KR20090132644A - Ｄｎａ 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

유전자 공학용 시약으로서 유용한 고 충실도의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 이 폴리펩티드의 제조방법, 및 이 폴리펩티드를 이용한 핵산의 증폭방법.

DNA 폴리메라아제, 폴리펩티드, 서모코커스

Description

ＤＮＡ 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 {Polypeptides having DNA polymerase activity}

본 발명은 유전자 공학용 시약으로서 유용한 고 충실도 (fidelity)의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 이 폴리펩티드의 제조방법, 및 이 폴리펩티드를 이용한 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.

DNA 폴리메라아제는 유전자 공학용 시약으로서 유용한 효소로, DNA 염기서열 결정법, 표식화, 부위 특이적 변이도입법 등에 널리 이용되고 있다. 또한 최근에는 폴리메라아제 연쇄반응 (PCR)법의 개발에 의해, 내열성 DNA 폴리메라아제가 주목을 받고 있으며, PCR법에 적합한 각종 DNA 폴리메라아제가 개발되어 상품화되고 있다.

현재 알려져 있는 DNA 폴리메라아제는 이의 아미노산 서열의 공통성으로부터, 크게 4개의 패밀리로 분류될 수 있고, 그 중에서도 패밀리 A (폴 (pol) I형 효소)와 패밀리 B (α형 효소)가 대다수를 차지하고 있다. 각각의 패밀리에 속하는 DNA 폴리메라아제는 대체로 유사한 생화학적 특성을 갖지만, 상세히 비교하면 각각의 효소에 의해 기질 특이성, 기질 아날로그의 취입, 프라이머 신장성의 세기 및 속도, DNA 합성의 양식, 엑소뉴클레아제 활성의 부수, 온도, pH 등의 최적반응조건, 또한 저해제에 대한 감수성 등에 대하여 상이한 성질을 갖는다. 따라서, 지금까지 실험조작에 따라 각각 현존하는 것 중에서 가장 적합한 성질을 갖는 DNA 폴리메라아제가 선택되어 이용된다.

예를 들면, 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus (Pfu)) 유래 DNA 폴리메라아제 (예를 들면, 특허문헌 1∼5 참조)는 가장 내열성이 높은 DNA 폴리메라아제의 하나로, 교정 (proofreading) 활성으로서 알려져 있는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 내열성 효소 중에서도 높은 충실도를 나타낸다. 그러나, 이 효소는 신장속도가 느리고 프로세시버티 (processivity)가 낮기 때문에, PCR에 사용하면 증폭에 시간이 걸리고, 또한 장쇄는 증폭할 수 없다는 문제를 갖고 있다.

또한, 최근에는 KOD DNA 폴리메라아제로 불리우는 Pfu 유래 DNA 폴리메라아제보다 높은 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 신장속도가 높으며, 프로세시버티가 높은 폴리메라아제가 시판되고 있다. (예를 들면, 특허문헌 6∼7, 비특허문헌 1 참조). 이 효소를 사용하여 정확성이 높은 PCR을 단시간으로 행하는 것이 가능하지만, 강한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프라이머나 증폭 산물이 분해되기 때문에 반응조건 설정이 비교적 어렵고, 또한 장쇄의 증폭에는 적합하지 않다는 문제를 갖고 있다.

또한, KOD DNA 폴리메라아제를 개량한 2종의 효소도 개발되어 있다. 그 중 하나인 KOD-Plus-DNA 폴리메라아제는 KOD DNA 폴리메라아제에 2종류의 모노클로널 항체를 가해, 상온하에 있어서의 폴리메라아제 활성, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성 을 억제함으로써 특별한 조작없이 핫스타트 PCR이 가능해진다. 또한, 반응 버퍼 조성을 최적화함으로써, 높은 충실도를 그대로 유지하면서 KOD DNA 폴리메라아제보다도 증폭 효율이나 장쇄 길이의 DNA 합성능력이 향상된다 (예를 들면, 특허문헌 8). 그러나, 이 효소의 신장속도는 KOD DNA 폴리메라아제보다 상당히 낮고, Pfu 유래 DNA 폴리메라아제와 동등한 정도로 저하한다는 문제를 갖고 있다.

또한, KOD Dash DNA 폴리메라아제는 바니스 (Barnes) 등의 방법 (예를 들면, 특허문헌 9, 비특허문헌 2 참조)에 기초하여 작성된 혼합형 DNA 폴리메라아제로, KOD DNA 폴리메라아제와, 유전자 조작에 의해 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 결실시킨 개변형 KOD DNA 폴리메라아제를 최적 비율로 혼합함으로써, 증폭 효율, 신장성이 향상된다 (예를 들면, 특허문헌 10 참조). 신장속도도 KOD DNA 폴리메라아제와 마찬가지로 높다. 단, 충실도는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 상대적으로 감소하기 때문에, KOD DNA 폴리메라아제 단독에 비해 현저하게 저하한다는 문제를 갖고 있다.

특허문헌 1: 미국 특허 제5489523호 명세서

특허문헌 2: 미국 특허 제5545552호 명세서

특허문헌 3: 미국 특허 제5866395호 명세서

특허문헌 4: 미국 특허 제6489150호 명세서

특허문헌 5: 미국 특허 제5948663호 명세서

특허문헌 6: 미국 특허 제6054301호 명세서

특허문헌 7: 미국 특허 제6225065호 명세서

특허문헌 8: 미국 특허 출원 공개 제2002/0076768호 명세서

특허문헌 9: 미국 특허 제5436149호 명세서

특허문헌 10: 미국 특허 제6008025호 명세서

비특허문헌 1: Barnes W. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, No.6, p.2216-2220 (1994)

비특허문헌 2: Takagi M., et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 63, No. 11, p.4504-4510 (1997)

본 발명의 목적은 클로닝, 시퀀싱, 핵산 증폭 중 어느 것에 있어서도 유용한 충실도가 높은 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 이 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법 및 이 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 이용한 핵산의 증폭방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 예의연구한 결과, 초호열성 고세균인 서모코커스 (Thermococcus) 속으로부터 지금까지의 DNA 폴리메라아제에는 없는 우수한 성질을 갖는 신규한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 알아냈다. 또한, 이 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 클로닝하여, 이 폴리펩티드의 제조방법을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명에 의해, 클로닝, 시퀀싱, 핵산 증폭 중 어느 것에 있어서도 유용한 충실도가 높은 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 및 이 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용함으로써, 예를 들면 PCR에 있어서 많은 사이클수이어도 에러율이 적은 증폭 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 카피수가 적은 표적 핵산의 해석/동정에 있어서 유용하다.

즉, 본 발명의 제 1 발명은

(a) 서열표의 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열,

(b) 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는

(c) 서열표의 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가, 치환된 아미노산 서열을 갖고, 또한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 제 2 발명은 제 1 발명의 폴리펩티드를 코드하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명의 제 2 발명의 핵산은 서열표의 서열번호 15, 23 또는 31에 기재된 염기서열 또는 그의 일부를 갖는 핵산이어도 되고, 또한 이 핵산에 상보적인 염기서열로 이루어지는 핵산과 가혹한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로, DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산이어도 된다.

본 발명의 제 3 발명은 폴리펩티드를 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하는 공정 및 배양물로부터 이 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는

(a) 서열표의 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열,

(b) 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는

(c) 서열표의 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가, 치환된 아미노산 서열을 갖고, 또한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는다.

본 발명의 제 4 발명은 폴리펩티드를 사용하여 핵산을 증폭하는 공정을 포함하는 핵산의 증폭방법에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는

(a) 서열표의 서열번호 16에 기재된 아미노산 서열,

(b) 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는

(c) 서열표의 서열번호 32에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군 중에서 선택되는 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가, 치환된 아미노산 서열을 갖고, 또한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는다.

