JP2002522042A

JP2002522042A - ポリメラーゼ活性を有する熱安定性ｉｎｖｉｔｒｏ複合体

Info

Publication number: JP2002522042A
Application number: JP2000563788A
Authority: JP
Inventors: キルゲル，クリスチャン; コベル，インゴ; フォス，ハルトムート; メッケル，ゲルト
Original assignee: ライオンバイオサイエンスアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1998-08-06
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2002-07-23
Also published as: AU5617199A; CA2338185A1; EP1100923A2; WO2000008164A3; WO2000008164A2

Abstract

(57)【要約】核酸の鋳型依存性延長のための、本発明の熱安定性（耐熱性）インビトロ複合体は、熱安定性タンパク質及び熱安定性延長タンパク質を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】説明本発明は、核酸の鋳型依存性伸張のための熱安定性in vitro複合体、それをコ
ードするＤＮＡ配列およびベクターに関する。本発明はさらに、in vitro鋳型依
存性ＤＮＡ鎖合成が起こるＰＣＲ反応、逆転写、ＤＮＡラベリングまたはＤＮＡ
シーケンシングのような核酸の鋳型依存性伸張のための方法における本発明の複
合体の使用に関する。最後に、本発明は、本発明の方法を実行するためのキット
または試薬キットにも関する。

【０００２】ＤＮＡポリメラーゼは、相補的ＤＮＡ鎖の合成のための鋳型として一本鎖ＤＮ
Ａを用いる酵素の一群に属する。これらの酵素は、ＤＮＡ複製、修復および組換
えの工程を含めた核酸代謝において大きな役割を演じる。ＤＮＡポリメラーゼは
、細菌からヒト細胞までのあらゆる細胞性生物体で、多数のウイルスで、ならび
にバクテリオファージで同定されている（Kornberg, A. & Baker, T.A.（1991）
DNA Replication WH Freeman, New York, NY）。古細菌および真正細菌は通常は
併合されて原核生物群を形成するが、これらは真の細胞画を有する生物体である
真核生物に対比して、真の細胞画を有さない生物体である。種々の生物体からの
多数のポリメラーゼの共通の特徴はしばしば、アミノ酸配列の類似性および構造
の類似性である（Wang, J., Sattar, A.K.M.A., Wang, C.C.,Karam, J.D., Koni
gsberg, W.H. & Steitz, T.A.（1997）Crystal Structure of polαfamily repl
ication DNA polymerase from bacteriophage RB69, Cell 89, 1087-1099）。ヒ
トのような生物は、しかしながら、ＤＮＡ複製にはすべてが関与しないわけでな
く、そのいくつかはＤＮＡ修復を実行する多数のＤＮＡ依存性ポリメラーゼを有
する。複製ＤＮＡポリメラーゼは通常は、in vivoで、細胞性生物およびウイル
スの染色体を複製するいくつかの単位とのタンパク質複合体で構成される。これ
らの複製ポリメラーゼの一般的特性は、概して、ＤＮＡ鋳型からの解離すること
なく数千のヌクレオチドを重合するそれらの能力を意味する高連続移動性である
（Kornberg, A. & Baker, T.A.（1991）DNA Replication, WH Frecman, New Yor
k, NY）。

【０００３】一方では細胞性メカニズムであり、他方ではバクテリオファージＴ４およびＴ
７で起こる複製メカニズムである高連続移動複製メカニズムは当業界で既知であ
る。複製装置は、多数の構成成分から成る。これらの例としては特に、ａ）ポリメ
ラーゼ活性を有するタンパク質、ｂ）クランプ構造の形成に関与するタンパク質
であって、クランク構造の機能の１つがポリメラーゼ活性をその鋳型と結合し、
結合を安定化して、したがって解離定数を対応的に変えるタンパク質、ｃ）鋳型
上にクランプを載せるタンパク質、ｄ）鋳型を安定化するタンパク質、そして任
意に、ｅ）鋳型上でポリメラーゼをガイドするタンパク質が挙げられる。

【０００４】ｂ）の項で記載されたタンパク質は、開いたまたは閉じた、例えば環または半
環構造である構造を形成する。このような構造は、１つまたはいくつかの種のタ
ンパク質により構成され得る。前記のタンパク質主の１つは、ポリメラーゼ活性
を有し得る。これらの構造の形成に関与するタンパク質は、下記において、「滑りクランプ
タンパク質」または「クランプタンパク質」として言及されるが、但し、それら
はポリメラーゼ活性を有さない。

【０００５】閉環形状を有さない連続移動複製装置の一例として、バクテリオファージＴ４
またはＴ７の複製装置を参照する。閉環形状を有する連続移動複製装置の一例として、細菌である大腸菌の複製装
置を参照する（Stukenberg, P.T., Studwell-Vaughan, P.S.& O'Donnel, M.（19
91）Mechanisms of theβclamp of DNA polymerase III holoenzyme. J. Biol.
Chem. 266, 11328-11334; Kuriyan, J. & O'Donnel, M.（1993）Sliding clamps
of DNA polymerase. J. Mol. Biol. 234, 915-925）。

【０００６】古細菌における複製装置は真核生物複製装置と同様であることが知られている
が、しかし真核生物と古細菌のゲノム組織化はまったく異なり、真正細菌の細胞
構造はは古細菌の場合と同様である（Edgell, D.R. and Doolittle, W.F.（1997
）, Archaea and the origin（s）of DNA replication protein, Cell 89, 995-
998）。

【０００７】滑りクランプは、しばしば、１つまたはいくつかの他のタンパク質を介して伸
張タンパク質に結合される。言い換えれば、それは伸張タンパク質にカップリン
グされる。このようなカップリングタンパク質は、本明細書中で下記において、
カップリングタンパク質またはカップリングサブユニットと呼ばれ、この場合、
カップリングは複数のカップリングタンパク質を介して起こり得る。

【０００８】伸張（延長）タンパク質は、本明細書中では、１つまたはいくつかの以下の特
性を有するポリメラーゼ活性を有するタンパク質または複合体と理解されるべき
である：ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを合成するための鋳型としてのＲＮＡの使
用、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを合成するための鋳型としてのＤＮＡの使用、
ＲＮＡの合成、ＤＮＡの合成、ＤＮＡおよびＲＮＡからの核酸の合成、５’−３
’方向のエキソヌクレアーゼ活性および３’−５’方向のエキソヌクレアーゼ活
性、鎖置換活性、熱安定性および連続移動性または非連続移動性。

【０００９】種々の滑りクランプタンパク質の三次元構造は、すでに確定されている： −真核生物増殖細胞画抗原の構造（ＰＣＮＡ）（Krishna, T.S.R., Kong, X.-
P., Gray, S., Burgers, P.M, & Kuriyan, J.（1994）Crystal structure of th
e eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA. Cell 79, 1233-1243
; Gulbis, J.M., Kelman, Z., Ilurwitz, J., O'Donnel, M. & Kuriyan, J.（19
96）Structure of the C-terminal region of p21WAF1/CIP1 complexed with hu
man PCNA. Cell 87, 297-306）、 −真正細菌である大腸菌のポリメラーゼＩＩＩのβサブユニットの構造（Kong
, X.-P., Onrust, R., O'Donnel, M. & Kuriyan, J.（1992）Three dimensional
structure of theβsubunit of Escherichia coli DNA polymerase III holoen
zyme; a sliding DNA clamp. Cell 69, 425-437）、 −ならびにバクテリオファージＴ４タンパク質の遺伝子４５タンパク質の構造
（Kleman, Zvi, Hurwitz, J. O'Dnell, Mike（1998）Structure, 6, 121-125）
。

【００１０】これらの滑りクランプの全体的構造は、非常に似ている。ＰＣＮＡの環状全タ
ンパク質構造の、βサブユニットおよびｇｐ４５の図は、互いに重ねた場合、重
なり合う（Kelman, Z. & O'Donell, M.（1995）Structure and functional simi
larities of prokaryotic and eukaryotic sliding clamps. Nucleic Acids Res
. 23, 3613-3620）。各環は、匹敵する寸法および、二重ＤＮＡ、即ち２つの相
補的ＤＮＡ鎖から成るＤＮＡ二本鎖を取り囲むのに十分な大きさである中心開口
部を有する。

【００１１】滑りクランプはそれ自体in vivoでＤＮＡ周囲に配置できないが、しかしＤＮ
Ａ周囲に押しつけられねばならない。原核生物および真核生物において、このよ
うなタンパク質複合体は真正細菌である大腸菌でγ複合体と、そしてヒトでは複
製因子Ｃ（ＲＦ−Ｃ）と呼ばれる多数のサブユニットから成る（Kelman, Z. & O
'Donell, M.（1994）DNA replication - enzymology and mechanisms. Curr. Op
in. Gent. Dev. 4, 185-195）。タンパク質複合体は、プライマー鋳型二重鎖の
プライマーの３’末端を認識し、ＡＴＰの存在下でＤＮＡ周囲に滑りクランプを
配置する。

【００１２】バクテリオファージＴ７の場合、同一対象物、即ち連続移動ＤＮＡ合成は、異
なる構造を有するタンパク質複合体によって成しとげられる。ファージは、遺伝
子５の遺伝子産物であるそれ自体の触媒的ポリメラーゼ、即ちＴ７ポリメラーゼ
を発現し、これが宿主大腸菌からのタンパク質、即ちチオレドキシンと結合し、
したがってレプリカーゼとしての高連続移動ＤＮＡ複製を可能にする（Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 1992, Oct. 15, 80（20）:9774-9778 Genetic analysis of
the interaction between bacteriophage T7 DNA polymerase and Escherichia
coli thiorexin, Himawan JS, Richardson CC）。この場合、クランプ形成も認
められるが、しかしこのクランプは、例えば真核生物ＰＣＮＡの場合と同一構造
を有さない。

【００１３】例えばヒトポリメラーゼδの場合には、カップリングタンパク質がポリメラー
ゼの触媒的活性部分と連続移動性因子（滑りクランプ）との間の連結を作製しな
ければならない、ということがしばしば必要である。ヒトの場合、これはδポリ
メラーゼの小サブユニットである（Zhang, S.-J., Zeng, X.-R., Zhang, P., To
omey, N.L., Chuang, R.Y., Chang, L.-S., and Lee, M.Y.W.T.（1994）A conse
rved region in the amino terminus of DNA polymeraseδis involved in poli
ferating cell nuclear antigen binding . J. Biol. Chem. 270, 7988-7992）
。しかしながら、Ｔ７ポリメラーゼの場合、連続移動性因子はポリメラーゼの触
媒単位に直接結合する。

【００１４】ＤＮＡポリメラーゼは、特に２つの特性、即ちそれらの伸張率、即ちそれらが
１秒当たりで増殖中のＤＮＡ鎖中に組み入れ得るヌクレオチドの数とそれらの解
離定数とにより特性化される。ポリメラーゼがヌクレオチドの１つを増殖中の鎖
中に組み入れる各工程（即ち、一伸張工程は結合事象毎に起こる）後に鎖から再
び解離する場合には、連続移動性は１という値を有し、ポリメラーゼは連続移動
的でない。この合成は、分配的と言われる。ポリメラーゼが反復核酸組入れのた
めに鎖に連結されたままである場合には、複製様式は連続移動的であるといわれ
、数千の値に達し得る（Methods in Enzymology Volume 262, DNA replication,
edited by J.L. Campbell, Academic Press 1995, pp.270-280も参照）。

【００１５】連続移動性（Processivity）は、ほとんどのin vitro適用、例えばＰＣＲまた
はシーケンシング法のために望ましい特性であるが、しかしこれらの反応に今日
まで用いられてきた熱安定性酵素はわずかな程度に連続移動性を有しているだけ
であり、一方、チオレドキシンに関連した感温性Ｔ７ポリメラーゼは、数千ヌク
レオチドの連続移動性を有する。比較すると、Thermus thermophilusまたはTher
mus aquaticusからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、約50ヌクレオチドの連続
移動性を有するに過ぎない（Biochem. Biophys. Acta. 1995 Nov. 7, 1264（2）
:243-248 Inactivation of the 5'-3' exonuclease of Thermus aquaticus DNA
polymerase. Merkens LS, Bryan SK, Moses RE）。

【００１６】米国特許第4,683,195号、第4,800,195号および第4,683,202号は、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるこのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの適用を
記載する。ＰＣＲでは、ＤＮＡは、プライマー、鋳型（マトリックスとも呼ばれ
る）、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝剤および安定反応条件を
用いて、新規に合成される。開始点は、通常は、ある標的領域が増幅される二本
鎖化ＤＮＡ配列である。このために、標的配列のフランキング領域と相補的で、
各々がＤＮＡ二本鎖の部分鎖上にある２つのプライマーが用いられる。しかしな
がら、プライマーをハイブリダイズするために、ＤＮＡ二本鎖は先ず変性され、
特に熱融解される。プライマーのハイブリダイゼーション後、それらはポリメラ
ーゼにより伸張される。その後、鋳型から新規に生成されたＤＮＡ鎖を分離する
ために変性が再び実行され、その時点で、元の鋳型鎖の他に、第一工程で生成さ
れた核酸鎖もさらなる伸張サイクルのための鋳型として利用可能であり、これら
は各々、プライマーと再びハイブリダイズされ、新規の伸張が起こる。この手法
は、各々、中間工程賭して熱変性を伴うサイクルにおいて実行される。ＤＮＡ鎖
の周期的熱溶融後に存続する熱安定性ポリメラーゼは、好ましくは、ＰＣＲのた
めに用いられる。したがって、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼがしばしば用いられる
（米国特許第4,965,188号）。しかしながら、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの連続
移動性は、前記のＴ７ポリメラーゼに比してかなり低い。

【００１７】ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定にも用いられる（Sanger et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA 74:5463-5467（1997））。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
は、しばしば、Sangerによるシーケンシングに用いられる（Tabor, S. and Rich
ardson, C.C., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:4076-4080（1989））。その後
、サイクルシーケンシング法が開発された（Murray, V.（1989）Nucleic Acids
Res. 17, 8889）が、これは一本鎖鋳型を必要とせず、相対的に少量の鋳型を用
いた配列反応の開始を可能にする。このために用いられる鋳型は、例えば前記の
Ｔａｑポリメラーゼ（米国特許第5,075,216号）またはThermotoga neapolitana
からのポリメラーゼ（WO 96/10640）またはその他の熱安定性ポリメラーゼであ
る。近年の方法は、ゲノムＤＮＡを直接シーケンシングし得るように、一工程に
おいて指数関数的増幅およびＤＮＡ断片のシーケンシングを連結する。方法の１
つ、いわゆるＤＥＸＡＳ法（Nucleic Acids Res. 1997 May 15; 25（10）:2032-
2034 Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C,
Paabo S, Biol. Chem. 1997 Feb; 378（2）:99-105 Direct exponential ampli
fication and sequencing（DEXAS）of genomic DNA. Kilger C, Paabo S and DE
19653439.9 and DE 19653494.1）は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と比
較して、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）に対して識別する能力低減を示
すポリメラーゼ、ならびに反応緩衝液、好ましくは等量で存在しない２つのプラ
イマーおよび前記のヌクレオチドを用いて、その後にプライマーが側面に位置す
るいくつかのサイクルにおける断片の完全な、配列特異的ＤＮＡラダーを得る。
この方法のさらなる開発は、２つのポリメラーゼのうちの１つがｄｄＮＴＰとｄ
ＮＴＰを識別するが、一方、二番目のものは識別能力低減を示すポリメラーゼ混
合物の使用を包含する（Nucleic Acids Res. 1997 May 15; 26（10）:2032-2034
Direct DNA sequence determination from total genomic DNA. Kilger C, Paa
bo S）。

【００１８】ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡのＤＮＡへの逆転写のためにも用いられる。こ
の場合、ＲＮＡは鋳型として役立ち、ポリメラーゼは相補的ＤＮＡ鎖を合成する
。生物体Thermus thermusphilus（Ｔｔｈ）（米国特許第5,322,770号）からの熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼが、例えばこの場合に用いられる。ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性、即ち３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性も有し得る。この特性は、合成される物質が低率のヌクレオチド組入れ
エラーで生成される必要がある場合に、特に望ましい。生物体ピロコッカス・ウ
ォセイ（Pyrococcus wosei）からのポリメラーゼは、この一例である。

