JP2010213689A - 新規な核酸合成用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】DNAポリメラーゼを用いた核酸合成用組成物であって、該DNAポリメラーゼに加えて、ベタイン(トリメチルグリシン)およびdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドを有することを特徴とする核酸合成用組成物および、これらの存在下で核酸合成反応を行う核酸の合成方法、に関する。
【選択図】なし
Description
(1)アーキア由来のDNAポリメラーゼ、dUTPアーゼ活性を有するポリペプチド、及びベタイン(トリメチルグリシン)を含有することを特徴とする、核酸合成用組成物。
(2)DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである、(1)に記載の核酸合成用組成物。
(3)DNAポリメラーゼがKOD DNAポリメラーゼである(2)に記載の核酸合成用組成物。
(4)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のdUTPアーゼ活性を有すポリペプチドである、(1)〜(3)のいずれかに記載の核酸合成用組成物。
(5)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがSIRV(Sulfolobus islandicus rod−shaped virus)由来、もしくはThermococcus Kodakaraensis由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、(4)に記載の核酸合成用組成物。
(6)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の(a)〜(c)のいずれかである、(5)に記載の核酸合成用組成物。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(c)配列番号1又は2のアミノ酸配列において、1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド
(7)アーキア由来のDNAポリメラーゼを用いた核酸合成方法であって、dUTPアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタイン(トリメチルグリシン)の存在下で行うことを特徴とする、核酸合成方法。
(8)DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである、(7)に記載の核酸合成方法。
(9)DNAポリメラーゼがKOD DNAポリメラーゼである、(8)に記載の核酸合成方法。
(10)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、(7)〜(9)のいずれかに記載の核酸合成方法。
(11)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが、SIRV(Sulfolobus islandicus rod−shaped virus)由来、もしくはThermococcus Kodakaraensis由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、(10)に記載の核酸合成方法。
(12)dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の(d)〜(f)のいずれかである、(10)に記載の核酸合成方法。
(d)配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(e)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(f)配列番号1又は2のアミノ酸配列において、1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド
本発明の第一の側面は、DNAポリメラーゼ、dUTPアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタインを含有する核酸合成用組成物である。
本明細書では、後者(ピロリン酸の定量)を具体的に以下のとおり行った。
活性測定したいdUTPアーゼをdUTP溶液(10mM dUTP、50mMトリス−塩酸バッファー(pH8.0)、5mM MgCl2)に添加し、80℃で1時間反応させた後、生成されたピロリン酸量をピロリン酸定量試薬(Pyrophosphatase reagent:Sigma社)を用いて定量する。活性は、「80℃、1時間の反応で、0.1μmolのピロリン酸を生成する酵素量を1unit」と定義する。
(1)DNAポリメラーゼ
(2)ベタイン
(3)SIRV−dUTPaseもしくはKOD−dUTPase
あるいは、以下の構成を少なくとも含む。
(4)DNAポリメラーゼ
(5)ベタイン
(6)SIRV−dUTPase及びKOD−dUTPase
さらには以下の構成を含むこともある。
(7)DNAポリメラーゼ
(8)ベタイン
(9)配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号1もしくは配列番号2のアミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド
さらに、以下の構成を少なくとも含む核酸合成用組成物であってもよい。
(10)DNAポリメラーゼ
(11)ベタイン
(12)配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号1及び配列番号2のアミノ酸配列において、1ないし数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド
本発明者らは、DNAポリメラーゼ関連因子の1つであるSulfolobus islandicus rod−shaped virus由来のdUTPaseをコードする遺伝子(SIRV−dut)を以下の方法によってクローニングした。SIRV−dutの塩基配列は474塩基対のオープンリィーディングフレームから構成されていることが報告されていた(非特許文献2)。そこで、我々は、16組の人工合成プライマーを用いたPCR法にて目的配列を含むDNA断片の合成を行い、このDNA断片を鋳型にしたnested PCR法にてDNA断片の連結を行い、目的のDNA鎖長を取得するに至った。
