WO2016084879A1 - 核酸増幅試薬 - Google Patents

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WO2016084879A1
WO2016084879A1 PCT/JP2015/083175 JP2015083175W WO2016084879A1 WO 2016084879 A1 WO2016084879 A1 WO 2016084879A1 JP 2015083175 W JP2015083175 W JP 2015083175W WO 2016084879 A1 WO2016084879 A1 WO 2016084879A1
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WO
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dna polymerase
amino acid
pcna
dna
seq
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Application number
PCT/JP2015/083175
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English (en)
French (fr)
Inventor
哲大 小林
康広 新井
Original Assignee
東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid amplification reagent used for PCR (polymerase chain reaction) excellent in reaction specificity and amplification efficiency.
  • PCR is (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of primer to template single-stranded DNA, (3) the primer using DNA polymerase
  • This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating this cycle with 3 steps of the extension of 1 as one cycle.
  • the target nucleic acid can be amplified hundreds of thousands of times even from a small amount of sample such as several copies, and it is widely used not only in the research field but also in the forensic field such as genetic diagnosis and clinical diagnosis, or in microbial testing in food and the environment. It has come to be used.
  • reaction specificity and amplification efficiency are important.
  • the reaction specificity is the ability to specifically amplify only the target DNA. If the reaction specificity is low, non-specific amplification or primer dimer occurs, and the amplification amount of the target product decreases. It leads to things.
  • the amplification efficiency refers to the efficiency of amplifying the target DNA. An ideal PCR with an amplification efficiency of 100% amplifies the target DNA twice in one cycle. If the amplification efficiency is low, the amount of target DNA amplified in one cycle decreases, resulting in a decrease in the amount of product obtained and the detection of the amplified target DNA.
  • salts such as KCl, NH 4 Cl, (NH 4 ) 2 SO 4 , and tetramethylammonium hydroxide have a function of regulating the annealing power of the primer, and the optimum of these concentrations improves the reaction specificity and amplification efficiency. It becomes important to increase.
  • additives such as betaine, glycerol, glycols, and sugars are said to prevent primer misannealing and to stabilize proteins, which can increase reaction specificity and amplification efficiency. Become.
  • SSB Single stranded binding protein
  • PCNA PCNA
  • the DNA polymerase that performs PCR is also very important for improving reaction specificity and amplification efficiency.
  • general-purpose Taq DNA polymerase and Tth DNA polymerase various mutations have been studied in order to improve PCR efficiency and reaction specificity.
  • DNA polymerase in which SSB is fused in order to increase the binding force with a nucleic acid Recently, it has also been shown that DNA polymerase belonging to family B has higher amplification efficiency than DNA polymerase belonging to family A (general-purpose Taq DNA polymerase, Tth DNA polymerase, etc.). .
  • Patent Document 2 discloses a composition containing betaine in nucleic acid amplification using a DNA polymerase belonging to Family B, and suggests that various additives are used to enhance PCR performance. . However, even in the invention described in Patent Document 2, it is difficult to say that sufficient required characteristics are satisfied from the viewpoint of versatility.
  • PCR is not sufficiently amplified.
  • amplification is difficult in DNA amplification of a long-chain target or a target having a region with a high GC ratio, and the reaction is inhibited even under conditions containing impurities, and DNA amplification may not occur.
  • There is a need for a PCR composition that can efficiently amplify even under such difficult conditions high reaction specificity and high amplification efficiency; the same applies hereinafter).
  • An object of the present invention is to provide a reaction composition having a high success rate in DNA replication. Still another object of the present invention is to provide a nucleic acid amplification reagent suitable for the above-mentioned purpose. In summary, an object of the present invention is to provide a PCR reaction reagent suitable for amplification of a gene in the presence of a base analog.
  • the nucleic acid amplification reagent of the present invention for achieving the above object is characterized by using DNA polymerase belonging to family B, PCNA, and betaine.
  • the present inventors have further added betaine to a reaction system using a DNA polymerase belonging to Family B and PCNA, whereby a long chain target DNA or a region having a high GC ratio is obtained. It has been found that efficient PCR can be performed even in a reaction system containing a target DNA having an inhibitor and an inhibitory substance, and the present invention has been completed.
  • the representative present invention is as follows.
  • [Claim 1] A nucleic acid amplification reagent comprising DNA polymerase belonging to family B, Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), and betaine, wherein the PCNA consists of any of the following (1) or (2) Nucleic acid amplification reagent characterized.
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, and having DNA polymerase amplification enhancing activity ( 2) A polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 of 80% or more and having DNA polymerase amplification enhancing activity [Claim 2]
  • a nucleic acid amplification reagent comprising a DNA polymerase belonging to family B, PCNA and betaine, wherein the PCNA consists of any of the following (1) or (2): (1) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 and having DNA polymerase amplification enhancing activity ( 2) A polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 of 80% or more and having DNA polymerase amplification enhancing
  • the present invention provides a PCR composition having excellent reaction specificity and amplification efficiency in DNA amplification. It can be widely used not only in the research field, but also in the clinical field such as genetic diagnosis or the field of forensic medicine, or in the examination of microorganisms in food or the environment.
  • the base sequence, the amino acid sequence, and individual constituent elements thereof may be simplified symbols using single-letter alphabets, but all follow the practices in the fields of molecular biology and genetic engineering.
  • a notation such as “D143A” is used.
  • D143A indicates that the 143rd aspartic acid was substituted with alanine, that is, the type of amino acid residue before substitution, its location, and the type of amino acid residue after substitution.
  • sequence numbers correspond to the sequence numbers described in the sequence listing unless otherwise specified. In the case of multiple mutants, the above notation is connected by “/”.
  • “D143A / D147A” indicates that the 143rd aspartic acid was substituted with alanine and the 147th aspartic acid was substituted with alanine.
  • information on the mutation site such as “P36H” is added after the symbol “/”.
  • the term “mutant” in the case of “mutant PCNA” means that it has an amino acid sequence different from the conventionally known PCNA, and is caused by artificial mutation or natural variation. It does not distinguish whether or not.
  • Nucleic acid amplification reagent One of the embodiments of the present invention is a reagent for amplifying a nucleic acid, (A) DNA polymerase belonging to family B, and (b) PCNA (C) A nucleic acid amplification reagent which performs a DNA synthesis reaction in the presence of betaine.
  • the nucleic acid amplification reagent in the present invention is not particularly limited as long as it can be amplified by a DNA polymerase.
  • PCR is a typical nucleic acid amplification method, but the nucleic acid amplification reagent of the present invention is not only PCR, but also a primer by reacting one kind of primer, dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate), using DNA as a template.
  • dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
  • a primer extension method, a sequencing method, a conventional method that does not perform temperature cycling, a cycle sequence method, and the like are included.
  • the nucleic acid applied to the nucleic acid amplification reagent of the present invention is not particularly limited as long as it can be amplified by DNA polymerase, and is not limited by its length, sequence, GC content, or the like.
  • the nucleic acid is DNA composed of adenine (A), cytosine (C), guanine (G), and thymine (T).
  • the nucleic acid is “decreased”. In this specification, it is possible to use a mutant having a detection activity ”(bases other than adenine, cytosine, guanine, and thymine are referred to as base analogs).
  • bases such as uracil and inosine may be included.
  • the base constituting the DNA may include any of the above A, C, G, T, and base analogs.
  • the amplification target DNA DNA polymerase belonging to family B
  • PCNA PCNA
  • C PCNA
  • D a pair of primers in which one primer is complementary to the DNA extension product of the other primer
  • dNTP DNA synthesis substrate
  • F mixing a buffer solution containing magnesium ions, ammonium ions and / or potassium ions
  • reaction solution is heated to about 94 ° C., and the temperature is maintained for 30 seconds to 1 minute to separate the double-stranded DNA into single strands.
  • Rapid cooling to about 60 ° C. (slightly different depending on the primer), and annealing the single-stranded DNA and the primer.
  • III Heat again to a temperature range that is optimal for DNA polymerase activity without primer separation. Depending on the experimental purpose, the temperature is set to about 60-72 ° C. This temperature is usually maintained for 1 to 2 minutes depending on the time required for DNA synthesis and the length of amplification.
  • IV This is one cycle, and thereafter, the procedure from (I) to (III) is repeated to amplify a specific DNA fragment.
  • BSA and a nonionic surfactant may be further used as necessary.
  • an antibody having the activity of suppressing the polymerase activity and / or 3'-5 'exonuclease activity of the thermostable DNA polymerase may be used.
  • the antibody include a monoclonal antibody and a polyclonal antibody. This reaction composition is particularly effective for increasing the sensitivity of PCR and reducing nonspecific amplification.
  • the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification reagent of the present invention is a DNA polymerase belonging to Family B.
  • a DNA polymerase belonging to Family B refers to a DNA polymerase having 3′-5 ′ exonuclease activity and not having 5′-3 ′ exonuclease activity.
  • a DNA polymerase derived from archaea (Archia) is preferred.
  • the DNA polymerase belonging to the family B is preferably an archaea-derived DNA polymerase.
  • DNA polymerase derived from archaea examples include DNA polymerases isolated from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus. Examples of the DNA polymerase derived from the genus Pyrococcus include Pyrococcus furiosus and Pyrococcus sp. Including, but not limited to, DNA polymerases isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus horikoshii.
  • DNA polymerases derived from the genus Thermococcus include Thermococcus kodakaraensis, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus litoralis, Thermococcus sp. JDF-3, Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. Including, but not limited to, DNA polymerase isolated from KS-1, Thermococcus celler, or Thermococcus sicili.
  • a mutant obtained by modifying the DNA polymerase described later to modify the 3′-5 ′ exonuclease region and / or to have a reduced base analog detection activity may be used.
  • the modified DNA polymerase used for the nucleic acid amplification reagent of the present invention may further contain at least one amino acid modification in any of the amino acid sequences of the 3′-5 ′ exonuclease active region.
  • 3′-5 ′ exonuclease activity refers to the ability to remove incorporated nucleotides from the 3 ′ end of a DNA polymer, and the above 3′-5 ′ exonuclease region is a DNA polymerase belonging to family B.
  • Thermococcus kodakaraensis DNA polymerase (SEQ ID NO: 1), Pyrococcus furiosus DNA polymerase (SEQ ID NO: 2), Thermococcus gorgonarius DNA polymerase (SEQ ID NO: 3), DNA polymerase derived from Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), DNA polymerase derived from Pyrococcus sp GB-D (SEQ ID NO: 5), derived from Thermococcus sp JDF-3 DNA polymerase (SEQ ID NO: 6 DNA polymerase derived from Thermococcus sp 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), DNA polymerase derived from Thermococcus sp KS-1 (SEQ ID NO: 8), DNA polymerase derived from Thermococcus cellar (sequence) No.
  • DNA polymerase derived from Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 10), amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318.
  • the present invention is also applied to a DNA polymerase other than the DNA polymerase specifically presenting the sequence.
  • the 3′- consisting of amino acids 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1 The region corresponding to the 5 ′ exonuclease region is shown.
  • amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 shown in SEQ ID NO: 1 are DNA polymerases having an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • An expression comprising amino acid sequences corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 of SEQ ID NO: 1.
  • the meaning of “corresponding” in the notation of the same format as described above is the same as in the above example.
  • the modification of the above 3'-5 'exonuclease region can consist of substitution, deletion or addition, but is not particularly limited. For example, alterations to amino acids corresponding to positions 137 to 147, 206 to 222, and 308 to 318 in SEQ ID NO: 1 are shown.