【００１９】ＰＣＲ反応に一般に用いられる前記の酵素はほとんど、実際にはin vivoで複
製酵素ではないが、多くは、それらの連続移動性が相対的に小さい理由であるＤ
ＮＡ修復に関与すると思われる酵素である。それゆえ、本発明の目的は、in vitro反応に用いるために、ポリメラーゼの前
記の特性のうちのいくつかを、特に高連続移動性と熱安定性の特性を組合せるこ
とであった。

【００２０】この目的は、熱安定性滑りクランプタンパク質およびポリメラーゼ活性を有す
る熱安定性伸張タンパク質を包含する熱安定性in vitro複合体を提供することに
より、本発明によって達成された。したがって、本発明の複合体は、核酸（単数
または複数）の鋳型依存性伸張のために用いられ得る。この複合体は、ＰＣＲ反応のようなin vitro反応に用いられ、そしてこれらの
反応において高連続移動性を有し得る。さらに別の利点は、本複合体がヌクレオ
チド組入れにおいて低エラー率を有する、即ち塩基組入れの精度増大を示すとい
う点である。それゆえ、本発明の複合体は、有益には、核酸の伸張、増幅、逆転
写、ＤＮＡ標識およびシーケンシングに用いられ得る。

【００２１】前記の用途は各々、本発明の特に好ましい実施態様を表す。本発明の複合体が核酸を増幅するために用いられる場合、この方法で生成され
る増幅生成物は特に低率の間違った塩基組入れを有する、ということが意外にも
見出された。例えば標準ＰＣＲ反応におけるこのような複合体の使用は、簡単な取扱い、な
らびに例えば図２６に示すような高連続移動性を保証する。

【００２２】一実施態様では、滑りクランプタンパク質は本発明のin vitro複合体において
伸張タンパク質に連結される、と意図される。本発明の熱安定性in vitro複合体の好ましい実施態様では、滑りクランプタン
パク質および伸張タンパク質は、カップリングタンパク質により連結される。滑りクランプタンパク質とポリメラーゼ活性を有する伸張タンパク質との間の
カップリングは、共有結合により、そして非共有結合によっても成し遂げられる
。好ましい代替的実施態様では、滑りクランプタンパク質と伸張タンパク質との
間の直接カップリングが意図される。

【００２３】この場合、滑りクランプタンパク質および／または伸張タンパク質は、古細菌
から得られ得る。本発明の複合体の好ましい実施態様では、それは原核生物in vitro複合体であ
る。好ましい実施態様では、本発明の原核生物複合体は古細菌in vitro複合体であ
り得る。

【００２４】好ましい代替的実施態様では、本発明の原核生物複合体は、真正細菌in vitro
複合体であり得る。本発明の複合体の代替的実施態様では、それは真核生物in vitro複合体である
。この点については、原核生物in vitro複合体は、滑りクランプタンパク質が伸
張タンパク質の起源と無関係な原核生物起源を有するものである。対応的に、真
正細菌複合体は、滑りクランプタンパク質が伸張タンパク質の起源と無関係な真
正細菌起源を有するものである。対応的に、古細菌複合体は、滑りクランプタン
パク質が伸張タンパク質の起源と無関係な古細菌起源を有するものである。さら
に、真核生物複合体は、対応的に、滑りクランプタンパク質が伸張生成物の起源
と無関係な真核生物起源を有するものである。

【００２５】本発明は、複合体が構成されるタンパク質が部分的に古細菌、真核生物および
真正細菌から得られる熱安定性in vitro複合体にも関する。この点では、それら
のタンパク質構成成分またはそれらのそれぞれの起源に関するin vitro複合体の
あらゆる順列が本発明の目的物質である。この点では、前文における起源は、遺伝子、遺伝情報またはタンパク質が基礎
とするあらゆる供給源を意味するよう意図される。

【００２６】これは、滑りクランプタンパク質または伸張タンパク質が、例えば化学的合成
、遺伝子工学的方法または天然源からの単離により得られる実際の物質とは無関
係である。本発明は、特に、相補的核酸鎖を全体的にまたは部分的に取り囲む熱安定性滑
りクランプタンパク質（図２０）、ならびにポリメラーゼ活性を有する熱安定性
タンパク質（図２１および図２２）であって、このタンパク質またはタンパク質
の複合体が滑りクランプタンパク質に結合されるかまたはそれと関連があるタン
パク質とを包含する、核酸の伸張のための、特に鋳型依存性伸張のための熱安定
性原核生物in vitro複合体に関する。

【００２７】本発明の範囲では、ポリメラーゼ活性を有する伸張タンパク質という用語は、
ポリメラーゼ活性を有するタンパク質複合体、またはポリメラーゼ活性を保有す
るこのような複合体のサブユニットも包含する。熱安定性であるとは、本発明の意味では、in vitro複合体が、ＰＣＲまたはそ
の他の反応、例えばＤＮＡシーケンシングで生じる低温ならびに高温で、高連続
移動性を有する増殖中の核酸鎖にヌクレオチドを組み入れることを意味する。

【００２８】ＰＣＲは、普通は、例えば、変性（70℃〜98℃）、アニーリング（40℃〜78℃
）およびＤＮＡ鎖合成（60℃〜76℃）の工程を包含する。この複合体は少なくと
も約60℃〜70℃で、特に好ましくは60℃〜76℃で、特に好ましくは40℃〜98℃で
、機能的でなければならない。伸張反応を阻止または抑制し得る全反応中に複合
体または個々の構成成分の不可逆的変性の徴候は存在すべきでない。

【００２９】滑りクランプ（sliding clamp）以下の詳細は、滑りクランプおよび滑りクランプタンパク質の機能および考え
得る形態を説明するものとする。滑りクランプタンパク質の機能は、伸張タンパク質をＤＮＡに結合することで
ある。すでに前記したように、滑りクランプタンパク質それ自体は、全体的にま
たは部分的に、あるいはポリメラーゼ活性を有するタンパク質との会合により、
あるいはポリメラーゼ活性を有するタンパク質複合体またはそのサブユニットを
伴い、したがって核酸周囲にクランプを形成し得る場合のように、一本鎖または
二本鎖を取り囲む。あらゆる場合に、連続移動性は、このクランプ形成により少
なくとも1.5倍有意に増大される（実施例５および図２３）。

【００３０】これは、本発明のin vitro複合体の連続移動性が、伸張タンパク質単独あるい
は滑りクランプを伴わないポリメラーゼ活性を有するタンパク質複合体またはそ
のサブユニットの少なくとも1.5倍であることを意味する（実施例５および図２
３）。本発明によれば、ヒトゲノムでコードされる増殖細胞画抗原タンパク質複合体
の相同体または機能的類似体、あるいは熱安定性生物体から得られるかまたは熱
安定性であるか、あるいはそれらが非熱安定性である場合には熱安定性にされる
か、あるいは非熱安定性生物から得られ、熱安定性であるかまたはその後アミノ
酸配列を修飾することにより熱安定性にされる大腸菌からの同様の環状β−クラ
ンプタンパク質複合体の相同体は、例えば滑りクランプとして用いられ得る（Ei
jsink VG. van der Zee JR, van den Burg B, Vriend G, Venema G, FEBS Lett
1991 Apr 22, 282（1）:13-16, Improving the thermostability of the neutra
l protease of Bacillus stearothermophilus by replacing a buried asparagi
ne by leusine, Bertus Van den Burg, Gert Vriend, Oene R. Veltman, Gerard
Venema and Vincent G.H. Eijsink Engineering An enzyme to resist boiling
PNAS 1998, 95:2056-2060）。相同配列は、本明細書中では、以下において、１
つまたはいくつかのその他の配列と、即ちそれが偶然一致する類似性であると考
えられ得ない程度に同様の配列を有することを特徴とする配列と理解される。配
列類似性の程度はパーセントで表され、相同と言われる。時として、配列同一性
という用語も用いられる。相同体は、参照配列と相同配列である核酸またはアミ
ノ酸配列である。

【００３１】滑りクランプは、いくつかの構成成分から成る。ヒトゲノム中で同定される滑
りクランプは、３つのＰＣＮＡタンパク質構成成分（配列番号１１）（ホモ三量
体）から成り、そして大腸菌ゲノム中で同定される滑りクランプは２つの構成成
分（配列番号３５）（ホモ二量体）から成る。本発明の意味での滑りクランプは、特に、ポリメラーゼ連続移動性を増大する
という機能的特性を有し（実施例５および図２３）、および／またはエラー率を
低減するあらゆるタンパク質と理解される。この目的のために、滑りクランプは
、環状三次元構造を有し得るか、または一本鎖および二本鎖核酸を全体的にまた
は部分的に取り囲み得る手段によりもう一つのタンパク質とカップリングするこ
とにより環状三次元構造を形成し得る。

【００３２】本発明の意味での滑りクランプは、特に、１．配列アラインメント中で少なくとも100アミノ酸長に亘って、ヒトＰＣＮ
Ａアミノ酸配列（真核生物）（配列番号１１）と少なくとも20％、好ましくは少
なくとも25％、さらに好ましくは少なくとも30％の配列同一性を有し、あるいは２．配列アラインメント中で少なくとも100アミノ酸長に亘って、大腸菌（E.
coli（真正細菌））からの細菌β−クランプ配列（配列番号３５）と少なくとも
20％、好ましくは少なくとも25％、さらに好ましくは少なくとも30％の配列同一
性を有し、あるいは３．配列アラインメント中で少なくとも100アミノ酸長に亘って、Archaeoglob
us fulgidusからのＰＣＮＡ相同体のアミノ酸配列（古細菌）（配列番号１２）
と少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、さらに好ましくは少なくとも30
％の配列同一性を有するタンパク質と理解される。

【００３３】本明細書中に開示された配列アラインメントはすべて、Altschul, S.F., Gish
, W., Miller, W.. Myers, E.W., and Lipman, D.J., J. Mol. Biol. 215, 403-
410（1990）にしたがって、BLAST算法を用いて生成された。本発明の滑りクランプは、１つまたはいくつかの前記の特徴を有する。本発明の意味では、滑りクランプまたは滑りクランプタンパク質は、以下のコ
ンセンサス配列（領域１および領域２）の一方または両方を含有し、そして領域
１（配列番号３９）から４つ以下の位置で、または領域２（配列番号４０）から
４つ以下の位置で逸れるタンパク質とも理解される（図４）。

【００３４】領域１（配列番号３９）： [GAVLIMPFW]-D-X-X-X-[GAVLIMPFW]-X-X-[GAVLIMPFW]-X-[GAVLIMPFW]-X-[GAVLIMP
FW]-X-X-X-X-F-X-X-Y-X-X-D および／または領域２（配列番号４０）： [GAVLIMPFW]-X（3）-L-A-P-[KRHDE]-[GAVLIMPFW]-E アミノ酸は、標準IUPAC−単一文字命名法により表され。Prositeパターン記述
基準にしたがって示される。以下のアミノ酸群は、しばしば、一緒にプールされ
る：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、ＦまたはＷ（非極性側鎖を有するアミノ酸）Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＹまたはＣ（非荷電極性側鎖を有するアミノ酸）Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤまたはＥ（荷電および極性側鎖を有するアミノ酸）。

【００３５】さらに、Ｘは配列または配列プロトコール中のあらゆる所望のアミノ酸または
挿入または欠失を意味する。さらに、図１２に示したヒトＰＣＮＡ相同体の多重アラインメントから、隠蔽
Markovモデルが作られた。それゆえ、滑りクランプは本発明の意味では、特に、
この方法で生成された隠蔽Markovモデル（以後、ＨＭＭと呼ぶ）に関して20より
大きい、好ましくは25より大きい、最も好ましくは30より大きいスコアを有し、
それによりスコアがＨＭＭ分析の出力値であるあらゆるタンパク質とも理解され
る。隠蔽Markovモデルおよび対応するスコアは、Sean Eddy, Dept. of Genetics
, Washington University School of Medicine, St. Louis, USAによるHMMERパ
ッケージ（HMMERタンパク質およびＤＮＡ隠蔽Markovモデル（バージョン1.8））
からのhmmfプログラム（バージョン1.8.4、1997年7月）を用いて算出された。

【００３６】隠蔽プロフィール（プロフィールＨＭＭ）を有するMarkovモデルは、隠蔽Mark
ovモデルと短縮形でも呼ばれ、ＨＭＭが配列族の一次構造のコンセンサスの統計
的モデルであるので、本明細書中では略書される。プロフィールは、アミノ酸（
またはヌクレオチド）に関する位置特異的スコアおよび挿入または欠失の開始ま
たは程度に関する位置特異的スコアを用いる。多重アラインメントからプロフィ
ールを提示する方法は、Taylor（1986）、Gribskov等（1987）、Barton（1990）
およびHeinikoff（1996）により導入された。

【００３７】ＨＭＭは、プロフィールの完全に蓋然的な説明を提供する。即ち、Bayesの教
示は、全蓋然性（査定）パラメーターが以下に設定されるべきであるかを確定す
る（Krogh et al. 1994、 Eddy 1996およびEddy 1998と比較）。重要な見解は、
ＨＭＭが無限数の考え得る配列全体の確率分布を説明する有限モデルであるとい
うことである。ＨＭＭは、それが一般に示されるような多重アラインメントのカ
ラムに対応する多数の状態から成る。各状態は、（状態特異的）記号放出確率に
対応する記号（残余）を出し、状態は状態遷移確率により一緒に連結される。一
連の状態は、最終状態に達するまで、状態遷移確率によりある状態から他の状態
への繊維により初期状態から開始して生成される。各状態は、次に、この状態の
放出確率分布に対応する記号を出し、これが記号の観察可能配列を生成する。

【００３８】隠蔽される属性は、根元的状態配列が観察され得ないという事実に由来し、そ
れは観察される記号配列である。遷移および放出確率の概算（モデルのトレーニ
ング）は、ＨＭＭＥＲパッケージで実行される動的プログラミング算法により成
し遂げられる。既存のＭＨＨおよび所定の配列を用いて、ＨＭＭが問題の配列を生成し得る確
率を算出し得る。ＨＭＭＥＲパッケージは、この確率に比例する数量（スコアま
たは出力値）を提供する。即ち、配列の情報含量はビットで記述され、ＨＭＭに
より測定される。

【００３９】ＨＭＭに関連して、以下の参考文献が参照される： Barton, G.J.（1990）: Protein multiple alignment and flexible pattern matching, Methods enzymol. 183:403-427 Eddy, S.R.（1996）: Hidden Markov models Curr. Opin. Strct. Biol. 6:361-365 Eddy, S.R.（1998）: Profile hidden Markov models Bioinformatics. 14:755-763 Gribskov, M. McLachlan, A.D. and Eisenberg D.（1987）: Profile analysis:Detection of distantly related proteins Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-5358 Heinikoff, S.（1996）: Scores for sequence searches and alignment Curr. Opin. Strct. Biol. 6:353-360 Krogh, A., Brown, M., Mian, I.S., Sjolander, K. and Haussler, D.（1994
）: Hidden Markov models in computational biology: Applications to protein
modelling. J. Mol. Biol. 235:1501-1531 Taylor, W.R.（1986） Identification of protein sequence homology by consensus template alig
nment J. Mol. Biol. 188:233-258 ＨＭＭは、図１３に示した大腸菌βクランプ相同体の多重アラインメントから
生成された。それゆえ、本発明の意味での滑りクランプは、特に、この方法で生
成されるＨＭＭにおいて25より大きい、好ましくは30より大きい、最も好ましく
は35より大きいスコアを有するあらゆるタンパク質とも理解される（図13）。

【００４０】滑りクランプは、核酸から容易に解離され得ない安定環状分子複合体が生成さ
れるように、特徴的結合により一緒にしっかり結合されるいくつかの構成成分か
らなる。これは、核酸上での自由運動を隠蔽しない核酸とのしっかりとした、し
かし非共有的結合を可能にする。さらに、連続移動性を増大する滑りクランプタ
ンパク質は、自由可動性を促し、そしてこの領域に挿入される水分子により促さ
れ得るＤＮＡとの相互作用の領域における特徴的局所分子特性を有する。