Thermococcus Kodakaraensis KOD1株由来のdUTPaseについては、コードする遺伝子(KOD−dut)を以下の方法によってクローニングした。すなわち、公共データベースに公開されているKOD−dutの塩基配列(データベース名:GenBank、アクセッションNo. NC_006624)を参考に、クローニング用のPCRプライマー:KODdut f1とr1(配列番号38と39)を合成した。なお、KODdut f1には、増幅断片の移し変えを容易にするために、その5’端にNdeIの制限酵素サイトを付加した。PCRは、これらのプライマーとKOD−Plus−(東洋紡績社製)を用いて、Thermococcus Kodakaraensis KOD1株由来のゲノミックDNAを鋳型にして実施した。次に、得られた増幅産物を、TArget Clone −Plus−(東洋紡績社製)を用いてベクターpTA2(東洋紡績社製)にTAクローニングを行った。得られたプラスミド(pTA2−KOD−dut)は、DNAシーケンシングにより、塩基配列の確認を行い、目的のKOD−dut遺伝子がクローニングされていることを確認した。
実施例1で得られたSIRV−dUTPaseおよび実施例2で得られたKOD−dUTPaseを用いて、ヒトゲノムDNA(200ng/50μl)を鋳型とした様々な鎖長の遺伝子領域をターゲットとしたPCRを行い、dUTPaseとベタインのPCR反応への添加効果の評価を行った。ターゲットとしては、HBg(ヒトβ-グロビン)遺伝子領域の3.6kbp、8.5kbp、17.5kbp、32kbpおよびtPA(ヒトティッシュープラスミノーゲンアクチベーター)遺伝子領域の24kbpを用いた。PCR反応は、KOD Plus Ver.2(東洋紡績社製)を用いて、表1に示すような反応組成にて、表2に示すプライマーセットとPCRサイクル条件によりPCRを行った。
実施例2で得られたKOD−dUTPase、及び実施例1で得られたSIRV−dUTPaseを用いて、再度実施例3と同様の条件にてヒトゲノムDNAを鋳型にHBg遺伝子(32kbp)をターゲットとするPCRを行なった。
Claims (12)
- アーキア由来のDNAポリメラーゼ、dUTPアーゼ活性を有するポリペプチド、及びベタイン(トリメチルグリシン)を含有することを特徴とする、核酸合成用組成物。
- DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである、請求項1に記載の核酸合成用組成物。
- DNAポリメラーゼがKOD DNAポリメラーゼである請求項2に記載の核酸合成用組成物。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のdUTPアーゼ活性を有すポリペプチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸合成用組成物。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがSIRV(Sulfolobus islandicus rod−shaped virus)由来、もしくはThermococcus Kodakaraensis由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項4に記載の核酸合成用組成物。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の(a)〜(c)のいずれかである、請求項5に記載の核酸合成用組成物。
(a)配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(c)配列番号1又は2のアミノ酸配列において、1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド - アーキア由来のDNAポリメラーゼを用いた核酸合成方法であって、dUTPアーゼ活性を有するポリペプチド及びベタイン(トリメチルグリシン)の存在下で行うことを特徴とする、核酸合成方法。
- DNAポリメラーゼがファミリーBに属するDNAポリメラーゼである、請求項7に記載の核酸合成方法。
- DNAポリメラーゼがKOD DNAポリメラーゼである、請求項8に記載の核酸合成方法。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドがアーキア由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の核酸合成方法。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが、SIRV(Sulfolobus islandicus rod−shaped virus)由来、もしくはThermococcus Kodakaraensis由来のdUTPアーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項10に記載の核酸合成方法。
- dUTPアーゼ活性を有するポリペプチドが以下の(d)〜(f)のいずれかである、請求項11に記載の核酸合成方法。
(d)配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(e)配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチド
(f)配列番号1又は2のアミノ酸配列において、1ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、もしくは置換したアミノ酸配列からなり、かつdUTPアーゼ活性を有するポリペプチド
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WO2016084879A1 (ja) * | 2014-11-28 | 2016-06-02 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅試薬 |
CN114381442A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-22 | 大连博格林生物科技有限公司 | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 |
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JP2003511044A (ja) * | 1999-10-06 | 2003-03-25 | ストラティジェン | Dnaの増幅、合成及び突然変異誘発のための組成物 |
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- 2010-02-17 JP JP2010032313A patent/JP5707705B2/ja active Active
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