  • DNA polymerase in which the 3′-5 ′ exonuclease active region is modified one in which at least one of amino acids corresponding to positions 141, 142, 143, 210, 311 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is modified is preferable.
  • These modified DNA polymerases are deficient in 3'-5 'exonuclease activity. More preferably, it is a DNA polymerase deficient in 3'-5 'exonuclease activity, wherein the amino acid modification is any one selected from D141A, E143A, D141A / E143A, I142R, N210D, or Y311F.
  • 3'-5 'exonuclease activity-deficient (exo (-)) DNA polymerase includes a complete lack of activity, for example, 0.03%, 0.05% compared to the parent enzyme , 0.1%, 1%, 5%, 10%, 20%, or at most 50% or less of a modified DNA polymerase having exonuclease activity.
  • DNA polymerase in which the 3'-5 'exonuclease active region is modified is any one selected from H147E and H147D in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. These modified DNA polymerases have improved PCR efficiency while maintaining exonuclease activity.
  • a method for producing a DNA polymerase with a modified 3′-5 ′ exonuclease active region and a method for analyzing 3′-5 ′ exonuclease activity are known and disclosed, for example, in US Pat. No. 6,946,273. Yes.
  • a DNA polymerase with improved PCR efficiency refers to a modified DNA polymerase in which the amount of PCR product is increased compared to the parent enzyme.
  • a method for analyzing whether or not the amount of the PCR product is increased as compared with the parent enzyme is described in Japanese Patent No. 3891330.
  • the DNA polymerase belonging to family B used for the nucleic acid amplification reagent of the present invention may be a mutant having reduced base analog detection activity.
  • Base analogs refer to bases other than adenine, cytosine, guanine, and thymine, and include uracil and inosine.
  • a DNA polymerase belonging to Family B binds strongly when a base analog such as uracil or inosine is detected, and inhibits the polymerase function.
  • the base analog detection activity refers to an activity that strongly binds to a base analog and inhibits the polymerase function.
  • a DNA polymerase mutant belonging to family B having reduced base analog detection activity is a DNA polymerase mutant belonging to family B characterized by low binding ability to uracil and inosine.
  • Such a mutant can be prepared by modifying at least one position of the amino acid sequence (uracil binding pocket) relating to uracil binding.
  • uracil-binding pockets formed by archaebacterial DNA polymerase belonging to family B for example, amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of DNA polymerase derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain (position No. 1), and positions 78-130 Examples include DNA polymerase mutants that have been modified at least at one site and have reduced ability to bind to uracil or inosine compared to wild-type DNA polymerase.
  • DNA polymerase mutants with low binding ability to uracil and inosine do not show much decrease in DNA polymerase function even in PCR in the presence of dUTP, and the effect of dUTP on the elongation reaction of DNA polymerase is reduced.
  • the amino acid sequence for uracil binding is highly conserved in DNA polymerases derived from Pyrococcus and Thermococcus.
  • DNA polymerase SEQ ID NO: 1 derived from Thermococcus kodakaraensis
  • SEQ ID NO: 2 derived from Thermococcus kodakaraensis
  • Pyrococcus furiosus SEQ ID NO: 2
  • it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus gorgonarius SEQ ID NO: 3
  • amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130 In Thermococcus gorgonarius (SEQ ID NO: 3), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus litoralis (SEQ ID NO: 4), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Pyrococcus sp. GB-D (SEQ ID NO: 5), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp. JDF-3 (SEQ ID NO: 6), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus sp 9 ° N-7 (SEQ ID NO: 7), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • KS-1 (SEQ ID NO: 8), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus cellar (SEQ ID NO: 9), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • Thermococcus cyclis (SEQ ID NO: 10), it is formed by amino acids 1 to 40 and amino acids 78 to 130.
  • DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity for use in the nucleic acid amplification reagent of the present invention is assumed to be directly related to interaction with uracil 7, 36, 37, 90 Archaebacterial DNA polymerase mutant in which at least one of amino acids ⁇ 97 and 112 to 119 is modified, for example, (a) 7, 36, 37 of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 , 90-97 and 112-119, an archaeal DNA polymerase variant represented by an amino acid sequence having at least one amino acid modification.
  • the DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (b).
  • the identity or the identity between the amino acid sequence and SEQ ID NO: 2 is 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, more preferably 98%.
  • the DNA polymerase mutant may be one represented by the following amino acid sequence (c).
  • “several” is not limited as long as “decreased base analog detection activity” is maintained, but is, for example, a number corresponding to less than about 20% of all amino acids, preferably less than about 15%. It is a corresponding number, more preferably a number corresponding to less than about 10%, even more preferably a number corresponding to less than about 5%, and most preferably a number corresponding to less than about 1%. More specifically, the number of amino acid residues to be mutated is, for example, 2 to 160, preferably 2 to 120, more preferably 2 to 80, still more preferably 2 to 40, and even more. The number is preferably 2-5.
  • amino acids corresponding to positions 7, 36, 37, 90 to 97, and 112 to 119 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are amino acid sequences that are not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a position (order) on SEQ ID NO: 1 in an amino acid sequence that is not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is compared with a position corresponding to a position (sequence) on the primary structure of the sequence, The position corresponds to the position of SEQ ID NO: 1.
  • the meaning of “corresponding” in the notation of the same format as described above is the same as in the above example.
  • the position corresponding to a certain position (order) on SEQ ID NO: 6 in the amino acid sequence not completely identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is compared (aligned) with the primary structure of the sequence.
  • the position corresponds to the position of SEQ ID NO: 1.
  • the meaning of “corresponding position” in the notation of the same format as described above is the same as the above example.
  • the DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity used for the nucleic acid amplification reagent of the present invention is more preferably selected from at least amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Y7 means a tyrosine (Y) residue which is the seventh amino acid, and one letter of the alphabet represents an abbreviation of a commonly used amino acid.
  • the Y7 amino acid has tyrosine (Y) substituted with a nonpolar amino acid, specifically selected from the group consisting of Y7A, Y7G, Y7V, Y7L, Y7I, Y7P, Y7F, Y7M, Y7W, and Y7C. Amino acid substitution.
  • the P36 amino acid is substituted with a polar amino acid in which proline (P) is positively charged, specifically P36H, P36K, or P36R.
  • the V93 amino acid has a valine (V) substituted with a positively charged polar amino acid, specifically a V93H, V93K, or V93R amino acid substitution.
  • the modification is at least one amino acid modification selected from the group consisting of Y7A, P36H, P36K, P36R, V93Q, V93K, and V93R. More preferably, it is P36K, P36R or P36H. Particularly preferred is P36H.
  • the DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity in the present invention is a modified version of two or more amino acids selected from amino acids corresponding to amino acids Y7, P36, or V93 in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. But it ’s okay. Specific examples include Y7A / V93K, Y7A / P36H, Y7A / P36R, Y7A / V93R, Y7A / V93Q or P36H / V93K, preferably Y7A / P36H or Y7A / V93K. It is not limited.
  • mutants can be considered as the modified DNA polymerase used in the nucleic acid amplification reagent of the present invention.
  • mutants include, but are not limited to, archaeal DNA polymerase mutants having any of the following modifications (1) to (4).
  • the base analog detection activity in the present invention can be evaluated by PCR.
  • the base analog is typically uracil.
  • a dUTP solution is added at a final concentration of 0.5 ⁇ M to 200 ⁇ M to a normal PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and a DNA polymerase to be evaluated, and thermal cycling is performed. After the reaction, the presence or absence of a PCR product is confirmed by ethidium bromide-stained 1% agarose electrophoresis, and the detection activity of uracil can be evaluated by the allowable dUTP concentration.
  • a DNA polymerase having a high uracil detection activity inhibits the extension reaction when a little dUTP is added, and the PCR product cannot be confirmed.
  • DNA polymerase with low uracil detection activity can confirm DNA amplification by PCR without problems even when a high concentration of dUTP is added.
  • a DNA polymerase mutant having reduced base analog detection activity means that there is no mutation as a result of optimal thermal cycling using any primer and DNA as a template in the enzyme optimal reaction buffer. Compared to the wild type, it refers to a DNA polymerase in which the elongation reaction is not inhibited even when a high concentration of dUTP is added, and the PCR product can be confirmed. However, when it is difficult to compare with wild type, archaeal DNA polymerase mutants that can be amplified by PCR even when dUTP is added at a concentration of 0.5 ⁇ M, the mutants are reduced compared to wild type. It is presumed to have the activity of detecting a base analog.
  • the evaluation of the base analog detection activity in the present invention follows the following method. KOD -Plus- Ver. 2 (Toyobo) attached 10 ⁇ PCR Buffer or Pfu DNA Polymerase (Agilent) attached 10 ⁇ PCR Buffer, 1 ⁇ PCR Buffer, 1.5 mM MgSO 4 , 0.2 mM dNTPs (dATP, dTTP, (dCTP, dGTP), 15 pmol of a primer described in SEQ ID NOS: 11 and 12 for amplifying about 1.3 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche Human Genomic DNA; model number 116111112001), in a 50 ⁇ l reaction solution containing 1 U of each enzyme DUTP (Roche) is added to a final concentration of 0.5, 5, 50, 100, and 200 ⁇ M.
  • PCR is performed using PCR system GeneAmp 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of repeating 98 cycles of 10 ° C., 10 seconds ⁇ 65 ° C., 30 seconds ⁇ 68 ° C., 1 minute 30 seconds.
  • 1% agarose electrophoresis is performed on 5 ⁇ l of the reaction solution, ethidium bromide staining is performed, and whether or not the base analog detection activity is decreased by confirming the amplified DNA fragment of about 1.3 kb under ultraviolet irradiation. Can be evaluated.
  • a site-specific mutagenesis method based on the Inverse PCR method can be used.
  • KOD-Plus-Mutageness Kit manufactured by Toyobo
  • Phosphorylation of newly synthesized gene, Ligation (5) A kit that can transform a cyclized gene into Escherichia coli and obtain a transformant having a plasmid introduced with the target mutation.
  • the modified DNA polymerase gene is transferred to an expression vector as necessary, and, for example, E. coli as a host is transformed with the expression vector, and then applied to an agar medium containing a drug such as ampicillin to form colonies.
  • the colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 ⁇ YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
  • a vector derived from pBluescript is preferable. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells. For example, ultrasonic treatment, a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • This crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes to inactivate the host-derived polymerase, and the DNA polymerase activity is measured.
  • any method may be used as a method for obtaining purified DNA polymerase from the strain selected by the above method.
  • the following method is preferable. That is, after collecting cells obtained by culturing in a nutrient medium, a crude enzyme solution is obtained by crushing and extracting by enzymatic or physical crushing methods. The obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the DNA polymerase fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by heparin sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation.
  • the purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it shows almost a single band.
  • the DNA polymerase used for the nucleic acid amplification reagent measures activity as follows. If the enzyme activity is strong, samples should be stored in storage buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin). Dilute and measure. (1) 25 ⁇ l of the following solution A, 5 ⁇ l of solution B, 5 ⁇ l of solution C, 10 ⁇ l of sterilized water, and 5 ⁇ l of enzyme solution are added to a microtube and reacted at 75 ° C. for 10 minutes.