【００４１】本発明のさらに好ましい実施態様は、特に、滑りクランプタンパク質が以下の
うちの１つである熱安定性原核生物in vitro複合体である：Archaeoglobus fulg
idusからのAF 0335（配列番号１２）（図２４）、Methanococcus jannaschiiか
らのMJ0247（配列番号１３）、Pyrococcus horikoschiiからのPHLA008（配列番
号１４）、Methanobacterium thermoautotrophicusからのMTH1312（配列番号１
５）ならびにAquifex aeolicusからのAE000761（配列番号３６）。

【００４２】特に、滑りクランプタンパク質が配列番号１１、１２、１３、１４、１５およ
び３６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含有する熱安定性in vitro複合
体は、本出願の目的物質である。滑りクランプローダーさらに好ましい実施態様は、本発明の複合体が滑りクランプローダーを含むも
のである。滑りクランプローダーは、ヒトにおいて同定された複製因子Ｃタンパ
ク質複合体の相同体を包含するタンパク質、タンパク質複合体またはタンパク質
のサブユニットと、本明細書中では理解される。

【００４３】ヒトにおいては、このタンパク質複合体は５つのサブユニットから成り、ヒト
においては５つの別個の遺伝子によりコードされる。１つの遺伝子により各々コ
ードされる４つの小型サブユニット（本明細書中では滑りクランプローダー１と
呼ばれる）は、ヒトにおけるタンパク質複合体を形成する。大型サブユニットの
タンパク質は、ヒトでは１つの遺伝子によりコードされる（本明細書中では滑り
クランプローダー２と呼ばれる）。４つの小型サブユニットの配列は、配列番号
１、３２、３３、３４として示され、大型サブユニットの配列は配列番号６とし
て示される。

【００４４】本発明によれば、前記の配列、配列番号１、３２、３３、３４のいずれかの相
同体または機能的類似体は、単独で、または滑りクランプローダー１としていず
れかの組合せで用いられ得る。この点では、相同体は、原核生物ならびに真正細
菌または古細菌あるいは真核生物起源のものであり得る。本発明によれば、前記の配列、配列番号６の相同体または機能的類似体は、単
独で、または滑りクランプローダー２としていずれかの組合せで用いられ得る。
この点では、相同体は、原核生物ならびに真正細菌または古細菌あるいは真核生
物起源のものであり得る。

【００４５】タンパク質は、本発明の意味では、配列アラインメント中で少なくとも100ア
ミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号１、３２、３３、
３４）と少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、さらに好ましくは少なく
とも30％の配列同一性を有する滑りクランプローダー１としても理解され得る。タンパク質は、本発明の意味では、配列アラインメント中で少なくとも150ア
ミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号６）と少なくとも
20％、好ましくは少なくとも25％、さらに好ましくは少なくとも30％の配列同一
性を有する滑りクランプローダー２としても理解され得る。

【００４６】滑りクランプローダー相同体は、前記の定義の意味では、例えば図１に列挙し
た古細菌からの遺伝子である。これらの遺伝子は、滑りクランプローダー１に関
しては配列番号２、３、４および５に、そして滑りクランプローダー２に関して
は配列番号７、８、９および１０に対応する。タンパク質は、本発明の意味では、以下のコンセンサス配列に従った配列を含
有し、そしてこの配列とは４以下の位置で異なる滑りクランプローダー１として
も理解され得る（アラインメントに関しては図６も参照）。

【００４７】配列番号１４： C-N-Y-X-S-[KRHDE]-I-I-X-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-Q-S-R-C-X-X-F-R-F-X-P-
[GAVLIMPFW] タンパク質は、本発明の意味では、以下のコンセンサス配列に従った配列を含
有し、そしてこの配列とは４以下の位置で異なる滑りクランプローダー２として
も理解され得る（アラインメントに関しては図７も参照）。

【００４８】配列番号４２： K-X-X-L-L-X-G-P-P-G-X-G-K-T-[STNQYC]-X- [GAVLIMPFW]-X-X-[GAVLIMPFW] さらに、ＨＭＭは、ヒト配列および古細菌からのそのいくつかの相同配列を包
含する図１４に示した滑りクランプローダー１の配列の多重アラインメントから
生成された。したがって、滑りクランプローダー１は、本発明の意味では、この
方法で生成されたＨＭＭにおいて25より大きい、好ましくは30より大きい、最も
好ましくは35より大きいスコアを有するタンパク質とも理解される（アラインメ
ントに関しては図１４も参照）。

【００４９】さらに、ＨＭＭは、ヒト配列および古細菌からのそのいくつかの相同配列を包
含する図１５に示した滑りクランプローダー２の配列の多重アラインメントから
生成された。したがって、滑りクランプローダー２は、本発明の意味では、この
方法で生成されたＨＭＭにおいて15より大きい、好ましくは20より大きい、最も
好ましくは25より大きいスコアを有するタンパク質とも理解される（アラインメ
ントに関しては、図１５も参照）。

【００５０】本発明のin vitro複合体は、滑りクランプローダー１または滑りクランプロー
ダー２のような、真正細菌である大腸菌γ複合体またはその一部と相同のタンパ
ク質も含有し得る。したがって、滑りクランプローダーは、本発明の意味では、各々前記と同様の
滑りクランプローダー１単独、滑りクランプローダー２単独、あるいは１つまた
はいくつかの滑りクランプローダー１または滑りクランプローダー２の組合せで
あり得る。

【００５１】さらに、一実施態様では、核酸の伸張のための本発明の熱安定性in vitro複合
体は、切断された場合にエネルギーを放出する化合物、例えばＡＴＰ、ＧＴＰ、
ＣＴＰ、ＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰを付加的に含有
する。以下におけるそれに限定されることなく、滑りクランプローダーは、非中断Ｄ
ＮＡ鎖周囲に滑りクランプの構成成分を集合させ、そして反応が完了した場合に
は、これらを再び除去すると思われる。この点では、滑りクランプは環形化三次
元構造を有するか、または一本鎖または二本鎖核酸を全体的にまたは部分的に取
り囲み得る手段で別のタンパク質とカップリングすることにより、環形化三次元
構造を形成し得る。滑りクランプローダーは、鋳型核酸分子が閉環形状で存在す
る場合には、有益であり得る。

【００５２】特に、滑りクランプローダー１が配列番号２、３、４および５から成る群から
選択されるアミノ酸配列を包含する熱安定性in vitro複合体が、本出願の目的物
質である。特に、滑りクランプローダー２が配列番号７、８、９および１０から成る群か
ら選択されるアミノ酸配列を包含する熱安定性in vitro複合体が、本出願の目的
物質である。

【００５３】カップリングタンパク質カップリングタンパク質の機能は、伸張タンパク質を１つまたはいくつかの滑
りクランプタンパク質と、または滑りクランプタンパク質複合体と連結すること
である。それゆえ、カップリングタンパク質は、本発明の意味では、特に、前記
の機能を有するあらゆるタンパク質と理解されるべきである。古細菌起源のカッ
プリングタンパク質が好ましい。

【００５４】カップリングタンパク質は、本発明の意味では、例えば、本明細書中ではカッ
プリングサブユニットと呼ばれるポリメラーゼδの小型サブユニットのヒト配列
（配列名：DPD2 HUMAN。配列番号１６として配列プロトコールに記載）と相同で
ある図１に列挙した配列の単独でのあるいはいずれかの組合せでの相同体または
機能的類似体である。本発明の意味では、カップリングタンパク質は、配列番号
１７、１８、１９、２０および２１から成る群から選択される配列を包含するタ
ンパク質であり得る。

【００５５】カップリングタンパク質は、本発明の意味では、配列アラインメント中で少な
くとも150アミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号１６
）と少なくとも18％、好ましくは少なくとも22％、さらに好ましくは少なくとも
26％の配列同一性を有するタンパク質として理解される。カップリングタンパク質は、本発明の意味では、配列アラインメント中で少な
くとも150アミノ酸長に亘って、Pyrococcus horikoshiiからのアミノ酸配列（配
列番号１９）と少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、さらに好ましくは
少なくとも30％の配列同一性を有するタンパク質として理解される。

【００５６】カップリングタンパク質は、本発明の意味では、以下のコンセンサス配列を含
有し、そして４つ以下の位置でこの配列から逸れるあらゆるタンパク質としても
理解される。本明細書中で配列番号４３として開示されるコンセンサス配列の生
成は、図５に示されている。配列番号４３： [FL]-[GAVLIMPFW]-X-X-[GAVLIMPFW]-X-G-X（13）-[GAVLIMPFW]-X-[YR]-[GAVLI
MPFW]-X-[GAVLIMPFW]-A-G-[DN]-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-[DS] さらに、ＨＭＭは、図１６に示したヒトカップリングサブユニットまたはカッ
プリングタンパク質との相同体の多重アラインメントから生成された。それゆえ
、カップリングサブユニットは、本発明の意味では、この方法で生成されるＨＭ
Ｍにおいて10より大きい、好ましくは15より大きい、最も好ましくは20より大き
いスコアを有するあらゆるタンパク質と理解されるべきである。

【００５７】特に、カップリングタンパク質が配列番号１７、１８、１９、２０および２１
から成る群から選択されるアミノ酸配列を包含する熱安定性in vitro複合体が本
出願の目的物質である。伸張タンパク質前記の特徴を有する伸張タンパク質が、本発明の範囲内で用いられ得る。さら
に、以下に記載される、そしてその少なくともいくつかが当業界で既知である伸
張タンパク質の形態を使用し得る。

【００５８】いくつかの伸張タンパク質は、何らかのポリメラーゼ活性を少しでも有するた
めに、カップリングタンパク質の存在を必要とすることが分かっている。いくつ
かの伸張タンパク質は滑りクランプタンパク質と直接結合し得るが、一方、他の
伸張タンパク質は滑りクランプタンパク質と結合するためにはカップリングタン
パク質の存在を必要とすることも分かっている。さらに、伸張タンパク質は、前
記の特性の両方を併有し、即ち、カップリングタンパク質を介して滑りクランプ
タンパク質と結合するか、または直接的に、即ちカップリングタンパク質を用い
ずに結合する。

【００５９】本発明のin vitro複合体のための好ましい伸張タンパク質は、生物体Carboxyd
othermus hydrogenoformans、Thermus aquaticus、Thermus caldophilus、Therm
us chliarophilus、Thermus filiformis、Thermus flavus、Thermus oshimai、T
hermus ruber、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species ZO5
、Thermus species sp. 17、Thermus thermusphilus、Therotoga maritima、The
rotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Anaerocellum thermophilum、バ
チルス属のBacillus caldotenaxまたはBacillus stearothermophilusを包含する
群から選択され得る。

【００６０】例えば、ヒト伸張タンパク質（配列番号２２）と相同であるかまたは機能的に
類似する古細菌からの図１に列挙した伸張タンパク質（配列番号２３、２４、２
５、２６）も、伸張タンパク質として適している。特に、伸張タンパク質が配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９
、３０および３１を包含する群から選択されるアミノ酸配列を包含する熱安定性
in vitro複合体は、本発明の目的物質である。

【００６１】伸張タンパク質は、本発明の意味では、特に、配列アラインメント中で少なく
とも200アミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号２２）
と少なくとも20％、好ましくは少なくとも25％、最も好ましくは少なくとも30％
の配列同一性を有するタンパク質として理解される。伸張タンパク質は、本発明の意味では、以下のコンセンサス配列（配列番号４
４）を含有し、そして４つ以下の位置でこの配列とは異なるタンパク質としても
理解される。図８は、コンセンサス配列のための基礎を形成するアラインメント
を示す。

【００６２】配列番号４４： D-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-X-X-Y-N-X-X-X-F-D-X-P-Y-[GAVLIMPFW]-X-X-R-A さらに、ＨＭＭは、図１７に示したヒト伸張タンパク質（配列番号２２）との
相同体の多重アラインメントから生成された。それゆえ、伸張タンパク質は、本
発明の意味では、この方法で生成されるＨＭＭにおいて20より大きい、好ましく
は25より大きい、最も好ましくは30より大きいスコアを有するあらゆるタンパク
質と理解されるべきである。

【００６３】それゆえ、伸張タンパク質は、本発明の意味では、特に、配列アラインメント
中で少なくとも400アミノ酸長に亘って、古細菌アミノ酸配列（配列番号２７）
と少なくとも25％、好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも35％
の配列同一性を有するタンパク質として理解される。例えば、配列番号２７、２
８、２９、３０または３１を有する古細菌由来のタンパク質が適している。

【００６４】それゆえ伸張タンパク質は、本発明の意味では、特に、本明細書中で配列番号
４５と呼ばれる以下のコンセンサス配列を含有し、そして４つ以下の位置でこの
配列とは異なるあらゆるタンパク質としても理解される（図９は、コンセンサス
配列のための基礎を形成するアラインメントを示す）。配列番号４５： A-[GAVLIMPFW]-R-T-A-[GAVLIMPFW]-A-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-T-E-G-[GAVLI
MPFW]-V-X-A-P-[GAVLIMPFW]-E-G-I-A-X-V-[KRHDE] さらに、ＨＭＭは、図１８に示した古細菌伸張タンパク質（配列番号２７）と
の相同体の多重アラインメントから生成された。それゆえ、伸張タンパク質は、
本発明の意味では、この方法で生成されるＨＭＭにおいて35より大きい、好まし
くは40より大きい、さらに好ましくは45より大きいスコアを有するあらゆるタン
パク質と理解される（図１８）。

【００６５】伸張タンパク質は、真正細菌起源のものでもあり得る。それゆえ、伸張タンパ
ク質は、本発明の意味では、特に、配列アラインメント中で少なくとも300アミ
ノ酸長に亘って、真正細菌アミノ酸配列（配列番号３７）と少なくとも25％、好
ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも35％の配列同一性を有する
タンパク質としても理解される。

【００６６】それゆえ伸張タンパク質は、本発明の意味では、特に、以下のコンセンサス配
列を含有し、そして８つ以下の位置でこの配列とは異なるあらゆるタンパク質と
しても理解される（図１０）。配列番号４６： [GAVLIMPFW]-P-V-G-[GAVLIMPFW]-G-R-G-S-X-[GAVLIMPFW]-G-S-[GAVLIMPFW]-V-
A-X-A-[GAVLIMPFW]-X-I-T-D-[GAVLIMPFW]-D-P-[GAVLIMPFW]-X-X-X-[GAVLIMPFW]-
L-F-E-R-F-L-N-P-E-R-[GAVLIMPFW]-S-M-P-D さらに、ＨＭＭは、図１９に示した真正細菌伸張タンパク質（配列番号３７）
との相同体の多重アラインメントから生成された。それゆえ、伸張タンパク質は
、本発明の意味では、この方法で生成されるＨＭＭにおいて20より大きい、好ま
しくは25より大きい、最も好ましくは30より大きいスコアを有するあらゆるタン
パク質と理解される。

【００６７】特に、伸張タンパク質が配列番号３８から成る群から選択されるアミノ酸配列
を包含する熱安定性in vitro複合体が本出願の目的物質である。本発明のin vitro複合体の使用：従来、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばPyrococcus furiosus（米国特許第5,545,5
52号）またはPyrococcus species（EP-A-0547359）からのＤＮＡポリメラーゼＩ
は、カップリングタンパク質を用いずに、そして滑りクランプを用いずに、標準
ＰＣＲ反応のための伸張タンパク質として用いられた。これらの酵素の特徴は、
それらが熱安定性であり、しばしば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（プルー
フリーディング活性）を保有するということである。ポリメラーゼ活性を有する
ヘテロ二量体がPyrococcus furiosusで発見されたのは、近年に過ぎない（Uemor
i, T., Sato, Y., Kato, I., Doi, H., and Ishino, Y.（1997）A novel DNA po
lymerase in the hyperthermophillic archaeon, Pyrococcus furiosus:gene cl
oning, expression and characterization. Genes to Cells 2, 499-512）。

【００６８】欠失または突然変異により、あるいはアミノ酸をくっつけることにより、これ
らのタンパク質の特性を最適化することもできる。これらの修飾化タンパク質も
本発明の目的物質であるが、但し、それらは核酸の伸張のための本発明のin vit
ro複合体を形成し、そして前記でより詳細に記載された機能を満たす。図３は、滑りクランプがカップリングタンパク質により伸張タンパク質と結合
する本発明の熱安定性in vitro複合体の一実施態様を実施例により説明する。

