JP2020162509A - 改変されたdnaポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[項1] 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼにおいて、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
[項2] 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列において、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
[項3] 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼにおいて、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
[項4] 549位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びバリンからなる群より選択される非極性側鎖を有する中性アミノ酸への置換である、項1〜3のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
[項5] 549位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシンへの置換である、項1〜4のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
[項6] 逆転写反応が5分以下で完了する、項1〜5のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
[項7] 逆転写反応が1分以下で完了する、項1〜6のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
[項8] 更に、509位に相当する部位のアミノ酸の改変を含む、項1〜7のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
[項9] 509位に相当する部位のアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、項8に記載のDNAポリメラーゼ。
[項10] 509位に相当する部位のアミノ酸の改変がアルギニンへの置換である、項8又は9に記載のDNAポリメラーゼ。
[項11] 項1〜10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼを含有する、核酸増幅用試薬。
[項12] RNAからの核酸増幅のために用いられる、項11に記載の核酸増幅用試薬。
[項13] RT−PCR方法において用いられる、項11又は12に記載の核酸増幅用試薬。
[項14] 項11〜13のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を含む、核酸増幅用キット。
[項15] 項1〜10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ、項11〜13のいずれかに記載の核酸増幅用試薬、又は項14に記載の核酸増幅用キットを用いる、核酸増幅方法。
[項16] RNAを検出対象核酸とする、項15に記載の核酸増幅方法。
[項17] 逆転写反応時間が5分以下である、項15又は16に記載の核酸増幅方法。
[項18] 逆転写反応時間が1分以下である、項15〜17のいずれかに記載の核酸増幅方法。
[項19] RT−PCR反応を行う工程を包含する、項15〜18のいずれかに記載の核酸増幅方法。
本発明のDNAポリメラーゼは、従来のものと比べて逆転写活性に優れ、短時間で逆転写反応を行うことが可能であり得る。具体的には、特に限定はされないが、標的RNAの全長が例えば50〜300bpである場合に、好ましくは150〜250bpである場合に、その標的RNAからの逆転写反応が5分以下、好ましくは3分以下、より好ましくは1分以下で完了するものである。ここで、本発明において、逆転写反応が完了するとは、以下のように定義される。すなわち、RT−PCR反応が成立している条件としては、PCR効率が70〜130%以内で、かつ、相関係数r2が0.97以上であることとする。PCR効率とは段階希釈した核酸量をX軸、核酸量に対応するCtをY軸として結果をプロットした検量線の傾き(slope)より、以下の式(1)に従って求めることができる。
・PCR効率(%) =(10−1/Slope−1)×100 ・・・式(1)
相関係数r2は検量線の直線性を表す。このような形で、逆転写反応の後のPCRが可能となっている場合に、逆転写反応が完了しているものとする。
このように逆転写反応が短時間で完了することにより、RNAを鋳型とする核酸増幅方法(例えば、RT−PCR方法)の全体に要する時間を短縮できるので、迅速な検査や診断が求められる場合には非常に有益である。
本発明においては、純化されたDNAポリメラーゼの活性は、以下に示す方法により測定する。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて、75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri−Carb2810 TR)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A液:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/ml BSA(牛血清アルブミン)
B液:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液:20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液:1mg/ml 仔牛胸腺DNA
DNAポリメラーゼプラスミドの作製
人工合成により作製したThermus thermophilus HB8由来のDNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号2)をpBluescriptにクローニングし、野生型Tth DNAポリメラーゼを組み込んだプラスミドを作製した(pTth)。変異をもつプラスミドは、pTthを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo製)を取扱い説明書に準じて使用して作製した。二重変異については作製した変異プラスミドを鋳型に、同様のキットを用いてさらに変異を入れることで作製した。プラスミドの作製に使用した鋳型・プライマーを表1に示す。得られたプラスミドはエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
DNAポリメラーゼの作製
実施例1で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを、500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mlの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、改変型DNAポリメラーゼを得た。