  • storage buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • Solution A 40 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 16 mM magnesium chloride 15 mM dithiothreitol, 100 ⁇ g / mL BSA (bovine serum albumin)
  • Solution B 1.5 ⁇ g / ⁇ l activated calf thymus DNA
  • C 1.5 mM dNTP (250 cpm / pmol [3H] dTTP)
  • Liquid D 20% trichloroacetic acid (2 mM sodium pyrophosphate)
  • E 1 mg / mL calf thymus DNA
  • PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen
  • the PCNA is not particularly limited, but is preferably a heat-resistant one that can withstand the thermal cycle of PCR, and preferably one that remains active after PCR. More preferably, it is soluble even after heat treatment at 80 ° C. for 30 minutes, and the activity remains at 50% or more, more preferably at least 70%, particularly preferably at least 90%.
  • PCNA examples include PCNA isolated from bacteria of the genus Pyrococcus and Thermococcus.
  • PCNA derived from the genus Pyrococcus includes Pyrococcus furiosus (SEQ ID NO: 13), Pyrococcus sp. Including, but not limited to, PCNA isolated from GB-D, Pyrococcus Wosei, Pyrococcus abyssi or Pyrococcus horikoshii.
  • PCNA derived from the genus Thermococcus includes Thermococcus kodakaaraensis (SEQ ID NO: 14), Thermococcus gorgonaris, Thermococcus literalis, Thermococcus sp.
  • JDF-3 Thermococcus sp. 9 degrees North-7 (Thermococcus sp. 9 ° N-7), Thermococcus sp. KS-1, Thermococcus celer, or Thermococcus siculi, Methanocladoccus jannaschii (Mja) or Methanobacterium thermoautotropicum (Mth) include, but are not limited to, PCNA.
  • a gene encoding PCNA can be cloned from an organism having PCNA. It can also be artificially synthesized based on amino acid sequence information and nucleic acid sequence information.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification reagent of the present invention may be a mutant that is loaded into DNA alone (having DNA polymerase amplification enhancing activity).
  • PCNA usually forms a multimer and has a ring-like structure. Loading to DNA indicates that the DNA is allowed to pass inside the ring structure of the PCNA multimer, and PCNA can be loaded into DNA only in combination with a factor usually called RFC.
  • Mutants that load DNA alone are those that modify the sites involved in PCNA multimer formation and destabilize multimer formation, making it easier to pass DNA into PCNA multimers without RFC. Show.
  • the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13, 14 or 19 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 93% or more, even more Preferably it is 95% or more, Especially preferably, it is 98% or more, Most preferably, it is 99% or more.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence having a certain identity or more can be prepared based on the known genetic engineering techniques as described above.
  • KOD-PCNA and Pfu-PCNA PCNA-related sites for multimer formation include PCNA derived from Thermococcus kodakaraensis (hereinafter also referred to as “KOD-PCNA”) (SEQ ID NO: 14), PCNA of Pyrococcus furiosus (hereinafter “Pfu-PCNA”).
  • SEQ ID NO: 13 includes an N-terminal region consisting of amino acids 82, 84 and 109 and a C-terminal region consisting of amino acids 139, 143 and 147. The N-terminal region is positively charged, the C-terminal region is negatively charged, and multimers are formed by interaction.
  • SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 as an example also applies to PCNA other than the PCNA whose sequence is specifically presented herein.
  • a region related to multimer formation consisting of amino acids 82, 84, 109, 139, 143, and 147 of SEQ ID NO: 13 Indicates the corresponding area.
  • the amino acid or region “corresponds” in one of the reference amino acid sequences means that when the primary structure of the amino acid sequences is compared (aligned), The position corresponds to the position.
  • PCNA variants that load DNA alone are more preferably involved in PCNA multimer formation, (A) N-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 82, 84 and 109, or (b) C-terminal region consisting of amino acids corresponding to positions 139, 143 and 147, having at least one modification and no RFC Both include mutants that are loaded into DNA and promote the elongation reaction by DNA polymerase.
  • the amino acid corresponding to position 143 of SEQ ID NO: 13 is changed to a basic amino acid
  • the positions 82 and 143 are both changed to neutral amino acids
  • the position 147 is changed to a neutral amino acid, or 109 And the like, in which both the 145th and 143rd are modified to neutral amino acids.
  • the neutral amino acid of the present invention include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, proline, serine, threonine, cysteine, methionine, asparagine, and glutamine as long as they are natural.
  • the alanine has the smallest influence on the three-dimensional structure of the peripheral site of the substitution site.
  • Examples of basic amino acids include arginine, histidine, lysine, and tryptophan as long as they are natural. Arginine or lysine is preferable.
  • a sequence in which the 147th amino acid residue is substituted with alanine (D147A), the 82nd and 143rd amino acid residues are alanine.
  • Sequence (R82A / D143A or R82A / E143A) and sequences in which the 109th and 143rd amino acid residues are substituted with alanine (R109A / D143A or R109A / E143A). It is not limited to.
  • the PCNA used in the nucleic acid amplification reagent of the present invention may be a modified methionine corresponding to the 73rd position of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 in order to increase the expression level. More preferable examples include those modified to M73L, but are not limited thereto.
  • PCNA used for the nucleic acid amplification reagent of this invention is a PCNA monomer shown in either of the following (1) to (3).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which the 142nd amino acid residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 is substituted with a basic amino acid residue.
  • the PCNA monomer represented by [1] one or several amino acid residues other than the amino acid residue corresponding to position 142 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 are substituted or missing.
  • mutation a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, and having DNA polymerase amplification enhancing activity.
  • SEQ ID NO: 19 is the amino acid sequence of PCNA derived from Methanocaldococcus jannaschii (hereinafter also simply referred to as Mja). This amino acid sequence has been elucidated in Non-Patent Document 1, etc.
  • the 142nd amino acid residue is one of the amino acid residues involved in PCNA multimer formation. Amino acid residues involved in PCNA multimer formation are present in the N-terminal region and C-terminal region of each monomer. The PCNA multimer is formed by joining the N-terminal region of one monomer and the C-terminal region of the other monomer as an interface. In eukaryotic cells and archaea, PCNA often forms trimers.
  • the N-terminal region corresponds to the position of the group indicated by (a) below
  • the C-terminal region corresponds to the position of the group indicated by (b) below.
  • polypeptide of (2) above one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 as long as the DNA polymerase amplification enhancing activity is retained. (Hereinafter, these are collectively referred to as “mutation”.)
  • One or several mutations include restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., site-directed mutagenesis or random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New (York) and the like can be carried out by introducing mutation into DNA encoding the PCNA monomer of the present invention described later.
  • variant PCNA monomer can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • variant PCNA monomers also include naturally occurring variants (for example, single nucleotide polymorphisms) such as those based on individual differences in microorganisms holding PCNA, differences in species or genera.
  • the polypeptide of [3] above is a polypeptide having an amino acid sequence that retains DNA polymerase amplification enhancing activity and has an identity of 80% or more compared to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19. is there.
  • the identity between the amino acid sequence of the PCNA monomer of the present invention and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 is 85% or more, more preferably 88% or more, still more preferably 90% or more, and even more.
  • it is 93% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • Such a polypeptide comprising an amino acid sequence having a certain identity or more can be prepared based on the known genetic engineering techniques as described above.
  • PCNA as described in [2] or [3] above, more preferably, those having an affinity tag such as a His tag inserted at the N-terminus for easy purification of PCNA can be mentioned. There is no particular limitation.
  • the 142nd amino acid residue in SEQ ID NO: 19 is substituted with a basic amino acid residue, but the type of basic amino acid to be substituted is not particularly limited.
  • Examples of basic amino acids include arginine, histidine, lysine, and tryptophan as long as they are natural. Arginine or lysine is preferable.
  • the above-mentioned method for obtaining PCNA involves transferring the PCNA gene to an expression vector as necessary, transforming, for example, Escherichia coli as a host using the expression vector, and then applying it to an agar medium containing a drug such as ampicillin. To form.
  • the colony is inoculated into a nutrient medium such as LB medium or 2 ⁇ YT medium and cultured at 37 ° C. for 12 to 20 hours, and then the cells are crushed and the crude enzyme solution is extracted.
  • a vector derived from pBluescript is preferable. Any known method may be used as a method for crushing bacterial cells.
  • ultrasonic treatment a physical crushing method such as French press or glass bead crushing, or a lytic enzyme such as lysozyme can be used.
  • This crude enzyme solution is heat-treated at 80 ° C. for 30 minutes and centrifuged to remove the host-derived protein and subjected to SDS-PAGE to confirm the expression of the target protein.
  • any method may be used as a method for obtaining purified PCNA from the strain selected by the above method, for example, the following method.
  • the crude enzyme solution is obtained by crushing and extracting by an enzymatic or physical crushing method.
  • the obtained crude enzyme extract is heat-treated, for example, at 80 ° C. for 30 minutes, and then the PCNA fraction is recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • This crude enzyme solution can be desalted by a method such as gel filtration using Sephadex G-25 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech). After this operation, it can be separated and purified by Q Sepharose column chromatography to obtain a purified enzyme preparation.
  • the purified enzyme preparation is purified by SDS-PAGE to such an extent that it almost shows a single band.
  • PCNA mutant can be loaded into DNA alone (having DNA polymerase amplification enhancing activity) can be evaluated by PCR.
  • PCNA to be evaluated is added to a PCR reaction solution containing DNA as a template, buffer material, magnesium, dNTPs, primers, and DNA polymerase belonging to Family B, with or without wild-type PCNA added, and DNA By comparing the amount of amplification, it can be confirmed whether or not the DNA can be loaded alone. Even if wild-type PCNA or other PCNA that cannot be loaded into DNA alone is added, the amount of DNA amplified by PCR does not change, but rather the amount of DNA amplified tends to be reduced. On the other hand, a mutant that can be loaded into DNA alone can be evaluated for DNA polymerase amplification enhancing activity by comparing with a mutant without addition of PCNA.
  • the evaluation of “whether the PCNA mutant can be loaded on DNA alone” is according to the following method. Using 10 ⁇ PCR Buffer (concentrated to 10 times the concentration used in the reaction) attached to KOD Dash (manufactured by Toyobo) 1 ⁇ PCR Buffer, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol of the primers according to SEQ ID NOS: 15 and 16, which amplify DNA of about 3.6 kb, 10 ng of human genomic DNA (Roche's Human Genomic DNA; model number 116111112001), Prepare a reaction solution containing 1U KOD-Plus-DNA polymerase, 250 ng of PCNA to be evaluated is added to 50 ⁇ l of the reaction solution, and PCR is performed on a schedule of repeating 30 cycles of 98 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 30 seconds after 94 ° C.
  • the amount of amplified DNA is quantified by using Gel Pro Analyzer (Media Cybernetics), which is an electrophoresis pattern analysis software.
  • the DNA amplification amount when PCNA is added is 1.0 times (preferably 1.2 times, more preferably when DNA amplification is not added). Exceeds 1.5 times, more preferably 2 times and 3 times.
  • the target DNA that has not been amplified is amplified, it is determined that the PCNA has “DNA polymerase amplification enhancing activity”.
  • the modification of PCNA can be performed in the same manner as the modification of DNA polymerase.
  • the DNA synthesis substrate is typically composed of four types of deoxynucleotide triphosphates, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, except for dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. It may also contain a deoxynucleotide triphosphate such as dUTP or dITP.
  • the primer used in the above-described nucleic acid amplification reagent of the present invention is typically composed of nucleotides consisting of 4 bases of adenine, cytosine, guanine and thymine.
  • adenine, cytosine and guanine are used.
  • Example 1-1 Production of KOD DNA polymerase mutants Modified thermostable DNA polymerases derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain (Y7A / V93K / H147E and Y7A / P36H / N210D mutation) for use in the examples described below.