본 발명의 제 5 발명은 본 발명의 제 1 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제 6 발명은 본 발명의 제 1 발명의 폴리펩티드를 함유하는 키트에 관한 것이다.

본 발명의 제 7 발명은 본 발명의 제 1 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체에 관한 것이다.

본 발명에 의해, 클로닝, 시퀀싱, 핵산 증폭 중 어느 것에 있어서도 유용한 충실도가 높은 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 및 이 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법이 제공 된다. 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용함으로써, 예를 들면 PCR에 있어서 많은 사이클수이어도 에러율이 적은 증폭 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 카피수가 적은 표적 핵산의 해석/동정에 있어서 유용하다.

본 명세서에 있어서, DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드란, 4종류의 데옥시리보뉴클레오시드삼인산 (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)을 주형 DNA의 염기서열에 따라 취입하여, 주형 DNA에 상보적인 DNA쇄의 중합을 촉매하는 폴리펩티드를 말한다.

본 명세서에 있어서, 프라이머 신장에 적합하다는 것은 1본쇄의 주형 DNA에 프라이머가 어닐링한 복합체를 기질로 하여 프라이머로부터 DNA를 합성하는 능력에 있어서 우수하다는 것을 말하는 것으로, 예를 들면 1본쇄 DNA에 대한 친화성이 높은 것을 들 수 있다. 1본쇄 DNA에 대한 친화성이 높은 DNA 폴리메라아제는 핵산 증폭반응에 있어서 높은 감도를 나타내는 것을 기대할 수 있다. 즉, 카피수가 적은 주형 핵산으로부터의 핵산 증폭 반응에 있어서 유용하다. DNA 폴리메라아제의 1본쇄 DNA에 대한 친화성을 나타내는 지표로는 예를 들면, M13 파아지의 1본쇄 DNA에 대한 Km값을 들 수 있고, 이 Km값은 2.5 ㎍/ml 이하인 것이 바람직하고, 2.0 ㎍/ml 이하인 것이 보다 바람직하며, 1.5 ㎍/ml 이하인 것이 더욱 바람직하다.

본 명세서에 있어서, 충실도가 높다는 것은 DNA 폴리메라아제의 DNA 합성반응에서의 염기취입의 정확성이 높다는 것을 말한다. 이 측정방법으로는 쿤켈 (Kunkel)법 (J. Biol. Chem. 1985 May 10; 260(9):5787-96), 시퀀싱법, 클라인 (Cline) 등의 방법 (Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15; 24(18):3546-51) 등이 예시 된다. 그 중에서도 시퀀싱법이 가장 신뢰성이 높다. 본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 서머스 서모필러스 (Thermus thermophilus ) HB-8의 게놈 DNA를 주형으로 하여 각 DNA 폴리메라아제로 PCR을 행하여, 증폭 산물을 벡터 pUC118로 클로닝한 후, 얻어진 다수의 클론 중의 증폭 단편 약 500 bp에 관해서 이의 염기서열을 확인하고, 에러로 여겨지는 염기의 수를 확인하여, 전체의 시퀀싱 염기 수에 대한 에러의 염기 수의 %를 구해, 충실도의 평가를 행할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

(1) 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 Pfu 유래 DNA 폴리메라아제, KOD 유래 DNA 폴리메라아제와 비교하여 프라이머 신장에 적합하고, 또한 DNA 합성시의 정확성이 우수한 폴리펩티드이다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 대표적인 고 충실도의 내열성 DNA 폴리메라아제인 Pfu 유래 DNA 폴리메라아제의 파이로베스트 (Pyrobest) DNA 폴리메라아제 (Takara Bio Inc. 제), KOD DNA 폴리메라아제, KOD dash DNA 폴리메라아제 및 KOD plus DNA 폴리메라아제 (모두, Toyobo 제)와 비교하여, PCR법에 있어서 증폭할 수 있는 DNA의 쇄길이나 이의 반응의 충실도라는 관점에서 우수하다.

본 발명의 DNA 폴리메라아제의 이화학적 성질은 하기와 같다.

(i) 분자량: SDS-PAGE법에 의해 약 85 내지 90 kDa이다.

(ii) 최적온도: 75℃ 내지 85℃

(iii) 최적 pH: 5.5 내지 6.5 (75℃)

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 이화학적 성질을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 서모코커스 sp. KS-1 (이하, Tks라고 칭한다), 서모코커스 시쿨리 (siculi) (이하, Tsi라고 칭한다), 서모코커스 셀러 (celer) (이하, Tce라고 칭한다)로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 16, 24 또는 32에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지거나, 또는 이것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 동등물이어도 된다. 천연에 존재하는 폴리펩티드에는 그것을 코드하는 유전자의 다형이나 변이 외에, 생성 후의 폴리펩티드의 생체 내 및 정제 중의 변형 반응 등에 의해 이의 아미노산 서열 중에 아미노산의 결실, 삽입, 부가, 치환 등의 변이가 일어날 수 있지만, 그럼에도 불구하고 변이를 갖지 않은 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 생리학적 활성, 생물학적 활성을 나타내는 것이 알려져 있다. 이와 같이 구조적으로 차이가 있어도 이의 기능이나 활성에 관해서는 큰 차이가 인정되지 않은 기능적 동등물도 본 발명에 포함된다. 여기서, 변이된 아미노산의 수는 폴리펩티드가 실질적으로 동등한 생리학적 활성, 생물학적 활성을 나타내는 한 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1 이상, 예를 들면 1 내지 수개, 보다 구체적으로는 1 내지 10의 변이 (결실, 삽입, 부가, 치환 등) 등이 예시된다. 또한, 인위적으로 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상기와 같은 변이를 도입한 경우도 마찬가지이고, 이 경우에는 추가로 다종다양한 변이체를 제작하는 것이 가능하다.

또한, 유전자 공학적으로 폴리펩티드의 생산을 행할 때에는 융합 폴리펩티드로서 발현시키는 것이 종종 행해진다. 예를 들면, 목적 폴리펩티드의 발현량을 증가시키기 위해, N 말단에 다른 폴리펩티드 유래의 N 말단 펩티드쇄를 부가하거나, 목적 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 적당한 펩티드쇄 (예를 들면, 히스티딘-태그나 글루타티온-S-트란스페라아제 등)을 부가하여 발현시켜, 이의 펩티드쇄에 친화성을 갖는 담체를 사용함으로써 목적 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 것 등이 행해진다. 따라서, 본 발명의 DNA 폴리메라아제와는 일부 상이한 아미노산 서열을 갖는 DNA 폴리메라아제이어도, 그것이 본 발명의 DNA 폴리메라아제와 실질적으로 동등한 활성을 나타내는 한에 있어서, 이 효소는 "기능적 동등물"로서 본 발명의 범위 내에 속하는 것이다.

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA로는 서열표의 서열번호 16, 24 또는 32에 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는 DNA, 예를 들면 서열표의 서열번호 15, 23 또는 31에 나타내는 염기서열의 전부 또는 일부를 포함하는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호 16, 24 또는 32의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 예를 들면 1 내지 수개, 보다 구체적으로는 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환 등으로 된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 상기 DNA 폴리메라아제로서의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA도 들 수 있다. 또한, 추가로 이들 DNA에 상보적인 염기서열로 이루어지는 DNA와 가혹한 조건하에서 하이브리다이즈가능하고, 또한 DNA 폴리메라아제로서의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 염기서열도 본 발명의 범 위내이다. 여기에서, "가혹한 조건"이란, 예를 들면 프로브와 함께 0.5% SDS, 5 × Denhardt's, 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함하는 6 × SSC (1 × SSC는 0.15 M NaCl, 0.015 시트르산나트륨, pH 7.0을 나타낸다) 중, 68℃에서 12 내지 20 시간 인큐베이트하는 조건을 말한다. 프로브에 하이브리다이즈한 DNA는 예를 들면 0.5% SDS를 포함하는 0.1 × SSC 중, 68℃에서 세정을 행한 후에 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 유전자는 폴리펩티드의 번역 후에 자발적으로 상기 폴리펩티드로부터 절출되는 인테인으로 불리우는 영역을 코드하는 서열을 포함하는 경우가 있다. 이러한 서열을 포함하는 DNA도 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 한, 본 발명에 포함된다.