【００６９】さらに、本発明のin vitro複合体またはこの複合体を含有する本発明の反応混
合物は、例えば、伸張される、シーケンシングされる、増殖されるまたは逆転写
される核酸、および／または好ましくは核酸とハイブリダイズするプライマーを
含有し得る。プライマーは、通常は、それらを標的配列と結合させる標的配列と相補的であ
り、そして互いに面するそれらの３’末端と反対配向であるオリゴヌクレオチド
であり、それらは、伸張され、シーケンシングされ、増幅されまたは逆転写され
る核酸セクションを取り囲む。それらは酵素活性の開始点として役立ち、そして
通常は、ヌクレオチドを組み入れるためにポリメラーゼに自由３’ＯＨ末端を提
供する。

【００７０】増幅、伸張、逆転写および／またはシーケンシングのための本発明の熱安定性
in vitro複合体の使用中、本発明の複合体は、好ましくはは適切な緩衝液中の反
応混合物中に存在し得る。適切な緩衝液は、ＰＣＲ、シーケンシング、核酸標識
およびポリメラーゼによるその他のin vitro核酸伸張反応に用いられるものであ
る。適切な緩衝液は、例えばMethods in Molecular Biology, vol.15 Hurnana P
ress Totowa, New Jersey, 1993, publ. Bruce A. Whiteに記載されている。

【００７１】本発明の熱安定性in vitro複合体が伸張、増幅、逆転写および／またはシーケ
ンシングに用いられる場合、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物が、本発
明の複合体に加えて、存在し、または使用され、または含まれ得る。デオキシヌ
クレオチドは、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰから選択され得る
が、しかしこれらに限定されない。さらに、熱安定性ポリメラーゼにより増殖中
の核酸分子中に組み入れられ得るデオキシヌクレオチドとして記載されるデオキ
シヌクレオチドの誘導体も用いられ得る。このような誘導体としては、チオヌク
レオチド７−デアザ−２’−ｄＧＴＰ、７−デアザ−２’−ｄＡＴＰ、ジゴキシ
ゲニン−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim）-ｄＡＴＰ、ならびにｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＴＴＰまたはｄＣＴＰのための置換デオキシヌクレオチドとしても用い
られ得るデオキシイノシントリホスフェートが挙げられるが、これらに限定され
ない。標識化デオキシヌクレオチドを用いることもできる。ピレンおよびピレン
誘導体を用いることもできる。この点では、本発明の目的のためのすべての既知
のおよび／または適切な標識が存在するかまたは用いられ得る。

【００７２】ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰおよびｄｄ
ＣＴＰから選択され得るが、しかしこれらに限定されない。あるいは、反応にお
いて合成される増殖中の核酸分子中にポリメラーゼにより組み入れられ得るジデ
オキシヌクレオチドとして記載されるジデオキシヌクレオチドの誘導体も用いら
れ得る。このような誘導体は放射性ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ、ｄｄ
ＧＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）あるいは、例えばFITC、Cy5、Cy5.5，Cy
7、テキサスレッドまたはその他の染料で標識されるジデオキシヌクレオチド（
ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）であり得るが、これら
に限定されない。本発明の熱安定性複合体を用いたシーケンシングの一部として
、標識化デオキシヌクレオチドを非標識化ジデオキシヌクレオチドと一緒に用い
ることもできる。

【００７３】リボヌクレオチドは、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＴＴＰおよびＣＴＰから選択され得る
が、しかしこれらに限定されない。さらに、あので合成される増殖中の核酸分子
にポリメラーゼにより混入され得るリボヌクレオチドと定義されるリボヌクレオ
チドの誘導体も本発明により用いられ得る。このような誘導体は、放射性リボヌ
クレオチド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰまたはＣＴＰ）あるいは、例えばFITC、Cy
5、Cy5.5，Cy7、テキサスレッドまたはその他の染料で標識されるリボヌクレオ
チド（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰまたはＣＴＰ）であり得るが、これらに限定され
ない。

【００７４】増幅、伸張またはシーケンシングのためのタンパク質複合体の使用中、それは
、ピロホスファターゼが反応中または反応混合物中に存在する場合に有益である
ことが立証され得る。本発明の熱安定性in vitro複合体を含有する反応混合物本発明のさらなる目的物質は、本発明のin vitro複合体を含有する反応混合物
である。少なくとも１つまたはいくつかの前記の特性または活性を有する１つま
たはいくつかの伸張タンパク質を反応混合物が付加的に含有するための準備が成
され得る。このような付加的伸張タンパク質は、有益には、熱安定性ポリメラー
ゼである。このような反応混合物は、既知の熱安定性ポリメラーゼを用いた場合
と比較して、連続移動性を増大させる。

【００７５】本発明のin vitro複合体のタンパク質の遺伝子の同定、遺伝子のクローニング
、これらの発現および精製好ましくは完全にまたは部分的に組換えタンパク質から成る複合体は、通常は
、以下の工程により調製され得る：所望のタンパク質をコードする核酸断片の調
製、発現ベクターへの結紮、宿主中での形質転換、タンパク質の発現および精製
（図２５）。本発明にしたがって、遺伝子特に古細菌からの遺伝子は最初に除去
され得るインテインを含有し得る（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 Jun. 15,
89（12）:5577-5581, Intervening sequences in an Archaea DNA polymerase
gene, Perler FB, Comb DG, Jack WE, Moran LS, Qiang B, Kucera RB, Benner
J. Slatko BE, Nwankwo DO, Hempstead SK, et al）。

【００７６】本発明の複合体に適したさらに別の遺伝子および／またはタンパク質は、例え
ば、原核生物からのゲノムを含有するデータベースでの相同探索により同定され
得る。このための適切なプログラムとしては、例えばプログラムBLAST、BLASTP
およびFASTAが挙げられるが、これらに限定されない（Altschul, Stephen F., T
homas L., Madden, Alejandro A. Snaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb
Miller and David J. Lipman（1997）, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new g
eneration of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25:338
9-3402, W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS（1988）85:2444-2448）。

【００７７】それらは、例えば原核生物または真核生物からの全ゲノムバンク中の適切な遺
伝子をスクリーニングするためにＤＮＡプローブを用いることによっても同定さ
れ得る。このために必要な実験方法は、Maniatis et al.（Molecular Cloning（
2nd edition, 3 volume set）:A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, N.Y.（1989））またはAusubel et al.（Current Protocols in M
olecular Biology, John Wiley and Sons（1988））に見出され得る。

【００７８】本発明の複合体が構成されるタンパク質に関する遺伝子の精製核酸は、例えば
、関連生物体のゲノムバンクからそれを単離することにより、または所望により
、所望の遺伝子セクションに特異的なプライマーの助けを借りてＰＣＲによる増
幅と各々併用される合成ＤＮＡ調製により提供され得る。標準方法は、Maniatis
et al.（Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labor
atory Press, N.Y.（1989））に記載されている。

【００７９】本発明のin vitro複合体のタンパク質の遺伝子は、多数の方法を用いてクロー
ン化され、したがって、発現ベクターにより宿主生物中でのタンパク質発現のた
めに利用可能にされ得る。標準方法は、Maniatis et al.（Molecular Cloning:A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.（1989））
に記載されている。この点については、複合体の遺伝子は、例えば先ず高コピー
ベクター、例えばpUC18、pBstまたはBR322中でクローン化され、その後にのみ、
原核生物発現ベクター、例えばpTrc99、pQE30、pQE31またはpQE32中で再クロー
ン化されるか、あるいは原核生物またはウイルス発現ベクター中で直接クローン
化され得る。この点についてベクターは、別の核酸分子を異なる生物または遺伝
的背景に、またはその間に運搬し得る核酸と理解される。原則的に、それらは自
律的に複製し得るか、および／または操作可能的連結核酸分子を発現し得る（発
現ベクター）。操作可能的に連結されるとは、本明細書中で用いる場合、運搬さ
れた核酸分子が、ベクターの発現制御配列の転写および翻訳制御下にあり、宿主
細胞中で発現され得る様な方法でベクターに連結されることを意味する。細菌お
よびウイルス発現系、それらの好ましい適用、ならびにベクター系の選択は、例
えばGene Expression Technology,（Meth, Enzymol. vol. 185, Goeddel Ed., A
cademic Press, N.Y.（1990））に記載されている。本発明のための適切なベク
ターは、それらが１つまたはすべての以下の特性を有するという事実のために、
異なる強度でタンパク質を発現させる必要がある：（１）タンパク質の開始に直
接隣接するかまたは融合タンパク質としてのプロモーターまたは転写開始部位、
（２）オペレーターが遺伝し発現をオンまたはオフに切り換Ｌために用いられ得
る、（３）翻訳改良のためのリボソーム結合部位、ならびに（４）転写の安定性
改良をもたらす転写または翻訳に関する終結部位。

【００８０】真核生物細胞と、好ましくは脊椎動物細胞と適合性である発現ベクターも用い
られ得る。いくつかの既知のベクターは、pSVLおよびpKSV-10（Pharmacia）、pB
PV-1/pML2d（International Biotechnologies, Inc.）、pAcHLT-ABC（Pharminge
n）およびpTDT1（ATCC 31255）である。レトロウイルス発現ベクターを用いるこ
ともできる。

【００８１】それゆえ、本発明のさらなる目的物質は、本発明の熱安定性in vitro複合体お
よび適切なベクター、好ましくは発現ベクターをコードするＤＮＡ配列である。本発明のベクターは、滑りクランプタンパク質のための少なくとも１つの遺伝
子、ならびにカップリングタンパク質のための少なくとも１つの遺伝子または滑
りクランプローダー１および／または２のための少なくとも１つの遺伝子または
伸張タンパク質のための少なくとも１つの遺伝子を含有する。一実施態様では、
ベクターは、前記の種々の遺伝子のいくつか、例えば伸張タンパク質および滑り
クランプタンパク質のための遺伝子を同時に含有する。

【００８２】本発明の範囲内では、ベクターはさらに別の適切な制限切断部位および任意に
、すでに底に含入されているＤＮＡ配列の他に、さらなるＤＮＡ配列の挿入のた
めのポリリンカーを含有するのが好ましい。すでに存在するＤＮＡ配列の空間的
配列および付加的挿入部位が発現後に融合タンパク質の形成をもたらすのが、特
に好ましい。

【００８３】本発明のベクターがプロモーターおよび／またはオペレーター領域を含有する
のがさらに好ましく、このようなプロモーターおよび／またはオペレーター領域
が誘導可能性または抑制性であるのが特に好ましい。これは、宿主細胞中での発
現の制御をかなり簡単にし、そして特に効率よくさせ得る。このようなタンパク質／オペレーター領域は、１つの発現ベクター中で数回生
じ、これが、１つだけの発現ベクターを用いていくつかのＤＮＡ配列を別々に発
現させ得る。

【００８４】本発明のさらに別の目的物質は、１つまたはいくつかの本発明のベクター（単
数または複数）を含有する宿主細胞であって、この場合、タンパク質を生成する
ための発現が適切な条件下でこの宿主中で起こり得る。適切な条件としては、例
えばレプレッサー、インデューサーまたはデレプレッサーの存在が挙げられる。形質転換、ファージ感染および細胞培養に関する標準プロトコールは、 Mania
tis et al.（Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbor La
boratory Press, N.Y.）に記載されている。形質転換に適した多数の利用可能な
大腸菌株の中でも、以下のものが好ましい：JM101（ATCC No.33876）、XL1（Str
atagene）、RR1（ATCC No.31343）、M15[prep4]（QIAGEN）およびBL21（Pharmac
ia）。タンパク質発現は、例えば大腸菌INVαF'株（Invitrogen）の助けを借り
ても起こり得る。形質転換体は、宿主株に適した増殖条件下で培養される。した
がって、ほとんどの大腸菌株は、例えば対数または定常増殖相に達するまで、30
℃〜42℃でＬＢ培地中で培養される。タンパク質は、形質転換化培養から精製さ
れ、これは、遠心分離後の細胞ペレットから、または培養液からであり得る。タ
ンパク質が細胞ペレットから精製される場合には、細胞は適切な緩衝液中に再懸
濁されて、超音波処理、酵素処理または凍結解氷により破裂される。それらが融
合タンパク質を含有するかまたは含有しない培養懸濁液から精製される場合には
、既知の手法、例えば遠心分離により細胞から上清が分離される。

【００８５】本発明の複合体のタンパク質は、培養溶液の上清から、または細胞抽出物から
、既知の分離または精製法により分離および精製され得る。これらの方法は、例
えば、塩沈降および溶媒沈降のような溶解度に基づいた方法、透析、限外濾過、
ゲル濾過およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動といった分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、
逆相ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のような疎水性の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィー（実施例６、７、図２４および図２５）
のような特定の親和性を利用する方法、ならびに等電点電気泳動のような等電点
の差を利用する方法である。本発明の目的を満たす補助複合体の遺伝子を保有す
る生物から、または組換え宿主生物、例えば大腸菌から細胞抽出物が作製され得
る、ということも考えられる。これらの抽出物が用いられる場合、他の精製工程
を省くことができる。

【００８６】前記の方法は、in vitro複合体のタンパク質を調製するために、多数の組合せ
で用いられ得る。核酸の伸張本発明の熱安定性in vitro複合体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（実施例
３、４および図２１、図２２）、ＤＮＡシーケンシングのために核酸を伸張する
ために、核酸を標識するために、ならびに核酸のin vitro合成を包含するその他
の反応のために用いられ得る。

【００８７】それゆえ、本発明のさらに別の目的は、核酸の鋳型依存性伸張方法であって、
必要な場合に核酸が変性され、ハイブリダイゼーション条件下で少なくとも１つ
のプライマーを提供され、プライマーが鋳型鎖の所望の核酸配列のフランキング
領域と十分に相補的であり、そしてプライマー伸張がポリメラーゼの助けを借り
てヌクレオチドの存在下で実行され、本発明の熱安定性in vitro複合体がポリメ
ラーゼとして用いられる方法である。

【００８８】伸張が、鋳型核酸とハイブリダイズされたプライマーにより開始され、伸張の
ための自由３’−ＯＨ末端を提供する核酸の鋳型依存性伸張のための方法は、当
業者には既知である。特に、ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応は、増幅のために実行
される。逆転写本発明の熱安定性in vitro複合体は、本発明の複合体それ自体が逆転写酵素活
性を有するか、あるいは熱安定性in vitro複合体それ自体が逆転写酵素活性を有
するか否かに関係なく逆転写酵素活性を有する適切な酵素がさらに付加される逆
転写のためにも用いられ得る。

【００８９】伸張タンパク質それ自体が逆転写酵素活性を有する本発明の熱安定性in vitro
複合体は、本発明により選択されるＤＮＡへのＲＮＡの逆転写のためにも用いら
れ得る。この逆転写酵素活性は、伸張タンパク質の単なるポリメラーゼ活性であ
り得るが、しかしそれは、既存の５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性に加えても
存在し得る。本発明により選択されるin vitro複合体の一実施態様は、EP-A 0 8
34 569に開示されているような生物体Carboxydothermus bydrogenoformansから
の伸張タンパク質を含有する。

【００９０】シーケンシング本発明のin vitro複合体のさらに好ましい使用は、Sangerの方法にしたがって
核酸をシーケンシングすることである。シーケンシングされる核酸の一部と十分
に相補的である少なくとも１つのプライマーを用いて開始して、鋳型依存性伸張
が実行される。ＲＮＡをシーケンシングする場合、逆転写を実行する必要がある
。この好ましい実施態様の範囲では、前記のそれぞれの誘導体は、デオキシヌク
レオチドまたはジデオキシヌクレオチドとして適しているとも考えられる。特に
、生成される核酸が標識されることが、核酸伸張の本発明の方法のためには好ま
しい。このために、標識化プライマーおよび／または標識化デオキシヌクレオチ
ドおよび／または標識化ジデオキシヌクレオチドおよび／または標識化リボヌク
レオチド、あるいは例えばすでに前記したようなもののようなこれらの各々の適
切な誘導体を用い得る。