  • A) A plasmid containing the gene was prepared.
  • a DNA template used for mutagenesis a modified heat-resistant DNA polymerase gene (SEQ ID NO: 17) (pKOD) derived from Thermococcus kodakaraensis KOD1 strain cloned in pBluescript was used.
  • Example 1-2 Preparation of Pfu DNA polymerase mutant A plasmid containing a modified thermostable DNA polymerase (Y7A / P36H / N210D mutant) gene derived from Pyrococcus furiosus strain was prepared for use in the examples described later.
  • a modified thermostable DNA polymerase gene (SEQ ID NO: 35) (pPfu) derived from Pyrococcus furiosus cloned in pBluescript was used. Mutation was introduced using a KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli JM109 was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • Example 2 Production of modified thermostable DNA polymerase The cells obtained in Example 1 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated at 37 ° C. for 16 hours in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. Coli JM109 (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Further, nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and heparin sepharose chromatography were performed.
  • thermostable DNA polymerase 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween 20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin.
  • the DNA polymerase activity in the purification step was measured according to the above DNA polymerase activity measurement method. When the enzyme activity was high, the sample was diluted for measurement.
  • Example 4 Production of KOD-PCNA1
  • the cells obtained in Example 3 were cultured as follows. First, 80 mL of TB medium (Molecular cloning 2nd edition, p.A.2) containing sterilized 100 ⁇ g / mL ampicillin was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. Escherichia cultivated at 37 ° C. for 16 hours in 3 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin in advance in this medium. E. coli DH5 ⁇ (plasmid transformant) (using a test tube) was inoculated and cultured at 37 ° C.
  • TB medium Molecular cloning 2nd edition, p.A.2
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; Gibco
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation. Furthermore, the nucleic acid treatment using polyethyleneimine, ammonium sulfate precipitation, and Q sepharose chromatography were performed.
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin
  • a storage buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM potassium chloride, 1 mM dithiothreitol, 0 1% Tween20, 0.1% Nonidet P40, 50% glycerin
  • Example 5 Plasmid preparation of Mja-PCNA mutant A plasmid containing a modified thermostable PCNA gene mutant (E142K) derived from Methanocaldococcus jannaschii strain was prepared. As a DNA template used for mutagenesis, PCNA (SEQ ID NO: 34) (pMjaPCNA) derived from Methanocaldococcus jannaschii strain cloned in pET23b was used. Mutation was introduced using KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo), and the method was performed according to the instruction manual. The mutant was confirmed by decoding the base sequence. Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS was transformed with the obtained plasmid and used for enzyme preparation.
  • E142K modified thermostable PCNA gene mutant
  • Example 6 Production of Mja-PCNA
  • the cells obtained in Example 1 were cultured as follows. First, 80 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin that was sterilized was dispensed into a 500 mL Sakaguchi flask. This medium was inoculated with Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (plasmid transformant) (using a test tube) previously cultured at 37 ° C. for 16 hours in 3 mL LB medium containing 100 ⁇ g / mL ampicillin at 37 ° C.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride; manufactured by Gibco
  • aeration culture was performed until OD600 became 0.3 to 0.6. Thereafter, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM, and aeration culture was performed for 4 hours.
  • the bacterial cells are collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mL of disruption buffer (30 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 30 mM NaCl, 0.1 mM EDTA), and then subjected to sonication. By crushing, a cell lysate was obtained. Next, the cell lysate was treated at 80 ° C. for 15 minutes, and then the insoluble fraction was removed by centrifugation.
  • Example 7 Amplification of long target DNA KOD DNA polymerase mutant (Y7A / V93K / H147E) and KOD-PCNA1 M73L / D147A mutant are used to amplify 17.5 kb of DNA with and without PCNA. Comparison of DNA amplification was performed. In each of the above cases, DNA amplification was compared with and without betaine. For PCR, KOD-Plus-Ver.
  • FIG. 1 shows a comparison of amplification by amplifying about 8.5 kb of DNA from a low-copy template with and without KOD-PCNA1 mutant and with and without betaine in each of the above cases. It will be.
  • PCNA is excellent in the function of increasing the amplification efficiency
  • DNA is amplified from a misannealed primer, resulting in poor reaction specificity.
  • Betaine on the other hand, not only increases amplification efficiency, but also improves reaction specificity. By combining these, it is considered that excellent amplification efficiency can be obtained while improving reaction specificity. It is done.
  • Example 8 Amplification of target DNA having a region with a high GC ratio KOD DNA polymerase mutant (Y7A / V93K / H147E), KOD-PCNA1 M73L / D147A mutant, 5 types of systems for amplifying DNA of about 10 kb (these 5 types are A region of 500 bp or more in which the GC rate exceeds 70% is included inside.), And DNA amplification was compared with and without PCNA. In each of the above cases, DNA amplification was compared with and without betaine. For PCR, KOD-Plus-Ver.
  • PCNA and betaine were not added.
  • the cycle is 94 ° C., 2 minutes before the reaction, and then PCR system GeneAmp (registered trademark) 9700 (Applied Biosystem) is used in a schedule of repeating 98 minutes, 10 seconds ⁇ 60 ° C., 10 seconds ⁇ 68 ° C., 2 minutes for 30 cycles. PCR was performed.
  • FIG. 2 shows the results of electrophoresis of products obtained by performing PCR with and without KOD-PCNA1 mutant, and with and without betaine in each of the above cases.
  • Example 9 Two types of KOD DNA polymerase mutant (Y7A / P36H / N210D) and Pfu polymerase mutant (Y7A / P36H / N210D) as DNA amplified DNA polymerase from plant lysate , KOD-PCNA1 mutant (M73L / D147A) as PCNA, Using two types of Mja-PCNA mutants (E142K), whether or not PCR can be performed without purification from plant lysates was compared with and without betaine.
  • PCR system GeneAmp registered trademark 9700 (Applied Biosystem) with a schedule of cycles of 94 ° C, 2 minutes pre-reaction, and 35 cycles of 98 ° C, 10 seconds ⁇ 65 ° C, 10 seconds ⁇ 68 ° C, 1.5 minutes PCR was performed using After completion of the reaction, 1% agarose electrophoresis was performed on 5 ⁇ l of the reaction solution, ethidium bromide staining was performed, and the amplification amount of the amplified DNA fragment was confirmed under ultraviolet irradiation.
  • FIG. 3 shows the plant lysate with the addition of 1000 ng of KOD-PCNA1 mutant or Mja-PCNA mutant with and without betaine of KOD DNA polymerase mutant (Y7A / P36H / N210D). The results of electrophoresis after electrophoresis without purification were shown. For comparison, a sample without PCNA added was also carried out.
  • Plant lysates contain a large amount of PCR-inhibiting substances, and are known to cause inhibition when subjected to PCR.
  • inhibition occurred when 2 ⁇ l of lysate was added to 50 ⁇ l of reactivity.
  • Inhibition occurred at 4 ⁇ l in the case of using the Mja-PCNA mutant without addition of betaine, and inhibition was induced in 8 ⁇ l of the one using the KOD-PCNA1 mutant without addition of betaine.
  • addition of betaine to each of them prevented inhibition even when doubled lysate was added. It was confirmed that the combination of betaine and PCNA strengthened inhibition. It was found that betaine and PCNA have independent functions, and an excellent amplification performance can be obtained by combining these functions.
  • the present invention is useful in biotechnology-related industries, and is particularly useful in technologies relating to DNA synthesis regardless of research use or diagnostic use.

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Abstract

ＤＮＡ複製において、成功率が高い、すなわち反応特異性及び増幅効率が高いＰＣＲ反応組成を提供すること。 ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡとを用いる反応系にさらにベタインを添加することで、長鎖ターゲットＤＮＡやＧＣ率の高い領域を持つターゲットＤＮＡの増幅、また阻害物質を含む反応系でも効率的なＰＣＲが可能になることを見出した。

Description

核酸増幅試薬
本発明は、反応特異性及び増幅効率に優れたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いられる核酸増幅試薬に関する。
ＰＣＲとは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。数コピーといった微量サンプルからでも標的核酸を何十万倍に増幅することができ、研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられるようになってきている。
ＰＣＲにおいては、反応特異性と増幅効率が重要になってくる。ここで、反応特異性とは、目的のターゲットＤＮＡのみを特異的に増幅する性能であり、反応特異性が低いと、非特異的な増幅やプライマーダイマーが生じ、目的産物の増幅量が減少することにつながる。また増幅効率とは、ターゲットＤＮＡを増幅する効率を示し、増幅効率が１００％の理想的なＰＣＲは１サイクルでターゲットＤＮＡが２倍に増幅する。増幅効率が低いと、１サイクルでのターゲットＤＮＡの増幅量が少なくなり、得られる産物量が少なくなることや増幅ターゲットＤＮＡの検出ができなくなることにつながる。
反応特異性、増幅効率を高めるために様々なＰＣＲ組成の検討が行われている。例えば、ＫＣｌやＮＨ4Ｃｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4、水酸化テトラメチルアンモニウムなど、塩はプライマーのアニーリング力を調節する働きがあり、これらの濃度の至適が反応特異性及び増幅効率を高めるために重要になってくる。また、ベタイン、グリセロール、グリコール類、糖などの添加剤は、プライマーのミスアニーリングを防ぎ、またタンパク質の安定化にも関わるとされており、添加によって反応特異性・増幅効率を高めることが可能になる。
