列を、記載されたＤＮＡ配列を用いてＰＣＲ増幅し（Uemori
et al., Genes to Cells 2 : 499-512 (1997)）、そして組換えＣＢＰ−ＤＰ１
／ＤＰ２ポリメラーゼをクローンし、発現し、そして先に略述した手順を用いて
第１項に記載のとおり精製した。ＰＣＮＡによる促進（図４２のデータ）の温度
依存性をアッセイするために、６６〜９９℃の範囲にわたるインキュベート温度
を用いて、１００ng ＰＣＮＡの存在又は非存在において１０分間、反応を行っ
た。

【０１０１】前記伸長反応を氷上で抑え、そして次に５μｌのアリコートを直にＤＥ８１フ
ィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）上にスポットした。取り込まれなかった〔 ³Ｈ〕Ｔ
ＴＰを、２×ＳＳＣ（０．３ＭＮａＣｌ、３０mMクエン酸ナトリウム、pH７．
０）による６回の洗浄で除き、引き続き１００％エタノールにより１回洗浄した
。取り込まれた放射活性を、シンチレーション・カウンターにより計測した。

【０１０２】２００mM ＫＣｌを反応混合物に加えることを通して、ｄＮＴＰ取り込みをバ
ックグラウンド・レベルまで小さくすることにより、向上したＰＣＮＡの検出を
許すように、このアッセイは、変更されうる。単独又は他の補助因子と取り合わ
せて、ＰＣＮＡは、ＰｆｕのＤＮＡポリメラーゼ活性の回復により検出されうる
。

【０１０３】このアッセイ混合物は以下を含む：１０ｇ／ml一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｃａｔ＃２７−１５４６−０１）１００ng／ml ４０−ｍｅｒプライマー（ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣ）（配列番号：）１× ｃＰｆｕ緩衝液２００mM ＫＣｌ各３０ＭｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ３ＭｄＴＴＰ５Ｍ ³Ｈ−ｄＴＴＰ（ＮＥＮｃａｔ＃ＮＥＴ−２２１Ｈ）（１００Ci／mL）１００Ｕ／ml クローン化Ｐｆｕポリメラーゼ組換え補助因子又は天然Ｐ．フリオサス由来の画分を、先の混合物に対してポリ
メラーゼ活性回復能力についてアッセイした。１μｌのサンプルを、１０μｌの
反応混合物に加え、そして反応液を７２℃で３０分間インキュベートした。その
反応混合物を、次に洗浄し、そして前記のとおりカウントされるところのＤＥ８
１ろ紙上にスポットした。

【０１０４】Ｃ．ＡＴＰａｓｅアッセイ先の実施例１Ｅの記載により得られたＲＦＣ又はヘリカーゼ標本１μｌを、１
μｌの１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．３）、３．５mM ＭｇＣｌ₂ 、及び７５mM
ＫＣｌ中の４．５ＭＡＴＰ及び１Ciのガンマ標識³³Ｐ−ＡＴＰ（³³Ｐ−−ｄ
ＡＴＰ）と一緒にインキュベートした。そのサンプルを７２℃で２０分間インキ
ュベートし、次にＰＥＩセルロースＦ（ＥＭＳｃｉｅｎｃｅ）上にスポットし
た。乾燥後、そのＰＥＩセルロースを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とし
て、０．４ＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ 、pH３．５の浅い容器に移した。その液体先端は
、４〜５cm移動させることが許され、その後それを液体から取り上げ、そして乾
燥した。そのサンプルを１時間Ｘ線フィルムに当てた。前記サンプルを、液体先
端と一緒に移動した放射活性含有量として観察したＡＴＰａｓｅ活性含有量につ
いて測定した。陽性対照（ブタＡＴＰａｓｅ）は、³³Ｐ−−ｄＡＴＰをｄＡＤＰ
＋³³Ｐ−Ｐに変える。³³Ｐ−−ｄＡＴＰ基質がその起源付近にとどまる一方で、 ³³ Ｐ−Ｐ産物は、ＴＬＣ条件下、液体先端とともに移動する。いくつかのケース
において、前記産物スポットをＰＥＩプレートから削って、次にシンチレーショ
ン・カウンターによりカウントすることで、産物を定量化した。

【０１０５】Ｄ．ゲル・シフト・アッセイ３８塩基オリゴ（５′ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡ
ＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３′）（配列番号：）を、ＲＦＡサンプルと一緒
に９５℃で１０分間インキュベートし、引き続き７２℃で２分間インキュベート
し、その後１×ＴＢＥ緩衝液中で４〜２０％アクリルアミド勾配ゲル（Ｎｏｖｅ
ｘ）に供した。バンドをＳＹＢＥＲｇｒｅｅｎ染色（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ）及びＵＶ照明により可視化した。ＤＮＡ結合活性は、ＲＦＡ存在中
の前記オリゴの移動における遅れ（より高分子側のバンド）について調べること
により観察される。一本鎖ＤＮＡ結合活性は、二本鎖ＤＮＡの二重鎖を用いると
シフトしないがしかし、一本鎖オリゴを用いるとバンド位置のシフトを示すこと
により証明された。図１８を参照のこと。

【０１０６】ＰｆｕＲＦＡは、４−システイン−タイプ・ジンク・フィンガー・モチーフ
を含むことが観察された（Ｘ₃ ＣＸ_2-4 ＣＸ_12-15 ＣＸ₂ Ｃ；水素は、炭素の許
容しうる代替物である）。このモチーフは真核生物ＲＦＡにおけるＤＮＡ結合に
重要でないと思われているが、最近の刊行物は、システイン残基の酸化が一本鎖
ＤＮＡ結合の著しい減少の原因となることを明らかにしている（Park et al., J
. Biol. Chem. 274 : 29075-80 (1999))。先の１，Ｅ，２項において得られたＲ
ＦＡ−ＣＢＰを還元剤不存在下、精製したため、私たちは還元条件下、ジンク・
フィンガー・モチーフを再構成した。１μｌの１００mM ＤＴＴ、１０mM Ｚｎ
Ｃｌ₂ を、５０mMトリス、pH８．０、１２５mM ＮａＣｌ中の精製ＲＦＡ−ＣＢ
Ｐタンパク質１０μｌに加えた。この混合物を７４℃で１０分間加熱し再構成Ｒ
ＦＡを製造した。

【０１０７】ゲル・シフト・アッセイを以下のとおり行った。１又は５μｌの再構成ＲＦＡ
を、０．１mM ＥＤＴＡ含又は不含の、１０mMトリス、pH８．０中に５．５ng／
μｌの一本鎖ＤＮＡオリゴマーＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＧ
ＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＡ
ＣＣ（配列番号：）を含む溶液９μｌと混合した。そのサンプルを室温で５分間
インキュベートし、次に３μｌの６×添加色素と混合し、そして４〜２０％アク
リルアミド勾配ゲルに供した。ブロモフェノール・ブルー色素がゲルの長さの２
／３まで移動したとき、ゲルをＳＹＢＲｇｒｅｅｎ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｎｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、そしてＵＶ光下で調べた。

【０１０８】図５４に見られるとおり、再構成ＲＦＡが一本鎖オリゴヌクレオチドの電気泳
動移動度を遅らせたことは、再構成ＲＦＡが前記オリゴマーに結合したことを示
している。レーン１は、水中の前記オリゴマーの電気泳動での移動を示す（陰性
対照）。レーン２は、１ｇＥ．ｃｏｌｉＳＳＢの存在下でのオリゴマーの移
動を示す（陽性対照）。レーン３及び４は、１ｇ（レーン３）又は５ｇ（レーン
４）のＰｆｕＲＦＡ−ＣＢＰタンパク質存在下でのオリゴマーの移動速度を示
す。したがって、これらの条件下、前記再構成ＰｆｕＲＦＡ−ＣＢＰは、対照Ｅ．ｃｏｌｉＳＳＢタンパク質とほぼ同じ位オリゴマーの移動への結合におい
て有効であった（レーン２と３を比べると、Ｅ．ｃｏｌｉＳＳＢはＳＹＢＲ
ｇｒｅｅｎシグナルの強度を多少抑制するらしいことに留意のこと）。

【０１０９】Ｅ．ヘリカーゼ・アッセイ３′突出又は５′突出を有する放射活性標識オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアニールした。その反応液を、５０mMト
リス−ＨＣｌ、pH８．５、２５mM ＫＣｌ、及び５mM ＡＴＰ中、Ｐ．フリオサ
ス・ヘリカーゼ０．５μｌ、並びに５mM ＡＴＰと一緒に５５℃で３０分間イン
キュベートした。陽性対照を、泳動前にアニールしたｏｌｉｇｏを温度により解
離させることで作製した。前記サンプルを、１×ＴＢＥ中の４〜２０％アクリル
アミド勾配ゲルで泳動した。そのゲルを乾かし、そしてＸ線フィルムに当てた。
ヘリカーゼ活性を有するサンプルは、一本鎖Ｍ１３ＤＮＡから、アニールした
放射線標識オリゴを外すであろう。そのヘリカーゼに外されたオリゴは、加熱に
より融解したオリゴ（遊離オリゴ）と同じ移動度で、ゲル内を移動するであろう
。ヘリカーゼ活性を欠いたサンプルにおいて、オリゴは、Ｍ１３に結合されたま
まで、「鋳型のみ」の対照に近い、異なる位置に移動するであろう。

【０１１０】６．ＰＣＲ反応ＰＣＲ反応を、標準的な条件下で行った。一般的に、増幅反応液（５０μｌ）
は、２００〜５００Ｍの各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液、５０〜２５０ngのヒト
・ゲノムＤＮＡ鋳型（又は１００〜２００ngのＳｔｒａｔａｇｅｎｅの０．５kb
標的のためのＢｉｇＢｌｕｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｏｕｓｅｇｅｎｏ
ｍｉｃＤＮＡ）、１００ngの各プライマー、及び２．５〜５ＵのＴａｑＰｌｕ
ｓ（商標）ＬｏｎｇＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｂｌｅｎｄ，ＰｆｕＴｕ
ｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑ２０００ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）ポリメラーゼを含む。ＴａｑＰｌｕｓ（商標）ＬｏｎｇＰＣＲｓを、以
下を含む１×緩衝液中で行った：５０mMトリシンpH９．０、８mM硫酸アンモニウ
ム、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２．３mM ＭｇＣｌ₂ 、及び７５ｇ／ml Ｂ
ＳＡ。ＰｆｕＴｕｒｂｏ又はＴａｑ２０００ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣ
Ｒｓを、それらの酵素とともに提供されたＰＣＲ緩衝液により実施した（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）。ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼによる標的＞１７kb
の増幅は、１．５×反応緩衝液及び５００μＭの各ｄＮＴＰを利用した（Borns,
M. et al., Stratagene Newsletter 13 : 27-30, 2000）。１７kb β−グロビ
ン標的の増幅に使用したＰＣＲプライマーの配列を、以下に示す。以下のいずれ
かの温度サイクラーを用いて、２００μｌ容の薄い壁のチューブ中で反応を反復
した：Stratagene RoboCycler（登録商標）96 temperature cycler（ホット・ト
ップ・アッセンブリー（hot top assembly）に適する）, Perkin Elmer GeneAmp
PCR System 9600、又はMJ Research PTC-200 Peltier thermocycler。