【００９１】核酸の標識本発明のさらに別の目的は、例えば核酸鎖のホスホジエステル結合に個々の切
れ目を挿入し、切れ目の部位のヌクレオチドをポリメラーゼの助けを借りて標識
化ヌクレオチドに置き換えることによる核酸の標識方法であって、本発明の熱安
定性in vitro複合体がポリメラーゼとして用いられる方法である。

【００９２】好ましい方法は、一般的にニックトランスレーションと呼ばれる方法であって
、これは核酸の簡単な標識を可能にする。標識化リボヌクレオチドまたはデオキ
シリボヌクレオチドまたはすでに前記したようなそれらの誘導体はすべて、この
ために適しているが、但し、ポリメラーゼはそれらを基質として受容する。標識は、前記の意味では、ＰＣＲ反応の一部として起こり、それにより、この
場合は標識化ヌクレオチドまたはそれらの誘導体が核酸配列に組み入れられる標
識でもある。

【００９３】本発明はさらに、核酸の伸張および／または増幅および／または逆転写および
／またはシーケンシングのためのキットであって、１つまたはいくつかの容器を
含有し得るキットに関する。キットそれ自体は、以下の：ａ）本発明の熱安定性in vitro複合体、あるいはｂ）熱安定性in vitro複合体および任意に、それとは別個に、ポリメラーゼ活
性を有する伸張タンパク質、および任意に、プライマー、緩衝物質、ヌクレオチ
ド、ＡＴＰ、その他の補因子およびピロホスファターゼから成る群から選択され
る１つまたはいくつかの構成成分を包含する。

【００９４】この場合、本発明の熱安定性in vitro複合体は、その個々の構成成分の形態で
、即ちある容器中では分離されるかまたは併合され、そして後々までこういうも
のとして生じるわけではない熱安定性滑りクランプタンパク質および熱安定性伸
張タンパク質として前記のキット中に存在する。特に、本発明の目的は、デオキシヌクレオチドまたはそれらの誘導体を付加的
に含有する核酸の伸張、増幅、逆転写、標識およびシーケンシングのためのキッ
トである。

【００９５】本発明のキットは、特に基質としてリボヌクレオチドを受容する伸張タンパク
質が用いられる場合には、任意に、リボヌクレオチドまたはそれらの誘導体も含
有し得る。本発明のキットの好ましい実施態様は、デオキシヌクレオチドおよびそれらの
誘導体の他に、鎖終結のためのジデオキシヌクレオチドまたはそれらの誘導体を
含有する核酸をシーケンシングするためのキットである。

【００９６】さらに、本発明の目的は、特に、本発明の複合体それ自体が逆転写酵素活性を
有するか、あるいは逆転写酵素活性を有する適切な酵素が付加的に存在し、デオ
キシヌクレオチドまたはそれらの誘導体が反応混合物中に存在し得る核酸の逆転
写のためのキットである。さらに特に好ましい実施態様では、キットはプライマーおよび／またはデオキ
シヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌク
レオチドおよび／または標識化形態でのそれらのそれぞれの誘導体を含有する。

【００９７】特に核酸をシーケンシングする場合には、標識を挿入する必要がある。適切な
標識は、実例の形態ですでに前記されている。適切な標識剤は、本発明のキット
の好ましい実施態様に含まれる。本発明の範囲内では、さらに、キット（本明細書中では試薬キットとも呼ばれ
る）は、核酸を標識するために用いられ得る。この場合、試薬キットは、構成成
分）またはｂ）および標識化ヌクレオチドを含有するが、この場合、緩衝物質、
ＡＴＰまたはその他の補因子および／またはピロホスファターゼも存在し得る。

【００９８】前記のような適切な緩衝剤を含有するキットが特に好ましい。本発明のキット
が付加的にピロホスファターゼ、ＡＴＰおよび／またはその他の補因子を含有す
るのも好ましい。本発明のさらに別の目的は、核酸の伸張、増幅、標識およびシーケンシングま
たは逆転写のためのin vitro方法における熱安定性滑りクランプタンパク質の使
用である。

【００９９】本発明の熱安定性in vitro複合体は、熱安定性伸張タンパク質単独の使用と比
較して、エラー率（不正確ヌクレオチドの組入れ）の全体的低減を達成するため
に短いならびに長いヌクレオチド断片を用いてシーケンシング、増幅、逆転写な
どの目的のために用いられ得る。好ましい代替法では、熱安定性in vitro複合体は長い核酸断片のシーケンシン
グ、増幅および逆転写のために用いられる。

【０１００】さらに好ましい代替法では、熱安定性in vitro複合体は、二次構造を構成する
核酸断片のシーケンシング、増幅および逆転写のために用いられる。以下の実施例は、図面とともに、本発明をさらに明らかにし、利点を説明する
よう意図される。図面：遺伝子バンクおよびＥＭＢＬデータベースにおけるタンパク質または核酸配列
を指す配列名が、以下においてしばしば用いられる。それらを以下に示す。

【０１０１】図面の詳細な説明図１：図１は、本発明の熱安定性in vitro複合体のタンパク質配列名、ならびに古細
菌間、および古細菌と対応するヒト遺伝子間の対合アラインメントおよび多重ア
ラインメントからの値の表である。これに関しては、注釈^"1"は、BLAST 2.0.4[1
998年2月24日]を用いて対合アラインメント（図参照）から算出される対応する
ヒト遺伝子に対する同一性パーセンテージ（％）を表し、注釈^"2"は、BLAST 2.0
.4[1998年2月24日]を用いて対合アラインメント（図参照）から算出されるArcha
eoglobus fulgidusの対応する遺伝子に対する同一性パーセンテージ（％）を表
し、そして注釈^"3"は、FASTA 3.1t02[1998年3月]を用いて対合アラインメント（
図参照）から算出される対応するヒト遺伝子に対する同一性パーセンテージを表
す。本方法は、Altschul, Stephen F. Thomas L. mADDEN, Alejandro A. Schaff
er, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller and David J. Lipman（1977）,
"Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein detabase searc
h programs, Nucleic Acids Res.25:3389-3402およびW.R. Pearson & D.J. Lipm
an Proc. Natl. Acad. Sci.（1988）85:2444-2448により詳細に記載されている
。図１は、データベースからの配列名、ならびに滑りクランプローダー１、滑り
クランプローダー２、滑りクランプ、カップリングタンパク質および伸張タンパ
ク質１に関する配列番号を示し、括弧内の値は各々、アミノ酸数についての同一
性パーセンテージを示す。伸張タンパク質２の場合、値はArchaeoglobus fulgid
us配列に対する配列同一性パーセンテージを示す。この場合、データベースから
の配列名および配列番号も示されている。

【０１０２】図２：図２は、複製装置の真正細菌からのタンパク質配列、対合アラインメントおよ
び多重アラインメントを示す。注釈¹は、 BLAST P 2.0.4[1998年2月24日]#を用
いて対合アラインメント（図参照）から算出される大腸菌からの対応する遺伝子
に対する同一性パーセンテージ（％）を表す。本方法は、Altschul, Stephen F. Thomas L. mADDEN, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, We
bb Miller and David J. Lipman（1977）, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a ne
w generation of protein detabase search programs, Nucleic Acids Res. 25
:3389-3402により詳細に記載されている。

【０１０３】図３：図３は、滑りクランプがカップリングタンパク質により伸張タンパク質と結合
する本発明の熱安定性in vitro複合体の考え得る形態のスケッチを示す。図４：図４は、滑りクランプタンパク質の２つの保存領域のアラインメント、ならび
にそれから得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：ヒトPC
NA（配列番号１１からの）、ならびにArchaeoglobus fulgidus（配列番号１２か
ら）、Methanococcus jannaschii（配列番号１３から）、Pyrococcus horikosch
ii（配列番号１４から）およびMethanobacterium thermoautotrophicus（配列番
号１５から）からの対応する配列。

【０１０４】図５：図５は、カップリングタンパク質の保存領域のアラインメント、およびそれか
ら得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：PfuORF2、DPD2
HUMAN、AF1790およびMJ0702。配列番号は、図１から採用され得る。図６：図６は、カップリングサブユニットの保存領域のアラインメントおよびそれか
ら得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：AC11 HUMAN、AF
2060、MTH0241、PHBN012およびMJ1422。配列番号は、図１から採用され得る。

【０１０５】図７：図７は、滑りクランプローダー２の保存領域のアラインメント、およびそれか
ら得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：AC15 HUMAN、 M
J0884、AF1195、MTH0240およびMTH0240。配列番号は、図１から採用され得る。図８：図８は、伸張タンパク質１の保存領域のアラインメントおよびそれから得られ
るコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：DPOD HUMAN、 MJ0885、M
TH0208、PHBT047およびDPOL ARCFU。配列番号は、図１から採用され得る。

【０１０６】図９：図９は、伸張タンパク質２の保存領域のアラインメントおよびそれから得られ
るコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：AF1722、MJ1630、PfuORF
3、MTH1536およびPHBN021。配列番号は、図１から採用され得る。図１０：図１０は、真正細菌からの伸張タンパク質の保存領域のアラインメントおよび
それから得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：DP3A ECO
LI:DNAPol III、αサブユニット、大腸菌BB0579; DNA Pol III、αサブユニット
、Borrelia burgdorferi、DP3A HELPY:DNA Pol III、αサブユニット、Helicoba
cter pylori AA50: Aquifes aeolicus、セクション50およびDP3A SALTY: DNA Po
l III、αサブユニット、Salmonella typhimurium。

【０１０７】図１１：図１１は、真正細菌からの滑りクランプの保存領域のアラインメントおよびそ
れから得られるコンセンサス配列を示す。以下の遺伝子が示される：AAPOL3B、D
P3B ECOLI、S.TYPHIM、DP3B PROM1、DP3B PSEPUおよびDP3B STRCO（AAPOL3B: Aq
uifes aeolicus、セクション93: DP3B ECOLI:DNA Pol III、β鎖、大腸菌S.TYPH
IM: DNA Pol III、β鎖、Salmonella typhimurium P3B PROMI: DNA Pol III、β
鎖Proteus mirabilis DP3B PSEPU:DNA Pol III、β鎖、Pseudomonas putida DP3
B STRCO: DNA Pol III、β鎖、Streptomyces coelicolor）。

【０１０８】図１２：図１２は、ＨＭＭを生成するための滑りクランプタンパク質配列の多重アライ
ンメントを示す。図１３：図１３は、ＨＭＭを生成するための真正細菌滑りクランプタンパク質配列の
多重アラインメントを示す（AAPOL3B: Aquifes aeolicus、セクション93: DP3B
ECOLI:DNA Pol III、β鎖、大腸菌S.TYPHIM: DNA Pol III、β鎖、Salmonella t
yphimurium P3B PROMI: DNA Pol III、β鎖Proteus mirabilis DP3B PSEPU:DNA
Pol III、β鎖、Pseudomonas putida DP3B STRCO: DNA Pol III、β鎖、Strepto
myces coelicolor）。

【０１０９】図１４：図１４は、ＨＭＭを生成するための滑りクランプローダー１タンパク質配列の
多重アラインメントを示す。図１５：図１５は、ＨＭＭを生成するための滑りクランプローダー２タンパク質配列の
多重アラインメントを示す。

【０１１０】図１６：図１６は、ＨＭＭを生成するためのカップリングタンパク質のタンパク質配列
の多重アラインメントを示す。図１７：図１７は、隠蔽Markovモデルを生成するための伸張タンパク質１の配列の多重
アラインメントを示す。

【０１１１】図１８：図１８は、隠蔽Markovモデルを生成するための伸張タンパク質２の配列の多重
アラインメントを示す。図１９：図１９は、ＨＭＭを生成するための真正細菌伸張タンパク質の配列の多重アラ
インメントを示す。以下の配列が示される：DP3A ECOLI:DNAPol III、αサブユ
ニット、大腸菌BB0579; DNA Pol III、αサブユニット、Borrelia burgdorferi
、DP3A HELPY:DNA Pol III、αサブユニット、Helicobacter pylori AA50: Aqui
fes aeolicus、セクション50およびDP3A SALTY: DNA Pol III、αサブユニット
、Salmonella typhimurium。

【０１１２】図２０：（実施例２）図２０は、組換え体Archaeoglobus fulgidus PCNA（AF 0335）のクロマトグラ
フィー分析を示す：組換え体Archaeoglobus fulgidus PCNA（AF 0335）は、自然条件下では三量体
として存在する。図２０Ａは、尿素を用いずに実行したクロマトグラフィーの分
画１５（レーン１）、１７（レーン２）、１９（レーン３）、２１（レーン４）
、２３（レーン５）、２５（レーン６）中のHisタグ（ヒスチジンタグ）を有す
るタンパク質を示す。図２０Ｂは、尿素の存在下で実行した変性クロマトグラフ
ィーの分画１０（レーン１）、１１（レーン２）、１２（レーン３）、１３（レ
ーン４）、１４（レーン５）、１５（レーン６）、１６（レーン７）、１７（レ
ーン８）中のHisタグを有するタンパク質を示す。

【０１１３】図２１：（実施例３）図２１は、本発明の熱安定性in vitro複合体の一構成成分として伸張タンパク
質を用いたＰＣＲの結果を示す。１μl（レーン４）、2.5μl（レーン５）および5μl（レーン６）Pyrococcus
horikoshiiＤＮＡポリメラーゼ（PH1947;粗製抽出物、図２５参照）を各々、１
単位のＴａｑポリメラーゼ（レーン２）および１μlのArchaeoglobus fulgidus
ＤＮＡポリメラーゼ（AF 0497）粗製抽出物（図２５参照）（レーン３）ととも
に活性比較のための標準ＰＣＲ反応に別々に用いた。レーン１はＤＮＡサイズマ
ーカー（New England Biolabs; １kbＤＮＡラダーおよび100 bpＤＮＡラダーの
混合物）を示す。

【０１１４】図２２：（実施例４）図２２は、本発明の熱安定性in vitro複合体の一構成成分として伸張タンパク
質を用いたＰＣＲの結果を示す。Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼAF
0497を用いたＰＣＲの試料は、種々の回数のサイクル（Ｚ）後に採取し、１ｘ
ＴＡＥ緩衝液（40 mMトリスアセテート；20 mM酢酸ナトリウム；10 mMＥＤＴＡ
；ｐＨ7.2）中の１％アガロースゲル上で10 v/cmで分離した。レーン２：16Ｚ；
レーン３：21Ｚ；レーン４：26Ｚ；レーン５；28Ｚ；レーン６：30Ｚ；レーン７
：32Ｚ；レーン８：34Ｚ；レーン９：36Ｚ；レーン１０：38Ｚ；レーン１１：40
Ｚ；レーン１はＤＮＡサイズマーカー（New England Biolabs; １kbＤＮＡラダ
ーと100 bpＤＮＡラダーの混合物）を示す。上部セクションは、Ｔａｑポリメラ
ーゼの反応生成物を示す。下部セクションはArchaeoglobus fulgidusＤＮＡポリ
メラーゼAF 0497の反応生成物を示す。

【０１１５】図２３：（実施例５）図２３は、滑りクランプタンパク質を用いた場合と用いなかった場合の伸張タ
ンパク質の活性の比較を示す。試料１は、酵素無含有混合物を示す。試料２〜１
２は、組換え体Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼ（初期濃度7.5μg/
μl）の分画の1:1000稀釈液各々３μlを付加的に含有した。試料３〜７および８
〜１２は、 Archaeoglobus fulgidusＰＣＮＡからの組換え体滑りクランプタン
パク質の分画0.5、1、2、4および8μlを付加的に含有した。ＡＩＤＡを用いて強
度を評価した：バックグラウンドレーン１の強度：46.4；レーン２＝258.5；レ
ーン３＝164.4；レーン４＝122.8；レーン５＝162.1；レーン６＝297.4；レーン
７＝359.5。

【０１１６】図２４：（実施例６）図２４は、滑りクランプタンパク質の精製結果を示す。レーン１は、分子量基
準（BIO RADカタログ番号161-0317）を示す。レーン２に関しては、500μlの細
菌を誘導直前に沈澱させて、NuPageゲル（NOVEX;図２５）を操作するためにメー
カーの使用説明書にしたがってそれらを処理し、適用した。レーン３は、溶離後
16時間の同量の細菌を示す。レーン４および５は各々、透析後のＮｉ−ＮＴＡア
ガロースカラムの8μｌの２つの溶出液を示す。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiage
n）上での精製により、生物体Archaeoglobus fulgidusの滑りクランプタンパク
質の高精製分画を得た（レーン４および５参照）。