ＰＣＲの添加剤としては、複製因子としてＤＮＡポリメラーゼと共同して働くタンパク質因子の添加も検討されている。一本鎖結合タンパク（ＳＳＢ）は一本鎖に特異的に結合し、核酸の二重螺旋構造を不安定化するため、プライマーのミスアニーリングを防ぐことが示されている。またＤＮＡクランプとして働くＰＣＮＡは添加することでポリメラーゼの合成核酸からの解離を防ぎ、増幅効率を高めることが示されている（特許文献１）。
ＰＣＲを実施するＤＮＡポリメラーゼについても、反応特異性、増幅効率を高めるためには非常に重要となる。汎用的に用いられるＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼではＰＣＲ効率や反応特異性を向上させるため様々な変異の検討がなされている。また核酸との結合力を強めるため、ＳＳＢを融合させたＤＮＡポリメラーゼも存在する。最近では、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼ（汎用的なＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼなどが該当する。）に比べ、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼの方が、増幅効率が高いといったことも示されている。
また、特許文献２においては、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅においてベタインを含有せしめる組成が示されており、ＰＣＲパフォーマンスを高めるために、様々な添加剤を用いることが示唆されている。しかしながら、特許文献２に記載されている発明においても、その汎用性の観点などから、十分な要求特性を満たしているとは言い難いところがある。
このように様々な検討が行われているにも関わらず、ＰＣＲで十分に増幅しないことが散見される。特に長鎖ターゲットやＧＣ率の高い領域を持つターゲットのＤＮＡ増幅では増幅が起こりにくく、また不純物質が含まれる条件でも反応が阻害され、ＤＮＡ増幅が起こらないことがあった。このような難しい条件でも効率よく増幅することができる、成功率の高い（反応特異性及び増幅効率が高いことをいう。以下同じ。）ＰＣＲ組成が求められている。
国際公開第２００７／００４６５４号パンフレット 特開２０１０－２１３６８９号公報
Ｃａｒｏｌ　Ｊ．Ｂｕｌｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２７３巻、１９９６年、第１０５８－１０７３頁
ＤＮＡ複製において、成功率が高い反応組成を提供することを目的とする。さらに本発明の他の目的は、上記の目的に適した核酸増幅試薬を提供することにある。要約すれば、本発明の目的は、塩基類似体存在下の遺伝子の増幅に適したＰＣＲ反応試薬を提供することにある。
上記目的を達成するための本発明の核酸増幅試薬は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡと、ベタインを用いることを特徴とする。
すなわち、本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討した結果、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼと、ＰＣＮＡとを用いる反応系にさらにベタインを添加することで、長鎖ターゲットＤＮＡやＧＣ率の高い領域を持つターゲットＤＮＡの増幅、また阻害物質を含む反応系でも効率的なＰＣＲが可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。代表的な本発明は以下の通りである。
［項１］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）、及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
（１）配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
（２）配列番号１３に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
［項２］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
（１）配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
（２）配列番号１４に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
［項３］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
（１）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
（２）配列番号１９に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
［項４］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである項１から３のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
［項５］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である項１から４のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
［項６］
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するものである項１から５のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
［項７］
ＰＣＮＡが増幅増強活性を有する変異型ＰＣＮＡである項１から６のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
本発明により、ＤＮＡ増幅において反応特異性及び増幅効率の優れたＰＣＲ組成が提供される。研究分野だけでなく、遺伝子診断などの臨床分野もしくは法医学分野、あるいは食品や環境中の微生物検査等においても広く利用することができる。
長鎖ターゲットＤＮＡの増幅 ＧＣ率の高い領域をもつターゲットＤＮＡの増幅 植物ライセートからのＤＮＡ増幅 ＰＣＮＡの多量体形成に関するアミノ酸領域を示す図
以下、本発明の実施形態を示しつつ、さらに詳説する。
本明細書においては、塩基配列、アミノ酸配列及びその個々の構成因子については、アルファベット一文字表記による簡略化した記号を用いる場合があるが、いずれも分子生物学・遺伝子工学分野における慣行に従う。また、本明細書においては、アミノ酸配列の変異を簡潔に示すため、例えば「Ｄ１４３Ａ」などの表記を用いる。「Ｄ１４３Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示しており、すなわち、置換前のアミノ酸残基の種類、その場所、置換後のアミノ酸残基の種類を示している。また、配列番号は、特に断らない限り、配列表に記載された配列番号に対応する。また、多重変異体の場合は、上記の表記を「／」でつなげて表す。例えば「Ｄ１４３Ａ／Ｄ１４７Ａ」は、第１４３番目のアスパラギン酸をアラニンに置換し、かつ、第１４７番目のアスパラギン酸をアラニンに置換したことを示す。三重変異体以上の多重変異体については、さらに「／」の記号の後に「Ｐ３６Ｈ」などの変異箇所についての情報を追記する。また、本明細書において「変異型ＰＣＮＡ」などという場合の「変異型」とは、従来知られたＰＣＮＡとは異なるアミノ酸配列を備えることを意味するものであり、人為的変異によるか自然界における変異によるかを区別するものではない。
（１）核酸増幅試薬
本発明の実施形態の一つは、核酸を増幅させるための試薬であって、
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）ベタイン
の存在下で、ＤＮＡの合成反応を行うことを特徴とする核酸増幅試薬である。
（１．１）
本発明における核酸増幅試薬は、ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能であれば特に限定されない。典型的な核酸増幅方法としてははＰＣＲであるが、本発明の核酸増幅試薬はＰＣＲのみならず、ＤＮＡを鋳型とし、１種のプライマー、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）を反応させることによりプライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成する方法にも使用される。具体的には、プライマーエクステンション法、シークエンス法、従来の温度サイクルを行わない方法及びサイクルシーケンス法等を含む。
本発明の核酸増幅試薬に適用される核酸は、ＤＮＡポリメラーゼで増幅可能なものであればその長さや配列、ＧＣ含量の違いなどに制約を受けず、特に限定されない。前記核酸は、典型的には、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）で構成されるＤＮＡであるが、本発明の核酸増幅試薬においてはＤＮＡポリメラーゼとして「減少した塩基類似体（本明細書においては、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を塩基類似体と称する。）検出活性」を有する変異体を用いてもよいので、アデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。以下、本明細書においては、特に断りのない限り、ＤＮＡを構成する塩基には、上記のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及び塩基類似体のいずれを含んでも良いものとする。
本発明の核酸増幅試薬において、ＰＣＲの場合の代表的な組成を以下に示すが、これに限定されるものではない。例えば、増幅対象ＤＮＡに、
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＰＣＮＡ
（ｃ）ベタイン
のほか、
（ｄ）一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に互いに相補的である一対のプライマー
（ｅ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、及び、
（ｆ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオン及び／又はカリウムイオンを含む緩衝液溶液を、混合し、
サーマルサイクラー等を用いて反応液の温度を以下の（Ｉ）から（ＩＶ）で示されるサイクルで上下させることにより、（１）ＤＮＡ変性、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長の熱サイクルを繰り返し、特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
（Ｉ）反応液を９４℃程度に加熱し、３０秒から１分間温度を保ち、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に分かれさせる。
（ＩＩ）６０℃程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その１本鎖ＤＮＡとプライマーをアニーリングさせる。
（ＩＩＩ）プライマーの分離がおきずＤＮＡポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は６０－７２℃程度に設定される。ＤＮＡが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常１分から２分、この温度を保つ。
（ＩＶ）ここまでが１つのサイクルで、以後、（Ｉ）から（ＩＩＩ）までの手順を繰り返していく事で特定のＤＮＡ断片を増幅させる。
上記ＰＣＲにおいては、必要に応じて、さらに、ＢＳＡ、非イオン界面活性剤を用いてもよい。また、さらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性及び／又は３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する活性を有する抗体を用いても良い。前記抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが挙げられる。本反応組成は、ＰＣＲの感度上昇、非特異的な増幅の軽減のために特に有効である。
（１．２）
［ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ］
本発明の核酸増幅試薬に用いるＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである。本発明においてファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を有し、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼをいう。好ましくは古細菌（アーキア、Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである。
［古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ］
ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されるＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉから単離されたＤＮＡポリメラーゼを含むが、これらに特に限定されない。これらのＤＮＡポリメラーゼは市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ）、ＫＯＤ（東洋紡）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）などがある。なかでもＰＣＲ効率の観点から、伸長性や熱安定性の優れたＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
また、前記ＤＮＡポリメラーゼに、後述の３’－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変、及び／又は減少した塩基類似体検出活性を有するような改変を施した変異体を用いても良い。
（１．３）
［ＤＮＡポリメラーゼの改変（Ｉ）３’－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変］
本発明の核酸増幅試薬に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域のアミノ酸配列のいずれかに少なくとも１つのアミノ酸の改変を含んでいてもよい。
３’－５’エキソヌクレアーゼ活性とは、取り込まれたヌクレオチドをＤＮＡ重合体の３’末端から除去する能力を指し、上記の３’－５’エキソヌクレアーゼ領域とは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼで高度に保存されている部位であり、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）、パイロコッカス・フリオサスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号２）、サーモコッカス・ゴルゴナリウスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号３）、サーモコッカス・リトラリスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）、パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号５）、サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号６）、サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号７）、サーモコッカス・エスピーＫＳ－１に由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号８）、サーモコッカス・セラーに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号９）、又はサーモコッカス・シクリに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１０）においては、１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目のアミノ酸である。本発明においては、具体的に配列を提示したＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼにも適用される。また、配列番号１～１０に示されるＤＮＡポリメラーゼ以外のファミリーＢに属する古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼにおいては、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目のアミノ酸からなる３’－５’エキソヌクレアーゼ領域と対応する領域のことを示す。
なお、「配列番号１に示される１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に対応するアミノ酸配列を含む表現である。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。
本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列における、配列番号１上のある位置（順番）と対応するアミノ酸の位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
上記の３’－５’エキソヌクレアーゼ領域の改変とは、置換、欠失、又は付加からなり得るが特に限定されない。例えば、配列番号１における１３７～１４７、２０６～２２２、及び３０８～３１８番目に対応するアミノ酸への改変を示す。
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとしては、配列番号１又は配列番号２における１４１、１４２、１４３、２１０、３１１番目に対応するアミノ酸の少なくとも一つを改変したものが好ましい。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している。より好ましくは、アミノ酸の改変がＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ、Ｉ１４２Ｒ、Ｎ２１０Ｄ、又はＹ３１１Ｆから選択されるいずれか一つである、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＤＮＡポリメラーゼである。なお、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させた（エキソ（－））ＤＮＡポリメラーゼとは、活性の完全な欠如を含み、例えば、親酵素と比較して０．０３％、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、２０％、又は最大でも５０％以下のエキソヌクレアーゼ活性を有する改変されたＤＮＡポリメラーゼを指す。
前記３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼとして、別の好ましい形態は、配列番号１又は配列番号２におけるＨ１４７Ｅ、又はＨ１４７Ｄから選択されるいずれか一つである。これらの改変型ＤＮＡポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を維持したまま、ＰＣＲ効率が向上している。
なお、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を改変したＤＮＡポリメラーゼを生成する方法や、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を解析する方法は公知であり、例えば、米国特許第６９４６２７３号に開示されている。ＰＣＲ効率を向上させたＤＮＡポリメラーゼとは、ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加している改変されたＤＮＡポリメラーゼを示す。ＰＣＲ産物の量が親酵素と比較して増加しているかどうかを解析するための方法としては、特許第３８９１３３０号公報等に記載されている。
