CN112442493A

CN112442493A - 热稳定的逆转录酶

Info

Publication number: CN112442493A
Application number: CN201910818640.6A
Authority: CN
Inventors: 钟淑瑶; 章瑞程; 杜翔斐; 黄杏帆; 卢庆庆
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-03-05

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种热稳定的逆转录酶，所述逆转录酶连接有来源于耐高温嗜极生物的DNA结合蛋白，能够增加逆转录酶在热稳定性，并获得较高的持续合成能力和对模板的结合能力。

Description

热稳定的逆转录酶

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种热稳定的逆转录酶。

背景技术

逆转录酶，是依赖RNA为模板的DNA聚合酶的统称。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了逆转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。逆转录酶的发现对遗传工程技术起来到了巨大的推动作用，是研究真核或者原核生物目的基因，构建cDNA文库等实验不可或缺的工具，与Taq酶等共同构成了现代生物技术的基础工具酶。目前已经商品化的逆转录酶例如MMLV(molomey murine leukemia virus)由于扩增能力有限，一般获得的cDNA片段长度不超过6kb，不足以满足构建cDNA片段，同时该酶的热稳定性较差，50℃时半衰期很短，无法通过提高反应温度克服RNA的二级结构，因此当遇到有复杂结构的RNA时，逆转录酶就会从模板上掉下来，逆转录失败。如何通过基因工程的方法提高逆转录酶的逆转录活性，降低RNaseH活性，提高酶的热稳定性，已成为生物公司的研发热点之一。

现有技术中有很多研究通过对逆转录酶的改造，经过改造后，逆转录酶的反应温度虽然可以提高，但其半衰期仍然较短，且其热稳定性在某些情况下还是无法满足本领域的需求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明提供稳定化逆转录酶融合蛋白，具体涉及一种逆转录酶，所述逆转录酶的N端和/或C端连接DNA结合蛋白，所述DNA结合蛋白来源于最适生长温度75℃以上的嗜极生物。

本发明还提供了上述逆转录酶的制备方法与在处理核酸分子中的应用。

如本文所述，相比未融合DNA结合蛋白的逆转录酶，稳定化逆转录酶融合蛋白可具有一个或多个下述优点：(a)提高的热稳定性；(b)提高的cDNA合成速率；(c)灵敏度水平未降低。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的一个实施方式中，逆转录酶耐高温活性的检测比较结果；

图2为本发明的一个实施方式中，cDNA合成速率的检测比较结果；

图3为本发明的一个实施方式中，逆转录灵敏度的检测比较结果。

具体实施方式

发明人意外地发现逆转录酶通过融合最适生长温度75℃以上的嗜极生物的DNA结合蛋白，能够提高热稳定性、cDNA合成速率。

本发明涉及一种逆转录酶，所述逆转录酶的N端和/或C端连接有融合蛋白，所述融合蛋白来源于最适生长温度75℃以上的嗜极生物的DNA结合蛋白。

最适生长温度(OGT，optical growth temperature)75℃以上的嗜极生物多为超嗜热生物(Hyperthermophile)，如属优选的：Pyrolobus、Pyrodictium、Pyrobaculum、Methanopyrus、Pyrococcus、Sulfolobus、Archaeoglobus、Thermococcus、Methanocaldococcus；如种优选的，Methanocaldococcus jannaschii(OGT 80℃)、Archaeoglobus fulgidus(OGT 83℃)、Pyrococcus horikoshii(OGT 98℃)、Pyrococcusabyssi(OGT 95℃)、Pyrococcus furiosus(OGT 100℃)、Pyrolobus fumarii(OGT大于90℃)、Pyrodictium abyssi(OGT大于80℃)、Pyrobaculum aerophilum(OGT 100℃)、Saccharolobus solfataricus(OGT 80℃)、Saccharolobus shibatae(OGT 80℃)、Methanopyrus kandleri(OGT 103℃)、Thermococcus litoralis(OGT 85-88℃)、Thermococcus barophilus(OGT 85℃)、Thermococcus celer(OGT 88℃)、Thermococcuskodakarensis(OGT 85℃)等。