【０１１７】図２５：（実施例７）図２５は、Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼの発現および精製を示
す（実施例７も参照）。レーン１は、分子量基準（BIO RADカタログ番号161-0317）を示す。レーン２
に関しては、500μlの細菌を誘導直前に沈澱させて、NuPageゲルを操作するため
にメーカーの使用説明書にしたがってそれらを処理し、適用した。レーン３は、
溶離後16時間の同量の細菌を示す。レーン４および５は各々、透析後のＮｉ−Ｎ
ＴＡアガロースカラムの8μｌの２つの溶出液を示す。レーン６は、8 mlの透析
粗製抽出物を示す。レーン４および５は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース上での精製に
より得られたArchaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼの高精製分画を示す。

【０１１８】図２６：（実施例８）図２６は、ＰＣＲに本発明のin vitro複合体を用いた結果を示す。レーン１は
滑りクランプの使用を伴わないＰＣＲ反応を示し、一方、レーン２は滑りクラン
プタンパク質を用いたＰＣＲ反応の結果を示す。図２７：（実施例９）図２７は、本明細書中でＹ２Ｈ実験と呼ばれる酵母の２つのハイブリッド実験
の結果を示し、この場合、転写活性化ドメインが発現されるように、空pGAD424
ベクター（Clontech, Palo Alto, USA）を保有する細胞を列Ａに置き、Sacharom
yces cerevesiae遺伝子CDC48が転写活性化ドメインを有する融合タンパク質とし
て発現されるpGAD424ベクターを保有する細胞を列Ｂに置き、そして列Ｃは、Arc
haeoglobus fulgidusからの滑りクランプ遺伝子が転写活性化ドメインを有する
融合タンパク質として発現されるpGAD424ベクターを保有する細胞を含有し、列
Ｄは、細胞を含有せず、そして列Ｅは、Archaeoglobus fulgidusからの伸張タン
パク質遺伝子が転写活性化ドメインを有する融合タンパク質として発現されるpG
AD424ベクターを保有する細胞を含有する。

【０１１９】カラム１は、ＤＮＡ結合ドメインが発現されるように空pGBT9ベクター（Clont
ech, Palo Alto, USA）を保有する細胞を提供され、カラム２は、Sacharomyces
cerevesiae遺伝子UFD3がＤＮＡ結合ドメインを有する融合タンパク質として発現
されるpGBT9ベクターを保有する細胞を提供され、カラム３は、Archaeoglobus f
ulgidusからの滑りクランプタンパク質がＤＮＡ結合ドメインを有する融合タン
パク質として発現されるpGBT9ベクターを保有する細胞を提供され、カラム４は
、Archaeoglobus fulgidusからのカップリングタンパク質がＤＮＡ結合ドメイン
を有する融合タンパク質として発現されるpGBT9ベクターを保有する細胞を提供
され、そしてカラム５は、Archaeoglobus fulgidusからの伸張タンパク質がＤＮ
Ａ結合ドメインを有する融合タンパク質として発現されるpGBT9ベクターを保有
する細胞を提供される。

【０１２０】図２８：（実施例１０）図２８は、本発明の熱安定性in vitro複合体を用いたヒトコラーゲン遺伝子の
ＰＣＲ増幅結果を示す。予測される増幅体は、両方の場合に、約1 kbのサイズを
有する。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２は滑りクランプを含有しな
い本発明の伸張タンパク質を用いた増幅の結果を示し、そしてレーン３は本発明
の熱安定性in vitro複合体を用いた増幅の結果を示す。

【０１２１】

【実施例】

以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はそれらに限定
されない。実施例１：既知の方法により、生物体Archaeoglobus fulgidus（DSM No.4304）からＤＮ
Ａを精製する。生物体は、ＤＳＭ（「Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen
」）により培養した。発現ベクターpTrc99およびpQE30中で適切な遺伝子（滑り
クランプローダー１および２、滑りクランプ、伸張タンパク質１および２、カッ
プリングサブユニット）をクローン化するために、停止コドンを含めた完全オー
プンリーディングフレームに及ぶ各遺伝子のためにプライマーを開発した。プラ
イマー配列は、付加的にのみ、pTRC99中でのクローニングのための開始コドンを
含有する。pQE30中でのクローニングのための対応するプライマーは、最初の遺
伝子特異的配列として開始コドン直後にヌクレオチドを含有する。発現ベクター
中での指令されたクローニングを促す制限末端をプライマーに付加する。適切な
アニーリング温度で約200 ngの全ゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲ反応（約35サイ
クル）を実行し、その結果生じた生成物を精製する。精製後、生成物を制限酵素
で処理して、結紮用にそれらを調製するためにアガロースゲル上で精製する。前
記のＰＣＲからの本発明のin vitro複合体の遺伝子の増幅体との結紮の準備が成
されるような方法で、制限酵素により発現ベクターを線状化し、精製し、稀釈す
る。結紮を生じさせて、インキュベーション後、アリコートを大腸菌INValphaF'
（Invitrogen）またはXL1 blueまたはM15[prep4]株の１つで形質転換させる。少
なくとも３つの陽性コロニーを各遺伝子から採取して、プラスミドＤＮＡを調製
し、ＤＮＡシーケンシングにより完全性および正確性に関して挿入物を検査する
。的確なクローンを選択し、単離のために再び寒天プレート上に載せる（アンピ
シリン、アンピシリンおよびカナマイシン）。コロニーを採取して、一夜培養を
調製する。一夜培養のアリコート（500μl）を、ＬＢ（アンピシリン：80 mg/l
またはM15[prep4]株用に付加的に25μl/mlカナマイシン）の１〜５リットル培養
に付加する。培養を37℃で0.8のＯＤ₆₆₀に増殖させる。ＩＰＴＧ（125 mg/l）を
インキュベーションのために付加する。これらの培養を、ここでさらに4〜21時
間増殖させる。培養を遠心分離し、ベクターpQE30により発現される組換えタン
パク質から開始して、QIAexpressionist（第三版、QIAGEN）からのプロトコール
８および１１にしたがって抽出し、精製する。代替的精製プロトコールでは、ペ
レットを緩衝液（緩衝液Ａ：50 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.9、50 mMデキストロ
ース、1 mMＥＤＴＡ）中に取る。遠心分離後、細胞を再び取るが、ここで、緩衝
液Ａはリゾチーム（4 mg/ml）を付加的に含有する。インキュベーション（15分
）後、同一容量の緩衝液Ｂ（Ｂ：10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.9）、50 mMＫＣ
ｌ、1 mMＥＤＴＡ、1 mMＰＭＳＦ、0.5％トゥイーン20、0.5％Nonidet P40）を
付加し、75℃で1時間インキュベートすることにより溶解する。遠心分離後、上
清を除去し、（ＮＨ₄）ＳＯ₄により過剰発現タンパク質を沈澱させる。遠心分離
後にペレットをプールし、タンパク質を緩衝液Ａ中に再懸濁する。再懸濁タンパ
ク質を保存緩衝液（50 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.9）、50 mMＫＣｌ、0.1 mMＥ
ＤＴＡ、1 mMＤＴＴ、0.5 mMＰＭＳＦ、0.5％グリセロール）に対して透析し、
その後+4℃〜-70℃で保存する。

【０１２２】タンパク質の活性を調べるために、以下のように反応を生じさせる。タンパク
質のアリコートを異なる形状およびモル濃度で併合する。滑りクランプ、カップ
リングサブユニットおよび伸張タンパク質を有する滑りクランプローダー１、２
、あるいは滑りクランプを有し、カップリングサブユニットと伸張タンパク質２
を有する場合と有さない場合、または滑りクランプと伸張タンパク質１または２
を有する、そして最後に伸張タンパク質１または２のみを有する滑りクランプロ
ーダー１、２。前記の保存緩衝液は、緩衝液として役立った。ＤＮＡ重合化活性
は、（メチル−³Ｈ）ＴＴＰを三塩素三不溶性物質中に混入することにより、ま
たはジゴキシゲニンｄＵＴＰを非標識化ＤＮＡ二本鎖領域に自由内部３‘末端を
組み入れることにより測定する（Ishino, Y., Iwasaki, H., Fukui, H., Mineno
, J., Kato, I., & Schinigawa, H.（1992）Biochemie 74, 131-136）。連続移
動性を確定するために、前記のタンパク質混合物をプライマー伸張実験に用いる
。普遍プライマー（New England Biolabs）（5'-FITC標識化）と一緒に、Ｍ１３
一本鎖鋳型を10 mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ9.4）に付加し、加熱（92℃）して、冷
却（室温）する。このように生成された鋳型プライマー混合物の連続稀釈液を、
ヌクレオチド（約200μM〜1mM）、反応緩衝液（最終濃度50 mMＫＣｌ、10 mMト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ8.3）、1.5〜5 mMＭｇＣｌ₂）、ＡＴＰ（0 mM〜200 mM）お
よびタンパク質安定剤から成る反応物に付加し、37℃、52℃、62℃、68℃、74℃
および78℃で10分間インキュベートする。アリコートを、分析用自動シーケンサ
ー（例えば、Alf, Pharmacia Biotech）に載せる。あるいは、適切な反応条件下
で自由内部３’末端を有する二本鎖領域へのヌクレオチドの組入れの刺激を検出
することにより、Maga G., Jonssom Z.O., Stucki, M., Spadari, S. and Hubsc
her U.（J. Mol. Biol. 1999, 285, 259-267, Dual Mode of Interaction of DN
A synthesis）にしたがって、連続移動性の増大を定量的に分析し得る（図２３
参照）。前記のタンパク質混合物は、Kohler et al.（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88:7958-7962（1991））またはChase et al.（J. Biol. Chem., 249:4545-4
552（1972））に記載された方法を用いて忠実度およびエキソヌクレアーゼ活性
を測定するのに役立つ。タンパク質混合物は、ＰＣＲにも用いられる（図２６、
Methods in Molecular Biology, vol. 15, Humana Press Totowa, New Jersey,
1993, edited by Bruce A. White）。

【０１２３】実施例２：ＰＣＮＡの三量体化以下の実験で、組換え体Archaeoglobus fulgidusＰＣＮＡタンパク質（AF 033
5）は自然条件下では三量体として存在し、したがってクランプ形成に適した構
造を採り得る、ということを示す。図２０Ａに示した実験に関しては、ＰＣＮＡの350μlのＮｉ−ＮＴＡアガロー
ス溶離液（図２４参照）および150μlの粗製ＤＮＡポリメラーゼ分画（図２５参
照）を、グリセロールを含有しない保存緩衝液を用いて１mlとし（図２５参照）
、メーカーの使用説明書にしたがって、セファデックスx200ＨＲ（Pharmacia）
ＦＰＬＣカラム上で同一緩衝液中のそれらの分子量により、タンパク質を分離し
た。全実行中に１ml分画を収集した。図２０Ｂに示した実験に関しては、同量の
同一タンパク質分画を、8 M尿素を含有し、グリセロールを含有しない保存緩衝
液中で１mlとし、95℃で10分間変性させ、その後図２０Ａに示したのと同一緩衝
液中で分子量によりタンパク質を分離した。その後、8μlの各分画をNuPage Bis
-トリスゲル（NOVEX;図２５参照）上で分離し、メーカーの使用説明書にしたが
ってニトロセルロース膜上でのブロットモジュール（NOVEX）によりブロットし
た。RGS His抗体（QIAGEN）および核酸用のDIG発光検出キット（Boehringer Man
nheim）を用いて、メーカーの使用説明書にしたがって、Ｈｉｓタグを有するタ
ンパク質を検出した。図２０Ａは、尿素を用いずに実行したクロマトグラフィー
における分画１５（レーン１）、１７（レーン２）、１９（レーン３）、２１（
レーン４）、２３（レーン５）、２５（レーン６）中のHisタグを有するタンパ
ク質を示す。図２０Ｂは、尿素の存在下で実行したクロマトグラフィーにおける
分画１０（レーン１）、１１（レーン２）、１２（レーン３）、１３（レーン４
）、１４（レーン５）、１５（レーン６）、１６（レーン７）、１７（レーン８
）中のHisタグを有するタンパク質を示す。Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリ
メラーゼ（AF0497）は、Ｍｒ＝90 kDaの算出分子量を有する。Archaeoglobus fu
lgidusＤＮＡポリメラーゼ（AF0335）は、Ｍｒ＝27 kDaの算出分子量を有する。
Archaeoglobus fulgidusＰＣＮＡ（AF0335）が真核生物からの相同タンパク質の
ようなホモ三量体として存在する場合には、ネイティブ因子は、したがって、Ｍ
ｒ＝81 kDaという理論分子量を有する。図２０Ａに示した結果は、ネイティブＰ
ＣＮＡが組換え体タンパク質に関するＤＮＡポリメラーゼと同様の分子量を有す
るということによりこの仮定を確証する。ゲル濾過カラムからの同一分画中で、
ネイティブ条件下で、両タンパク質は溶離する（図２０Ａ、レーン１〜３）。ほ
とんどのＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼピークよりやや遅れて用リシ、多少小
さいサイズの推定三量体（90 kDaに比して81 kDa）と相関する。図２０Ｂに示し
たデータは、タンパク質／タンパク質相互作用を可能にしない変性条件下では、
低分子量のモノマーに対応するＤＮＡポリメラーゼ（図２０Ｂ、レーン１〜７）
よりかなり遅れてＰＣＮＡはカラムから溶離するため、この観察がＰＣＮＡのオ
リゴマー化に基づくことを立証する。

【０１２４】実施例３：本発明のin vitro複合体を生成するための伸張タンパク質（Pyroco
ccus horikoshiiＤＮＡポリメラーゼ（PH1947））の単離、調製および使用 Pyrococcus horikoshiiからの伸張タンパク質（Pyrococcus horikoshiiＤＮＡ
ポリメラーゼ（PH1947））をＰＣＲ反応に用いて、特定のＤＮＡ生成物の有効な
増幅を誘導する。

【０１２５】１μl（レーン４）、2.5μl（レーン５）および5μl（レーン６）のPyrococcu
s horikoshiiＤＮＡポリメラーゼ（PH1947;粗製抽出物、図２５参照）を各々、
１単位のＴａｑポリメラーゼ（レーン２）および１μlのArchaeoglobus fulgidu
sＤＮＡポリメラーゼ（AF 0497）粗製抽出物（図２５参照）（レーン３）ととも
に活性比較のための標準ＰＣＲ反応に別々に用いた。レーン１はＤＮＡサイズマ
ーカー（New England Biolabs; １kbＤＮＡ分子量サイズマーカーおよび100 bp
ＤＮＡ分子量サイズマーカーの混合物）を示す。酵素の他に、各反応物は、反応
物当たり50μlの全容量中に、5 ngの鋳型ＤＮＡ（ＰＣＲ2.1でクローン化荒れる
アダプターを有する421 bp Rsa 1断片）（Kaiser C., v. Stein O., Laux G., H
offmann M., Electrophoresis 1999; 20:261-268, Functional Genomics in Can
cer Research; Identification of target genes of the Epstein-Barr virus n
uclear antigen 2 by subtractive cDNA cloning and high throughput differe
ntial screening using high-density agarose gel）、各々0.2 mMのｄＡＴＰ、
ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、各々1.5μMの特定のアダプタープライマー
（Kaiser et al.（1999））、50 mMのＫＣｌ、2 mMのＭｇＣｌ₂、10 mMのトリス
ＨＣｌ（Ｔａｑ反応用、ｐＨ8.3；Archaeoglobus fulgidusおよびPyrococcus ho
rikoshiiポリメラーゼ反応用、ｐＨ7.5）を含有した。95℃で30秒、55℃で30秒
および68℃で120秒から成るサイクルを30回、試料に施した。その後、5μlの反
応物を取り出し、１ｘＴＡＥ緩衝液（40 mMトリス酢酸塩、20 mM酢酸ナトリウム
、10 mMＥＤＴＡ、ｐＨ7.2）中の１％アガロースゲル上で10 V/cmで分離した。