【０１１１】ＰＣＲプライマー配列は以下のとおりである：１７kb−グロビン正プライマー：５′−ＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＡＴＴ（配
列番号：）負プライマー：５′−ＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴ
ＣＡＧＧ（配列番号：）２３kb−グロビン正プライマー：５′−ＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＡＴＴ（配
列番号：）負プライマー：５′−ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴ（配列番号
：）３０kb−グロビン正プライマー：５′−ＣＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＴＡＣＡ
ＣＡＣＣ（配列番号：）負プライマー：５′−ＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＴ（配列番
号：）２．１kbアルファー１抗トリプシン正プライマー：５′−ＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣ（配列
番号：）負プライマー：５′−ＧＡＡＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧ（配列番
号：）５．２kbアルファー１抗トリプシン正プライマー：５′−ＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣ（配列
番号：）負プライマー：５′−ＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＧＧ（配列番号
：）０．５kb／ｌａｃＩ（トランスジェニック・マウス・ゲノムＤＮＡ）ラムダ・プライマー：５′−ＧＡＣＡＧＴＣＡＣＴＣＣＧＧＣＣＣＧ（配列番号
：）ｌａｃＺプライマー：５′−ＣＧＡＣＧＡＣＴＣＧＴＧＧＡＧＣＣＣ（配列番号
：）以下の温度反復条件を、２３及び３０kb−グロビン標的に使用した：９２℃、
２分間（１回）；９２℃、１０秒間、６５℃、３０秒間、６８℃、２５分間（１
０回）；９２℃、１０秒間、６５℃、３０秒間、６８℃、２５分間（各回の伸長
時間に連続的に加えた１０秒の増加を有する）（２０回）。２．１及び５．２kb
標的を以下のとおり増幅した：９５℃、１分間（１回）；９５℃、１分間、５８
℃、１分間、７２℃、２分間（２kb標的において）又は５分間（５．２kb標的に
おいて）（３０回）；７２℃、１０分間（１回）。０．５kb標的を以下のとおり
増幅した：９４℃、１分間（１回）；９４℃、１分間、５４℃、２分間、７２℃
、１．５分間（３０回）；７２℃、１０分間（１回）。

【０１１２】結果１．ＰＣＮＡＰ．フリオサスＰＣＮＡは、天然Ｐ．フリオサス抽出物の分留の間に生じたカ
ラム画分中に最初に同定された。ＰＣＮＡを、前述のＱ及びＳＰカラム法の間に
ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼと一緒に補足精製した。ＰＣＮＡ活性ピークを、ヘ
パリン・セファロース・カラムを用いてＤＮＡポリメラーゼ活性ピークと区別す
ることができたが、しかし全てのＰＣＮＡ含有画分は、ＤＮＡポリメラーゼ活性
と混在した。

【０１１３】天然ＰＣＮＡ単離のために、ＤＮＡポリメラーゼ活性を塩不活化ＰｆｕＤＮ
Ａポリメラーゼに回復しうる画分を、研究した。上述の「回復（ｒｅｓｔｏｒａ
ｔｉｏｎ）」活性をヘパリン・セファロースから溶出したカラム画分について検
出した（図１）。活性カラム画分を、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてゲル
切片を削り取り、そしてタンパク質を除くために抽出した。ＤＮＡポリメラーゼ
活性を、６４〜９８kDa のタンパク質の移動に一致するゲル中の位置から回収し
たゲル切片中に発見した。これに対し、ＰＣＮＡ活性を、３０と３６kDa のタン
パク質マーカーの間の位置を占めるゲル切片から回収した（図２）。３５kDa に
移動するタンパク質のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で可視化した。このタン
パク質をＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移し、そして
アミノ末端シークエンシングに出した。前記３５kDa タンパク質のＮ末端配列は
、ＰＦＥＩＶＦＥＧＡＫＥＦＡＱＬＩＤＴＡＳＫＬ（Ｈ／Ｉ）ＤＥＡＡＦＫＶＴ
ＥＤＧ−−ＭＲ（配列番号：）であった（ここで（Ｈ／Ｉ）はいずれかのアミノ
酸が存在しうることを意味し、そして−は、あらゆるアミノ酸が存在しうること
を意味する）。ＤＮＡデータ・ベースのＢＬＡＳＴ検索は、前記３５kDa タンパ
ク質を既知の真核生物ＰＣＮＡ配列に対して有意な相同性を示すものとして同定
した。

【０１１４】Ｐ．フリオサスＰＣＮＡをコードする配列を、表１に示したＰＣＮＡＰＣＲ
プライマーを用いてｐＣＡＬｎＥＫ内にクローニングした。ピロコッカス・ホリ
コシイ・ゲノム配列データベースにより同定されたＰＣＮＡのＤＮＡ配列を用い
てプライマーを設計した。ピロコッカス・ホリコシイはピロコッカス・フリオサ
スに関連性が高い。推定のピロコッカス・ホリコシイＰＣＮＡの翻訳Ｎ末端は、
化学的に決定した天然ピロコッカス・フリオサスＰＣＮＡのＮ末端配列に一致す
る。ピロコッカス・フリオサスＰＣＮＡをコードするｐＣＡＬｎＥＫクローンの
ＤＮＡ配列は、図３に示され、そしてその予想されるアミノ酸配列を図４に示す
。Ｐ．フリオサスＰＣＮＡの予想される分子量は２８kDa であるが、ＥＫ−切断
した組換えＰＣＮＡと天然ＰＣＮＡの見かけ上の分子量は、それぞれ３８と３５
kDa である。

【０１１５】塩不活化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによるヌクレオチド取り込み刺激に加え
て、両天然及び組換えピロコッカス・フリオサスＰＣＮＡ標本は、Ｐｆｕのプロ
セシビティーの著しい増加を示した。ＰＣＮＡを、一本鎖Ｍ１３鋳型にアニール
した５′放射線標識プライマーを含むプライマー伸長反応に加える場合、早い時
点で産生される産物の大部分は、完全長であり、そしてより少数の短かい切断さ
れた産物が蓄積した（図５）。これらの結果は、ＰＣＮＡが、Ｐｆｕポリメラー
ゼのプロセシビティーを増加することにより（ポリメラーゼ当りの加えられた塩
基の数／ＤＮＡ結合現象）、そしてヌクレオチド取り込みの全体的な速度の上昇
により（単位時間当りの取り込んだヌクレオチド）、この核酸ポリメラーゼ反応
を著しく促進することを示す。

【０１１６】Ｐ．フリオサスｐｏｌII ＤＮＡポリメラーゼに対するＰＣＮＡの影響をも試
験した。ＰＣＮＡは、Ｐｆｕポリメラーゼ及びＰ．フリオサスｐｏｌII ＤＮＡ
ポリメラーゼの両者によりｄＮＴＰ取り込みを刺激することが示された。興味深
いことに、ＰＣＮＡの添加は、両ＤＮＡポリメラーゼの至適反応温度を変えた。
なぜならＤＮＡ二重鎖は、上昇した温度では不安定であるため、超好熱古細菌の
至適生育温度（＞１００℃）に達する温度で核酸ポリメラーゼ反応を実施するこ
とは困難であった。図４２に示すＭ１３／４０−ｍｅｒ二重鎖について、７５℃
超の温度は鋳型の不安定状態を生じ、７２〜８０℃の両ポリメラーゼの活性の下
落と一致する。しかしながら、ＰＣＮＡの存在下において、前記プライマー／Ｍ
１３二重鎖は、Ｐｆｕ（ｐｏｌＩ）及びＰ．フリオサスｐｏｌII ＤＮＡポリメ
ラーゼによるなおいっそう高いプライマー伸長活性を導き、７２℃超の温度で安
定化されているように見える。したがって、Ｍ１３／オリゴ二重鎖は、約８０℃
より高い温度でアニールしたままである。

【０１１７】これらのデータは、ＰＣＮＡの添加が、重合速度、並びにＰｆｕ（ｐｏｌＩ）
及びＰ．フリオサスｐｏｌII ＤＮＡポリメラーゼのプロセシビリティーの促進
と並んで他の利点をもちうることを示す。ＰＣＮＡの使用は、特定の核酸ポリメ
ラーゼ反応の促進により、現在まで実行されてきたよりも高い温度でのこれら超
好熱性酵素の使用を許すはずである。ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ配列決定、及び等温度
増幅反応は、プライマー／鋳型二重鎖の安定性を守るために７２℃以下の伸長温
度を利用する。しかしながら、この温度は、Ｐ．フリオサスのような超好熱古細
菌からのＤＮＡポリメラーゼの予想される至適温度より相当低い。（至適反応温
度の近くで行われることによる）ポリメラーゼ活性の増加及びＤＮＡ鋳型内の二
次構造からの阻害の減少といった利点を有するであろう、これらの重合反応中の
上昇した伸長温度（例えば８０℃超）の使用を可能にしうる。

【０１１８】さらに、ＰＣＮＡによるプライマー／Ｍ１３ＤＮＡ二重鎖の明らかな安定化
は、核酸二重鎖の高い安定性を必要とする適用の改良において有用性をもちうる
。例えば、よりストリンジェントなアニーリング温度又は反応条件（より低いイ
オン強度）の使用を許すことにより、ＰＣＮＡは、プローブ・ハイブリダイゼー
ション反応の特異性を向上しうる。他の補助因子なしにＰＣＮＡをＰＣＲ増幅反
応に加えることの影響を試験した。他の補助因子の不存在下において、比較的高
濃度のＰＣＮＡ（１００ng−１μｇ）は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる産
物合成を阻害しえた。これより低い濃度のＰＣＮＡは、ＰＣＲ増幅反応中で許容
される（＜１００ng）。ＰＣＮＡは、ＰＣＲ増幅反応に機能的であり、そして利
益をもたらす（図６及び７）。ＰＣＮＡは、Ｔａｑ，Ｐｆｕ、及びＰ．フリオサ
スｄＵＴＰａｓｅ（ＰＥＦ）を含むＤＮＡポリメラーゼ混合物により増幅された
産物の収量を劇的に増加させうる。試験された前記混合物において、Ｔａｑは２
．５〜５Ｕで存在し、Ｐｆｕは、０．１５６〜０．３１２５Ｕで存在する。ｄＵ
ＴＰａｓｅは、天然ＰＥＦ又は組換えｄＵＴＰａｓｅ（Ｐ４５）（ＷＯ９８／４
２８６０；米国特許出願第０８／９５７，７０９号を参照のこと）の形であるこ
とができ、そして反応当り１〜１０ngで存在しうる。ＰＣＮＡは、そのＤＮＡポ
リメラーゼ混合物中の微量な校正成分のプロセシビティーを促進し、一方ｄＵＴ
Ｐａｓｅは、ｄＵＴＰ取り込み（そしてその後のＰｆｕ阻害）を防ぐ。したがっ
てＰｆｕポリメラーゼを含む核酸ポリメラーゼ反応は、促進される。そのｄＵＴ
Ｐａｓｅ活性は、国際特許出願第９８／４２８６０号及び米国特許出願第０８／
９５７，７０９号に述べられており、目的を問わずそれらを全体としてイメージ
的に援用した。したがって、至適濃度のＰＣＮＡは、単独で、取り合わせの形で
又は真正細菌又は古細菌起源の他の校正を行わないＤＮＡポリメラーゼとの混合
、例えばＰｆｕとＴａｑの混合のいずれかで、古細菌ＤＮＡポリメラーゼ（例え
ばＰｆｕ、Ｐ．フリオサスｐｏｌII）を含む核酸ポリメラーゼ反応を促進するこ
とが望ましい（米国特許第５，５５６，７７２号、１９９５年９月１８日出願の
米国特許出願第０８／５２９，７６７号、及び１９９９年１０月６日出願の米国
特許出願第０９／４１４，２９５号を参照のこと）。さらに、ＰＣＮＡ活性を、Ｐ．フリオサスＲＦＣ，ＲＦＡ，ＭＣＭ，ＣＤＣ６，ＦＥＮ−１、及びヘリカー
ゼを含む、他の補助因子のさらなる添加により向上しうる。

【０１１９】２．ＲＦＣ本願発明以前、発明者は、メタノコッカス・ジャナスチイの配列以外の古細菌
ゲノム配列の有用性を知らなかった。メタノコッカス・ジャナスチイのゲノム配
列は、１つのＦａｍｉｌｙＢＤＮＡポリメラーゼ、２つのＲＦＣサブユニッ
ト、及びＰＣＮＡを含む真核生物からのＤＮＡ複製タンパク質に対して特異的な
ＤＮＡ配列の一致を示した、翻訳領域（ＯＲＦｓ）を含んだ（Bult et al., 199
6 （参考文献６））。真核生物において、ＲＦＣ複合体は、５つの異なるサブユ
ニット（ＡＴＰａｓｅ活性により会合する、１つの大サブユニットと４つの小サ
ブユニット）から構成され、そしてＰＣＮＡにより刺激される。しかしながら、
２つのゲノムだけがＲＦＣサブユニットに対し一致を示すとしてメタノコッカス
・ジャナチイにおいて同定された：第１の配列は、大ＲＦＣサブユニットの推定
相当物と、第２の配列は、小サブユニットの１つの推定相当物と同定された。最
初に、ＰＣＲプライマーを、推定のメタノコッカス・ジャナスチイｒｆｃ遺伝子
のＤＮＡ配列に基づき作製した。しかしながら、これらのプライマーは、Ｐ．フ
リオサス・ゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅しなかった、おそらくメタノコッ
カス・ジャナスチイとピロコッカス・フリオサスの間のＤＮＡ配列における相違
のためであろう。