여기에서, "DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드"란 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 상기에 나타낸 각종 이화학적 성질을 나타내는 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드가 바람직하다.

여기에서, 본 명세서에 기재된 "아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA"라는 용어에 관해서 설명한다. 유전자상에서 아미노산을 지정하는 코돈 (3개의 염기의 조합)은 아미노산의 종류마다 1 내지 6 종류씩 존재하는 것이 알려져 있다. 따라서, 어느 아미노산 서열을 코드하는 DNA는 이의 아미노산 서열에도 따르지만, 다수 존재할 수 있다.

또한, 동일한 아미노산 서열을 코드하는 다종류의 유전자를 인위적으로 제작하는 것은 여러가지의 유전자 공학적 수법을 이용하면 곤란한 것은 아니다. 예를 들면, 유전자 공학적인 폴리펩티드의 생산에 있어서, 목적 폴리펩티드를 코드하는 본래의 유전자상에서 사용되고 있는 코돈이 숙주 중에서는 사용 빈도가 낮은 것인 경우에는 폴리펩티드의 발현량이 낮은 경우가 있다. 이러한 경우에는 코드되어 있는 아미노산 서열에 변화를 주지 않고, 코돈을 숙주에서 빈번히 사용되는 것으로 인위적으로 변환함으로써, 목적 폴리펩티드의 고 발현을 도모하는 것이 행해지고 있다 (예를 들면, 일본 특공평 7-102146호 공보). 이와 같이, 특정 아미노산 서열을 코드하는 다종류의 유전자는 인위적으로 제작가능한 것은 말할 것도 없고, 자연계에서도 생성될 수 있는 것이다. 따라서, 본 발명 중에 개시된 염기서열과 동일한 염기서열을 갖는 유전자일 필요는 없고, 그것이 본 발명 중에 개시된 아미노산 서열을 코드하는 한, 이 유전자는 본 발명에 포함되는 것이다.

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 시험관 내에서의 프라이머 신장에 적합하다. 예를 들면, 1본쇄 DNA에 프라이머가 어닐링한 형의 기질 (M13의 1본쇄 DNA에 서열표의 서열번호 33 기재의 HT 프라이머가 어닐링한 기질, 이하 M13/HT 프라이머 기질, 또는 프라이머 신장형 기질로도 불리운다)을 사용하여 DNA 폴리메라아제 활성을 측정한 경우에는 통상의 활성 측정에 사용되는 활성화 DNA (DNase I 처리 송아지 흉선 DNA)에 비해 높은 뉴클레오티드 취입 활성이 얻어진다.

또한, 상기 M13/HT 프라이머 기질을 사용하여 측정된 DNA 폴리메라아제 활성 (이하, 신장 활성으로도 불리운다)과 활성화 DNA를 기질로서 사용하여 측정된 DNA 폴리메라아제 활성 (이하, 취입 활성으로도 불리운다)의 비 (신장 활성/취입 활성) 는 기지의 피로코커스 푸리오서스 (Pyrococcus furiosus ; Pfu DNA 폴리메라아제; Stratagene 제), 서머스 아쿠아티커스 (Thermus aquaticus) 유래의 Taq DNA 폴리메라아제 (TaKaRa Taq; Takara Bio Inc. 제), 서모코커스 코다카라엔시스 (Thermococcus kodakaraensis) 유래의 KOD DNA 폴리메라아제 (KOD DNA 폴리메라아제, Toyobo 제)에 비해, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 높은 값을 나타낸다.

또한, 상기 M13/HT 프라이머 기질을 이용한 반응계 중에 경합 기질로 되는 활성화 DNA를 가한 경우에는, 상기 3종의 DNA 폴리메라아제의 프라이머 신장 활성은 강하게 저해되는 것에 대하여, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 다만 경도로 저해되므로, 이 폴리펩티드가 프라이머 신장형 기질에 높은 친화성을 갖는 것을 보여준다.

또한, 본원 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 M13 파아지의 1본쇄 DNA에 대한 Km값이 2 ㎍/ml 이하인 것으로부터도, 이 폴리펩티드가 프라이머 신장형 기질에 높은 친화성을 갖는 것을 보여준다.

(2) 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 예를 들면 Tks, Tsi 또는 Tce의 균주 배양물로부터, 또는 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 도입한 형질전환체로부터 대량 생산하는 것이 가능하다.

본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 취득은 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 미생물의 게놈 DNA를 출발재료로 하여 실시할 수 있다. 상기 게놈 DNA를 조제하는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 서모코커스속 고세균을 85℃에서 혐기 배양하고, 증식한 균체를 파쇄하여 DNA를 추출, 정제하는 방법을 들 수 있다. 또한, 얻어진 DNA를 제한효소로 절단하는 방법 등 유전자 클로닝에 사용되는 여러가지의 조작에는 공지의 밥법을 사용할 수 있고, 이 방법의 상세는 문헌 [참조: J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재되어 있다.

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 서열표의 서열번호 15, 23 또는 31 기재의 염기서열을 갖는 핵산 또는 이의 일부가 혼입된 재조합 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 적절한 배양조건, 예를 들면 대장균을 숙주로 하는 경우에는 LB 배지 (트립톤 10 g/l, 효모 추출물 5 g/l, NaCl 5 g/l, pH 7.2) 중에서 배양함으로써, 이의 균체 내에 발현시킬 수 있다. 이 폴리펩티드는 상기 배양 균체로부터, 예를 들면 초음파 처리, 열처리, 및 양이온 교환 컬럼, 어피너티 담체 컬럼, 겔 여과 컬럼 또는 음이온 교환 컬럼 등을 이용한 크로마토그래피를 행함으로써 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 SDS-PAGE 상에서 약 85 내지 90 Da를 나타낸다.

또한, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 트리스 완충액 중, 75℃에서 pH 5.5 내지 6의 최적 pH를 나타낸다. 또한, 이 DNA 폴리메라아제의 효소 활성을 여러 온도에서 측정한 경우에 75℃ 내지 85℃에서 높은 활성을 나타낸 다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 높은 열안정성을 갖는다.

또한, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 부수되고, DNA 폴리메라아제 활성에 대한 엑소뉴클레아제 활성의 세기는 이의 활성이 강하기 때문에, DNA 합성의 정확성이 매우 높은 것으로 알려져 있는 Pfu DNA 폴리메라아제의 활성비를 초과한다. 또한, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관해서 측정된 DNA 합성반응 중에 일어나는 에러의 빈도는 Pfu 유래 DNA 폴리메라아제보다 낮다. 상기한 여러 성질은 본 발명의 DNA 폴리메라아제가 PCR법 등의 유전자 공학용 시약으로서 매우 우수하다는 것을 나타낸다.

(3) 본 발명의 DNA 폴리메라아제를 이용한 핵산의 증폭방법, 이 방법을 위한 조성물 및 키트

본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 충실도가 높고, 프라이머 신장에 적합하다는 특징을 가지며, 이 폴리펩티드를 사용함으로써, 표적 핵산의 정확한 증폭, 해석, 동정을 행하는 방법, 이 방법을 위한 조성물 및 키트가 제공된다.