【０１２６】実施例４：伸張タンパク質の使用 Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼAF 0497は、Ｔａｑポリメラーゼ
と同様に有効にＰＣＲ生成物を生成し得る。１単位のＴａｑポリメラーゼおよび
1μlのArchaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼAF0497粗製抽出物（図２５参
照）を標準ＰＣＲ反応で別々に用いて、活性を比較した。用いたＰＣＲの試料は
、種々の回数のサイクル（Ｚ）後に採取し、酵素の他に、各反応物は、20 ngのM
13MP18 ssDNA、各々0.2 mMのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、各
々1.5μMの以下のヌクレオチド配列を有するプライマー： GGATTGACCGTAATGGGATAGGTTACGTT（配列番号４７）または AGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG（配列番号４８）を、反応物につき50μlの全容量中の50 mMＫＣｌ、2 mMＭｇＣｌ₂、10 mMトリス
ＨＣｌ（Ｔａｑ反応用、ｐＨ8.3；Archaeoglobus fulgidusポリメラーゼ反応用
、ｐＨ7.5）中に含有した。95℃で30秒、59℃で30秒および68℃で60秒から成る
サイクルを、種々の回数、試料に施した。そのサイクル（Ｚ）を種々の回数施し
た後、5μlの混合物を取り出し、2ｘＴＡＥ緩衝液（40 mMトリス酢酸塩、20 mM
酢酸ナトリウム、10 mMＥＤＴＡ、ｐＨ7.2）中の１％アガロースゲル上で10 V/c
mで分離した（図２２参照）。

【０１２７】実施例５：本発明の熱安定性in vitro複合体の調製および使用本発明のin vitro複合体の以下の構成成分が特に、最終容量50μl中に存在し
た：10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.5、50 mMＫＣｌ、2 mMＭｇＣｌ₂、10μgＢＳ
Ａ（省くこともできる）、0.5 mMジゴキシゲニンｄＵＴＰ（ＤＩＧ−ｄＵＴＰ、
Boehringer Mannheim）、40μM、0.5μgのポリｄＡ／40 nMオリゴｄＴ（20mer）
ハイブリッド。試料１は伸張タンパク質を含有しない。試料２〜１２は、組換え
体Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼ（伸張タンパク質）の分画の1:10
00稀釈液各々３μlを付加的に含有した。試料３〜７および８〜１２は、 Archae
oglobus fulgidusＰＣＮＡからの組換え体滑りクランプタンパク質の分画0.5、1
、2、4および8μlを付加的に含有した。

【０１２８】試料を68℃で30分間インキュベートし、その後、３容量不のエタノール／3 M
酢酸ナトリウム、ｐＨ5.2（30/1）を用いて核酸を沈澱させた。沈殿物を100 mM
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ7.9）20μl中に再懸濁し、10μlアリコートを、ナイロン6
6 Biodyne B 0.45μm孔（Nalge Nunc）を含有する９６ウエルサイレントスクリ
ーンプレートの個々のウエルに滴下し、70℃で10分間、膜に核酸を固定した。核
酸用のＤＩＧ発光検出キット（Boehringer Mannheim）により、混入ジゴキシゲ
ニンｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を検出した。化学発光を検出するために
、次に、Ｘ線フィルムを30秒間膜の上に載せた。ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラー
ゼによるＤＩＧ−ｄＵＴＰの混入をかなり刺激した（レーン３〜７をレーン２と
比較）。用いたＰＣＮＡ分画は、内因性ポリメラーゼ活性を有さない（レーン８
〜１２）。

【０１２９】実施例６：Archaeoglobus fulgidusからの滑りクランプタンパク質の増幅、ク
ローニング、発現および精製 Archaeoglobus fulgidusからの本発明の滑りクランプタンパク質の増幅後、遺
伝子を発現ベクターpTrc99およびpQE30中でクローン化した。図２５で伸張タン
パク質（ＤＮＡポリメラーゼAF0497）に関して示したように、Archaeoglobus fu
lgidus滑りクランプタンパク質（ＰＣＮＡ（AF0335））の発現、精製およびゲル
電気泳動分離を実行した。

【０１３０】実施例７：伸張タンパク質の調製 Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼの発現および精製：伸張タンパク
質、Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼAF0497のための、的確な読取り
枠内に挿入された遺伝子を有するpQE30プラスミド（QIAGEN）を、QIAexpression
ist（第三版：QIAGEN）からの使用説明書にしたがって、コンピテント大腸菌M15
[prep4]中で形質転換した。１l培地に移し、タンパク質発現の誘導も、これらの
使用説明書に示された計画にしたがって実行した。16時間の誘導時間後、細菌を
5000gで10分間沈澱させた。 QIAexpressionist手法（第三版：QIAGEN、プロトコ
ール８、プロトコール１１）を用いて、高精製分画を得た。2 x 2ml溶離緩衝液
を用いて、そしてこれらの使用説明書には記載されていない4 x 0.5 ml溶離緩衝
液を用いて、結合タンパク質の溶離のみを実行した。組換え体タンパク質の粗製
抽出物を得るために、細菌沈殿物を代替的に100 ml緩衝液（50 mMトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ7.9、50 mMグルコース、１mMＥＤＴＡ）で洗浄し、再び遠心分離後、
それらを、4 mg/mlリゾチームを含有する緩衝液Ａ50ml中に再懸濁した。室温で1
5分後、50 mlの溶解緩衝液（10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.9、50 mMＫＣｌ、１m
MＥＤＴＡ、0.5％トゥイーン20、0.5％ＩＧＰＡＬ）を付加し、水浴中で75℃で6
0分間インキュベートすることにより、大腸菌タンパク質を変性させた。その後2
7,000gで15分間遠心分離後、絶えず撹拌しながら40 mgの結晶硫酸アンモニウム
／抽出物1 mlを徐々に付加することにより、上清を沈降させた。沈降タンパク質
を27,000gで15分間沈澱させ、沈殿物を20 mlの緩衝液Ａ中に再懸濁した。これら
の粗製抽出物、ならびにＮｉＮＴＡアガロースからの溶離分画を、少なくとも50
部／１容積保存緩衝液（10 mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7.9、50 mMＫＣｌ、１mMＥ
ＤＴＡ、50％グリセロール、1 mMジチオトレイトール、0.5 mMフッ化フェニルメ
チルスルホニル）に対して８時間、各々２回透析し、-20℃で保存した。得られ
た分画のタンパク質組成を分析するために、そのアリコートを、メーカーの使用
説明書にしたがってNuPage10％ビス−トリスゲル（NOVEX）上で電気泳動により
分離し、得られたタンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色した。レー
ン１は、分子量基準（BIO RADカタログ番号161-0317）を示す。レーン２に関し
ては、500μlの細菌を誘導直前に沈澱させて、NuPageゲルを操作するためにメー
カーの使用説明書にしたがってそれらを処理し、適用した。レーン３は、溶離後
16時間の同量の細菌を示す。レーン４および５は各々、透析後のＮｉ−ＮＴＡア
ガロースカラムの8μｌの２つの溶出液を示す。レーン６は、8 mlの透析粗製抽
出物を示す。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース上での精製によりArchaeoglobus fulgidus
ＤＮＡポリメラーゼの高精製分画を得る（レーン４および５）。しかしながら、
この酵素はすでに、粗製抽出物中の主ポリペプチドである。

【０１３１】実施例８：ＰＣＲにおける本発明のin vitro複合体の使用 Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼ（AF0497）を含有するＰＣＲ反応
におけるArchaeoglobus fulgidusＰＣＮＡ（AF0335）の使用は、ＰＣＮＡを含有
しないＰＣＲ反応に比して、特定のＤＮＡ生成物のより有効な増幅を生じる。Ａ
ＩＤＡ（Advanced Image Data Analyzer, ソフトウエアバージョンAIDA 2.1, Ra
ytest Company）によるＤＮＡの増幅量の評価は、バックグラウンド94、レーン
１に関する値104.9、レーン２に関する値は228.4を示す。レーン１および２に関
する値からバックグラウンドを差し引くと、レーン２は、その反応においてＰＣ
ＮＡによる連続移動刺激の12.3倍という結果を示す。

【０１３２】 0.3μlのArchaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼ（ AF497のタンパク質濃
度 7.5μg/μlの粗製抽出物。図２５参照）をＰＣＲ反応に別々に用いて、0μl
および0.01μlのArchaeoglobus fulgidusＰＣＮＡ（Ｎｉ−ＮＴＡ溶離液、図２
４）によるＰＣＲ活性の刺激を分析した。酵素および0.05μl（2.8μg）のArcha
eoglobus fulgidusからの滑りクランプタンパク質（増殖中の細胞画抗原ＰＣＮ
Ａと相同）の他に、各反応物は、ＰＣＲ（）により増幅された非精製ＰＣＮＡ遺
伝子断片、0.5μlのArchaeoglobus fulgidusポリメラーゼ、各々0.2 mMのｄＡＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、各々1.5μMの特定のプライマー（5'-A
CG CGC GGA TCC ATA GAC GTC ATA ATG ACC GG-3'（配列番号４９）；5'-TAC GGG
GTA CCC GAG CCA AAA TTG GGT AAA G-3'（配列番号５０））、50 mMＫＣｌ、2
mMＭｇＣｌ₂、10 mMトリスＨＣｌ（ｐＨ7.5）、ならびにBamHIおよびKpn I制限
部位に挿入されたArchaeoglobus fulgidusＰＣＮＡのコード配列を保有する50 n
gのpQE30プラスミドを、95℃で30秒、61℃で30秒および68℃で240秒から成るサ
イクルを40回実行する反応につき50μlの全容量中に含有し、各々0.2 mMのｄＡ
ＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、各々1.5μMの特定のプライマー（5'
-ACG CGC GGA TCC ATA GAC GTC ATA ATG ACC GG-3'（配列番号５１）；5'-TAC G
GG GTA CCC GAG CCA AAA TTG GGT AAA G-3'（配列番号５２））、50 mMＫＣｌ、
2 mMＭｇＣｌ₂、10 mMトリスＨＣｌ（ｐＨ7.5）を、50μl／反応の全容量中に含
有した。95℃で30秒、61℃で120秒および68℃で240秒から成るサイクルを40回、
試料に施した。その後、5μlの混合物を取り出し、１ｘＴＡＥ緩衝液（40 mMト
リス酢酸塩、20 mM酢酸ナトリウム、10 mMＥＤＴＡ、ｐＨ7.2）中の１％アガロ
ースゲル上で10 V/cmで分離した。

【０１３３】実施例９：Ｙ２Ｈ実験 Archaeoglobus fulgidusからの本発明の複合体のタンパク質の相互作用を、Ｙ
２Ｈ系を用いて実証した。その遺伝子産物が本発明の熱安定性in vitro複合体に
用いられるArchaeoglobus fulgidusからの遺伝子のコード領域をＰＣＲにより増
幅し、ベクターpGBT9（図２７の垂直カラム）およびpGAD424（図２７の水平カラ
ム）中でクローン化し、酵母PJ69-4a（pGAD424用）およびPJ69-4α（pGBT9用）
中でのギャップ修復によりハイブリッドタンパク質として発現させた。陽性対照
もＰＣＲにより増幅し、ベクターpGBT9（図２７の垂直カラム参照）およびpGAD4
24（図２７の水平カラム参照）中でクローン化し、酵母PJ69-4a（pGAD424用）お
よびPJ69-4α（pGBT9用）中でのギャップ修復によりハイブリッドタンパク質と
して発現させた。両ベクターを含有する二倍体細胞を、図２７に示したラスター
にしたがって対合により生成した。３つの別々のレポーター（IIIS3、ADE2およ
びMEL1）の発現を測定した。図２７は、ヒスチジンおよびアデニンを含有しない
培地上での増殖を示す。この実験で増殖する細胞は両ベクターを保有すものであ
り、この場合、さらに、これらの両ベクターの発現生成物は互いに結合する。レ
ポーター遺伝子の転写は、ヒスチジンおよびアデニン栄養要求性が廃止され、そ
してこれらの細胞が前記の培地中で増殖できるように、発現生成物の結合の結果
として開始される。

【０１３４】ここで陽性であったカラムはすべて、MEL1遺伝子の発現に関しても陽性であっ
た。Clontech Company（酵母菌プロトコールハンドブックPT3024-1）の指示にし
たがって、酵母菌２ハイブリッド（Ｙ２Ｈ）系を用いた。図２７は、陽性対照間
、伸張タンパク質と滑りクランプタンパク質、滑りクランプタンパク質と滑りク
ランプタンパク質、そしてカップリングタンパク質と滑りクランプタンパク質間
の結合を示す。

【０１３５】実施例１０：本発明の熱安定性in vitro複合体の使用本発明の熱安定性in vitro複合体は、ゲノムＤＮＡ断片の増幅のために非常に
良好に用いられ得る。少量の鋳型または伸張タンパク質を用いた場合でさえ、有
効な増幅が起きる。実施例１０では、ヒトコラーゲン遺伝子の切片を、本発明の
熱安定性in vitro複合体を用いて、そして伸張タンパク質単独も用いて、増幅し
た。50μlの全容量中に、以下のもの：0.5μlのヌクレオチドミックス（各ヌク
レオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴを包含する25 mM初期溶液）、0.2μlの各プライマ
ー（「コラーゲン前方」5'-TAA AGG GTC ACC GTG GCT TC-3'（配列番号５３）の
100 pmol/μl初期溶液、「コラーゲン逆」5'-CGA ACC ACA TTG GCA TCA TC-3'（
配列番号５４））、0.8μlのＤＮＡ（Boehringer Mannheimからの200 ng/μlヒ
トゲノムＤＮＡ）、5μlの10 xＰＣＲ緩衝液（ｐＨ7.5）（100 mMトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ7.5、500 mMＫＣｌ、15 mMＭｇＣｌ₂）、1μlの伸張タンパク質（AF 03
35，タンパク質濃度0.3μg/ml）を用い、ＰＣＲ機中で以下のサイクルを施した
：最初に、95℃で5分、次に95℃で30秒、59℃で30秒を30回、最後に68℃で6分。
図２８は、本発明の熱安定性in vitro複合体を用いる利点を明示する。

【０１３６】前記の説明および特許請求の範囲に開示される本発明の特徴は、その種々の実
施態様に置いて、本発明の実現のために別々に、ならびに組合せて重要であり得
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明のin vitro複合体のタンパク質配列名、ならびに古細菌間、お
よび古細菌と対応するヒト遺伝子間の対合アラインメントおよび多重アラインメ
ントからの値の表である。

【図２】図２は、図１と同様の表であるが、しかし大腸菌とA. aeolicusの滑りクラン
プタンパク質および伸張タンパク質に限定される。

【図３】図３は、本発明の熱安定性in vitro複合体の略図である。

【図４】図４は、滑りクランプタンパク質の２つの保存領域のアラインメントである。

【図５】図５は、カップリングタンパク質の保存領域のアラインメントである。

【図６】図６は、滑りクランプローダーの保存領域のアラインメントである。

【図７】図７は、滑りクランプローダー２の保存領域のアラインメントである。

【図８】図８は、伸張タンパク質１の保存領域のアラインメントである。

【図９】図９は、伸張タンパク質２の保存領域のアラインメントである。

【図１０】図１０は、真正細菌からの伸張タンパク質の保存領域のアラインメントである
。

【図１１】図１１は、真正細菌からの滑りクランプの保存領域のアラインメントである。

【図１２】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１３】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１４】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１５】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１６】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１７】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１８】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図１９】隠蔽Markovモデル（ＨＭＭ）の生成のための種々のタンパク質配列の多重アラ
インメントである。