【０１２０】本発明者は、Ｐ．フリオサスＲＦＣサブユニット複製のために代替法を使用し
た。メタノコッカス・ジャナスチイと５２％の一致を有する６７−アミノ酸領域
と同定されたヒトＲＦＣの間で、アミノ酸配列をアライメントする。ＲＦＣタン
パク質は、より遠縁の生物、すなわちヒトと古細菌の間で比較的保存されていた
ので、古細菌の間では高度に保存されそうであった。

【０１２１】相同性の６７−アミノ酸領域をコードする領域を包含する２００bpの配列を、
以下のプライマーを用いてメタノコッカス・ジャナスチイ・ゲノムＤＮＡから増
幅した：５′ＧＡＴＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＴＡＧＡＴ（配列番号：）ａｎｄ５
′ＡＴＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＴ（配列番号：）。そのメタノコッカス
・ジャナスチイ配列をＰ．フリオサス・ゲノムＤＮＡライブラリーのプローブと
して使用した。

【０１２２】大サブユニットと小サブユニットの両方を縦並びでコードする配列を含んだ、
１つの陽性ゲノム・クローンを回収した。そのゲノム・クローンのＤＮＡ配列を
図８に示し、そしてその予想アミノ酸配列を図９に示した。Ｐ３８及びＰ５５の
ゲノム配列を、カッコでくくる。Ｐ３８のヌクレオチド配列は１９７〜２８３５
位のヌクレオチドである（インテイン配列は３７４〜２０２８位のヌクレオチド
である）。Ｐ５５のヌクレオチド配列は、２８３９〜４２８１位のヌクレオチド
である。小Ｐ．フリオサスＲＦＣサブユニット（Ｐ９８）をコードするＤＮＡ配
列の検討は、インテインの存在を明らかにした。インテインは、推定のメタノコ
ッカス・ジャナスチイ小ＲＦＣサブユニットをコードする遺伝子内に同定されも
した（Bult et al., 1996)。

【０１２３】発現構築物を、大、及び小サブユニットをコードする配列をｐＣＡＬｎＥＫベ
クター内にサブクローニングすることにより調製した。発現を容易にするために
、インテイン配列の側面に位置する５′及び３′領域にアニールし、そしてイン
テインに対して反対の方向にプライマーとして働くように設計されたプライマー
により増幅することで、インテインを小ＲＦＣサブユニット・クローンから削除
した。大ＲＦＣサブユニット及び小「インテインを欠く」ＲＦＣサブユニットの
推定アミノ酸配列を図１０及び図１１に示す。

【０１２４】ウサギによってＰ５５及びＰ３８サブユニットに対して、抗体を産生した。固
定化抗Ｐ５５又は抗Ｐ３８ＩｇＧを用いて、イムノアフィニティー・クロマト
グラフィーによりＰ．フリオサス抽出物から天然ＲＦＣ複合体を精製した。イム
ノアフィニティー精製したＲＦＣ複合体のウエスタン・ブロット分析は、真核生
物の大、及び小サブユニットとして働くものとして、Ｐ．フリオサスにおいてＰ
３８及びＰ５５が複合体を形成することを示す、捕獲抗体に関係のない両サブユ
ニットの存在を示す（図１２）。１つの天然ＲＦＣ標本のタンパク質組成を図１
３に示す。Ｐ５５及びＰ３８に加えて、他の未同定タンパク質バンドが存在する
。ＲＦＣ標本のＡＴＰａｓｅ活性を図１４に示すように試験した。ＲＦＣサブユ
ニットの持っているＡＴＰａｓｅ活性を測定した。それがＡＴＰをＡＤＰとリン
酸に変換する活性がそれである。真核生物におけるＲＦＣ複合体は、ＡＴＰから
ＡＤＰとリン酸への変換を典型的に必要とする過程においてＤＮＡ上でＰＣＮＡ
「スライディング・クランプ」を導くことが知られている。組換えＰ５５及びＰ
３８は、別々に分析した場合、ＡＴＰａｓｅ活性を示した。Ｐ５５とＰ３８サブ
ユニットの混合物は、ＰＣＮＡの存在において増加し、しかしプライムされたＭ
１３ＤＮＡの存在においてなくなるところのＡＴＰａｓｅ活性を示すことも見
出された。これに対して、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーにより精
製された天然ＲＦＣは、ＰＣＮＡとＤＮＡの両者によってより刺激されたＡＴＰ
ａｓｅ活性を示した。真核生物ＲＦＣ複合体は、ＰＣＮＡとＤＮＡの両者によっ
てより刺激されたことから、天然ＲＦＣ標本は完全な機能のものであり、一方組
換えＰ５５とＰ３８の混合物は一部の活性だけでありうることを現わす。

【０１２５】この結果は、Ｐ．フリオサスから免疫精製された天然ＲＦＣ標本が、Ｐｆｕ
ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＮＡを含む反応において合成される完全長産物の収
量を向上させることを示した、プライマー伸長試験によって支持された（図１５
）。これに対して、類似したＡＴＰａｓｅ活性を有する組換えＰ５５とＰ３８の
混合物は、Ｐｆｕ＋ＰＣＮＡによるプライマー伸長の促進を示さなかった。天然
ＲＦＣと組換えＲＦＣの間の活性の違いが、Ｐ５５：Ｐ３８の比の違いによるか
又はタンパク質修飾の違いによるか、あるいは天然ＲＦＣ標本中に存在する補足
的タンパク質の欠如によるのかどうかは、今のところ分からない。当業者は、Ｐ
５５対Ｐ３８の異なる割合を又は異なる反応条件を試みることによりあるいは補
足的なタンパク質因子、例えば天然ＲＦＣ標本中に存在するものを加えることに
より解決法を容易に決定できた。前記２つのＲＦＣ遺伝子はＰｆｕゲノムに隣接
するので、完全な機能のＲＦＣ複合体の会合を促進するためのクローン・タンパ
ク質を補助的に発現することが必要である。さらに、ＣＢＰアフィニティー・タ
グの存在は、そのタグを除去した場合でも自発的に天然の構造に戻らない、異常
なタンパク質の折りたたみを生じうる。当業者は、本明細書に記載した以外の、
適切でない実験法及び／又は方法論を必要とするそれらの方法のどちらでもない
ことを高く評価するであろう。

【０１２６】３．ＲＦＡ真核生物ＲＦＡの大サブユニットを、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴによる古細菌タンパ
ク質データベースを検索するために使用した。古細菌配列で該当するものを実験
した。発明者は、不完全なＰ．フリオサス・ゲノム配列内のＲＦＡ配列の推定開
始及び終止コドンを同定するために一致する配列をアライメントした。Ｐ．フリ
オサスｒｆａ配列をＰＣＲ増殖し、そしてｐＣＡＬｎＥＫベクター内にクローニ
ングした。そのＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を、図１６及び１７に示す。十
分に変性したその発現タンパク質の見かけ上の分子量は、予想されたアミノ酸配
列から推測したサイズと一致した（４１kDa ）。

【０１２７】機能を評価するために、Ｐ．フリオサスＲＦＡを、ゲル・シフト・アッセイに
より一本鎖ＤＮＡ結合活性について試験した（図１８）。ＲＦＡを３８塩基のオ
リゴヌクレオチドとインキュベートしたとき、移動のＤＮＡパーセンテージを低
下させ、これは、ＲＦＡが一本鎖ＤＮＡ結合活性を示したことを示している。比
較において、Ｅ．コリＳＳＢは、オリゴを十分に遅くすることを見出された。よ
り低い一本鎖ＤＮＡ結合活性は、不十分なタンパク質の使用、ＣＢＰタグの存在
又は最適以下の反応条件の使用により説明されうるＰ．フリオサスＲＦＡにより
示された。ＣＢＰ−ＲＦＡの精製に用いた、溶液は、可逆的なタンパク質変性を
生じうる非還元剤を含んだ。真核生物ＲＦＡのジンク・フィンガードメインの酸
化は、一本鎖ＤＮＡ結合容量の低下を示した（Ｐａｒｋｅｔａｌ．）。図５
４に示すとおり、ＰｆｕＣＢＰ−ＲＦＡを、還元剤及びＺｎＣｌ₂ と復元した
場合、そのゲル・シフトは、Ｅ．コリＳＳＢのそれに類似する。

【０１２８】オリゴの移動度は、タンパク質−ＤＮＡ複合体の質量及びタンパク質多量体の
形成に関係する。Ｅ．ｃｏｌｉＳＳＢは、四量体を形成することが知られてい
るが、しかしＰ．フリオサスＲＦＡも多量体を形成するかどうか今のところ知ら
れていない。

【０１２９】Ｐｆｕ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼにより実行される増幅に対するＰ．フ
リオサスＲＦＡの添加は、増幅特異性（図１９及び２１）及びＰＣＲ産物の収量
（図２０及び２１）の増加を示す。その条件は先の６項に記載のとおりであった
。図２１において、Ｐ．フリオサスＲＦＡは、収量及び増幅特異性の増加、並び
に過剰な濃度（５μｌ）でのＤＮＡ移動の遅延を含む、Ｅ．コリ一本鎖ＤＮＡ結
合タンパク質（ＳＳＢ：ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ）
により生み出された効果に類似したところの効果を生じた。ＰＣＲにおけるＰ．フリオサスＲＦＡ及びＥ．コリ一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の相対性能の評価は
されない；しかしながら、ＲＦＡの増加した温度安定性は、温度サイクルにおい
て付加的な利点を提供するであろう。

【０１３０】４．ヘリカーゼ細胞は、複製、ＤＮＡ修復、組換え、転写、及び翻訳を含む多くの過程におい
て専門化した役割をもつ多量体ヘリカーゼを含む。既知のヘリカーゼは、配列の
相同性に基づいた５つのファミリーに分類される。機構的に、２クラスのヘリカ
ーゼがあり、それはＤＮＡ複製におけるヘリカーゼの機能の特徴であるところの
、巻き戻しに３′突出を必要とするか（３′−５′方向性）又は５′突出を必要
とするか（５′−３′方向性）どうかによる。古細菌複製ヘリカーゼは、具体的
な代謝的役割に構わず、既知の真核生物ヘリカーゼに相同性を示した古細菌ゲノ
ム中のＯＲＦｓを確認することにより同定した。古細菌と真核生物の間のヘリカ
ーゼの機能は異なるので、予想しないヘリカーゼ配列を除いた。さらに、前記真
核生物複製ヘリカーゼは結果的に同定されなかった。真核生物ヘリカーゼを使用
し、古細菌タンパク質データベースにおけるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索を実施した
。

【０１３１】規準に合った８つの推定ヘリカーゼを、分析により選んだ。不完全なＰ．フリ
オサスゲノム配列を、それらの配列の推定開始及び終止コドンを同定するために
、そしてクローニングのためのＰＣＲプライマー設計のために調べた。そのＤＮ
Ａ配列を、それぞれ図２２〜２８、及び４０に示す；その予想アミノ酸配列をそ
れぞれ図２９〜３５、及び４１に示す。発現タンパク質の見かけ上の分子量は、
翻訳されたＤＮＡ配列から推測したサイズと一致した（図２９〜３５の図面記載
を参照のこと）。不完全なＰ．フリオサス配列における将来の修正は、代わりの
開始及び終止部位を明確にしうる。