상기 특징에 의해, 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 PCR법에 사용한 경우에는 매우 우수한 성능을 나타낸다. 예를 들면, PCR법에 이용되는 서모코커스 코다카라엔시스 유래의 DNA 폴리메라아제 (KOD DNA 폴리메라아제, Toyobo 제)는 단독으로는 6 킬로염기쌍 이상의 DNA 단편을 증폭하는 것은 곤란하 고, 다만 다른 DNA 폴리메라아제와 조합함으로써 15 킬로염기쌍 이상의 DNA 단편의 증폭을 행할 수 있다. 이것에 대하여, 본 발명의 DNA 폴리메라아제를 사용한 경우에는 다른 효소가 첨가되지 않고 효소 단독으로 15 킬로염기쌍의 DNA 단편의 증폭이 가능하다.

또한, 종래의 DNA 폴리메라아제나 다수의 DNA 폴리메라아제를 함유하는 조성물, 예를 들면 KOD DNA 폴리메라아제를 포함하는 조성물 키트, 또한 KOD dash DNA 폴리메라아제를 포함하는 조성물 및 키트, 또한 KOD plus DNA 폴리메라아제를 포함하는 조성물 및 키트에 대해서도 표적 핵산의 정확한 증폭, 해석, 동정을 행할 수 있는 점에서 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 키트는 우수하다.

상기 조성물 및 키트로는 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 이 폴리펩티드에 최적화된 완충액, 4종의 dNTP, 및 2가 양이온을 포함하는 것이 예시되고, 또한 표적 핵산을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함해도 된다.

본 발명에 의해, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체가 제공된다. 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 인식하여, 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 폴리클로널 항체. 모노클로널 항체 중 어느 것이어도 된다. 또한, 상기 항체와 동일한 인식 특성을 갖는 항체 단편 (예를 들면, Fab 프레그먼트 등), 1본쇄 항체 등도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 항체는 공지의 방법, 예를 들면 문헌 [참조: Current Protocols in Immunology, 1992, John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 방법에 의해, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 일부를 항원으로 하여 마우스나 래빗을 면역함으로써 제작할 수 있다. 또한, 통상법에 따라, 상기 면역동물로부터 채취한 항체 생산 세포를 기초로 하이브리도마를 제작함으로써, 모노클로널 항체를 제작할 수도 있다.

상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 검출이나 정제에 사용할 수 있는 것 이외에, 이 폴리펩티드가 보유하는 활성, 예를 들면 DNA 폴리메라아제 활성이나 3'→5' 엑소뉴클레아제의 저해에 사용할 수 있다. DNA 폴리메라아제 활성을 억제하는 능력을 갖는 항체는 예를 들면, PCR에 있어서 반응개시 전의 저온시에 비특이적으로 어닐링한 프라이머로부터의 DNA 신장의 억제에 유용하다. 또한, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 억제하는 능력을 갖는 항체는 예를 들면, PCR에 있어서 반응개시 전의 프라이머 분해의 억제에 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1:

본 실시예의 DNA 폴리메라아제의 활성 측정에 사용하는 활성화 DNA는 이하의 방법으로 조제하였다.

즉, 연어 정자 DNA (Sigma 제) 또는 송아지 흉선 DNA (Worthington 제)를 DNase I 처리에 의해 활성화하였다. 이 방법은 문헌 [참조: C. C. Richardson in D. R. Davis (ed.), "DNA polymerase from Escherichia coli", pp. 263-276, Harper & Row]에 기재된 방법을 기초로 한 것이다.

또한, DNA 폴리메라아제의 활성 측정은 이하의 방법으로 행하였다.

즉, 활성 측정할 시료를 활성측정용 반응액 (20 mM 트리스-염산 완층액 pH 8.3, 10 mM 염화칼륨, 6 mM 황산암모늄, 2 mM 염화마그네슘, 0.1% 트리톤 X-100, 0.001% 소 혈청 알부민, 각 200 μM dATP, dGTP 및 dCTP, 100 μM dTTP, 0.238 μM [³H]-메틸 TTP, 0.4 mg/ml 활성형 연어 정자 DNA) 50 ㎕ 중에서 74℃에서 5분간 반응시켰다.

반응종료 후, 2% Nappi (Nacalai Tesque 제)를 포함하는 20% 트리클로로아세트산 (TCA)을 500 ㎕, 전단 (sheared) DNA를 500 ㎕ 첨가하여, 얼음 위에 15분 이상 방치한 후, 글래스 필터 (Whatman 제)에 포집하였다. 다음에, 5 ml의 2% Nappi를 포함하는 5% TCA로 7회 세정한 후, 에탄올로 세정하고, 글래스 필터를 건조하여, 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 상기 효소 활성 측정방법에 의해 30분간에 10 nmol의 전체 뉴클레오티드를 산불용성 침전물에 취입하는 활성을 효소 1 U로 하였다.

실시예 2:

서모코커스 sp. KS-1 주 (JCM11816), 서모코커스 셀러 (JCM8558), 서모코커스 시쿨리 (DSMZ12349)에 관해서 이하의 방법으로 게놈 DNA를 조제하였다.

즉, 구입한 배양액 10 ml를 8000 rpm, 10분간 원심분리하였다. 얻어진 상청액 및 상청액과 침전의 계면에 있는 흑층을 추가로 15000 rpm, 10분간 원심분리한 후, 얻어진 침전에 0.8 ml의 20% 수크로스, 50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0)에 현탁하여, 0.16 ml의 500 mM EDTA (pH 8.0), 0.08 ml의 10 mg/ml 염화리소자임 (Nacalai Tesque 제) 수용액을 가해, 실온에서 2시간 반응시켰다.

반응종료 후, 이 반응액에 6.4 ml의 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 20 mM 트리스-HCl 완충액 (pH 8.0), 0.08 ml의 20 mg/ml 프로테이나제 K (Takara Bio Inc. 제) 및 0.4 ml의 10% 라우릴황산나트륨 수용액을 가해, 37℃에서 1시간 보온하였다. 이어서, 이것에 등량의 100 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 포화페놀/클로로포름/이소아밀알콜 혼합액 (25:24:1, v/v)을 가해 10분간 서서히 혼합한 후, 추가로 10분간 원심분리 (10000 × g)를 2회 행하였다. 원심분리 종료 후, 얻어진 상청액을 에탄올 침전후, 0.1 ml의 TE 완충액에 용해하여 게놈 DNA 용액을 얻었다.

실시예 3:

(1) DNA 폴리메라아제 유전자 중앙부의 클로닝

다양한 내열성 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열 사이에 보존되어 있는 부분을 기초로 하여 서열표의 서열번호 1∼4 기재의 올리고뉴클레오티드 TPPolBF4, TPPolBF5, TTPolBR1 및 TTPolBR4를 DNA 합성기로 합성하였다.

다음에, 상기 실시예 2에서 조제한 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 250 ng을 주형으로 하고, 50 pmol의 TPPolBF4와 TTPolBR1, 50 pmol의 TPPolBF4와 50 pmol의 TTPolBR4, 50 pmol의 TPPolBF5와 50 pmol의 TTPolBR1의 프라이머의 조합으로, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR에 있어서, DNA 폴리메라아제는 다카라 ExTaq (Takara Bio Inc. 제)를 첨부 프로토콜에 따라 사용하여, PCR은 94℃, 3분간 반응 후, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 2분을 1 사이클로 하는 40 사이클 반응 을 행하였다.

반응종료 후, 각각의 반응액을 페놀 처리한 후, 마이크로콘-100 (Takara Bio Inc. 제)으로, 프라이머를 제거함과 동시에 증폭 DNA 단편의 농축을 행하였다.