本发明所述的嗜极生物应理解为已明确种属的嗜极生物或未明确种属的嗜极生物宏基因组。OGT75℃以上的嗜极生物宏基因组多源于深海、热泉等热液喷口(hydrothermal vent)，热液喷口区温度达350℃左右。

在一些实施方式中，所述融合蛋白来源于选自Saccharolobus solfataricus、Pyrococcus furiosus、Thermococcus litoralis的DNA结合蛋白，以及来源于热液喷口宏基因组中的核酸序列所表达的DNA结合蛋白。

在一些实施方式中，所述融合蛋白独立的选自：

SEQ ID NO:1所示的Saccharolobus solfataricus的DNA结合蛋白；

SEQ ID NO:2所示的Pyrococcus furiosus的DNA结合蛋白；

SEQ ID NO:3所示的Thermococcus litoralis的DNA结合蛋白；以及

SEQ ID NO:4所示的来源于热液喷口宏基因组中的核酸所表达的DNA结合蛋白。

如果已知SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列中可以诱变哪个位置来提高热稳定性，那么适于产生突变或产生所需要的重组蛋白序列的任何方法均可应用。

此外，所述融合蛋白的氨基酸序列还可以与选自SEQ ID NO：1～4中的任一项的氨基酸序列具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，且保留DNA结合蛋白功能(例如保留解链酶活性)的序列；更进一步的，SEQ ID NO：1～4各自的突变蛋白依次来源于Saccharolobus solfataricus、Pyrococcus furiosus、Thermococcus litoralis以及热液喷口宏基因组。

在一些实施方式中，所述逆转录酶的N端和/或C端通过连接肽与融合蛋白连接。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能(例如蛋白定位、酶切位点等)的无意义多肽。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

在许多实施方案中，逆转录酶通过连接肽与上述的热稳定的融合蛋白连接。然而，逆转录酶和热稳定的融合蛋白也可相互直接融合。包含融合蛋白的多肽优选从N末端到C末端连接。然而，逆转录酶和热稳定的融合蛋白可按任一顺序连接在一起。例如，两个肽序列可从C端到N端连接或者从N端到C端连接。在一些实施方案中，连接肽包含在逆转录酶和热稳定的融合蛋白的连接C末端和N末端之间。

连接肽通常是柔性的，可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻，从而更有利于蛋白正确折叠。

在另外的实施方案中，连接肽是刚性接头肽；即相对非柔性肽接头。刚性连接肽不要求完全缺乏柔性，而是比柔性接头肽如富甘氨酸肽接头柔性少。由于其相对缺乏柔性，刚性连接肽降低通过刚性连接肽连接在一起的两个蛋白结构域(在当前情况下是稳定剂蛋白和热稳定逆转录酶)的运动。提供有序链(例如α螺旋结构)的连接肽可提供刚性接头肽。例如，精氨酸、亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸都显示出相对高的螺旋接头结构倾向。然而，包含许多脯氨酸残基的非螺旋接头也可表现显著的刚性。刚性连接肽的实例包括聚赖氨酸和聚-DL-丙氨酸聚赖氨酸。刚性肽接头的进一步描述由Wriggers等，Biopolymers，80，第736-46页(2005)提供。此外，刚性接头肽在由George等，Protein Engineering，15，第871-79页(2003)描述的接头数据库中描述。优选地，刚性连接肽也是非可切割接头肽，即非可切割刚性连接肽。

所述逆转录酶选自莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)逆转录酶，可以针对MMLV酶的野生型或突变型进行融合。