【０１３２】ヘリカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、補助因子、及び修
復因子の鋳型をあらわにするために、ＤＮＡ又はＲＮＡの相補鎖を外す。ヘリカ
ーゼは、リボ−又はデオキシリボヌクレオチドの加水分解と結びついた過程の中
で相補鎖を解く。大部分のヘリカーゼは、５′突出又は３′突出のいずれかを外
すが、しかしいくつかのヘリカーゼは、両方の鋳型を外すか又は異なる反応条件
下で異なる鋳型を利用する。典型的には、ヘリカーゼは、１以上のヌクレオチド
三リン酸を選択的に利用する。８つの同定したヘリカーゼを評価するために、組
換えヘリカーゼをＡＴＰａｓｅ活性について試験した。他のリボ−又はデオキシ
リボヌクレアーゼは好ましい基質として使用されうるが、リボヌクレオチドＡＴ
Ｐを使用した。得られる組換えタンパク質をＡＴＰと一緒にインキュベートし、
そしてＴＬＣによる分離の後、リン酸を検出した。図３６及び３７の結果は、８
つの組換えヘリカーゼがＡＴＰａｓｅ活性を示すことを説明している。

【０１３３】８つの組換えヘリカーゼをヘリカーゼ活性について試験した。使用した鋳型は
、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡにアニールした標識オリゴヌクレオチドを含ん
だ。そのオリゴは、５′又は３′非相補末端のいずれかを有した。図３８に示す
とおり、ヘリカーゼ２はオリゴを両鋳型から外すことができた。このヘリカーゼ
は、非相補５′及び３′末端を有する鋳型をも解く（データ未掲載）。このよう
な分岐した鋳型は、複製ホークにより形成された「泡（ｂｕｂｂｌｅ）」に似る
。さらに、ヘリカーゼ７は、遊離の３′末端を有するオリゴを外す（図３８）。
検出可能なオリゴ排除の欠如が必ずしも残りの酵素がヘリカーゼでないことを意
味するものではない。例えば、最適以下の緩衝液又は反応条件の使用、Ｎ末端Ｃ
ＢＰタグの存在又は不十分な量の組換えタンパク質の使用のために検出されない
のかもしれない。予備実験は、希釈したヘリカーゼ２又はヘリカーゼｄｎａ２の
標本を、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応への添加が、ＰＣＲ産物
収量の増加をもたらしうることを説明した。

【０１３４】５．ＭＣＭ及びＣＤＣ６Ｐ．フリオサスＭＣＭコード領域に一致するヌクレオチド配列を図４５（イン
テインあり）及び図５５（インテイン配列削除）に示す。予想されたアミノ酸配
列を図４６（インテインあり）及び図４７（インテイン削除）に示す。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥにより決定した組換えＰ．フリオサスＭＣＭの見かけ上の分子量は、Ｍ
ＣＭ−ＣＢＰについての予期された移動（計算した分子量：７６．８kD Ｐ．フ
リオサスＭＣＭ＋４kD ＣＢＰタグ）と一致し、８２kDであった。前記ＭＣＭイ
ンテインを、表１に示したｍｃｍインテイン削除プライマーを使用したことを除
いて、先の実施例１Ｆに記載のとおり削除した。

【０１３５】Ｐ．フリオサスＣＤＣ６のヌクレオチド及び予想アミノ酸配列をそれぞれ図４
８及び４９に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した組換えＰ．フリオサスＣＤ
Ｃ６の見かけ上の分子量は、ＣＢＰ−ＣＤＣ６について予期された移動（計算し
た分子量：４８．２kD Ｐ．フリオサスＣＤＣ６＋４kD ＣＢＰタグ）と一致し
、５３kDであった。他のより高分子量バンドも、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより明らか
であり、そのことはＣＤＣ６タンパク質も多量体を生じることを示唆する。

【０１３６】Ｐ．フリオサスＭＣＭは、Ｔａｑを加えたＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ混合物
、ＴａｑＰｌｕｓＬｏｎｇＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）により、先の方法６（ＰＣＲ反応）に従って増幅されたＰＣＲ産物の収
量を増加させることを発見された。図５３に示されたとおり、ＭＣＭ単独では、
１０倍以上タンパク質濃度の範囲で、２３kbゲノム標的の収量が有意に向上した
（図５３、左図）。それに対して、ＣＤＣ６単独では、ごくわずか産物収量が増
加した。しかしながら、ＣＤＣ６とＭＣＭの取り合わせは、それぞれの因子単独
によって達成しえたよりも有意により高い産物収量を生じた（図５３、右図）。
これらの観察は、ＭｔｈＭＣＭのヘリカーゼ活性に対するＭｔｈＣＤＣ６／
ＯＲＣ相同体の報告された阻害効果の観点において予期されなかった（Kelman e
t al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96 : 14783-88 (1999)）。Ｐ．フリオサスＭＣ
Ｍ及び／又はＣＤＣ６相同体は、それぞれヘリカーゼ活性及びヘリカーゼローデ
ィング以外の機構を通して増幅反応を促進することが可能である。例えば、ＭＣ
Ｍ及び／又はＣＤＣ６タンパク質のＤＮＡ結合活性は、ｓｓＤＮＡ鋳型の安定化
及びそれによってＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの移動を妨げうるところの構造的
障害の減少により促進されたＤＮＡ合成に貢献する。

【０１３７】補足実験は、ＭＣＭ及びＣＤＣ６がＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼに
より増幅された産物の収量を増やしもすることを示す（データ未掲載）。収量増
加は、より長い標的（＞５kb）の増幅において最も劇的であるようだ。ＰｆｕＴ
ｕｒｂｏ増幅についての実験条件は、方法６（ＰＣＲ反応）の前記のとおりであ
る。一方２．１又は５．２kb標的のＰｆｕＴｕｒｂｏ増幅のわずかな促進は、
ＭＣＭ及びＣＤＣ６を加えたときに明らかであり、より長い標的、例えば１７kb
−グロビン標的を、ＰｆｕＭＣＭ単独の又はＣＤＣ６と組合わせての存在にお
いて増幅したとき、著しく促進される。

【０１３８】６．ＦＥＮ−１Ａ．ＰＣＲ組換えＰ．フリオサスＦＥＮ−１を、１．５×反応緩衝液及び５００μＭの各
ｄＮＴＰを利用したＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼによる標的１７kb以
上の増幅であることを除いて、先に記載のとおり行ったＰＣＲ増幅反応に加えた
（Borns, M. et al., Stratagene Newsletter 13 : 27-30, 2000）。その１７kb
β−グロビン標的を増幅するために用いたＰＣＲプライマーの配列は、以下の
とおりであった：正プライマー：５′−ＣＡＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＡＴＴ（配
列番号：）負プライマー：５′−ＣＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴ
ＣＡＧＧ（配列番号：）。

【０１３９】Ｂ．ＰＣＲ促進ＦＥＮ−１の利点は、より長いゲノム標的の増幅において特に明らかである。
図５０に示すとおり、２３kb標的を、先の方法６（ＰＣＲ反応）に記載のとおり
ＴａｑＰｌｕｓＬｏｎｇＤＮＡポリメラーゼを用いてゲノムＤＮＡから増幅
した。産物収量は、単独のＦＥＮ−１により増加し、そしてＰＣＮＡ及びＦＥＮ
−１を取り合わせて加えたときそれらをさらに増加させた。各反応混合物に存在
するＰＣＮＡ及びＦＥＮ−１の終濃度を、図５０に示す。

【０１４０】刺激は、ＦＥＮ−１及びＰＣＮＡの比較的低濃度により達成され、一方比較的
高い濃度では、阻害をもたらしうる。例えば図５０において、増幅は、４．８nM
ＰＣＮＡを利用したとき、完全に阻害され、そして１．２nM超ＦＥＮ−１を
使用したとき促進の減少が顕著であった。

【０１４１】ＰＣＮＡ活性のＦＥＮ−１刺激は、先の方法６（ＰＣＲ反応）に記載の方法を
用いて、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ及び１７kbゲノム−グロビンＤ
ＮＡ標的（図５１）を用いて観察されもした。１７kb標本は、ＰＣＮＡ及びＦＥ
Ｎ−１の不存在下（０）、ＰＣＮＡ単独（１１fg／μｌＰＣＮＡ（１３１pM
ＰＣＮＡ））存在下、又はＰＣＮＡ及びＦＥＮ−１（１１fg／μｌＰＣＮＡ（
１３１pM ＰＣＮＡ）及び３０fg／μｌＦＥＮ−１（７７４pM ＦＥＮ−１）
）存在下、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼによりヒト・ゲノムＤＮＡか
ら増幅された。増幅を、耐熱性トポイソメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓ
ｅ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の不存在（０）又はさまざまな濃度での存在下で行った
。トポイソメラーゼについて、ゲルの上部に示された１μｌのその希釈液を、Ｐ
ＣＲ反応液５０μｌ当りに加えた。

【０１４２】トポイソメラーゼは、阻害的であったが、しかしＰＣＮＡ及びＦＥＮ−１刺激
性作用は阻害を部分的に逆戻りさせた。単独のＰＣＮＡは、収量を増加し、そし
てさらなる増加は、図５１に示すとおり、ＦＥＮ−１の添加により顕著であった
。１７kb標的を、それらの不存在（０）又はＰＣＮＡ及びさまざまな濃度のＦＥ
Ｎ−１の存在において、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼにより増幅した
（図５２）。ＦＥＮ−１は、収量のわずかな増加を提供し、そしてＰＣＮＡの添
加は、産物収量をさらに増やした。この例において、約０．１nMのＦＥＮ−１濃
度は、０．０１〜０．１nMの濃度より効果的ではなかった。

【０１４３】これだけに制限されることなく、論文、本、論評、特許及び特許出願を含むこ
の出願において触れた書類を、目的を問わずそれらを全体としてこの明細書の中
に援用する。

【０１４４】

【化１】

【０１４５】

【化２】

【０１４６】

【化３】

【０１４７】本明細書中で推定されたアミノ酸（又は翻訳されたタンパク質）内のアミノ酸
についての略語は一文字であり、そしてヌクレオチドは、慣例的に使用されるも
のであって、本明細書中のStryer et al., Biochemistry, 3rd ed., W.H. Freem
an, N.Y. (1988）のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヘパリンセファロース画分中の天然ＰＣＮＡの同定。ポリメラーゼ活性（「Ｐ
ｏｌ」）検出のために塩の存在下で、又はＰＣＮＡ検出のためにＮａＣｌ＋Ｐｆ
ｕＤＮＡポリメラーゼ存在下でヌクレオチド取り込みを計測した。

【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル切片中の天然ＰＣＮＡ活性の同定。活性ヘパリンセファ
ロース画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動し、そしてそのゲル切片を
削り、そして溶出した。ＰＣＮＡ又はポリメラーゼ活性の存在を図１及び本発明
の態様の詳細な記載に前記のとおり測定した。

【図３】ＰＣＮＡのＤＮＡ配列。

【図４】ＰＣＮＡの推定アミノ酸配列。

【図５】ＰＣＮＡは、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのプロセシビティーを促進する。５
′−放射線ラベルした３８bpオリゴヌクレオチドを一本鎖Ｍ１３にアニールした
。その鋳型をクローン化ＰｆｕＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰｓ、及びクローン化Ｐ
ｆｕＤＮＡポリメラーゼ又はｅｘｏ^- ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼいずれかの
存在下、７２℃でインキュベートした。その反応のために〜０．１又は１０ｆ
ｍｏｌｅｓのＰＣＮＡを加えた。反応を、１，５，１０又は３０分間続行させ、
次に添加緩衝液を加えて止めた。その伸長産物をＣａｓｔＡｗａｙ（商標）ｐｒ
ｅｐｏｕｒｅｄ６％（７Ｍ尿素）ゲルにおいて電気泳動し、そして、そのゲル
を乾かし、そして放射能写真撮影により可視化した。完全に伸長した産物の長さ
は約７kbである。

【図６】ＰＣＮＡによるＴａｑＰｌｕｓ（商標）ＬｏｎｇＤＮＡポリメラーゼ混合物
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の刺激。２３kb断片を、天然ＰＥＦ，ＫＣｌ不含緩衝
液、及びさまざまな量のＰＣＮＡ存在下、５ＵＴａｑＰｌｕｓ（商標）Ｌｏｎ
ｇポリメラーゼ混合物を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。