（１．４）
［ＤＮＡポリメラーゼの改変（ＩＩ）減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製する改変］
本発明の核酸増幅試薬に用いるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を有する変異体でもよい。塩基類似体とはアデニンやシトシン、グアニン、チミン以外の塩基を示し、ウラシルやイノシンなどが挙げられる。通常、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体であるウラシルやイノシンを検出すると強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する。塩基類似体検出活性とは、塩基類似体と強く結合し、ポリメラーゼ機能を阻害する活性を示す。減少した塩基類似体検出活性を有するファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、ウラシルやイノシンへの結合能力が低いことを特徴とするファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
このような変異体は、ウラシルの結合に関するアミノ酸配列（ウラシル結合ポケット）の少なくとも１か所に改変を加えることにより作製できる。具体的には、ファミリーＢに属する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ　ＫＯＤ１株由来のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の１～４０番目、及び７８～１３０番目によって形成されるウラシル結合ポケットの少なくとも１か所に改変を加え、野生型のＤＮＡポリメラーゼと比較してウラシルやイノシンへの結合能力を低下させたＤＮＡポリメラーゼ変異体が例示される。ウラシルやイノシンへの結合能力が低いＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ｄＵＴＰの存在下のＰＣＲでもＤＮＡポリメラーゼの機能低下があまり見られず、ｄＵＴＰによるＤＮＡポリメラーゼの伸長反応への影響が低減されている。
ウラシルの結合に関するアミノ酸配列は、パイロコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼ及びサーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼにおいて高度に保存されている。サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・フリオサス（配列番号２）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・ゴルゴナリウス（配列番号３）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・リトラリス（配列番号４）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。パイロコッカス・エスピーＧＢ－Ｄ（配列番号５）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＪＤＦ－３（配列番号６）のおいては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピー９°Ｎ－７（配列番号７）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・エスピーＫＳ－１（配列番号８）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・セラー（配列番号９）においては、アミノ酸１～４０、及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。サーモコッカス・シクリ（配列番号１０）においては、アミノ酸１～４０及びアミノ酸７８～１３０によって形成される。
（１．５）
本発明の核酸増幅試薬に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体として、より好ましいのは、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、及び１１２～１１９番目のアミノ酸のうち少なくとも１つに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体、例えば、（ａ）配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列の７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目に相当するアミノ酸のうち、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するアミノ酸配列で示される古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
（１．６）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｂ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｂ）（ａ）で示されるアミノ酸配列においてさらに７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目以外の部位において少なくとも１つのアミノ酸が改変されており、そのアミノ酸配列と配列番号１との同一性又はそのアミノ酸配列と配列番号２との同一性が８０％以上（好ましくは８５％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、さらに好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である）であり、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　ｌｏｃａｌ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｓｅａｒｃｈ　ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
（１．７）
上記のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、以下の（ｃ）のアミノ酸配列で示されるものであってもよい。
（ｃ）（ａ）で示されるアミノ酸配列において、さらに７、３６、３７、９０～９７及び１１２～１１９番目以外の部位において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列。
ここで「数個」とは、「減少した塩基類似体検出活性」が維持される限り制限されないが、例えば、全アミノ酸の約２０％未満に相当する数であり、好ましくは約１５％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。より具体的には、変異されるアミノ酸残基の個数は、例えば、２～１６０個、好ましくは２～１２０個、より好ましくは２～８０個、更に好ましくは２～４０個であり、より更に好ましくは２～５個である。
なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列における７、３６、３７、９０～９７、及び１１２～１１９番目に相当するアミノ酸」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、配列番号１の７、３６、３７、９０～９７、及び１１２～１１９番目に対応するウラシルの結合に関するアミノ酸配列を含む表現である。
本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号１上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「相当する」の意味は、前記の例示と同じである。
本発明において、配列番号１に示されるアミノ酸配列と完全同一ではないアミノ酸配列おける、配列番号６上のある位置（順番）と対応する位置とは、配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、配列番号１の当該位置と対応する位置とする。本明細書において、前記と同じ形式の表記における「対応する位置」の意味は、前記の例示と同じである。
配列の一次構造を比較する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。本発明においては、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／ｌａｎｇ＝ｊａ）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、配列の一次構造を比較する。
（１．８）
本発明の核酸増幅試薬に用いる減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、より好ましくは配列番号１又は配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、又はＶ９３に相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸の改変を有する。ここで、例えば、Ｙ７とは、７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｙ）残基を意味しており、アルファベット１文字は通用されているアミノ酸の略号を表している。好ましい例において、Ｙ７アミノ酸はチロシン（Ｙ）が非極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＹ７Ａ、Ｙ７Ｇ、Ｙ７Ｖ、Ｙ７Ｌ、Ｙ７Ｉ、Ｙ７Ｐ、Ｙ７Ｆ、Ｙ７Ｍ、Ｙ７Ｗ、及びＹ７Ｃからなる群より選ばれるアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｐ３６アミノ酸はプロリン（Ｐ）が正電荷をもつ極性アミノ酸に置換されており、具体的にはＰ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、又はＰ３６Ｒのアミノ酸置換である。別の好ましい例において、Ｖ９３アミノ酸はバリン（Ｖ）が正電荷をもつ極性アミン酸に置換されており、具体的にはＶ９３Ｈ、Ｖ９３Ｋ、又はＶ９３Ｒのアミノ酸置換である。
より好ましくは、改変がＹ７Ａ、Ｐ３６Ｈ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ、及びＶ９３Ｒからなる群より選ばれる、少なくとも１つのアミノ酸の改変である。さらに好ましくはＰ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ又はＰ３６Ｈである。特に好ましくはＰ３６Ｈである。
本発明における減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号１又は配列番号２におけるアミノ酸Ｙ７、Ｐ３６、又はＶ９３に相当するアミノ酸から選択される２つ以上のアミノ酸を改変したものでも良い。具体的には、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ又はＰ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられ、好ましくはＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ又はＹ７Ａ／Ｖ９３Ｋなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
なお、特許第４３９５３７７号公報又は特表２００６－５０７０１２号公報には、ウラシルと相互作用に直接関連していると想定されている７、３６、３７、９０～９７、及び１１２～１１９番目のアミノ酸のいずれかに改変を加えた古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体がいくつか例示されている。しかしながら、その全ての改変体が本発明の課題を解決することができる程度の良好な特性を有しているわけではなく、中には活性を失っているものも見られる。
（１．９）
上記に例示したＤＮＡポリメラーゼの改変をもとに、本発明の核酸増幅試薬に用いる改変されたＤＮＡポリメラーゼとしては、種々の変異体が考えられる。そのような変異体として、以下の（１）－（４）のいずれかの改変を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼの変異体が例示されるが、これに限定されるものではない。
（１）（Ａ）Ｈ１４７Ｅと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ／Ｖ９３Ｋ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｒ又はＶ９３Ｑのいずれか
（２）（Ａ）Ｎ２１０Ｄと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｋ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｋ又はＶ９３Ｒのいずれか
（３）（Ａ）Ｉ１４２Ｒと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｒ、Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｑ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３Ｒ又はＶ９３Ｑのいずれか
（４）（Ａ）Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａと、（Ｂ）Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｒ、Ｐ３６Ｈ又はＶ９３Ｋのいずれか
（１．１０）
［塩基類似体検出活性の評価方法］
本発明における塩基類似体検出活性は、ＰＣＲによって評価することができる。塩基類似体は典型的にはウラシルである。例えば、鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー及び評価対象のＤＮＡポリメラーゼを含む通常のＰＣＲ反応液に、ｄＵＴＰ溶液を、終濃度０．５μＭ～２００μＭで添加し、熱サイクルを行う。反応後にエチジウムブロマイド染色１％アガロース電気泳動でＰＣＲ産物の有無を確認し、許容できたｄＵＴＰ濃度によって、ウラシルの検出活性を評価することが出来る。ウラシル検出活性の高いＤＮＡポリメラーゼは少しのｄＵＴＰの添加で伸長反応が阻害され、ＰＣＲ産物が確認できない。また、ウラシルの検出活性の低いＤＮＡポリメラーゼは高濃度のｄＵＴＰを添加しても問題なくＰＣＲによるＤＮＡ増幅が確認できる。
減少した塩基類似体検出活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体とは、酵素至適の反応Ｂｕｆｆｅｒ中で、任意のプライマー、及び鋳型となるＤＮＡを用い、至適の熱サイクルを行った結果、変異がない野生型と比較し、高濃度のｄＵＴＰを添加しても伸長反応が阻害されず、ＰＣＲ産物が確認できるＤＮＡポリメラーゼのことをいう。ただし、野生型との比較が困難な場合は、ｄＵＴＰを０．５μＭの濃度で添加してもＰＣＲによる増幅ができる古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体については、当該変異体が野生型と比較して減少した塩基類似体検出活性を有すると推定する。
本発明における塩基類似体検出活性の評価は、以下の方法に従う。
ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、又はＰｆｕ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、及び１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ4、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）、約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１１及び１２に記載のプライマー、１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、１Ｕの各酵素を含む５０μｌの反応液中に、ｄＵＴＰ(Ｒｏｃｈｅ製)を終濃度０．５、５、５０、１００、２００μＭになるよう添加する。９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、３０秒→６８℃、１分３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）にてＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、約１．３ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を確認することで塩基類似体検出活性が減少しているかどうかが評価することができる。
（１．１１）
［アミノ酸改変の導入方法］
本発明の核酸増幅試薬に用いるＤＮＡポリメラーゼを改変する方法は、既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い改変を行うことが出来、その態様は特に制限されない。
アミノ酸の改変を導入する方法の一態様として、Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲ法に基づく部位特異的変異導入法を用いることができる。例えば、ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）は、（１）目的とする遺伝子を挿入したプラスミドを変性させ、該プラスミドに変異プライマーをアニーリングさせ、続いてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長反応を行う、（２）（１）のサイクルを１５回繰り返す、（３）制限酵素ＤｐｎＩを用いて鋳型としたプラスミドのみを選択的に切断する、（４）新たに合成された遺伝子をリン酸化、Ｌｉｇａｔｉｏｎを実施し環化させる、（５）環化した遺伝子を大腸菌に形質転換し、目的とする変異の導入されたプラスミドを保有する形質転換体を取得することのできるキットである。
上記改変ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、宿主由来のポリメラーゼを失活させ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定する。
上記方法により選抜された菌株から精製ＤＮＡポリメラーゼを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法が好ましい。すなわち、栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的又は物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＤＮＡポリメラーゼ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品はＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
（１．１２）
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定法］
本発明において、核酸増幅試薬に用いるＤＮＡポリメラーゼは、以下のようにして活性を測定するものとする。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ　ＫＣｌ，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０，０．１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０，５０％　グリセリン）でサンプルを希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及び酵素溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ　塩酸及びエタノールで十分洗浄する。（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パーキンエルマー製ＴｒｉＣａｒｂ　２８１０ＴＲ）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込む酵素量とする。