在一些实施方式中，所述逆转录酶包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：

Q19，Y64，R116，D124，H126，Y133，K152，T197，V223，L435，D524；

可用于替代Tyr的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn或Gln。可用于替代Arg的氨基酸包括Tyr、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、ILe、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Phe、Asn、或Gln。可用于替代Lys的氨基酸包括Tyr、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Glu的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Tyr、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Thr的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Tyr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Val的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Tyr、Leu、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、或Gln。可用于替代Leu的氨基酸包括Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Tyr、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn或Gln。可用于替代Asp的氨基酸包括Lys、Arg、His、Leu、Glu、Ala、Val、Tyr、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Asn或Gln。

可以通过众所周知的方法例如定点诱变来制备这些突变体。

在一些实施方式中，所述L435被精氨酸或赖氨酸所取代。

本发明发现，L435单个点只能将反应温度提高至50℃～55℃，但增加融合蛋白后可进一步增加其热稳定性。

在一些实施方式中，所述D524被天冬酰胺所取代。

D524突变后可获得更低的RNase H活性，可降低RNase H活性1000倍左右。

本发明的逆转录酶相比未连接DNA结合蛋白的逆转录酶有提高的热稳定性、提高的cDNA合成速率。

在一些实施方式中，所述逆转录酶在加热至65℃达30min后保留逆转录酶活性，其仍能够延伸≤10kb的模板。

在一些实施方式中，所述逆转录酶在加热至60℃达30min后保留逆转录酶活性，其仍能够延伸≤20kb的模板。

上述“保留逆转录酶活性”可以被理解为具有至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的逆转录酶活性，该百分比是与野生型在其最适转录温度条件下测得数据比较得到的。

在一些实施方式中，所述逆转录酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6～15中的任一项。

与序列5～8提供的融合蛋白“实质上相似”的稳定化逆转录酶融合蛋白氨基酸序列将分享至少85％同一性、更优选90％同一性和甚至更优选95％同一性，并仅包括保守区中的保守氨基酸置换。

“实质上相似”意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列共有至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少95％的同一性。此外，总的来说，仅描述或编码其中在保守区中作出仅保守置换的蛋白的序列实质上相似。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的独特活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。

根据本发明的一方面，本发明还涉及编码如上所述逆转录酶的核酸。

在一些实施方式中，所述逆转录酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:16～25中的任一项。

所述逆转录酶的氨基酸序列还可以与选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12的多核苷酸序列具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性或至少约98％同一性的序列。

根据本发明的一方面，本发明还涉及包含编码如上所述的逆转录酶的核酸的载体。

依据本发明，稳定化逆转录酶融合蛋白表达盒插入到载体中。载体优选质粒载体或腺病毒载体，但是亦可使用与启动子连接的线性DNA或其他载体，例如腺伴随病毒或修饰的痘苗病毒、逆转录病毒载体或慢病毒载体。特别优选使用大肠杆菌质粒载体。在一些实施方式中，所述载体为pTXB1。

根据本发明的一方面，本发明还涉及包含如上所述载体的宿主细胞。

重组宿主细胞可为原核的或真核的，在一些实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌或酵母等。哺乳动物细胞包括但不限于牛、猪、猴和啮齿动物来源的细胞系；和昆虫细胞包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞系。这样的重组宿主细胞可在合适条件下培养以生产稳定化逆转录酶融合蛋白。

根据本发明的一方面，本发明还涉及生产逆转录酶的方法，其包括：a)培养如上所述的宿主细胞；b)表达所述逆转录酶；并c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶。

根据本发明的一方面，本发明还涉及用于逆转录一种或多种第一核酸分子的方法，所述方法包括：a)将一种或多种核酸模板与如上所述的逆转录酶混合得到混合物；并b)在足以生成与所述一种或多种模板的整个或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下将a)的混合物保温。

本发明的逆转录酶可以用于从一种或多种模板制得核酸分子。此类方法可以包含将一种或多种核酸模板(例如DNA或RNA，如非编码RNA(ncRNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)分子)与本发明的逆转录酶中的一种或多种混合并且在足以制得与全部或一部分一种或多种核酸模板互补的一种或多种核酸分子的条件下培育混合物。