【図７】ＰＣＮＡによるＴａｑＰｌｕｓ（商標）ＬｏｎｇＤＮＡポリメラーゼ混合物
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の刺激。３０kb断片を、天然ＰＥＦ，ＫＣｌ不含緩衝
液、及びさまざまな量のＰＣＮＡ存在下、５ＵＴａｑＰｌｕｓ（商標）Ｌｏｎ
ｇポリメラーゼ混合物を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。

【図８ａ】ゲノムＲＦＣクローンのＤＮＡ配列。Ｐ３８及びＰ５５サブユニットをコード
するゲノム配列は、それぞれ縦並びに配置されている。Ｐ３８をコードする配列
はインテインを含む。本明細書で用いた、用語「インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）」
は、それだけに制限されることなく、タンパク質スプライシング・エレメントを
含む。これらのエレメントは、プレタンパク質の翻訳後プロセッシング中に含ま
れる。Ｐ３８及びＰ５５サブユニットのコード領域を、角カッコ〔〕でくくる
。インテイン配列を丸カッコ（）により囲む。

【図８ｂ】ゲノムＲＦＣクローンのＤＮＡ配列。Ｐ３８及びＰ５５サブユニットをコード
するゲノム配列は、それぞれ縦並びに配置されている。Ｐ３８をコードする配列
はインテインを含む。本明細書で用いた、用語「インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）」
は、それだけに制限されることなく、タンパク質スプライシング・エレメントを
含む。これらのエレメントは、プレタンパク質の翻訳後プロセッシング中に含ま
れる。Ｐ３８及びＰ５５サブユニットのコード領域を、角カッコ〔〕でくくる
。インテイン配列を丸カッコ（）により囲む。

【図９】ゲノムＲＦＣクローンの推定アミノ酸配列。Ｐ３８及びＰ５５をコードする配
列を、それぞれ丸カッコ（）により囲み、一方インテインの配列は角カッコ〔
〕である。^* は終止コドンを示す。

【図１０】組換えＰ５５クローンの推定アミノ酸配列を示す。

【図１１】組換えＰ３８クローンの推定アミノ酸配列を示す。

【図１２】抗Ｐ３８ＩｇＧ（図Ａ）又は抗Ｐ５５ＩｇＧ（図Ｂ）を用いた、イムノア
フィニティー精製した天然ＲＦＣ複合体のウエスタン・ブロット。イムノアフィ
ニティー精製を、補獲反応物としてウサギ抗Ｐ５５ＩｇＧを用いて行った。画
分を以下のとおり名づけた：＋、陽性対照；０、洗浄。Ｆ２０−Ｆ３４はカラム
からpH２．８で溶出した画分に関する。

【図１３】イムノアフィニティー精製した天然ＲＦＣ複合体のタンパク質ゲル。アミノア
フィニティー精製を、補獲反応物としてウサギ抗Ｐ５５（−Ｐ５５）ＩｇＧを用
いて行った。画分を以下のとおり名づけた：＋、陽性Ｐ３８対照；−Ｐ３８（関
係しない実験）又は−Ｐ５５カラム洗浄液（本実験）。Ｆ１８−Ｆ２３は、カラ
ムからpH２．８で溶出した画分に関する。

【図１４】天然及び組換えＲＦＣのＡＴＰａｓｅ活性。ＴＬＣプレート上の放出放射活性
リン酸を含む位置を、削り、そしてシンチレーション・カウンターによりカウン
トした。

【図１５】天然クランプ・ローダーは、ＰＣＮＡの存在下、Ｐｆｕによるプライマー伸長
をさらに刺激する。プライマー伸長反応を、本発明の態様の詳細な記載に記載の
とおり行った。

【図１６】ＰＦＡ発現クローンのｃＤＮＡ配列。ヌクレオチド７を、注釈した（ ₇Ｇ）。

【図１７】ＲＦＡの推定アミノ酸配列。その理論分子量は４１．３kDa である。その天然
タンパク質は、第３アミノ酸、メチオニン（注釈 ₃Ｍ）で開始しうる。第４アミ
ノ酸を、太字で示し、そして４−システイン−タイプ・ジンク・フィンガー・モ
チーフ（Ｘ₃ ＣＸ_2-4 ＣＸ_12-15 ＣＸ₂ Ｃ：Ｈは、Ｃの許容しうる代替物である
）を下線で表す。

【図１８】Ｐ．フリオサスＲＦＡの一本鎖ＤＮＡ結合活性を証明するゲル・シフト・アッ
セイ。５０ngの３８−ｍｅｒオリゴを、Ｅ．コリＳＳＢ（レーン１）、水（レ
ーン２）又はＴＥ緩衝液（レーン１〜３）、１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液（レー
ン４）、５０mMトリスpH８．５、２５mM ＫＣｌ、２mM ＭｇＣｌ₂ （レーン５
）、５０mMトリスpH８．５、２５mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ （レーン６）若
しくは５０mMトリスpH８．５、２５mM ＫＣｌ、２mM ＺｎＣｌ₂ （レーン７）
中のＰ．フリオサスＲＦＡ（レーン３〜７）と一緒にインキュベートした。サン
プルを９５℃で１０分間インキュベートし、引き続き７２℃で２分間インキュベ
ートし、その後１×ＴＢＥ緩衝液中の４〜２０％アクリルアミド勾配ゲルに供し
た。バンドを、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ染色及びＵＶ照射により可視化した。

【図１９】クローン化Ｐｆｕ＋ＰＥＦ（ＰｆｕＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））（５．２kbの系）を用いたＲＦＡによる増幅特異性の
増加。

【図２０】クローン化ＰｆｕＴｕｒｂｏ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２．１kbの系）と
の取り合わせてＲＦＡを用いた産物収量の増加。

【図２１】Ｔａｑ及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（０．５kbの系）を用いたＲＦＡ及びＥ．コリＳＳＢによる収量及び増幅特異性の増加。

【図２２ａ】組換えヘリカーゼ２のＤＮＡ配列。このヘリカーゼは、ＰＣＲ促進活性を証明
した。

【図２２ｂ】組換えヘリカーゼ２のＤＮＡ配列。このヘリカーゼは、ＰＣＲ促進活性を証明
した。

【図２３】組換えヘリカーゼ３のＤＮＡ配列。

【図２４ａ】組換えヘリカーゼ４のＤＮＡ配列。

【図２４ｂ】組換えヘリカーゼ４のＤＮＡ配列。

【図２５】組換えヘリカーゼ５のＤＮＡ配列。

【図２６ａ】組換えヘリカーゼ６のＤＮＡ配列。

【図２６ｂ】組換えヘリカーゼ６のＤＮＡ配列。

【図２７ａ】組換えヘリカーゼ７のＤＮＡ配列。

【図２７ｂ】組換えヘリカーゼ７のＤＮＡ配列。

【図２８】組換えヘリカーゼｄｎａ２のＤＮＡ配列。このヘリカーゼは、ＰＣＲ促進活
性を証明した。

【図２９】ヘリカーゼ２の推定アミノ酸配列。理論分子量は８７．９kDa ＋４．０kDa （
ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３０】ヘリカーゼ３の推定アミノ酸配列。理論分子量は、１００．０kDa ＋４．０kD
a （ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３１】ヘリカーゼ４の推定アミノ酸配列。理論分子量は、１０５．０kDa ＋４．０kD
a （ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３２】ヘリカーゼ５の推定アミノ酸配列。理論分子量は、８６．８kDa ＋４．０kDa
（ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３３】ヘリカーゼ６の推定アミノ酸配列。理論分子量は、１０５kDa ＋４．０kDa （
ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３４】ヘリカーゼ７の推定アミノ酸配列。理論分子量は、１２６．０kDa ＋４．０kD
a （ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３５】ヘリカーゼｄｎａ２の推定アミノ酸配列。理論分子量は７４．６kDa ＋４．０
kDa （ＣＢＰアフィニティー・タグ）である。

【図３６】ファージ誘導により産生されたヘリカーゼのＡＴＰａｓｅ活性。１μｌのＰｆ
ｕヘリカーゼ３，４，５，６，７、及び８（それぞれレーン１〜６）、０．８単
位のブタＡＴＰａｓｅ（９）又は水（１０）を、１μｌの４．５ＭＡＴＰ及び
１×Ｏｐｔｉｐｒｉｍｅ緩衝液＃３（１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．３）、３．
５mM ＭｇＣｌ₂ 、７５mM ＫＣｌ）中の１Ciのガンマ標識³³ＰＡＴＰと一緒
にインキュベートした。サンプルを７２℃で２０分間インキュベートし、その後
ＰＥＩセルロースＦにスポットした。そのサンプルを乾燥し、その後そのＰＥＩ
セルロースを、０．４ＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ の浅い容器の中に置いた。その液体先
端を、５cm移動させた後、液体から取り上げ、そして乾燥した。そのサンプルを
Ｘ線フィルムに１時間当てた。

【図３７】細菌培養のＩＰＴＧ誘導により産生させたヘリカーゼのＡＴＰａｓｅ活性。１
μｌの旧ロット又は新ロットのＰｆｕｄｎａ２様ヘリカーゼ（それぞれレーン
１及び２）、Ｐｆｕヘリカーゼ２，３，４，５、及び７（レーン３〜７）、水（
８）又は０．８単位のブタＡＴＰａｓｅ（９）を、１μｌの４．５μＭＡＴＰ
及び１×Ｏｐｔｉｐｒｉｍｅ緩衝液＃３（１０mMトリス−ＨＣｌ（pH８．３）、
３．５mM ＭｇＣｌ₂ 、７５mM ＫＣｌ）中の１μCiのガンマ標識³³ＰＡＴＰ
と一緒にインキュベートした。サンプルを７２℃で２０分間インキュベートし、
その後ＰＥＩセルロースＦ上にスポットした。乾燥後、そのＰＥＩセルロースを
、０．４ＭＮａＨ₂ ＰＯ₄ の浅い容器に置く。液体先端を４cm移動させ、その
後液体から取り上げ、そして乾燥した。そのサンプルをＸ線フィルムに１時間晒
した。

【図３８】結合オリゴのヘリカーゼによる排除。３′突出（Ａ）又は５′突出（Ｂ）をも
つ放射活性標識オリゴヌクレオチドを、Ｍ１３ｍｐ１８にアニールした。その反
応液を、０．５μｌの５０mMトリスpH８．５、２５mM ＫＣｌ、５mM ＭｇＣｌ ₂ 、及び５mM ＡＴＰ中の推定Ｐｆｕヘリカーゼ３〜７、及びＰｆｕヘリカーゼ
ｄｎａ２と一緒に５５℃で３０分間インキュベートした。１μｌのＰｆｕヘリカ
ーゼ２を同一の反応に用いた。陽性対照を、添加前にアニールしたオリゴを加熱
により融解することにより作製した。陰性対照を水と一緒にインキュベートした
。サンプルを１×ＴＢＥ中の４〜２０％アクリルアミド勾配ゲルに泳動した。そ
のゲルを乾かし、そしてＸ線フィルムに晒した。

【図３９】ＰｆｕＰＣＮＡ及びＲＦ−ＣによるＰｆｕポリメラーゼ・プロセシビティー
の促進。

【図４０】組換えヘリカーゼ８のＤＮＡ配列。分子量は、８２．６kDa ＋４kDa ＣＢＰタ
グである。

【図４１】組換えヘリカーゼ８の推定アミノ酸配列。

【図４２】ＰＣＮＡを用いた、Ｐｆｕ及びＰ．フリオサスｐｏｌII ＤＮＡポリメラーゼ
によるヌクレオチド取り込み刺激。プライマー伸長反応を、プライムされた一本
鎖Ｍ１３ＤＮＡを用いて６６〜９９℃で行った。最大活性を、ＰＣＮＡの存在
下において８０℃又はそれ以上で観察し（８０℃〜９５℃で計測を行わなかった
）、一方活性減小を、ＰＣＮＡの不存在下、約７２℃で観察した。