Ａ液：４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１６ｍＭ　塩化マグネシウム１５ｍＭ　ジチオスレイトール、１００μｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ　ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ　［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％　トリクロロ酢酸（２ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ仔牛胸腺ＤＮＡ
（２）ＰＣＮＡ
（２．１）
本発明の核酸増幅試薬に用いられるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ）は、ＰＣＲ増強因子の一種である。前記ＰＣＮＡとしては、特に限定されないが、ＰＣＲの熱サイクルに耐えられる耐熱性のものが望ましく、好ましくはＰＣＲ後も活性が残るものが望まれる。より好ましくは８０℃で３０分の熱処理を行っても可溶性であり、活性が５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上残っているものが望まれる。
そのようなＰＣＮＡとしては、例えば、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属及びサーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌から単離されたＰＣＮＡが挙げられる。パイロコッカス属由来のＰＣＮＡとしては、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ（配列番号１３）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＧＢ－Ｄ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ａｂｙｓｓｉ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉから単離されたＰＣＮＡを含むが、これらに限定されない。サーモコッカス属に由来するＰＣＮＡとしては、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（配列番号１４）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＪＤＦ－３、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９ｄｅｇｒｅｅｓ　Ｎｏｒｔｈ－７（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．９°Ｎ－７）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．ＫＳ－１、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｅｌｅｒ、又はＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｉｃｕｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊａ）又はＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）から単離されたＰＣＮＡを含むが、特にこれらには限定されない。
ＰＣＮＡをコードする遺伝子は、ＰＣＮＡをもつ生物からクローニングすることができる。またアミノ酸の配列情報や核酸の配列情報をもとに人工的に合成することもできる。
さらに、本発明の核酸増幅試薬に用いるＰＣＮＡは、単独でＤＮＡにロードする（ＤＮＡポリメラ－ゼ増幅増強活性のある）変異体であってもよい。ＰＣＮＡは通常、多量体を形成し輪のような構造をとる。ＤＮＡにロードするとは、ＰＣＮＡ多量体の輪の構造内部にＤＮＡを通すことを示し、通常はＲＦＣと呼ばれる因子と共同して初めてＰＣＮＡはＤＮＡにロードすることができる。単独でＤＮＡにロードする変異体とは、ＰＣＮＡの多量体形成に関わる部位を改変し、多量体形成を不安定化することで、ＲＦＣなしでもＤＮＡをＰＣＮＡ多量体内部に通しやすくした変異体を示す。
本発明の核酸増幅試薬に用いるＰＣＮＡとしては、具体的には、以下のようなものが挙げられる。配列番号１３、１４又は１９に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドである。また、配列番号１３、１４又は１９に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチドであっても良い。より好ましくは、配列番号１３、１４又は１９に記載のアミノ酸配列との相同性が８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
（２．１．１）ＫＯＤ－ＰＣＮＡ及びＰｆｕ－ＰＣＮＡ
ＰＣＮＡが多量体形成に関する部位は、サーモコッカス・コダカラエンシスに由来するＰＣＮＡ（以下、「ＫＯＤ－ＰＣＮＡ」とも記載）（配列番号１４）、パイロコッカス・フリオサスのＰＣＮＡ（以下、「Ｐｆｕ－ＰＣＮＡ」とも記載）（配列番号１３）においては、８２、８４、１０９番目のアミノ酸からなるＮ末端領域と１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなるＣ末端領域があげられる。Ｎ末端領域はプラスに帯電し、Ｃ末端領域はマイナスに帯電し、相互作用することで多量体形成を行う。
配列番号１３又は配列番号１４を例にして説明することは、本明細書で具体的に配列を提示したＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにも適用される。例えば、図４で示したように配列番号１３及び１４に示されるＰＣＮＡ以外のＰＣＮＡにおいては、配列番号１３の８２、８４、１０９、１３９、１４３、１４７番目のアミノ酸からなる多量体形成に関する領域と対応する領域のことを示す。ここで、異なる２つのアミノ酸配列があるとき、基準となる一方のアミノ酸配列においてアミノ酸や領域が「対応する」とは、アミノ酸配列の一次構造を比較（アラインメント）したとき、基準となる配列の当該位置と対応する位置とする。
単独でＤＮＡにロードするＰＣＮＡ変異体は、より好ましくはＰＣＮＡの多量体形成に関わる、
（ａ）８２、８４、１０９番目に相当するアミノ酸からなるＮ末端領域、又は
（ｂ）１３９、１４３、１４７番目に相当するアミノ酸からなるＣ末端領域に少なくとも一つの改変を有し、ＲＦＣがなくともＤＮＡにロードし、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を促進する変異体が挙げられる。
例えば、配列番号１３の１４３番目に相当するアミノ酸を塩基性アミノ酸に改変したもの、８２番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したもの、１４７番目を中性アミノ酸に改変したもの、又は、１０９番目と１４３番目を共に中性アミノ酸に改変したものなどが挙げられる。本発明の中性アミノ酸としては、天然のものであれば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。好ましくは、置換部位の周辺部位の立体構造に与える影響が最も小さいアラニンである。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、トリプトファンが挙げられる。好ましくはアルギニン又はリジンである。
より好ましくは、特許文献１に記載のＰＣＮＡ変異体が例示されるほか、第１４７番目のアミノ酸残基をアラニンに置換した配列（Ｄ１４７Ａ）、第８２番目、及び第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに置換した配列（Ｒ８２Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ８２Ａ／Ｅ１４３Ａ）、第１０９番目、及び第１４３番目のアミノ酸残基をアラニンに置換した配列（Ｒ１０９Ａ／Ｄ１４３Ａ、もしくはＲ１０９Ａ／Ｅ１４３Ａ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の核酸増幅試薬に用いるＰＣＮＡは、発現量を増やすため、配列番号１３又は配列番号１４の７３番目に相当するメチオニンを改変したものでもよい。より好ましくはＭ７３Ｌに改変したものが挙げられるが、これに限定されない。
（２．１．２）Ｍｊａ－ＰＣＮＡ
また、本発明の核酸増幅試薬に用いるＰＣＮＡは、以下の（１）から（３）のうちいずれかで示されるＰＣＮＡ単量体であることが好ましい。
［１］配列番号１９に記載のアミノ酸配列の１４２番目のアミノ酸残基を塩基性アミノ酸残基に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド。
［２］［１］で示されるＰＣＮＡ単量体において、さらに、配列番号１９に記載のアミノ酸配列における、１４２番目に相当するアミノ酸残基以外の、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加（これらを纏めて「変異」とも表す。）されているアミノ酸配列からなり、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
［３］配列番号１９で示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド。
配列番号１９は、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（以下、単にＭｊａとも記載する。）由来のＰＣＮＡのアミノ酸配列である。このアミノ酸配列は非特許文献１などで解明されている。
配列番号１９において、１４２番目のアミノ酸残基はＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基のうちの一つである。ＰＣＮＡの多量体形成に関わるアミノ酸残基は、各単量体のＮ末端側領域とＣ末端側領域とに存在する。ＰＣＮＡ多量体は、一方の単量体のＮ末端側領域と他方の単量体のＣ末端側領域とが界面となって接合することにより形成される。真核細胞及び古細菌においては、多くの場合ＰＣＮＡは三量体を形成する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列においては、Ｎ末端領域が下記の（ａ）で示される群の位置に該当し、Ｃ末端領域が下記の（ｂ）で示される群の位置に該当する。
（ａ）８０、８２、１０８番目のアミノ酸残基群
（ｂ）１３８、１４２、１４６番目のアミノ酸残基群
上記（２）のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持する限度で、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ　１３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＰＣＮＡ単量体をコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントＰＣＮＡ単量体を得ることができる。バリアントＰＣＮＡ単量体には、ＰＣＮＡを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
上記［３］のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を保持するものであって、かつ、配列番号１９に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＰＣＮＡ単量体が有するアミノ酸配列と配列番号１９に示されるアミノ酸配列との同一性は８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
上記の［２］又は［３］に記載したようなＰＣＮＡとして、より好ましくは、ＰＣＮＡの精製を簡便にすべくＮ末端に挿入したＨｉｓタグなどのアフィニティタグの付加されたものが挙げられるが、特に限定されない。
上記のＰＣＮＡ単量体においては、配列番号１９における１４２番目のアミノ酸残基が塩基性アミノ酸残基に置換されるが、置換する塩基性アミノ酸の種類は特に限定されない。塩基性アミノ酸としては、天然のものであれば、アルギニン、ヒスチジン、リジン、トリプトファンが挙げられる。好ましくはアルギニン又はリジンである。
（２．２）
上記ＰＣＮＡを得る方法は、ＰＣＮＡ遺伝子を必要に応じて発現ベクターに移し替え、宿主として例えば大腸菌を、該発現ベクターを用いて形質転換した後、アンピシリン等の薬剤を含む寒天培地に塗布し、コロニーを形成させる。コロニーを栄養培地、例えばＬＢ培地や２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で１２～２０時間培養した後、菌体を破砕して粗酵素液を抽出する。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ由来のものが好ましい。菌体を破砕する方法としては、公知のいかなる手法を用いても良いが、例えば超音波処理、フレンチプレスやガラスビーズ破砕のような物理的破砕法やリゾチームのような溶菌酵素を用いることができる。この粗酵素液を８０℃、３０分間熱処理し、遠心分離することで宿主由来のタンパク質を除去し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに供することで、目的タンパク質の発現を確認することができる。
上記方法により選抜された菌株から精製ＰＣＮＡを取得する方法は、いかなる手法を用いても良いが、例えば下記のような方法がある。栄養培地に培養して得られた菌体を回収した後、酵素的又は物理的破砕法により破砕抽出して粗酵素液を得る。得られた粗酵素抽出液から熱処理、例えば８０℃、３０分間処理し、その後硫安沈殿によりＰＣＮＡ画分を回収する。この粗酵素液をセファデックスＧ－２５（アマシャムファルマシア・バイオテク製）を用いたゲル濾過等の方法により脱塩を行うことができる。この操作の後、Ｑセファロースカラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。該精製酵素標品は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってほぼ単一バンドを示す程度に純化される。
（２．３）ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性
上記ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるか（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性があるか）どうかは、ＰＣＲによって評価できる。鋳型となるＤＮＡ、緩衝材、マグネシウム、ｄＮＴＰｓ、プライマー、及びファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液に、評価するＰＣＮＡを添加し、ＰＣＮＡ添加なしのもの、また野生型ＰＣＮＡ添加のものとＤＮＡ増幅量を比較することで、単独でＤＮＡにロードできるかを確認することができる。野生型のＰＣＮＡをはじめ、単独でＤＮＡにロードできないＰＣＮＡは添加しても、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅量は変化せず、むしろＤＮＡ増幅量を減らす傾向がある。一方、単独でＤＮＡにロードできる変異体は、ＰＣＮＡ添加なしのものと比較することでＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を評価することができる。
本発明において「ＰＣＮＡ変異体が単独でＤＮＡにロードできるかどうか」の評価（ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性の評価）は、以下の方法に従うものとする。
ＫＯＤ　Ｄａｓｈ（東洋紡製）に添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（反応に用いる濃度の１０倍に濃縮されている）を用いて、
１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、
約３．６ｋｂのＤＮＡを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号１５及び１６に記載のプライマー、
１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、
１Ｕ　ＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　ＤＮＡポリメラーゼ
を含むよう反応液を調製し、
５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを２５０ｎｇ添加し、９４℃、３０秒の前反応の後、９８℃、１０秒→６８℃、３０秒を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲを行う。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下約３．６ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を、野生型ＰＣＮＡを添加したものと比較することで単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡかどうかを評価することができる。単独でＤＮＡにロードできるＰＣＮＡは添加によってＤＮＡ増幅量が増加する。
本発明において、ＤＮＡ増幅量の増加を定量的に評価する方法としては、電気泳動パターン解析用ソフトウェアであるＧｅｌ　Ｐｒｏ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を利用することにより、ＤＮＡ増幅量を数値化するものとする。このような方法でＤＮＡ増幅量を比較したとき、ＰＣＮＡを添加した場合のＤＮＡ増幅量が、ＰＣＮＡを添加しなかった場合のＤＮＡ増幅量の１．０倍（好ましくは１．２倍、さらに好ましくは１．５倍、さらに好ましくは２倍、３倍）を超える。もしくは増幅していなかったターゲットＤＮＡが増幅すれば、そのＰＣＮＡが「ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有する」と判断する。
ＰＣＮＡの改変についても、ＤＮＡポリメラーゼの改変と同様にして行うことができる。
上記の本発明の核酸増幅試薬において、ＤＮＡ合成基質は、典型的には、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸で構成されるが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ以外のデオキシヌクレオチド三リン酸、例えばｄＵＴＰやｄＩＴＰなどを含むものであってもよい。
上記の本発明の核酸増幅試薬において用いられるプライマーは、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、チミンの４塩基からなるヌクレオチドで構成されるが、本発明の核酸増幅試薬ではアデニン、シトシン、グアニン、チミン以外のヌクレオチド、例えばウラシルやイノシンなどを含むものであってもよい。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載は、本発明を特に限定するものではない。
（実施例１－１）
ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例に用いるために、サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ及び、Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号１７）（ｐＫＯＤ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例１－２）
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作製
後述の実施例に用いるために、パイロコッカス・フリオサス株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたパイロコッカス・フリオサス株由来の改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（配列番号３５）（ｐＰｆｕ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＪＭ１０９を形質転換し、酵素調製に用いた。
（実施例２）
改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの作製