在一些实施方式中，所述核酸模板是mRNA；

在一些实施方式中，所述方法用于核酸分子测序；更进一步的，所述核酸模板为待测序核酸分子，所述混合物中还包括一种或多种引物以及一种或多种终止剂；更进一步的，所述方法还包括步骤c)：将反应产物中分子群的成员分开以测定待测序分子的整个或部分的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述保温的温度为55℃～65℃，例如56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃，或任意两个温度所组成的范围值。

所述保温的时间为5min～35min，例如6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、20min或25min。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于核酸分子的逆转录、扩增或测序的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的逆转录酶。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包含一种或多种核苷酸、一种或多种DNA聚合酶、一种或多种缓冲液、一种或多种引物、和一种或多种终止剂。

在一些实施方式中，所述终止剂是双脱氧核苷酸。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例

1.融合蛋白

以下述来源于OTG75℃以上的嗜极生物或嗜极生物宏基因组的DNA结合蛋白为例，以MMLV为例进行构建：

来源于Saccharolobus solfataricus的DNA结合蛋白Sso7d的氨基酸序列如SEQID NO:1所示；

来源于Pyrococcus furiosus的DNA结合蛋白Pfud的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

来源于Thermococcus litoralis的DNA结合蛋白Tlid的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

来源于hydrothermal vent metagenome宏基因组的DNA结合蛋白Ventd的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.逆转录酶与DNA结合蛋白的融合

在MMLV突变体(MMLV的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，突变位点L435K/D524N，突变后命名KNMMLV)的C端融合Sso7d获得KNMMLV-Sso7d(氨基酸序列为SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:16所示)；在MMLV突变体KNMMLV的N端融合Sso7d获得Sso7d-KNMMLV(氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:17所示)。

在MMLV突变体KNMMLV的C端融合Pfud，获得KNMMLV-Pfud(氨基酸序列为SEQ IDNO:8，核苷酸序列为SEQ ID NO:18)；在C端融合Pfud之间连接linker(GGGGSGGGGSGGGGS)，获得KNMMLV-L-Pfud(氨基酸序列为SEQ ID NO:9，核苷酸序列为SEQ ID NO:19)。

在MMLV突变体KNMMLV的C端融合Tlid，获得KNMMLV-Tlid(氨基酸序列为SEQ IDNO:10，核苷酸序列为SEQ ID NO:20)；在N端融合Tlid，获得Tlid-KNMMLV(氨基酸序列为SEQID NO:11，核苷酸序列为SEQ ID NO:21)。

在MMLV突变体KNMMLV的C端融合Ventd，获得KNMMLV-Ventd(氨基酸序列为SEQ IDNO:12，核苷酸序列为SEQ ID NO:22)，在C端融合Pfud之间连接linker(GGGGSGGGGSGGGGS)，获得KNMMLV-L-Ventd(氨基酸序列为SEQ ID NO:13，核苷酸序列为SEQ ID NO:23)。

在MMLV的C端融合Pfud，获得MMLV-Pfud(氨基酸序列为SEQ ID NO:14，核苷酸序列为SEQ ID NO:24)；

在MMLV的N端融合Tlid，获得Tlid-MMLV(氨基酸序列为SEQ ID NO:15，核苷酸序列为SEQ ID NO:25)。

2.融合蛋白的表达与纯化

(1)使用pTXB1作为表达载体，分别将以上克隆进行活化接菌，活化的条件为100μl种子菌接入到100ml LB培养基中，培养基加入100ug/ml的氨苄抗性，37℃，250rpm条件下培养4h后接菌；活化好的种子菌按1：100的条件接入到LB培养基中培养，培养条件为37℃，200rpm，培养至OD达到0.6～0.8开始诱导，加入1mM IPTG后进行诱导，诱导条件为37℃，2～4h后收菌，收菌条件为7000rpm，3min。

(2)菌体裂解：裂解buffer为50mM PB(pH7.0@25℃)，150mM NaCl，0.1％NP-40，裂解时补加1mM PMSF做为蛋白酶水解抑制剂，使用超声破碎，超生破碎后立即低温高速离心，离心条件为13500rpm，30min，取离心后的上清液。