【図２０】図２０は、組換え体滑りクランプ（Archaeoglobus fulgidus PCNA（AF 0335）
）のクロマトグラフィー分析を示す。

【図２１】熱安定性in vitro複合体の一構成成分として伸張タンパク質を用いたＰＣＲの
結果を示す。

【図２２】熱安定性in vitro複合体の一構成成分として伸張タンパク質を用いたＰＣＲの
結果を示す。

【図２３】図２３は、滑りクランプタンパク質を用いた場合と用いなかった場合の伸張タ
ンパク質の活性の比較である。

【図２４】図２４は、滑りクランプタンパク質の精製結果を示す。

【図２５】図２５は、Archaeoglobus fulgidusＤＮＡポリメラーゼの発現および精製を示
す。

【図２６】図２６は、ＰＣＲに本発明のin vitro複合体を用いた結果を示す。

【図２７】図２７は、Ｙ２Ｈ実験の結果である。

【図２８】図２８は、本発明の熱安定性in vitro複合体を用いたヒトコラーゲン遺伝子の
ＰＣＲ増幅結果である。

【図２９ａ】図１に示したタンパク質配列数に対応し、それぞれのデータベースから得られ
得る遺伝子の外観の表である。

【図２９ｂ】図１に示したタンパク質配列数に対応し、それぞれのデータベースから得られ
得る遺伝子の外観の表である。

【図３０ａ】本明細書中に記述した核酸配列データおよびアミノ酸配列データを得るために
用いられ得る英語での種々のデータベースに関するバックグラウンド情報の表で
ある。

【図３０ｂ】本明細書中に記述した核酸配列データおよびアミノ酸配列データを得るために
用いられ得る英語での種々のデータベースに関するバックグラウンド情報の表で
ある。

【図３０ｃ】本明細書中に記述した核酸配列データおよびアミノ酸配列データを得るために
用いられ得る英語での種々のデータベースに関するバックグラウンド情報の表で
ある。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年２月１６日（２００１．２．１６）

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図６

【補正方法】変更

【補正内容】

【図６】

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

【手続補正９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図９

【補正方法】変更

【補正内容】

【図９】

【手続補正１１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１０】

【手続補正１２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１１】

【手続補正１３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２０

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２０】

【手続補正１４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２３】

【手続補正１５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２５】

【手続補正１６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２９ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２９ａ】

【手続補正１７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２９ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２９ｂ】

【手続補正１８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３０ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３０ａ】

【手続補正１９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３０ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３０ｂ】

【手続補正２０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３０ｃ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３０ｃ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9/12 (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｃ１２Ｑ 1/68 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19）Ａ (Ｃ１２Ｎ 15/09 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:01） (31)優先権主張番号９９１１１７９５．３ (32)優先日平成11年６月18日(1999．6．18) (33)優先権主張国欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者フォス，ハルトムートドイツ連邦共和国，デー−69221 ドッシェンハイム，ビルケンベーク８アー (72)発明者メッケル，ゲルトドイツ連邦共和国，デー−68723 オフテルシャイム，ミューレンシュトラーセ 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA10 CA04 DA06 EA04 FA02 GA19 HA01 HA14 4B050 CC04 DD02 FF04 FF05 FF09 FF12 FF13 GG06 HH02 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR56 QR62 QS03 QS25 QS34 4B064 AG01 CA02 CA19 CC24 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA29 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】熱安定性滑りクランプタンパク質および熱安定性伸張タンパ
ク質を包含する核酸の鋳型依存性伸張のための熱安定性in vitro複合体。
【請求項２】前記滑りクランプタンパク質が伸張タンパク質に連結される
ことを特徴とする、請求項１記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項３】前記滑りクランプタンパク質が伸張タンパク質に直接連結さ
れることを特徴とする、請求項１記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項４】前記滑りクランプタンパク質および伸張タンパク質がカップ
リングタンパク質により連結されることを特徴とする、請求項１または２記載の
熱安定性in vitro複合体。
【請求項５】前記滑りクランプタンパク質および／または伸張タンパク質
が古細菌（Archaebacteria）から得られることを特徴とする、請求項１〜４のい
ずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項６】前記滑りクランプタンパク質が鋳型核酸鎖を全体的にまたは
部分的に取り囲む環様構造を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか
に記載熱安定性in vitro複合体。
【請求項７】前記滑りクランプタンパク質が以下の：配列番号３９： [GAVLIMPFW]-D-X-X-X-[GAVLIMPFW]-X-X-[GAVLIMPFW]-X-[GAVLIMPFW]-X-[GAVLIMP
FW]-X-X-X-X-F-X-X-Y-X-X-D および／または配列番号４０： [GAVLIMPFW]-X（3）-L-A-P-[KRHDE]-[GAVLIMPFW]-E のアミノ酸コンセンサス配列の一方または両方を含有することを特徴とする、請
求項１〜６のいずれかに記載熱安定性in vitro複合体。
【請求項８】前記滑りクランプタンパク質が、配列アラインメント中で少
なくとも100アミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）ＰＣＮＡアミノ酸配列（配
列番号１１）と少なくとも20％の配列同一性を有し、および／または滑りクラン
プタンパク質が、配列アラインメント中で少なくとも100アミノ酸長に亘って、
大腸菌からの細菌β−クランプ配列（真正細菌）（配列番号３５）と少なくとも
20％の配列同一性を有し、および／または滑りクランプタンパク質が、配列アラ
インメント中で少なくとも100アミノ酸長に亘って、Archaeoglobus fulgidusか
らのＰＣＮＡ相同体のアミノ酸配列（配列番号１２）と少なくとも20％の配列同
一性を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の熱安定性in v
itro複合体。
【請求項９】前記滑りクランプタンパク質が、図１２からのアラインメン
トから生成される隠蔽Markovモデルで少なくとも20のスコアを生じ、および／ま
たは滑りクランプタンパク質が、図１３からのアラインメントから生成される隠
蔽Markovモデルで少なくとも25のスコアを生じることを特徴とする、前記請求項
のいずれかに記載の熱安定性複合体。
【請求項１０】前記滑りクランプタンパク質がアルケオグロブス・フルジ
ダス（Archaeoglobus fulgidus）、メタノコッカス・ジャナスチイ（Methanococ
cus jannaschii）、ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoschii）、メタ
ノバクテリウム・サーモオートトロフィカス（Methanobacterium thermoautotro
phicus）、アクイフェックス・アエロリカス（Aquifex aeolicus）およびカルボ
キシドサーマス・ヒドロゲノフォーマス（Carboxydothermus hydrogenofhormans
）から成る群から選択される生物体から得られる滑りクランプタンパク質である
ことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１１】前記滑りクランプタンパク質がArchaeoglobus fulgidusか
らのAF 0335、Methanococcus jannaschiiからのMJ0247、Pyrococcus horikoschi
iからのPHLA008、Methanobacterium thermoautotrophicusからのMTH1312およびA
quifex aeolicusからのAE000761−７から成る群から選択されることを特徴とす
る、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１２】前記伸張タンパク質が５’−３’ポリメラーゼ活性および
／または逆転写酵素活性を有することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記
載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１３】前記伸張タンパク質が以下のコンセンサス配列およびこの
配列からの誘導体の少なくとも１つを４以下位置に含有することを特徴とする、
請求項１２記載の熱安定性in vitro複合体：配列番号４４： D-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-X-X-Y-N-X-X-X-F-D-X-P-Y-[GAVLIMPFW]-X-X-R-A 配列番号４５： A-[GAVLIMPFW]-R-T-A-[GAVLIMPFW]-A-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-T-E-G-[GAVLI
MPFW]-V-X-A-P-[GAVLIMPFW]-E-G-I-A-X-V-[KRHDE]-I 配列番号４６： [GAVLIMPFW]-P-V-G-[GAVLIMPFW]-G-R-G-S-X-[GAVLIMPFW]-G-S-[GAVLIMPFW]-V-
A-X-A-[GAVLIMPFW]-X-I-T-D-[GAVLIMPFW]-D-P-[GAVLIMPFW]-X-X-X-[GAVLIMPFW]-
L-F-E-R-F-L-N-P-E-R-[GAVLIMPFW]-S-M-P-D。
【請求項１４】前記伸張タンパク質が、配列アラインメント中で少なくと
も200アミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号２２）と
少なくとも20％の配列同一性を有し、および／または配列アラインメント中で少
なくとも400アミノ酸長に亘って、古細菌アミノ酸配列（配列番号２７）と少な
くとも25％の配列同一性を有し、および／または配列アラインメント中で少なく
とも300アミノ酸長に亘って、真正細菌アミノ酸配列（配列番号３７）と少なく
とも25％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１２記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１５】前記伸張タンパク質が、図１７からのアラインメントから
生成される隠蔽Markovモデルで少なくとも20のスコアを生じ、および／または伸
張タンパク質が、図１８からのアラインメントから生成される隠蔽Markovモデル
で少なくとも35のスコアを生じ、および／または伸張タンパク質が、図１９から
のアラインメントから生成される隠蔽Markovモデルで少なくとも20のスコアを生
じることを特徴とする、請求項１２記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１６】前記伸張タンパク質がArchaeoglobus fulgidus、Methanoc
occus jannaschii、Pyrococcus horikoschii、Methanobacterium thermoautotro
phicus、 Pyrococcus furiosusおよびCarboxydothermus hydrogenofhormansから
成る群から選択される生物体から得られる伸張タンパク質であることを特徴とす
る、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項１７】前記伸張タンパク質がArchaeoglobus fulgidusからのAF 0
497またはAF1722、Methanococcus jannaschiiからのMJ0885またはMJ1630、Pyroc
occus horikoschiiからのPHBT047またはPHBN021、Methanobacterium thermoauto
trophicusからのMTH1208またはMTH1536およびPyrococcus furiosusからのPFUORF
3から成る群から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の
熱安定性in vitro複合体。
【請求項１８】前記カップリングタンパク質が以下のコンセンサス配列を
含有し、４以下の位置でこの配列と異なることを特徴とする、前記請求項のいず
れかに記載の熱安定性in vitro複合体：配列番号４３： [FL]-[GAVLIMPFW]-X-X-[GAVLIMPFW]-X-G-X（13）-[GAVLIMPFW]-X-[YR]-[GAVLI
MPFW]-X-[GAVLIMPFW]-A-G-[DN]-[GAVLIMPFW]-[GAVLIMPFW]-[DS]。
【請求項１９】前記カップリングタンパク質が、配列アラインメント中で
少なくとも150アミノ酸長に亘って、ヒト（真核生物）アミノ酸配列（配列番号
１６）と少なくとも18％の配列同一性を有することを特徴とする、前記請求項の
いずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項２０】前記カップリングタンパク質が、図１６からのアラインメ
ントから生成される隠蔽Markovモデルで少なくとも10のスコアを生じることを特
徴とする、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項２１】前記カップリングタンパク質がArchaeoglobus fulgidus、
Methanococcus jannaschii、Pyrococcus horikoschii、Methanobacterium therm
oautotrophicus、Pyrococcus furiosusおよびCarboxydothermus hydrogenofhorm
ansから成る群から選択される生物体から得られるカップリングタンパク質であ
ることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項２２】前記カップリングタンパク質がArchaeoglobus fulgidusか
らのAF 1790、Methanococcus jannaschiiからのMJ0702、Pyrococcus horikoschi
iからのPHBN023、Methanobacterium thermoautotrophicusからのMTH1405およびP
yrococcus furiosusからのPFUORF2から成る群から選択されることを特徴とする
、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項２３】前記複合体が滑りクランプローダーとして作用するタンパ
ク質と会合することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in v
itro複合体。
【請求項２４】前記複合体がＡＴＰまたは別の補因子と会合して存在する
ことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体。
【請求項２５】請求項１〜２４のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合
体をコードすることを特徴とする組換えＤＮＡ配列。
【請求項２６】滑りクランプタンパク質およびカップリングタンパク質お
よび／または伸張タンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列を含有することを特
徴とするベクター。
【請求項２７】滑りクランプタンパク質および付加的ＤＮＡ配列の発現生
成物から成る融合タンパク質を生じる配置での付加的ＤＮＡ配列の挿入に適した
少なくとも１つの制限切断部位を有する少なくとも１つの付加的ＤＮＡ配列を付
加的に含有することを特徴とする、請求項２６記載のベクター。
【請求項２８】ＤＮＡ配列（単数または複数）の発現を制御するのに適し
たプロモーターおよび／またはオペレーター領域を含有することを特徴とする、
請求項２６または２７記載のベクター。
【請求項２９】いくつかのＤＮＡ配列の別々の発現のためのいくつかのプ
ロモーターおよび／またはオペレーター領域を含有することを特徴とする請求項
２８記載のベクター。
【請求項３０】抑制および／または誘導プロモーターおよび／またはオペ
レーター領域を含有することを特徴とする、請求項２６〜２９のいずれかに記載
のベクター。
【請求項３１】請求項２５に記載されるＤＮＡ配列を含有することを特徴
とする、請求項２６〜３０のいずれかに記載のベクター。
【請求項３２】請求項２６〜３１のいずれかに記載される１つまたはいく
つかのベクターで形質転換されることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３３】請求項２５に記載される適切な組換えＤＮＡ配列または請
求項２６〜３１のいずれかに記載される１つまたはいくつかのベクターが宿主細
胞中に導入され、タンパク質が発現されて、培地からまたは細胞溶解後に単離さ
れ、そして任意に複合体の他の構成成分に付加的に結合されることを特徴とする
、請求項１〜２４のいずれかに記載される熱安定性in vitro複合体の製造方法。
【請求項３４】必要な場合に核酸が変性され、ハイブリダイゼーション条
件下で少なくとも１つのプライマーを提供され、前記プライマーが鋳型鎖の所望
の核酸配列のフランキング領域と十分に相補的であり、そしてプライマー伸張が
ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼの助けを借りて実行される核酸の鋳型依存
性伸張のための方法であって、請求項１〜２４のいずれかに記載の熱安定性in v
itro複合体がポリメラーゼとして用いられる方法。
【請求項３５】所望の核酸配列およびデオキシヌクレオチドおよび／また
はその誘導体および／またはリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体の側面
に位置する２つのプライマーがＤＮＡ配列を増幅するために用いられることを特
徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】ポリメラーゼ連鎖反応が実行されることを特徴とする、請
求項３５記載の方法。
【請求項３７】その伸張タンパク質が逆転写酵素活性を有する請求項１〜
２４のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体が、ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写
のために用いられることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】 Sangerの方法にしたがって核酸をシーケンシングするため
に、デオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチドまたはそれらの誘導体
を用いて、シーケンシングされる核酸に隣接する領域と相補的であるプライマー
を用いて開始して、鋳型依存性伸張または逆転写が実行されることを特徴とする
、請求項３４〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】標識が核酸の伸張中に挿入されることを特徴とする、請求
項３４〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】標識化プライマーおよび／または標識化デオキシヌクレオ
チドおよび／またはその誘導体および／または標識化ジデオキシヌクレオチドお
よび／またはその誘導体および／または標識化リボヌクレオチドおよび／または
その誘導体が用いられることを特徴とする、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】核酸鎖のホスホジエステル結合に個々の切れ目を生成し、
切れ目の部位のヌクレオチドをポリメラーゼの助けを借りて標識化ヌクレオチド
に置き換えることによる核酸の標識方法であって、請求項１〜２４のいずれかに
記載の熱安定性in vitro複合体がポリメラーゼとして用いられることを特徴とす
る方法。
【請求項４２】核酸の伸張および／または増幅および／または逆転写およ
び／またはシーケンシングのための試薬キットであって、１つまたはいくつかの
容器中に、以下の：ａ）請求項１〜２４のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体、あるいはｂ）請求項１〜２４のいずれかに記載の熱安定性in vitro複合体および、それ
とは別個に、ポリメラーゼ活性を有する伸張タンパク質、および任意に、プライ
マー、緩衝物質、ヌクレオチド、ＡＴＰ、１つまたはいくつかのその他の補因子
および／またはピロホスファターゼを含有する試薬キット。
【請求項４３】５’−３’ポリメラーゼ活性を有する構成成分ａ）または
ｂ）の他に、核酸を増幅するためにデオキシヌクレオチドおよび／またはその誘
導体を含有することを特徴とする、請求項４２記載のキット。
【請求項４４】逆転写のために逆転写酵素活性を有する構成成分ａ）また
はｂ）、ならびにデオキシヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含有するこ
とを特徴とする、請求項４２記載のキット。
【請求項４５】デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび／ま
たはそれらの誘導体の他に、シーケンシングのためのジデオキシヌクレオチドお
よび／またはそれらの誘導体を含有することを特徴とする、請求項４２〜４４の
いずれかに記載のキット。
【請求項４６】プライマーおよび／またはデオキシヌクレオチドおよび／
またはジデオキシヌクレオチドを標識化形態で含有することを特徴とする、請求
項４２〜４５のいずれかに記載のキット。