농축한 3 kb의 TPPolBF4-TTPolBR1 증폭 단편, 2 kb의 TPPolBF4-TTPolBR4 증폭 단편, 0.7 kb의 TPPolBF5-TTPolBR1 증폭 단편에 관해서 다이렉트 시퀀싱을 행하여 염기서열을 결정하여, 여러가지의 내열성 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열과 비교하였다. 그 결과, 서모코커스 sp. KS-1 DNA 폴리메라아제가 인테인 서열을 포함하는 것이 명백해졌다.

(2) DNA 폴리메라아제 유전자 상류 부분의 클로닝

상기 실시예 3-(1)에서 얻어진 염기서열을 기초로 상류를 클로닝하기 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 Tks01 (서열표의 서열번호 5)을 합성하였다. 또한, 하기 표 1에 나타내는 32종류의 프라이머를 합성하였다. 표 1 중의 태그 서열을 서열표의 서열번호 6에 나타낸다.

실시예 2에서 조제한 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하여, 10 pmol의 Tks01과 각 10 pmol의 표 1 기재의 32종류의 프라이머의 조합으로 20 mM 트리스-아세트산 완충액 (pH 8.5), 50 mM 아세트산칼륨, 3 mM 아세트산마그네슘, 0.01% BSA, 각 300 μM dNTP 혼합물, 1.25 U의 다카라 ExTaq DNA 폴리메라아제 (Takara Bio Inc. 제)를 포함하는 50 ㎕ 반응액 중에서 PCR을 행하였다. PCR은 94℃ 3분 인큐베이트한 후, 98℃ 10초, 50℃ 10초, 72℃ 40초를 1 사이클로 하는 40 사이클 반응을 행하였다. 얻어진 PCR 산물의 일부를 아가로스 겔 전기영동하고, 싱글 밴드로 된 것을 선출하여, 이들 반응액을 마이크로콘-100 (Takara Bio Inc. 제)으로, 프라이머를 제거함과 동시에 농축하고, 다이렉트 시퀀싱을 행하여, DNA 폴리메라아제의 상류 부분을 포함하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 1300 bp의 PCR 증폭 단편 Tks012G에 목적 DNA 폴리메라아제 유전자의 상류가 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 단편에 실시예 3-(1)과는 상이한 인테인 서열이 포함되어 있는 것도 확인할 수 있었다.

또한, 상류 스타트 코돈 주변을 클로닝하기 위한 Tks012G의 서열을 기초로 특이적인 올리고뉴클레오티드 Tks04 (서열표의 서열번호 7)를 합성하였다. 실시예 2에서 조제한 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하여, 10 pmol의 Tks04와 각 10 pmol의 표 1 기재의 32종류의 프라이머의 조합으로 상기 50 ㎕ 반응액 중에서 PCR을 행하였다. PCR 조건 및 정제 조작은 상기 조건과 동일하게 하였다. 얻어진 증폭 단편의 다이렉트 시퀀싱을 행하여, DNA 폴리메라아제의 상류를 포함하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 1800 bp의 PCR 증폭 단편 Tks041B에 목적 DNA 폴리메라아제 유전자의 스타트 코돈 주변이 포함되는 것을 알 수 있었다.

(3) DNA 폴리메라아제 유전자 하류 부분의 클로닝

상기 실시예 3-(1)에서 얻은 염기서열을 기초로 상류를 클로닝하기 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 Tks02 (서열표의 서열번호 8)를 합성하였다. 다음에, 실시예 2에서 조제한 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하여, 10 pmol의 Tks02와 각 10 pmol의 표 1 기재의 32종류의 프라이머의 조합으로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 상기 조건과 동일하게 하여 행하였다. 얻어진 PCR 산물의 일부를 아가로스 겔 전기영동하여, 이 중의 Tks022D의 약 2500 bp DNA 단편을 회수하고, T4 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio Inc. 제)를 사용하여 말단을 평활화한 후, HincII (Takara Bio Inc. 제)로 소화한 pUC118 (Takara Bio Inc. 제)에 T4 DNA 리가아제 (Takara Bio Inc. 제)를 사용하여 연결하고, 이 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109를 형질전환하였다. 또한, 형질전환체를 배양하여 약 2500 bp의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드 pTks022D를 얻어, 삽입된 DNA 단편의 염기서열을 결정하였다.

(4) DNA 폴리메라아제를 발현시키기 위한 플라스미드의 구축

서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 폴리메라아제가 서열 중에 2개소 인테인 서열을 포함하는 것이 명백해졌다.

그리하여, 인테인 서열을 제거한 DNA 폴리메라아제 유전자를 구축하였다.

실시예 3-(3)에서 얻어진 서열을 기초로 하여 서열표의 서열번호 9∼14 기재의 올리고뉴클레오티드, TksNde, Tks1EndBg, Tks2StaBg, Tks2EndBal, Tks3StaBal 및 TksBgPs를 합성하였다.

다음에, 실시예 2에서 조제한 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA 100 ng을 주형으로 하고, 20 pmol의 TksNde와 20 pmol의 Tks1EndBg (TksA), 20 pmol의 Tks2StaBg와 20 pmol의 Tks2EndBal (TksB), 20 pmol의 Tks3StaBal과 20 pmol의 TksBgPs (TksC)의 프라이머의 조합으로, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR에 있어서의 DNA 폴리메라아제는 파이로베스트 (Takara Bio Inc. 제)를 첨부 프로토콜에 따라 사용하여, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 3분을 1 사이클로 하는 40 사이클 반응을 행하여, 약 1.3 kb의 TksA, 약 0.3 kb의 TksB, 약 0.9 kb의 TksC 각 DNA 증폭 단편을 얻었다. 또한, 동일한 방법으로 상기 PCR 반응액 TksB 1 ㎕와 PCR 반응액 TksC 1 ㎕를 혼합한 것을 주형으로 하고, 20 pmol의 Tks2StaBg와 20 pmol의 TksBgPs (TksD) 프라이머를 사용하여, 100 ㎕의 용량으로 상기 조건에서 PCR을 행하여, 약 1.2 kb의 TksD DNA 증폭 단편을 얻었다.

얻어진 TksA DNA 단편은 제한효소 NdeI와 BglII로, TksD DNA 단편은 제한효소 BglII와 PstI로 소화한 후, 제한효소 NdeI와 PstI로 소화한 pTV119Nd (pTV119N의 NcoI 사이트를 NdeI 사이트로 변환한 것)와 통상법에 의해 라이게이션하여, 플라스미드 pTks59를 구축하였다. 이 플라스미드는 pTks59로 명명, 표시되어, 2004년 5월 14일 (원기탁일)에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터 (일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566)에 FERM BP-10312로서 기탁되어 있다.

(5) DNA 폴리메라아제 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정

실시예 3-(4)에서 얻어진 pTks59의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 따라 결정하였다.

얻어진 염기서열의 결과를 해석한 바, 목적 DNA 폴리메라아제를 코드하는 것으로 여겨지는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 이 오픈 리딩 프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 15에 나타낸다. 또한, 이 염기서열로부터 추정되는 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 16에 나타낸다.

(6) 서모코커스 sp. KS-1 DNA 폴리메라아제 유전자의 발현

pTks59로 형질전환된 대장균 JM109를 100 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 5 ml의 LB (1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨) 배지에 식균하여, 37℃에서 6시간 배양한 배양액 50 ㎕를 100 ㎍/ml의 암피실린 및 1 mM IPTG를 포함하는 5 ml의 LB 배지에 식균하여, 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다. 배양종료 후, 원심분리에 의해 모여진 균체를 36 ㎕의 소니케이션 버퍼 (50 mM 트리스-염산 pH 8.0, 2 mM 2-머캅토에탄올, 10% 글리세롤)에 현탁하여, 초음파 파쇄기에 걸었다. 이 파쇄액을 12000 rpm으로 10분간의 원심분리를 행하여, 얻어진 상청액을 80℃, 10분간 열처리하였다. 그 후, 다시 12000 rpm으로 10분간의 원심분리를 행하여, 상청액을 모아서 열처리 상청액을 얻었다.