(3)蛋白纯化：使用亲和层析纯化目的蛋白，纯化后的样品使用凝胶过滤层析置换至SP柱进行线性洗脱，跑SDS-PAGE后取纯度较高的目的蛋白进行合并透析，透析完成后放置-80℃储存。

3.逆转录酶活性的检测

(1)耐高温活性的检测：使用500bp、1kb、5kb的RNA为模板，分别在50℃、55℃、60℃、65℃，30min下发生逆转录反应，逆转录酶的使用量为100U。

结果如表1显示：融合了来源于耐高温嗜极生物或其宏基因组的DNA结合区域有助于提高MMLV的热稳定性，其中，示例性给出KNMMLV-Sso7d与KNMMLV胶图如图1所示。

表1耐高温活性的检测

注：+表示活性强弱，+个数越多活性越强，-表示无活性。

(2)cDNA合成速率的比较：以C端融合的KNMMLV酶为例，分别加入KNMMLV酶100U，使用10kb的RNA为模板进行逆转录反应，逆转录反应条件为50℃，30min，反应后的cDNA使用高保真酶KOD进行扩增，扩增后的产物分别进行琼脂糖凝胶进行检测，检测结果如图2所示。

结果显示：KNMMLV-Sso7d、KNMMLV-Pfud、KNMMLV-Tlid、KNMMLV-Ventd均比KNMMLV的cDNA合成速率要高，能够延伸10kb的模板，而KNMMLV不能够延伸10kb的模板。

(3)逆转录灵敏度的比较：以C端融合的KNMMLV酶为例，分别加入KNMMLV酶100U，使用HIV的RNA为模板，分别稀释至10²copy/μl～10⁵copy/μl后进行逆转录反应，逆转录反应条件为50℃，20min，反应后的cDNA使用Taq酶进行扩增，扩增后的产物分别进行琼脂糖凝胶进行检测。

结果如表2所示显示：KNMMLV能扩增10²copy/μl而KNMMLV-Sso7d也能扩增10²copy/μl(如图3所示)，KNMMLV-Pfud、KNMMLV-Tlid、KNMMLV-Ventd均与KNMMLV的灵敏度无明显差异，都能在10²copy/μl～10⁵copy/μl进行有效的扩增。

表2逆转录灵敏度的比较

蛋白名称	10<sup>2</sup>copy/μl	10<sup>3</sup>copy/μl	10<sup>4</sup>copy/μl	10<sup>5</sup>copy/μl
					KNMMLV	+	+	+	+
KNMMLV-Sso7d	+	+	+	+
					KNMMLV-Pfud	+	+	+	+
KNMMLV-Tlid	+	+	+	+
					KNMMLV-Ventd	+	+	+	+

注：+表示可检出。

其中，本发明所涉及的序列如下：

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:10

SEQ ID NO:11

SEQ ID NO:12

SEQ ID NO:13

SEQ ID NO:14

SEQ ID NO:15

SEQ ID NO:16

SEQ ID NO:17

SEQ ID NO:18

SEQ ID NO:19

SEQ ID NO:20

SEQ ID NO:21

SEQ ID NO:22

SEQ ID NO:23

SEQ ID NO:24

SEQ ID NO:25

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.逆转录酶，所述逆转录酶的N端和/或C端连接有融合蛋白，所述融合蛋白来源于最适生长温度75℃以上的嗜极生物的DNA结合蛋白。

2.根据权利要求1所述的逆转录酶，所述融合蛋白来源于选自下列属的微生物：Pyrolobus、Pyrodictium、Pyrobaculum、Methanopyrus、Pyrococcus、Sulfolobus、Archaeoglobus、Thermococcus以及Methanocaldococcus；