【図４３】Ｐｆｕゲノム・ヘリカーゼ８のＤＮＡ配列。

【図４４】Ｐｆｕゲノム・ヘリカーゼ８の推定アミノ酸配列。理論分子量は、８２．６kD
a ＋４kDa タグである。

【図４５ａ】インテインが存在するＰｆｕｍｃｍ遺伝子のＤＮＡ配列。下線の配列は、イ
ンテインの削除、そして連結の適切な結合を裏づけるための配列決定に用いたオ
リゴヌクレオチド・プライマーに一致する。

【図４５ｂ】インテインが存在するＰｆｕｍｃｍ遺伝子のＤＮＡ配列。下線の配列は、イ
ンテインの削除、そして連結の適切な結合を裏づけるための配列決定に用いたオ
リゴヌクレオチド・プライマーに一致する。

【図４６】インテインが存在するＰｆｕＭＣＭポリペプチドの推定アミノ酸配列。理論
分子量は１１８kDa である。

【図４７】インテインを削除したＰｆｕＭＣＭポリペプチドの推定アミノ酸配列。理論
分子量は７８．６kDa である。

【図４８】Ｐｆｕｃｄｃ６遺伝子のＤＮＡ配列。

【図４９】ＰｆｕＣＤＣ６ポリペプチドの推定アミノ酸配列。理論分子量は４８．３kD
a である。

【図５０】ＰｆｕＰＣＮＡを含むＴａｑＰｌｕｓＬｏｎｇ（ＴＰＬ）ＰＣＲ反応のＦ
ＥＮ−１による促進。２３kb−グロビン標的を、その不存在下（０ＰＣＮＡ）
又はＰｆｕＰＣＮＡの２つの異なる量の存在下（４７．７pM及び４．７７nM）
のＴａｑＰｌｕｓＬｏｎｇＤＮＡポリメラーゼ及びさまざまな濃度のＰｆｕ
ＦＥＮ−１（レーン１〜６がそれぞれ０，１１．９pM、２３．７pM、１１９pM
、１．１９nM、及び１１．９nMに当たる）による、ヒト・ゲノムＤＮＡから増幅
した。

【図５１】ＰｆｕＰＣＮＡ刺激されたＰｆｕＴｕｒｂｏＰＣＲ反応のＦＥＮ−１によ
る促進。１７kb−グロビン標的を、ＰＣＮＡ又はＦＥＮ−１の不存在下（０）、
単独ＰＣＮＡの存在（１３１pM）又はＰＣＮＡ及びＦＥＮ−１の存在（１３１pM
ＰＣＮＡ、７７４pM ＦＥＮ−１）において、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリ
メラーゼによりヒト・ゲノムＤＮＡから増幅した。増幅を耐熱性トポイソメラー
ゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｄｅｌａｓｅ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の存在下、行った。ト
ポイソメラーゼを加えないか（０）、１μｌの無希釈（１）又は希釈（１／５、
１／１０又は１／２５）トポイソメラーゼのいずれかをその反応に加えた。

【図５２】ＰｆｕＰＣＮＡ刺激されたＰｆｕＴｕｒｂｏＰＣＲのＦＥＮ−１による促
進。１７kb−グロビン標的を、ＰＣＮＡの不存在（０）又は存在下（９５pM）、
そしてさまざまな濃度のＦＥＮ−１（レーン１〜６はそれぞれ０，１１．９pM、
２３．７pM、１１９pM又は１．１９nMに当たる）中のＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡ
ポリメラーゼにより、ヒト・ゲノムＤＮＡから増幅した。

【図５３】ＭＣＭ又はＭＣＭとＣＤＣ６のいずれかを含むＰＣＲ反応の促進。２３kbゲノ
ム標的を、ＣＤＣ６の不存在（左側）、存在（右側）、及び以下の量のＰ．フリ
オサスＭＣＭ：無し（０）又は１μｌのＭＣＭを１／１０００、１／５００又は
１／１００に希釈の中のＴａｑＰｌｕｓＬｏｎｇＤＮＡポリメラーゼにより
、増幅した。

【図５４】組換えＲＦＡを用いたゲル・シフト・アッセイ。レーン１は、６０−ｍｅｒ
オリゴ鋳型及び水を含む（陰性対照）。レーン２は、６０−ｍｅｒオリゴ鋳型
及び１μｇＥ．コリＳＳＢを含む（陽性対照）。レーン３は、６０−ｍｅｒ
オリゴ鋳型及び約１μｇの組換えＰｆｕＲＦＡ−ＣＢＰを含む。レーン４は、
６０−ｍｅｒオリゴ鋳型及び約５μｇの組換えＰｆｕＲＦＡ−ＣＢＰを含む
。