상기에서 얻어진 열처리 상청액에 관해서, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 효소 활성을 측정한 결과, DNA 폴리메라아제 활성을 확인할 수 있었다.

(7) 정제 DNA 폴리메라아제 표본의 조제

실시예 3-(5)에서 얻어진 플라스미드 pTks59로 형질전환된 대장균 JM109를 50 ㎍/ml의 암피실린, 0.1% 글루코스를 포함하는 400 ml LB 배지에 식균하여, 37℃에서 하룻밤 진탕배양후, 전체량을 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 20ℓ LB 배지에 첨가하여, 37℃에서 OD600이 1.0으로 될 때까지 배양하였다. OD600이 1.0에 이르면, 최종 농도 0.2 mM로 되도록 IPTG를 첨가하고, 또한 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양종료 후, 원심분리에 의해 모여진 균체를 732 ml의 버퍼 A [50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5), 2 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨, 1 mM 페닐메탄술포닐플루오라이드]에 현탁하여, 초음파 파쇄기에 걸었다. 이 파쇄액을 12000 rpm으로 30분간의 원심분리를 행하였다. 얻어진 상청액에 최종 농도 0.2 M이 되도록 황산암모늄을 첨가하여, 75℃, 15분간의 열처리 후, 0℃에서 30분간 방치하고, 다시 12000 rpm으로 30분간의 원심분리를 행하였다. 또한, 상청액을 폴리에틸렌이민에 의한 제핵산처리, 황산암모늄 침전을 행한 후, 버퍼 B [50 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5), 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM 페닐메탄술포닐플루오라이드] 2ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 투석 후의 효소액 200 ml를 버퍼 B로 평형화한 포스포셀룰로스 P-11 컬럼 (Whatman 제)에 가해, FPLC 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech 제)을 사용하여 0∼500 mM 인산칼륨 완충액 (pH 7.5) 직선농도구배에 의해 용출하였다.

용출한 DNA 폴리메라아제 분획을 버퍼 C [20 mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.5), 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.2% 트윈 (Tween) 20, 1 mM 디티오트레이톨] 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 투석 후의 효소액 100 ml를 버퍼 B로 평형화한 헤파린-세파로스 CL-6B (Pharmacia Pharmacia Biotech 제)에 가해, FPLC 시스템을 사용하여 0∼700 mM KCl 직선농도구배에 의해 용출하였다.

이 분획을 버퍼 D [20 mM 트리스-HCl (pH 9.0), 1 mM EDTA, 10% 글리세롤, 0.2% 트윈 20, 1 mM 디티오트레이톨] 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 투석 후의 효소액 50 ml를 버퍼 D로 평형화한 Q-세파로스 (Pharmacia Pharmacia Biotech 제)에 가해, FPLC 시스템을 사용하여 0∼300 mM NaCl 직선농도구배에 의해 용출하였다.

이 분획을 보존 버퍼 [50 mM 트리스-HCl (pH 8.2), 0.1 mM EDTA, 10 mM 염화나트륨, 0.1% 트윈 20, 0.1% 노니뎃 (Nonidet) P-40, 1 mM 디티오트레이톨, 50% 글리세롤] 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 폴리메라아제를 Tks DNA 폴리메라아제 표본으로 하였다.

얻어진 Tks DNA 폴리메라아제 표본을 사용하여, 실시예 1에 기재한 방법으로 활성을 측정한 바, DNA 폴리메라아제 활성을 확인할 수 있었다.

실시예 4:

(1) DNA 폴리메라아제 유전자 중앙부의 클로닝

다양한 내열성 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열 사이에 보존되어 있는 부분을 기초로 하여 서열표의 서열번호 17, 2, 3, 18 기재의 올리고뉴클레오티드 TPPolBF1, TPPolBF5, TTPolBR1 및 TTPolBR5를 합성하였다.

다음에, 상기 실시예 2에서 조제한 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA 250 ng을 주형으로 하여, 50 pmol의 TPPolBF1과 50 pmol의 TTPolBR1, 50 pmol의 TPPolBF1과 50 pmol의 TTPolBR5, 50 pmol의 TPPolBF5와 50 pmol의 TTPolBR1의 프라이머의 조합으로, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR 조건 및 정제 조작은 실시예 3-(1) 기재와 동일하게 하여 행하였다. 얻어진 약 2 kb의 TPPolBF1-TTPolBR1, 약 1 kb의 TPPolBF1-TTPolBR5 및 약 0.8 kb의 TPPolBF5-TTPolBR1의 각 증폭 단편에 관해서 다이렉트 시퀀싱을 행하여, 염기서열을 결정하였다.

(2) DNA 폴리메라아제 유전자 상류 및 하류 부분의 클로닝

상기 실시예 4-(1)에서 얻은 염기서열을 기초로 상류를 클로닝하기 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 Tce01 (서열표의 서열번호 19) 및 하류를 클로닝하기 위한 올리고뉴클레오티드 Tce02 (서열표의 서열번호 20)를 합성하였다.

다음에, 실시예 2에서 조제한 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하여, 10 pmol의 Tce01 또는 Tce02와 각 10 pmol의 실시예 3-(2) 표 1 기재의 32종류의 프라이머의 조합으로, 실시예 3-(2) 기재의 방법과 동일하게 PCR 및 정제 조작을 행하였다. 얻어진 증폭 산물에 관해서 다이렉트 시퀀싱을 행하여, 목적 DNA 폴리메라아제의 상류 영역을 포함하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 650 bp의 PCR 증폭 단편 Tce013C에 DNA 폴리메라아제 유전자의 상류, 약 650 bp의 PCR 증폭 단편 Tce022F에 DNA 폴리메라아제 유전자의 하류가 포함되어 있는 것을 알았다.

(3) DNA 폴리메라아제를 발현시키기 위한 플라스미드의 구축

실시예 4-(2)에서 얻어진 서열을 기초로 하여 서열표의 서열번호 21 및 22 기재의 올리고뉴클레오티드 TceNde 및 TceBgPs를 합성하였다.

실시예 2에서 조제한 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA 100 ng을 주형으로 하고, 20 pmol의 TceNde와 20 pmol의 TceBgPs를 프라이머로 사용하여, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR은 DNA 폴리메라아제로서 파이로베스트 (Takara Bio Inc. 제)를 첨부 프로토콜에 따라 사용하여, 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 2분을 1 사이클로 하는 40 사이클 반응을 행하였다. 얻어진 약 2.3 kb의 DNA 증폭 단편을 제한효소 NdeI 및 Bg1II (모두 Takara Bio Inc. 제)로 소화하여, 얻어진 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pTV119Nd (pTV119의 NcoI 사이트를 NdeI 사이트로 변환한 것)의 NdeI와 BamHI 사이에 혼입하여, 플라스미드 pTce19를 제작하였다. 이 플라스미드는 pTce19로 명명, 표시되어, 2004년 5월 14일 (원기탁일)에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터 (일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566)에 FERM BP-10311로서 기탁되어 있다.

(4) DNA 폴리메라아제 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정

상기 pTce19의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 따라 결정하였다.