A液: 40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)、16mM 塩化マグネシウム、15mM ジチオスレイトール、100μg/ml BSA
B液: 1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液: 20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液: 1mg/ml 仔牛胸腺DNA
A液25μl、B液5μl、C液5μl及び滅菌水10μlを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液5μlを加えて、75℃で10分間反応させた。その後冷却し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷した。この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri−Carb2810 TR)を用いて計測し、鋳型DNAへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の1単位は、この条件下で30分当り10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
RT−PCR法での増幅効率の評価(逆転写反応時間5分)
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、RNAから1ステップでのRT−PCRを実施した。RT−PCRにはTth DNA Polymerase RT−PCR Buffer(Roche製、反応液中終濃度が約15mMとなる塩化マグネシウムを含有)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.4mM dNTPs、エンテロウイルスRNA(約196bp)を増幅する各々4pmolのプライマー(配列番号7及び8)、4pmolのTaqmanプローブ(配列番号9)、1Uの酵素を含む20μlの反応液に濃度未知のエンテロウイルスRNAを添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、5分の逆転写反応を行い、それに続いて95℃、5秒→60℃、10秒を45サイクル繰り返すスケジュールでStep One(Applied Biosystem製)を用いてPCRを行った。酵素には、549位に相当する部位でアミノ酸改変を有さない従来公知のTth DNAポリメラーゼ(Q509R)と、549位に相当する部位のアミノ酸改変を有する本発明の改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R/D549G)を使用した。
RT−PCR法での逆転写反応効率の評価(逆転写反応時間5分、1分)
実施例2で作製した本発明の改変型DNAポリメラーゼ(Q509R/D549G)を用いて、RNAから1ステップでのRT−PCRを実施した。RT−PCRにはTth DNA Polymerase RT−PCR Buffer(Roche製、反応液中終濃度が約15mMとなる塩化マグネシウムを含有)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.4mM dNTPs、ヒトβ−アクチン(約188bp)を増幅する各々4pmolのプライマー(配列番号10及び11)、4pmolのTaqmanプローブ(配列番号12)、1Uの酵素を含む20μlの反応液にRNAを500ng、50ng、5ng、0.5ngになるよう添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃で1分または5分の逆転写反応を行い、それに続いて95℃、15秒→60℃、1分を45サイクル繰り返すスケジュールでStep−OnePlus(Applied Biosystem製)を用いてPCRを行った。酵素としては、549位に相当する部位でアミノ酸改変を有する本発明の改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R/D549G)を使用した。
Claims (19)
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼにおいて、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は付加されたアミノ酸配列において、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列からなるDNAポリメラーゼにおいて、549位に相当する部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 549位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、及びバリンからなる群より選択される非極性側鎖を有する中性アミノ酸への置換である、請求項1〜3のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 549位に相当する部位のアミノ酸の改変が、グリシンへの置換である、請求項1〜4のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 逆転写反応が5分以下で完了する、請求項1〜5のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 逆転写反応が1分以下で完了する、請求項1〜6のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 更に、509位に相当する部位のアミノ酸の改変を含む、請求項1〜7のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 509位に相当する部位のアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジン及びアルギニンからなる群より選択される塩基性アミノ酸への置換である、請求項8に記載のDNAポリメラーゼ。
- 509位に相当する部位のアミノ酸の改変がアルギニンへの置換である、請求項8又は9に記載のDNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼを含有する、核酸増幅用試薬。
- RNAからの核酸増幅のために用いられる、請求項11に記載の核酸増幅用試薬。
- RT−PCR方法において用いられる、請求項11又は12に記載の核酸増幅用試薬。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の核酸増幅用試薬を含む、核酸増幅用キット。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ、請求項11〜13のいずれかに記載の核酸増幅用試薬、又は請求項14に記載の核酸増幅用キットを用いる、核酸増幅方法。
- RNAを検出対象核酸とする、請求項15に記載の核酸増幅方法。
- 逆転写反応時間が5分以下である、請求項15又は16に記載の核酸増幅方法。
- 逆転写反応時間が1分以下である、請求項15〜17のいずれかに記載の核酸増幅方法。
- RT−PCR反応を行う工程を包含する、請求項15〜18のいずれかに記載の核酸増幅方法。
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