【図５５】インテイン配列を削除したＰｆｕＭＣＭＤＮＡ配列。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/10 5/00 Ａ (72)発明者ハンセン，コニージョーアメリカ合衆国，カリフォルニア 92115，サンディエゴ，ゲイルストリート 3645 (72)発明者ボーンズ，マイケルシー．アメリカ合衆国，カリフォルニア 92026，エスコンディド，エディスドライブ 1907 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA04 CA12 EA02 EA03 EA04 GA11 HA03 HA08 HA12 4B050 CC03 DD02 LL03 4B065 AB01 BA02 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】古細菌MCM並びに少なくとも１の、PCNA、RFC-P38、RFC-P55
、RFA、CDC6、FEN-1、dUTPase、リガーゼ、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリ
カーゼ3、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、及びヘリカ
ーゼ8から成る群から選ばれる古細菌ポリペプチドを含む、核酸ポリメラーゼ反
応促進用組成物。
【請求項２】前記古細菌MCMが、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus ）からであるか又はその中に見出されるMCMと相同である、請求項1に記
載の組成物。
【請求項３】前記古細菌MCMがピロコッカス種（Pyrococcus species）若
しくはサーモコッカス種（Thermococcus species）からであるか又はその中に見
出されるMCMと相同である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、PCNAである、請
求項１に記載の組成物。
【請求項５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P38である、
請求項1に記載の組成物。
【請求項６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P55である、
請求項1に記載の組成物。
【請求項７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFAである、請求
項1に記載の組成物。
【請求項８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2であ
る、請求項1に記載の組成物。
【請求項９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3であ
る、請求項1に記載の組成物。
【請求項１０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4で
ある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5で
ある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6で
ある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7で
ある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ8で
ある、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼdna
2である、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、CDC6である、
請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、FEN-1である、
請求項1に記載の組成物。
【請求項１８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、リガーゼであ
る、請求項1に記載の組成物。
【請求項１９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、dUTPaseである
、請求項1に記載の組成物。
【請求項２０】さらにポリメラーゼを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】前記ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請求項
20に記載の組成物。
【請求項２２】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項21
に記載の組成物。
【請求項２３】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求項2
1に記載の組成物。
【請求項２４】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項20に記載の組成物
。
【請求項２５】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請
求項24に記載の組成物。
【請求項２６】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活
性を欠く、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメラ
ーゼである、請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポリ
メラーゼである、請求項26に記載の組成物。
【請求項２９】古細菌CDC6並びに少なくとも１の、PCNA、RFC-P38、RFC-P
55、RFA、FEN-1、リガーゼ、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3、ヘリ
カーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、ヘリカーゼ8、及びdUTPas
eから成る群から選ばれる古細菌ポリペプチドを含む、核酸ポリメラーゼ反応を
促進する組成物。
【請求項３０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、PCNAである、
請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P38である
、請求項29に記載の組成物。
【請求項３２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P55である
、請求項29に記載の組成物。
【請求項３３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFAである、請
求項29に記載の組成物。
【請求項３４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項３５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項３６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項３７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項３８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項３９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項４０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ8で
ある、請求項29に記載の組成物。
【請求項４１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼdna
2である、請求項29に記載の組成物。
【請求項４２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、FEN-1である、
請求項29に記載の組成物。
【請求項４３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、リガーゼであ
る、請求項29に記載の組成物。
【請求項４４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、dUTPaseである
、請求項29に記載の組成物。
【請求項４５】さらにポリメラーゼを含む、請求項29に記載の組成物。
【請求項４６】前記ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請求項
45に記載の組成物。
【請求項４７】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項46
に記載の組成物。
【請求項４８】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求項4
6に記載の組成物。
【請求項４９】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項46に記載の組成物
。
【請求項５０】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項49に記載
の組成物。
【請求項５１】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活
性を欠く、請求項50に記載の組成物。
【請求項５２】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメラ
ーゼである、請求項51に記載の組成物。
【請求項５３】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポリ
メラーゼである、請求項51に記載の組成物。
【請求項５４】古細菌FEN-1並びに少なくとも１の、PCNA、RFC-P38、RFC-
P55、RFA、リガーゼ、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3、ヘリカーゼ
４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、ヘリカーゼ8、及びdUTPaseから
成る群から選ばれる古細菌ポリペプチドを含む、核酸ポリメラーゼ反応を促進す
る組成物。
【請求項５５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、PCNAである、
請求項54に記載の組成物。
【請求項５６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P38である
、請求項54に記載の組成物。
【請求項５７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P55である
、請求項54に記載の組成物。
【請求項５８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFAである、請
求項54に記載の組成物。
【請求項５９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ8で
ある、請求項54に記載の組成物。
【請求項６６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼdna
2である、請求項54に記載の組成物。
【請求項６７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、リガーゼであ
る、請求項54に記載の組成物。
【請求項６８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、dUTPaseである
、請求項54に記載の組成物。
【請求項６９】さらにポリメラーゼを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項７０】前記ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請求項
69に記載の組成物。
【請求項７１】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項70
に記載の組成物。
【請求項７２】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求項7
0に記載の組成物。
【請求項７３】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項69に記載の組成物
。
【請求項７４】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請
求項73に記載の組成物。
【請求項７５】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活
性を欠く、請求項74に記載の組成物。
【請求項７６】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメラ
ーゼである、請求項75に記載の組成物。
【請求項７７】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポリ
メラーゼである、請求項75に記載の組成物。
【請求項７８】古細菌RFA 並びに少なくとも１の、PCNA、RFC-P38、RFC-P
55、FEN-1、リガーゼ、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3、ヘリカー
ゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、ヘリカーゼ8及び、dUTPaseか
ら成る群から選ばれる古細菌ポリペプチドを含む、核酸ポリメラーゼ反応を促進
する組成物。
【請求項７９】前記古細菌RFAが、ピロコッカス・フリオサスからである
か又はその中に見出されるRFAと相同である、請求項78に記載の組成物。
【請求項８０】前記古細菌RFAがピロコッカス種若しくはサーモコッカス
種からであるか又はその中に見出されるRFAと相同である、請求項78に記載の組
成物。
【請求項８１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、PCNAである、
請求項78に記載の組成物。
【請求項８２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P38である
、請求項78に記載の組成物。
【請求項８３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P55である
、請求項78に記載の組成物。
【請求項８４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、FEN-1である、
請求項78に記載の組成物。
【請求項８５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項８６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項８７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項８８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項８９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項９０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項９１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ8で
ある、請求項78に記載の組成物。
【請求項９２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼdna
2である、請求項78に記載の組成物。
【請求項９３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、リガーゼであ
る、請求項78に記載の組成物。
【請求項９４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、dUTPaseである
、請求項78に記載の組成物。
【請求項９５】さらにポリメラーゼを含む、請求項78に記載の組成物。
【請求項９６】前記ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請求項
95に記載の組成物。
【請求項９７】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項96
に記載の組成物。
【請求項９８】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求項9
6に記載の組成物。
【請求項９９】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項95に記載の組成物
。
【請求項１００】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、
請求項99に記載の組成物。
【請求項１０１】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ
活性を欠く、請求項100に記載の組成物。
【請求項１０２】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメ
ラーゼである、請求項101に記載の組成物。
【請求項１０３】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポ
リメラーゼである、請求項101に記載の組成物。
【請求項１０４】古細菌リガーゼ並びに少なくとも１の、PCNA、RFC-P38
、RFC-P55、RFA、CDC6、FEN-1、MCM、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリカー
ゼ3、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、ヘリカーゼ8、
及びdUTPaseから成る群から選ばれる古細菌ポリペプチドを含む、核酸ポリメラ
ーゼ反応を促進する組成物。
【請求項１０５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、PCNAである
、請求項104に記載の組成物。
【請求項１０６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P38であ
る、請求項104に記載の組成物。
【請求項１０７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFC-P55であ
る、請求項104に記載の組成物。
【請求項１０８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFAである、
請求項104に記載の組成物。
【請求項１０９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１２】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ8
である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼd
na2である、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、CDC6である
、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、FEN-1である
、請求項104に記載の組成物。
【請求項１１９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、MCMである、
請求項104に記載の組成物。
【請求項１２０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、dUTPaseであ
る、請求項104に記載の組成物。
【請求項１２１】さらにポリメラーゼを含む、請求項104に記載の組成物
。
【請求項１２２】前記ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、請求
項121に記載の組成物。
【請求項１２３】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項1
22に記載の組成物。
【請求項１２４】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求
項122に記載の組成物。
【請求項１２５】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項121に記載の組成
物。
【請求項１２６】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性ポリメラーゼである、
請求項125に記載の組成物。
【請求項１２７】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ
活性を欠く、請求項126に記載の組成物。
【請求項１２８】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメ
ラーゼである、請求項127に記載の組成物。
【請求項１２９】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポ
リメラーゼである、請求項127に記載の組成物。
【請求項１３０】少なくとも１の、MCM、RFA、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3
、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ7、及びヘリカーゼdna
2から成る群から選ばれる古細菌補助因子を含む、核酸ポリメラーゼ反応を促進
する組成物。
【請求項１３１】前記少なくとも１の古細菌補助因子が、ピロコッカス・
フリオサスからであるか又はその中に見出される補助因子と相同である、請求項
130に記載の組成物。
【請求項１３２】前記少なくとも１の古細菌補助因子がピロコッカス種若
しくはサーモコッカス種からであるか又はその中に見出される補助因子と相同で
ある、請求項130に記載の組成物。
【請求項１３３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、MCMである、
請求項１30に記載の組成物。
【請求項１３４】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、RFAである、
請求項130に記載の組成物。
【請求項１３５】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ2
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１３６】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ3
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１３７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ4
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１３８】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ5
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１３９】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ6
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１４０】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼ7
である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１４１】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドが、ヘリカーゼd
na2である、請求項130に記載の組成物。
【請求項１４２】さらにポリメラーゼを含む、請求項130に記載の組成物
。
【請求項１４３】前記ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項142に記載
の組成物。
【請求項１４４】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項1
43に記載の組成物。
【請求項１４５】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求
項143に記載の組成物。
【請求項１４６】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項142に記載の組成
物。
【請求項１４７】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項146に記
載の組成物。
【請求項１４８】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ
活性を欠く、請求項147に記載の組成物。
【請求項１４９】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメ
ラーゼである、請求項148に記載の組成物。
【請求項１５０】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポ
リメラーゼである、請求項148に記載の組成物。
【請求項１５１】古細菌CDC6、古細菌MCM及び少なくとも１のポリメラー
ゼを含む、核酸ポリメラーゼ反応を促進する組成物。
【請求項１５２】前記CDC6及びMCMが、ピロコッカス種若しくはサーモコ
ッカス種からであるか又はその中に見出されるCDC6及びMCMと相同である、請求
項151に記載の組成物。
【請求項１５３】前記CDC6及びMCMが、ピロコッカス・フリオサスからで
あるか又はその中に見出されるCDC6及びMCMと相同である、請求項151に記載の組
成物。
【請求項１５４】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項1
51に記載の組成物。
【請求項１５５】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求
項151に記載の組成物。
【請求項１５６】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項151に記載の組成
物。
【請求項１５７】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項156に記
載の組成物。
【請求項１５８】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ
活性を欠く、請求項157に記載の組成物。
【請求項１５９】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメ
ラーゼである、請求項158に記載の組成物。
【請求項１６０】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポ
リメラーゼである、請求項158に記載の組成物。
【請求項１６１】さらに古細菌dUTPaseを含む、請求項151に記載の組成物
。
【請求項１６２】古細菌PCNA、古細菌FEN-1及び少なくとも１のポリメラ
ーゼを含む、核酸ポリメラーゼ反応を促進する組成物。