얻어진 염기서열의 결과를 해석한 바, 목적 DNA 폴리메라아제를 코드하는 것으로 여겨지는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 이 오픈 리딩 프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 23에 나타낸다. 또한, 이 염기서열로부터 추정되는 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 24에 나타낸다.

(5) 서모코커스 셀러 DNA 폴리메라아제 유전자의 발현

pTce19로 형질전환된 대장균 JM109를 실시예 3-(6) 기재의 방법으로 배양하여, 원심분리에 의해 모여진 균체를 64 ㎕의 소니케이션 버퍼에 현탁하여, 초음파 파쇄기에 걸었다. 이 파쇄액을 12000 rpm으로 10분간의 원심분리를 행하여, 얻어진 상청액을 80℃, 10분간 열처리하였다. 그 후, 다시 12000 rpm으로 10분의 원심분리를 행하여, 상청액을 모아서 열처리 상청액을 얻었다.

상기에서 얻어진 열처리 상청액에 관해서, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 효소 활성을 측정한 결과, DNA 폴리메라아제 활성이 확인되었다.

(6) 정제 DNA 폴리메라아제 표본의 조제

상기 pTce19로 형질전환된 대장균 JM109를 실시예 3-(7) 기재의 방법으로 배양하였다. 정제는 헤파린-세파로스 CL-6B (Pharmacia Biotech 제)를 사용하여, 0∼700 mM KCl 직선농도구배에 의해 용출할 때까지는 실시예 3-(7)과 동일한 방법으로 행하였다.

용출한 DNA 폴리메라아제 분획은 또한 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 버퍼 C 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 투석 후의 효소액 95 ml를 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 버퍼 C로 평형화한 수퍼덱스 (Superdex) G200 (Pharmacia Biotech 제)에 가해, 0.3 M 염화나트륨을 포함하는 버퍼 C로 용출하였다.

용출한 DNA 폴리메라아제 분획을 버퍼 D 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 투석 후의 효소액 45 ml를 버퍼 D로 평형화한 Q-세파로스 (Pharmacia Pharmacia Biotech 제)에 가해, FPLC 시스템을 사용하여 0∼300 mM NaCl 직선농도구배에 의해 용출하였다.

이 분획을 보존 버퍼 1ℓ를 외액으로 하여, 2시간의 투석을 2회, 하룻밤의 투석을 1회 행하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA 폴리메라아제를 Tce DNA 폴리메라아제 표본으로 하였다.

상기에서 얻어진 Tce DNA 폴리메라아제 표본을 사용하여, 실시예 1에 기재한 방법으로 효소 활성을 측정한 바, Tce DNA 폴리메라아제 표본에 DNA 폴리메라아제 활성을 확인할 수 있었다.

실시예 5:

(1) DNA 폴리메라아제 유전자 중앙부의 클로닝

다양한 내열성 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열 사이에 보존되어 있는 부분을 기초로 하여 서열표의 서열번호 17, 2, 3, 4, 18 기재의 올리고뉴클레오티드 TPPolBF1, TPPolBF5, TTPolBR1, TTPolBR4 및 TTPolBR5를 합성하였다.

다음에, 실시예 2에서 조제한 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA 250 ng을 주형으로 하여, 50 pmol의 TPPolBF1과 50 pmol의 TTPolBR4, 50 pmol의 TPPolBF1과 50 pmol의 TTPolBR5, 50 pmol의 TPPolBF5와 50 pmol의 TTPolBR1의 프라이머의 조합으로, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR 조건 및 정제 조작은 실시예 3-(1) 기재와 동일하게 하여 행하였다. 얻어진 약 1.2 kb의 TPPolBF1-TTPolBR4, 약 1 kb의 TPPolBF1-TTPolBR5, 약 2 kb의 TPPolBF5-TTPolBR1의 각 증폭 단편에 관해서 다이렉트 시퀀싱을 행하여, 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 서모코커스 시쿨리 DNA 폴리메라아제가 인테인 서열을 포함하는 것이 명백해졌다.

(2) DNA 폴리메라아제 유전자 상류 및 하류 부분의 클로닝

상기 실시예 5-(1)에서 얻은 염기서열을 기초로 상류를 클로닝하기 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 Tsi01 (서열표의 서열번호 25) 및 하류를 클로닝하기 위한 올리고뉴클레오티드 Tsi06 (서열표의 서열번호 26)를 합성하였다.

다음에, 실시예 2에서 조제한 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA 1 ng을 주형으로 하고, 10 pmol의 Tsi01 또는 Tsi06과 각 10 pmol의 표 1 기재의 32종류의 프라이머의 조합으로 PCR을 행하였다. PCR 조건 및 정제 조작은 실시예 3-(2)와 동일하게 하여 행하였다. 얻어진 증폭 단편은 다이렉트 시퀀싱을 행하여, DNA 폴리메라아제의 상류를 포함하는 단편을 스크리닝하였다. 그 결과, 약 2900 bp의 Tsi011A 단편에 DNA 폴리메라아제 유전자의 상류, 약 400 bp의 Tsi065B 단편에 DNA 폴리메라아제 유전자의 하류가 포함되어 있는 것을 알았다.

(3) DNA 폴리메라아제를 발현시키기 위한 플라스미드의 구축

서모코커스 시쿨리 DNA 폴리메라아제의 서열 중에 1개소 인테인 서열을 포함하는 것이 명백해졌다. 그리하여, 인테인 서열을 제거한 DNA 폴리메라아제 유전자를 구축하였다.

즉, 실시예 5-(2)에서 얻어진 서열을 기초로 하여 서열표의 서열번호 27∼30 기재의 올리고뉴클레오티드, TsiNde, TsiA, TsiB 및 TsiBamPst를 합성하였다.

실시예 2에서 조제한 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA 100 ng을 주형으로 하여, 20 pmol의 TksNde와 20 pmol의 TsiB (TsiI), 20 pmol의 TsiA와 20 pmol의 TsiBamPst (TsiII)의 프라이머의 조합으로, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. PCR 조건은 실시예 5-(2)와 동일하게 행하여, 약 1.5 kb의 TsiI, 약 0.9 kb의 TsiII DNA 단편을 얻었다. 또한, 동일한 방법으로 상기 PCR 반응액 TsiI 1 ㎕와 PCR 반응액 TsiII 1 ㎕를 혼합한 것을 주형으로 하고, 20 pmol의 TsiNde와 20 pmol의 TsiBamPst의 프라이머를 사용하여, 100 ㎕의 용량으로 PCR을 행하여, 약 2.4 kb의 DNA 단편을 얻었다.

얻어진 약 2.4 kb의 DNA 단편은 제한효소 NdeI와 BamHI로 소화한 후, NdeI와 BamHI로 소화한 pTV119Nd (pTV119N의 NcoI 사이트를 NdeI 사이트로 변환한 것)와 라이게이션하여, 플라스미드 pTsi16를 구축하였다. 이 플라스미드는 pTsi16으로 명명, 표시되어, 2004년 5월 14일 (원기탁일)에 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터 (일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제 6 (우편번호 305-8566)에 FERM BP-10310으로서 기탁되어 있다.

(4) DNA 폴리메라아제 유전자를 포함하는 DNA 단편의 염기서열의 결정

실시예 5-(3)에서 얻어진 pTsi16의 삽입 DNA 단편의 염기서열을 디데옥시법에 따라 결정하였다. 얻어진 염기서열의 결과를 해석한 바, DNA 폴리메라아제를 코드하는 것으로 여겨지는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 이 오픈 리딩 프레임의 염기서열을 서열표의 서열번호 31에 나타낸다. 또한, 이 염기서열로부터 추정되는 DNA 폴리메라아제의 아미노산 서열을 서열표의 서열번호 32에 나타낸다.