可选的，所述融合蛋白来源于选自下列的微生物：Methanocaldococcus jannaschii、Archaeoglobus fulgidus、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrococcusfuriosus、Pyrolobus fumarii、Pyrodictium abyssi、Pyrobaculum aerophilum、Saccharolobus solfataricus、Saccharolobus shibatae、Methanopyrus kandleri、Thermococcus litoralis、Thermococcus barophilus、Thermococcus celer以及Thermococcus kodakarensis；

可选的，所述融合蛋白来源于选自Saccharolobus solfataricus、Pyrococcusfuriosus、Thermococcus litoralis的DNA结合蛋白，以及来源于热液喷口宏基因组中的核酸序列所表达的DNA结合蛋白；

可选的，所述融合蛋白独立的选自：

SEQ ID NO:1所示的Saccharolobus solfataricus的DNA结合蛋白；

SEQ ID NO:2所示的Pyrococcus furiosus的DNA结合蛋白；

SEQ ID NO:3所示的Thermococcus litoralis的DNA结合蛋白；以及

SEQ ID NO:4所示的来源于热液喷口宏基因组中的核酸所表达的DNA结合蛋白；

或与选自SEQ ID NO：1～4所示的氨基酸中的任一项具有至少约80％同一性，并保留DNA结合蛋白功能的序列；且SEQ ID NO：1～4各自的突变依次来源于嗜酸热硫化叶菌、激烈火球菌、超级嗜热菌、热液喷口宏基因组；

可选的，所述逆转录酶的N端和/或C端通过连接肽与融合蛋白连接；

可选的，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；

可选的，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

3.根据权利要求1或2所述的逆转录酶，所述逆转录酶选自MMLV酶，

可选的，MMLV酶包含至少一个位于选自下组的氨基酸位置处的突变：

Q19，Y64，R116，D124，H126，Y133，K152，T197，V223，L435，D524；

可选的，所述L435被精氨酸或赖氨酸所取代；

可选的，所述D524被天冬酰胺所取代。

4.根据权利要求3所述的逆转录酶，所述逆转录酶相比未连接DNA结合蛋白的逆转录酶有提高的热稳定性、提高的cDNA合成速率；

可选的，所述逆转录酶在加热至65℃达30min后保留逆转录酶活性，其仍能够延伸≤10kb的模板；

可选的，所述逆转录酶在加热至60℃达30min后保留逆转录酶活性，其仍能够延伸≤20kb的模板；

可选的，所述逆转录酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO:6～15中的任一项。

5.编码权利要求1～4任一项所述逆转录酶的核酸；

可选的，所述逆转录酶的核苷酸序列选自SEQ ID NO:16～25中的任一项。

6.包含权利要求5所述核酸的载体；

可选的，所述载体为pTXB1。

7.包含权利要求6所述载体的宿主细胞。

8.生产逆转录酶的方法，其包括：a)培养权利要求7所述的宿主细胞；b)表达所述逆转录酶；并c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶。

9.用于逆转录一种或多种第一核酸分子的方法，所述方法包括：a)将一种或多种核酸模板与权利要求1～4任一项所述的逆转录酶混合得到混合物；并b)在足以生成与所述一种或多种模板的整个或部分互补的一种或多种第一核酸分子的条件下将a)的混合物保温；

可选的，所述核酸模板是mRNA；

可选的，所述方法用于核酸分子测序；更进一步的，所述核酸模板为待测序核酸分子，所述混合物中还包括一种或多种引物以及一种或多种终止剂；更进一步的，所述方法还包括步骤c)：将反应产物中分子群的成员分开以测定待测序分子的整个或部分的核苷酸序列；

可选的，所述保温为在55℃～65℃下保温5min～35min；

可选的，所述保温为在60℃～65℃下保温5min～35min。

10.用于核酸分子的逆转录、扩增或测序的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的逆转录酶；

可选的，所述试剂盒还包含一种或多种核苷酸、一种或多种DNA聚合酶、一种或多种缓冲液、一种或多种引物、和一种或多种终止剂；

可选的，所述终止剂是双脱氧核苷酸。