【請求項１６３】前記PCNA及びFEN-1が、ピロコッカス種若しくはサーモ
コッカス種からであるか又はその中に見出されるPCNA及びFEN-1と相同である、
請求項162に記載の組成物。
【請求項１６４】前記PCNA及びFEN-1が、ピロコッカス・フリオサスから
であるか又はその中に見出されるPCNA及びFEN-1と相同である、請求項162に記載
の組成物。
【請求項１６５】前記ポリメラーゼが、Pfuポリメラーゼである、請求項1
62に記載の組成物。
【請求項１６６】前記ポリメラーゼが、P.フリオサスpolIIである、請求
項162に記載の組成物。
【請求項１６７】さらに2次ポリメラーゼを含む、請求項162に記載の組成
物。
【請求項１６８】前記2次ポリメラーゼが、耐熱性である、請求項167に記
載の組成物。
【請求項１６９】前記2次ポリメラーゼが、3’→5’エキソヌクレアーゼ
活性を欠く、請求項168に記載の組成物。
【請求項１７０】前記2次ポリメラーゼが、Taq、Tfl、Tbr又はTthポリメ
ラーゼである、請求項169に記載の組成物。
【請求項１７１】前記2次ポリメラーゼが、Stoffel、Tru、Tca又はTfilポ
リメラーゼである、請求項169に記載の組成物。
【請求項１７２】さらに古細菌dUTPaseを含む、請求項162に記載の組成物
。
【請求項１７３】以下の：（a）図16（配列番号）に記載のヌクレオチド
配列、若しくはヌクレオチド7から始まる図16のヌクレオチド配列；（b）図17（
配列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チド、若しくはアミノ酸3から始まる図17のアミノ酸配列；又は（c）（a）若し
くは（b）のアナログ若しくは縮重変異体を含む古細菌RFAをコードする単離及び
精製ポリヌクレオチド。
【請求項１７４】前記ポリヌクレオチドがcDNAである、請求項173に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１７５】前記ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項173に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１７６】前記ポリヌクレオチドが完全又は一部合成である、請求
項173に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７７】以下の：（a）図45（配列番号）若しくは図55（配列番
号）に記載のヌクレオチド配列；（b）図46（配列番号）若しくは図47（配列番
号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
又は（c）（a）若しくは（b）のアナログ若しくは縮重変異体を含む古細菌MCMを
コードする単離及び精製ポリヌクレオチド。
【請求項１７８】前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項178に
記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７９】前記ポリヌクレオチドがcDNAである、請求項178に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１８０】前記ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項178に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１８１】前記ポリヌクレオチドが完全又は一部合成である、請求
項178に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８２】古細菌ヘリカーゼをコードする単離及び精製ポリヌクレ
オチドであって、ここで上記ポリヌクレオチドが以下の：（a）図22（配列番号
）に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（b）図29（配列番号）
に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；（c
）図23（配列番号）に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（d）
図30（配列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチド；（e）図24（配列番号）に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌク
レオチド；（f）図31（配列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチド；（g）図25（配列番号）に記載のヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド；（h）図32（配列番号）に記載のアミノ酸配列を含
むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；（i）図26（配列番号）に記載
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（j）図33（配列番号）に記載の
アミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；（k）図27（
配列番号）に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；（l）図34（配
列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチ
ド；（m）図28（配列番号）に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
；（n）図35（配列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチド；（o）図29（配列番号）に記載のヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチド；（p）図36（配列番号）に記載のアミノ酸配列を含むアミノ
酸配列をコードするポリヌクレオチド；及び（q）（a）〜（p）のアナログ若し
くは縮重変異体から成る群から選ばれる、古細菌ヘリカーゼをコードする単離及
び精製ポリヌクレオチド。
【請求項１８３】前記ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項183に
記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８４】前記ポリヌクレオチドがcDNAである、請求項183に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１８５】前記ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項183に記載
のポリヌクレオチド。
【請求項１８６】前記ポリヌクレオチドが完全又は一部合成である、請求
項183に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８７】 MCM、RFA、ヘリカーゼdna2、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3
、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、及びヘリカーゼ7から成る群から
選ばれる単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１８８】図46又は図47（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求
項188に記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１８９】図17（配列番号）又はアミノ酸3で始まる図17のアミノ
酸配列を含む、請求項188に記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９０】図29（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９１】図30（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９２】図31（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９３】図32（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９４】図33（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９５】図34（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９６】図35（配列番号）のアミノ酸配列を含む、請求項188に
記載の単離及び精製古細菌ポリペプチド。
【請求項１９７】核酸ポリメラーゼ反応に請求項１の組成物を利用するこ
とを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項１９８】核酸合成反応に請求項１の組成物を利用することを含む
、請求項198に記載の方法。
【請求項１９９】核酸増幅反応に請求項１の組成物を利用することを含む
、請求項198に記載の方法。
【請求項２００】核酸を突然変異誘導するときに請求項１の組成物を利用
することを含む、請求項198に記載の方法。
【請求項２０１】核酸を標識するときに請求項１の組成物を利用すること
を含む、請求項198に記載の方法。
【請求項２０２】核酸ポリメラーゼ反応に請求項29の組成物を利用するこ
とを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２０３】核酸合成反応に請求項29の組成物を利用することを含む
、請求項203に記載の方法。
【請求項２０４】核酸増幅反応に請求項29の組成物を利用することを含む
、請求項203に記載の方法。
【請求項２０５】核酸を突然変異誘導するときに請求項29の組成物を利用
することを含む、請求項203に記載の方法。
【請求項２０６】核酸を標識するときに請求項29の組成物を利用すること
を含む、請求項203に記載の方法。
【請求項２０７】核酸ポリメラーゼ反応に請求項54の組成物を利用するこ
とを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２０８】核酸合成反応に請求項54の組成物を利用することを含む
、請求項208に記載の方法。
【請求項２０９】核酸増幅反応に請求項54の組成物を利用することを含む
、請求項208に記載の方法。
【請求項２１０】核酸を突然変異誘導するときに請求項54の組成物を利用
することを含む、請求項208に記載の方法。
【請求項２１１】核酸を標識するときに請求項54の組成物を利用すること
を含む、請求項208に記載の方法。
【請求項２１２】核酸ポリメラーゼ反応に請求項78の組成物を利用するこ
とを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２１３】核酸合成反応に請求項78の組成物を利用することを含む
、請求項213に記載の方法。
【請求項２１４】核酸増幅反応に請求項78の組成物を利用することを含む
、請求項213に記載の方法。
【請求項２１５】核酸を突然変異誘導するときに請求項78の組成物を利用
することを含む、請求項213に記載の方法。
【請求項２１６】核酸を標識するときに請求項78の組成物を利用すること
を含む、請求項213に記載の方法。
【請求項２１７】核酸ポリメラーゼ反応に請求項104の組成物を利用する
ことを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２１８】核酸合成反応に請求項104の組成物を利用することを含
む、請求項218に記載の方法。
【請求項２１９】核酸増幅反応に請求項104の組成物を利用することを含
む、請求項218に記載の方法。
【請求項２２０】核酸を突然変異誘導するときに請求項104の組成物を利
用することを含む、請求項218に記載の方法。
【請求項２２１】核酸を標識するときに請求項104の組成物を利用するこ
とを含む、請求項218に記載の方法。
【請求項２２２】核酸ポリメラーゼ反応に請求項130の組成物を利用する
ことを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２２３】核酸合成反応に請求項130の組成物を利用することを含
む、請求項223に記載の方法。
【請求項２２４】核酸増幅反応に請求項130の組成物を利用することを含
む、請求項223に記載の方法。
【請求項２２５】核酸を突然変異誘導するときに請求項130の組成物を利
用することを含む、請求項223に記載の方法。
【請求項２２６】核酸を標識するときに請求項130の組成物を利用するこ
とを含む、請求項223に記載の方法。
【請求項２２７】核酸ポリメラーゼ反応に請求項151の組成物を利用する
ことを含む核酸ポリメラーゼ反応の促進方法。
【請求項２２８】核酸合成反応に請求項151の組成物を利用することを含
む、請求項228に記載の方法。
【請求項２２９】核酸増幅反応に請求項151の組成物を利用することを含
む、請求項228に記載の方法。
【請求項２３０】核酸を突然変異誘導するときに請求項151の組成物を利
用することを含む、請求項228に記載の方法。
【請求項２３１】核酸を標識するときに請求項151の組成物を利用するこ
とを含む、請求項228に記載の方法。
【請求項２３２】そのポリメラーゼ反応に古細菌MCM、古細菌CDC6、及び
古細菌FEN-1から成る群から選ばれる少なくとも1の補助因子を添加することを含
む、核酸ポリメラーゼ反応における核酸二重鎖の安定性増加の方法。
【請求項２３３】前記MCMがピロコッカス種若しくはサーモコッカス種か
らであるか又はそれらの中に見出されるMCMに対する相同体である、請求項233に
記載の方法。
【請求項２３４】前記MCMがピロコッカス・フリオサスからであるか又は
その中に見出されるMCMに対する相同体である、請求項233に記載の方法。
【請求項２３５】前記CDC6がピロコッカス種若しくはサーモコッカス種か
らであるか又はそれらの中に見出されるCDC6に対する相同体である、請求項233
に記載の方法。
【請求項２３６】前記CDC6がピロコッカス・フリオサスからであるか又は
その中に見出されるCDC6に対する相同体である、請求項233に記載の方法。
【請求項２３７】前記FEN-1がピロコッカス種若しくはサーモコッカス種
からであるか又はそれらの中に見出されるFEN-1に対する相同体である、請求項2
33に記載の方法。
【請求項２３８】前記FEN-1がピロコッカス・フリオサスからであるか又
はその中に見出されるFEN-1に対する相同体である、請求項233に記載の方法。
【請求項２３９】前記MCM、CDC6、及びFEN-1がピロコッカス種若しくはサ
ーモコッカス種からであるか又はそれらの中に見出されるMCM、CDC6、及びFEN-1
に対する相同体である、請求項233に記載の方法。
【請求項２４０】前記MCM、CDC6、及びFEN-1がピロコッカス・フリオサス
からであるか又はその中に見出されるMCM、CDC6、及びFEN-1に対する相同体であ
る、請求項233に記載の方法。
【請求項２４１】そのポリメラーゼ反応に古細菌PCNA、並びにMCM、CDC6
、FEN-1、RFC-P38、RFC-P55、RFA、dUTPase、リガーゼ、ヘリカーゼdna2、ヘリ
カーゼ2、ヘリカーゼ3、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリカーゼ
7、及びヘリカーゼ8から成る群から選ばれる少なくとも1の古細菌ポリペプチド
を添加することを含む、核酸ポリメラーゼ反応における核酸二重鎖の安定性増加
の方法。
【請求項２４２】前記古細菌PCNAがピロコッカス種若しくはサーモコッカ
ス種からであるか又はそれらの中に見出されるPCNAに対する相同体である、請求
項242に記載の方法。
【請求項２４３】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドがピロコッカス
種若しくはサーモコッカス種からであるか又はそれらの中に見出される少なくと
も1の古細菌ポリペプチドに対する相同体である、請求項242に記載の方法。
【請求項２４４】前記古細菌PCNA及び少なくとも1の古細菌ポリペプチド
がピロコッカス・フリオサスからであるか又はそれらの中に見出されるPCNA及び
少なくとも1の古細菌ポリペプチドに対する相同体である、請求項242に記載の方
法。
【請求項２４５】そのエキソヌクレアーゼ反応に古細菌PCNA、並びにMCM
、CDC6、FEN-1、RFC-P38、RFC-P55、RFA、dUTPase、リガーゼ、ヘリカーゼdna2
、ヘリカーゼ2、ヘリカーゼ3、ヘリカーゼ４、ヘリカーゼ5、ヘリカーゼ6、ヘリ
カーゼ7、及びヘリカーゼ8から成る群から選ばれる少なくとも1の古細菌ポリペ
プチドを添加することを含む、エキソヌクレアーゼ反応促進の方法。
【請求項２４６】前記古細菌PCNAがピロコッカス種若しくはサーモコッカ
ス種からであるか又はそれらの中に見出されるPCNAに対する相同体である、請求
項246に記載の方法。
【請求項２４７】前記少なくとも1の古細菌ポリペプチドがピロコッカス
種若しくはサーモコッカス種からであるか又はそれらの中に見出される少なくと
も1の古細菌ポリペプチドに対する相同体である、請求項246に記載の方法。
【請求項２４８】前記古細菌PCNA及び少なくとも1の古細菌ポリペプチド
がピロコッカス・フリオサスからであるか又はそれらの中に見出されるPCNA及び
少なくとも1の古細菌ポリペプチドに対する相同体である、請求項246に記載の方
法。
【請求項２４９】前記MCMがピロコッカス・フリオサスからであるか又は
その中に見出されるMCMに対する相同体である、請求項246に記載の方法。
【請求項２５０】前記MCMがピロコッカス種若しくはサーモコッカス種か
らであるか又はそれらの中に見出されるMCMに対する相同体である、請求項246に
記載の方法。
【請求項２５１】前記CDC6がピロコッカス・フリオサスからであるか又は
その中に見出されるCDC6に対する相同体である、請求項246に記載の方法。
【請求項２５２】前記CDC6がピロコッカス種若しくはサーモコッカス種か
らであるか又はそれらの中に見出されるCDC6に対する相同体である、請求項246
に記載の方法。
【請求項２５３】前記FEN-1がピロコッカス・フリオサスからであるか又
はその中に見出されるFEN-1に対する相同体である、請求項246に記載の方法。
【請求項２５４】前記FEN-1がピロコッカス種若しくはサーモコッカス種
からであるか又はそれらの中に見出されるFEN-1に対する相同体である、請求項2
46に記載の方法。
【請求項２５５】前記MCM、CDC6、及びFEN-1がピロコッカス・フリオサス
からであるか又はその中に見出されるMCM、CDC6、及びFEN-1に対する相同体であ
る、請求項246に記載の方法。
【請求項２５６】前記MCM、CDC6、及びFEN-1がピロコッカス種若しくはサ
ーモコッカス種からであるか又はそれらの中に見出されるMCM、CDC6、及びFEN-1
に対する相同体である、請求項246に記載の方法。
【請求項２５７】以下の：宿主細胞内に請求項304のベクターのポリヌクレオチドを発現させ、そして上記発現MCMポリペプチドを精製することを含むピロコッカス・フリオサスMCMポリペプチド製造方法。
【請求項２５８】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項258に記載
の方法。
【請求項２５９】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項258に記載
の方法。
【請求項２６０】請求項258の方法により製造された組換えMCMポリペプチ
ド。
【請求項２６１】以下の：宿主細胞内に請求項313のベクターのポリヌクレオチドを発現させ、そして上記発現RFAポリペプチドを精製することを含むピロコッカス・フリオサスRFAポリペプチド製造方法。
【請求項２６２】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項262に記載
の方法。
【請求項２６３】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項262に記載
の方法。
【請求項２６４】請求項262の方法により製造された組換えRFAポリペプチ
ド。
【請求項２６５】以下の：宿主細胞内に請求項322のベクターのポリヌクレオチドを発現させ、そして上記発現ヘリカーゼ・ポリペプチドを精製することを含むピロコッカス・フリオサス・ヘリカーゼ・ポリペプチド製造方法。
【請求項２６６】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項266に記載
の方法。
【請求項２６７】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項266に記載
の方法。
【請求項２６８】請求項266の方法により製造された組換えヘリカーゼ・
ポリペプチド。
【請求項２６９】単離及び精製古細菌MCMポリペプチド。
【請求項２７０】前記ポリペプチドがピロコッカス種若しくはサーモコッ
カス種からであるか又はそれらの中に見出されるMCMに対する相同体である、請
求項270に記載の方法。
【請求項２７１】前記ポリペプチドがピロコッカス・フリオサスからであ
るか又はその中に見出されるMCMに対する相同体である、請求項270に記載の方法
。
【請求項２７２】単離及び精製古細菌RFAポリペプチド。
【請求項２７３】前記ポリペプチドがピロコッカス種若しくはサーモコッ
カス種からであるか又はそれらの中に見出されるRFAに対する相同体である、請
求項273に記載の方法。
【請求項２７４】前記ポリペプチドがピロコッカス・フリオサスからであ
るか又はその中に見出されるRFAに対する相同体である、請求項273に記載の方法
。
【請求項２７５】請求項1の組成物を含むキット。
【請求項２７６】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項276
に記載のキット。
【請求項２７７】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項276に記載のキット。
【請求項２７８】核酸の標識又は検出に使用するための請求項276に記載
のキット。
【請求項２７９】請求項29の組成物を含むキット。
【請求項２８０】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項280
に記載のキット。
【請求項２８１】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項280に記載のキット。
【請求項２８２】核酸の標識又は検出に使用するための請求項280に記載
のキット。
【請求項２８３】請求項54の組成物を含むキット。
【請求項２８４】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項284
に記載のキット。
【請求項２８５】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項284に記載のキット。
【請求項２８６】核酸の標識又は検出に使用するための請求項284に記載
のキット。
【請求項２８７】請求項78の組成物を含むキット。
【請求項２８８】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項288
に記載のキット。
【請求項２８９】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項288に記載のキット。
【請求項２９０】核酸の標識又は検出に使用するための請求項288に記載
のキット。
【請求項２９１】請求項104の組成物を含むキット。
【請求項２９２】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項292
に記載のキット。
【請求項２９３】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項292に記載のキット。
【請求項２９４】核酸の標識又は検出に使用するための請求項292に記載
のキット。
【請求項２９５】請求項130の組成物を含むキット。
【請求項２９６】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項296
に記載のキット。
【請求項２９７】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項296に記載のキット。
【請求項２９８】核酸の標識又は検出に使用するための請求項296に記載
のキット。
【請求項２９９】請求項151の組成物を含むキット。
【請求項３００】核酸ポリメラーゼ反応促進に使用するための請求項300
に記載のキット。
【請求項３０１】核酸の合成、増幅又は突然変異誘導に使用するための請
求項300に記載のキット。
【請求項３０２】核酸の標識又は検出に使用するための請求項300に記載
のキット。
【請求項３０３】請求項178のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３０４】前記ベクターがプラスミドである、請求項304のベクタ
ー。
【請求項３０５】前記ベクターがバクテリオファージである、請求項304
のベクター。
【請求項３０６】前記ベクターがレトロウイルスである、請求項304のベ
クター。
【請求項３０７】前記ベクターがアデノウイルスである、請求項304のベ
クター。
【請求項３０８】前記ベクターがバキュロウイルスである、請求項304の
ベクター。
【請求項３０９】請求項304のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１０】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項310の宿主
細胞。
【請求項３１１】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項310の宿主
細胞。
【請求項３１２】請求項173のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３１３】前記ベクターがプラスミドである、請求項313のベクタ
ー。
【請求項３１４】前記ベクターがバクテリオファージである、請求項313
のベクター。
【請求項３１５】前記ベクターがレトロウイルスである、請求項313のベ
クター。
【請求項３１６】前記ベクターがアデノウイルスである、請求項313のベ
クター。
【請求項３１７】前記ベクターがバキュロウイルスである、請求項313の
ベクター。
【請求項３１８】請求項313のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３１９】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項319の宿主
細胞。
【請求項３２０】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項319の宿主
細胞。
【請求項３２１】請求項183のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２２】前記ベクターがプラスミドである、請求項322のベクタ
ー。
【請求項３２３】前記ベクターがバクテリオファージである、請求項322
のベクター。
【請求項３２４】前記ベクターがレトロウイルスである、請求項322のベ
クター。
【請求項３２５】前記ベクターがアデノウイルスである、請求項322のベ
クター。
【請求項３２６】前記ベクターがバキュロウイルスである、請求項322の
ベクター。
【請求項３２７】請求項322のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２８】前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項328の宿主
細胞。
【請求項３２９】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項328の宿主
細胞。