実施例１で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％　バクトトリプトン、０．５％　酵母エキス、０．５％　塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＪＭ１０９（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％　ノニデットＰ４０、５０％　グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得た。上記精製工程のＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、上記のＤＮＡポリメラーゼ活性測定法に従い行った。また、酵素活性が高い場合はサンプルを希釈して測定を行った。
（実施例３）
ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体の作製
サーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ１（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体）遺伝子を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにクローニングされたサーモコッカス・コダカラエンシス　ＫＯＤ１株由来のＰＣＮＡ（配列番号１８）（ｐＫＯＤＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読により行った。得られたプラスミドによりエシェリシア・コリＤＨ５αを形質転換し、酵素の調製に用いた。
（実施例４）
ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１の作製
実施例３で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＴＢ培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐ．Ａ．２）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地（１％　バクトトリプトン、０．５％　酵母エキス、０．５％　塩化ナトリウム；ギブコ製）で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＤＨ５α（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にて１６時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％　ノニデットＰ４０、５０％　グリセリン）に置換し、改変型耐熱性ＰＣＮＡを得た。
（実施例５）
Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体のプラスミド作製
Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来の改変型耐熱性ＰＣＮＡ遺伝子変異体（Ｅ１４２Ｋ）を含有するプラスミドを作製した。変異導入に使用されるＤＮＡ鋳型は、ｐＥＴ２３ｂにクローニングされたＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ株由来のＰＣＮＡ（配列番号３４）（ｐＭｊａＰＣＮＡ）を用いた。変異導入にはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。なお、変異体の確認は塩基配列の解読で行った。得られたプラスミドにより、エシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、酵素の調製に用いた。
（実施例６）
Ｍｊａ－ＰＣＮＡの作製
実施例１で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地（１％　バクトトリプトン、０．５％　酵母エキス、０．５％　塩化ナトリウム；ギブコ製）８０ｍＬを、５００ｍＬ坂口フラスコに分注した。この培地に予め１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する３ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間培養したエシェリシア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（プラスミド形質転換株）（試験管使用）を接種し、３７℃にてＯＤ６００が０．３～０．６になるまで通気培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭになるように添加し、４時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、５０ｍＬの破砕緩衝液（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、３０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に、細胞破砕液を８０℃にて１５分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、Ｑセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ　塩化カリウム、１ｍＭ　ジチオスレイトール、０．１％　Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％　ノニデットＰ４０、５０％　グリセリン）に置換し、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体を得た。
（実施例７）
長鎖ターゲットＤＮＡの増幅
ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ）、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体を用い、１７．５ｋｂのＤＮＡを増幅する系で、ＰＣＮＡがある場合とない場合とでＤＮＡ増幅の比較を行った。なお、前記のそれぞれの場合において、さらにベタインがある場合とない場合とでＤＮＡ増幅を比較した。ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（東洋紡製）に添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、
１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、
１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ4、
０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、
約８．５ｋｂのＤＮＡを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号２０及び２１に記載のプライマー、
３００、３０、３コピー相当のヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、及び、
１μｇのＫＯＤ抗体と混合した１．２５Ｕ　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ）を含む５０μｌの反応液中に、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）を５００ｎｇ添加（又は添加せず）し、また、１Ｍ　ベタインを添加（又は添加せず）して、反応系を比較した。
コントロールとしてＰＣＮＡを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、４分３０秒を４０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）を用いてＰＣＲを行った。反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図１は、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体がある場合とない場合、さらに前記のそれぞれの場合においてベタインがある場合とない場合において、低コピーの鋳型から約８．５ｋｂのＤＮＡを増幅し、増幅を比較したものになる。
結果、ＰＣＮＡ、ベタインなしでは、まったくＤＮＡ増幅が確認できなかった。また、ＰＣＮＡあり、ベタインなしでは、ＤＮＡ増幅は確認できるものの特異性が悪く、ＤＮＡ増幅が見られないレーンが散見された。ＰＣＮＡなし、ベタインありでは、ＤＮＡ増幅は確認できたものの、増幅効率が悪く、３コピーからの増幅ではＤＮＡ増幅量が少ない結果となった。一方、ＰＣＮＡあり、ベタインありでは、特異性も高く、３コピーといった低コピーからも十分なＤＮＡ増幅が確認された。長鎖のターゲットＤＮＡは、伸長時間が長く、非特異的な増幅が生じやすい。ＰＣＮＡは増幅効率を高める働きには優れるものの、ミスアニーリングしたプライマーからもＤＮＡ増幅してしまうため、反応特異性が悪くなる。一方、ベタインは増幅効率を高めるだけでなく、反応特異性も向上させる働きがあり、これらが組み合わさることで反応特異性を高めたまま、優れた増幅効率をも得ることができたものと考えられる。
（実施例８）
ＧＣ率の高い領域をもつターゲットＤＮＡの増幅
ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ）、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１　Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ変異体を用い、約１０ｋｂのＤＮＡを増幅する系５種（これら５種はＧＣ率が７０％を超える５００ｂｐ以上の領域を内部に含んでいる。）で、ＰＣＮＡがある場合とない場合とでＤＮＡ増幅の比較を行った。なお、前記のそれぞれの場合において、さらにベタインがある場合とない場合とでＤＮＡ増幅を比較した。ＰＣＲにはＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｖｅｒ．２（東洋紡製）に添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、
１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、
１．５ｍＭ　ＭｇＳＯ4、
０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、
約１０ｋｂを増幅する６ｐｍｏｌのプライマー（ＡＴＣＢ：配列番号２２及び２３、ＢＲＡＦ：配列番号２４及び２５、ＴＧＦｂ：配列番号２６及び２７、ＡＣＥ：配列番号２８及び２９、ＣＡＳＰ３：配列番号３０及び３１）、
２０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ製Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；型番１１６９１１１２００１）、及び、
０．５μｇのＫＯＤ抗体と混合した０．６Ｕ　ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｖ９３Ｋ／Ｈ１４７Ｅ）
を含む２０μｌの反応液中に、ベタインを１Ｍになるように添加（又は添加せず）し、また、ＰＣＮＡ変異体を４００ｎｇ添加（又は添加せず）して、反応系を比較した。コントロールとしてＰＣＮＡ、ベタインを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６０℃、１０秒→６８℃、２分を３０サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。
図２は、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体がある場合とない場合、さらに前記のそれぞれの場合においてベタインがある場合とない場合において、ＰＣＲを行い、得られた産物を電気泳動した結果を示す。
結果、ベタイン、ＰＣＮＡともに存在しない場合では、５種全てでＤＮＡ増幅が見られなかった。ベタインを添加せず、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体を添加したものではレーン５のＣＡＳＰ３のみＤＮＡ増幅が確認できたが、スメアが生じ増幅産物のバンドが確認できない、また全くバンドが見られないなど、増幅成功率は低い結果となった。ベタインを添加し、ＰＣＮＡを添加しなかったものでは、レーン１のＡＴＣＢ、レーン５のＣＡＳＰ３で薄くバンドがあることが確認できたが、増幅効率が悪い結果となった。一方、ベタイン、ＰＣＮＡを共に添加したものはレーン４のＡＣＥのバンドが薄いものの５種全てでＤＮＡ増幅を確認することができた。ＧＣを含む領域は増幅しにくく、優れた増幅効率が必要になる。またこのターゲットＤＮＡも１０ｋｂと長く、反応特異性も重要となる。ＰＣＮＡとベタインを組み合わせることで、優れた反応特異性を保ちながら、効率的なＤＮＡ増幅が可能になった。
（実施例９）
植物ライセートからのＤＮＡ増幅
ＤＮＡ　ポリメラーゼとしてＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）及びＰｆｕポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）の２種類、ＰＣＮＡとしてＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体（Ｍ７３Ｌ／Ｄ１４７Ａ）、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体（Ｅ１４２Ｋ）の２種類を用いて、植物のライセートから精製を行うことなくＰＣＲができるかをベタインありなしで比較検討した。鋳型にはタバコの葉３ｍｍ角をＢｕｆｆｅｒ　Ａ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）１００μｌに添加し、９５℃、１０分の熱処理を行ったものをライセートとして用いた。ＰＣＲにはＫＯＤ　Ｄａｓｈ（東洋紡製）添付の１０×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒを用い、
１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、
０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、
約１．３ｋｂを増幅する１５ｐｍｏｌの配列番号３２及び３３に記載のプライマー、
１μｇのＫＯＤ抗体と混合した１．２５Ｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（ＫＯＤ、ＰｆｕそれぞれＹ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ変異体）を含む５０μｌの反応液中に、評価するＰＣＮＡを１０００ｎｇ添加（又は添加せず）し、また、ベタインは１Ｍを含むものと含まないものを比較した。コントロールとしてＰＣＮＡ、ベタインを添加しないものも実施した。サイクルは９４℃、２分の前反応の後、９８℃、１０秒→６５℃、１０秒→６８℃、１．５分を３５サイクル繰り返すスケジュールでＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いてＰＣＲを行った。
反応終了後、５μｌの反応液について１％アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅ＤＮＡ断片の増幅量を確認した。
図３は、ＫＯＤ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）のベタインがある場合とない場合において、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体、又は、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体１０００ｎｇ添加してＰＣＲ反応を行い、植物ライセートから精製を経ずにＰＣＲを実施し、電気泳動した結果を示す。比較のためにＰＣＮＡを添加していないものも実施した。
植物ライセートはＰＣＲ阻害物質を多く含み、ＰＣＲに供すると阻害を生じることが知られている。ベタイン、ＰＣＮＡ共に添加しなかった場合では、ライセート２μｌを５０μｌの反応性に添加すると阻害が生じた。ベタインを添加せず、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体を用いたものは４μｌで阻害が生じ、ベタインを添加せず、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体を用いたものは８μｌで阻害が生じた。前記のそれぞれの場合において、そこへベタインを添加することで、それぞれ倍のライセートを添加しても阻害が生じなくなった。ベタインとＰＣＮＡを組み合わせることで、阻害にも強くなることが確認された。ベタイン、ＰＣＮＡはそれぞれ機能が独立しており、これらを組み合わせることで優れた増幅性能を示すことがわかった。
Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｙ７Ａ／Ｐ３６Ｈ／Ｎ２１０Ｄ）でも同様の結果になり、ベタイン、ＰＣＮＡ共に添加しなかった場合では、ライセート２μｌを５０μｌの反応性に添加すると阻害が生じた。ベタインを添加せず、Ｍｊａ－ＰＣＮＡ変異体を用いたものは４μｌで阻害が生じ、ベタインを添加せず、ＫＯＤ－ＰＣＮＡ１変異体を用いたものは８μｌで阻害が生じた。前記のそれぞれの場合において、そこへベタインを添加することで、それぞれ倍のライセートを添加しても阻害が生じなくなった。ベタインとＰＣＮＡの組み合わせにはポリメラーゼの種類は問わないことが分かった。
本発明は、バイオテクノロジー関連産業において有用であり、研究用途、診断用途を問わず、特にＤＮＡ合成に関わる技術において有用である。

Claims (7)

  1. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）、及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
    （１）配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
    （２）配列番号１３に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
  2. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
    （１）配列番号１４に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
    （２）配列番号１４に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
  3. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＮＡ及びベタインを含む核酸増幅試薬であって、該ＰＣＮＡが以下の（１）又は（２）に示されるいずれかからなるものであることを特徴とする核酸増幅試薬。
    （１）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
    （２）配列番号１９に記載のアミノ酸配列との相同性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ増幅増強活性を有するポリペプチド
  4. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）由来のＤＮＡポリメラーゼである請求項１から３のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
  5. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌ＤＮＡポリメラーゼ変異体である請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
  6. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが３’－５’エキソヌクレアーゼ活性領域を構成するアミノ酸のいずれかに、少なくとも１つのアミノ酸の改変を有するものである請求項１から５のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
  7. ＰＣＮＡが増幅増強活性を有する変異型ＰＣＮＡである請求項１から６のいずれかに記載の核酸増幅試薬。
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