(5) 서모코커스 시쿨리 DNA 폴리메라아제 유전자의 발현

플라스미드 pTsi16으로 형질전환된 대장균 JM109를 실시예 3-(6) 기재의 방법으로 배양하여, 원심분리에 의해 모여진 균체를 52 ㎕의 소니케이션 버퍼에 현탁하여, 초음파 파쇄기에 걸었다. 이 파쇄액을 12000 rpm으로 10분간의 원심분리를 행하여, 얻어진 상청액을 80℃, 10분간 열처리하였다. 그 후, 다시 12000 rpm으로 10분의 원심분리를 행하여, 상청액을 모아서 열처리 상청액을 얻었다.

상기에서 얻어진 열처리 상청액에 관해서, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 효소 활성을 측정한 결과, DNA 폴리메라아제 활성이 확인되었다.

(6) 정제 DNA 폴리메라아제 표본의 조제

플라스미드 pTsi16으로 형질전환된 대장균 JM109를 실시예 3-(7) 기재의 방법으로 배양하였다. 정제는 실시예 3-(7)과 동일한 방법으로 행하였다.

이렇게 하여 얻어진 DNA 폴리메라아제를 Tsi DNA 폴리메라아제 표본으로 하였다. 얻어진 Tsi DNA 폴리메라아제 표본을 사용하여, 실시예 1에 기재되어 있는 방법으로 활성을 측정한 결과, DNA 폴리메라아제 표본에 DNA 폴리메라아제 활성을 확인할 수 있었다.

실시예 6:

(1) 각종 DNA 폴리메라아제의 취입 및 신장 활성

Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 취입 및 신장 활성을 측정하였다. 대조로서 시판되는 KOD DNA 폴리메라아제 (Toyobo 제)를 사용하였다.

주형으로서, 취입 활성을 측정하는 경우는 1 ㎍ 활성형 송아지 흉선 DNA를 사용하였다. 또한, 신장 활성을 측정하는 경우는 1 ㎍ M13 파아지의 1본쇄 DNA와 이것에 상보적인 1 pmol의 서열표의 서열번호 33 기재의 HT 프라이머를 어닐링시킨 것 (M13/HT 프라이머)을 사용하였다. 완충액은 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 KOD＃1 버퍼를 사용하였다. DNA 폴리메라아제의 활성 측정은 이하의 방법으로 행하였다.

즉, 활성을 측정하고자 하는 효소 시료, 상기 주형, 40 μM dNTP, 0.238 μM [³H]메틸-TTP (Amersham 제) 및 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 KOD＃1 버퍼 (Toyobo 제) 50 ㎕로 75℃ 5분간 반응시켰다. 반응액 중 40 ㎕를 DE81 페이퍼 (Whatman 제)에 스폿하여, 5% Na₂PO₄로 4회 세정을 행한 후에 DE81 페이퍼 상에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 상기 효소 활성 측정방법에 의해 30분간에 10 nmol의 dNMP를 기질 DNA로 취입하는 효소량을 효소 1 U로 하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2 중, "취입"은 주형이 되는 핵산 중의 닉 (nick) 부위에 대한 취입 능력을 나타내며, "신장"은 주형이 되는 핵산에 어닐링한 프라이머로부터의 신장으로 인한 취입 능력을 나타낸다.

폴리메라아제 활성 (U/㎕)	취입	신장	신장/취입
Tks	9.38	11.46	1.22
Tce	10.83	13.28	1.23
Tsi	9.67	21.93	2.27
KOD	6.80	6.69	0.98

표 2에 나타내는 바와 같이, Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제는 KOD＃1 버퍼 중에서 주형 DNA로의 핵산의 취입보다 프라이머 신장으로 인한 취입이 활성이 높다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 대조가 되는 KOD DNA 폴리메라아제와 비교해도, 프라이머 신장으로 인한 취입이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다. 이 때문에, 본 발명의 DNA 폴리메라아제는 프라이머 신장에 매우 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) M13의 1본쇄 DNA에 대한 친화성

Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 취입 및 M13의 1본쇄 DNA 폴리메라아제에 대한 친화성을 조사하였다. 대조로서, KOD DNA 폴리메라아제를 사용하였다.

주형으로서, 여러가지 농도의 M13의 1본쇄 DNA를 사용하였다. 프라이머로서 이것에 상보적인 1 pmol의 HT 프라이머를 사용하였다. 완충액은 1 mM 염화마그네슘을 포함하는 KOD＃1 버퍼를 사용하였다. DNA 폴리메라아제 활성 측정은 상기 실시예 6-(1) 기재의 방법으로 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.

폴리메라아제	Km (㎍/ml)
Tks	1.04
Tce	0.91
Tsi	1.33
KOD	2.65

표 3에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제는 KOD DNA 폴리메라아제 보다 M13의 1본쇄 DNA에 대한 친화성이 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다. 이 때문에, 본 발명의 DNA 폴리메라아제는 PCR의 검출 감도라는 관점에 있어서 KOD DNA 폴리메라아제 보다 우수하다는 것을 시사하였다.

(3) Tks 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 충실도

Tks 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 충실도를 조사하였다. 대조로서, KOD DNA 폴리메라아제, KOD plus DNA 폴리메라아제 (모두 Toyobo 제) 및 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio Inc. 제)를 사용하였다.

주형으로서, 서머스 서모필러스 HB8 게놈 DNA (Takara Bio Inc. 제)를 사용하였다. 또한, 서열표의 서열번호 34 및 35 기재의 c280/RG34-F 및 -R 프라이머를 사용하였다.

충실도의 측정은 이하의 방법으로 행하였다. 즉, 서머스 서모필러스 HB8 게놈 DNA 10 ng을 주형으로 하여, 상기 c280/RG34-F 및 -R 프라이머의 조합으로 50 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. 상기 프라이머 쌍으로 증폭하는 영역은 GC 함량이 70%로 높기 때문에, DMSO를 농도 2%가 되도록 첨가하였다. Tks, Tsi 및 KOD plus DNA 폴리메라아제를 사용하는 경우는 KOD plus 버퍼를 사용하여, 이의 첨부 프로토콜에 따라 사용하였다. 또한, KOD DNA 폴리메라아제를 사용하는 경우는 KOD＃1 버퍼를 사용하여, KOD DNA 폴리메라아제 첨부 프로토콜에 따라 사용하였다. 또한, 파이로베스트 DNA 폴리메라아제는 첨부 완충액 및 프로토콜에 따라 행하였다. PCR 조건은 96℃ 2분 인큐베이트한 후, 98℃ 5초, 68℃ 30초를 1 사이클로 하는 30 사이클 반응을 행하였다. 반응종료 후, 등량의 100 mM 트리스-염산 완충액 (pH 8.0) 포화페놀/클로로포름/이소아밀알콜 혼합액 (25:24:1, v/v)을 가해 혼합한 후, 10분간 원심 (10000 × g)을 2회 행하였다. 원심종료 후, 얻어진 상청액을 클로로포름/이소아밀알콜 혼합액 (24:1, v/v)을 가해 혼합한 후, 10분간 원심 (10000 × g)을 행하였다. 얻어진 상청액을 에탄올 침전 후, 20 ㎕의 H₂O에 용해하여 약 0.5 bp의 DNA 단편을 얻었다. 8 ㎕의 약 0.5 bp의 DNA 단편을 다카라 BKL 키트 (Takara Bio Inc. 제)의 프로토콜에 따라 처리한 후, 얻어진 용액 5 ㎕로 대장균 JM109를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체를 배양하여, 약 500 bp의 DNA 단편이 삽입된 12∼24 클론에 대해서 염기서열을 결정하여, 판독된 총 염기수에 대한 변이 염기수의 비를 구해 충실도로 하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

완충액	효소명	변이 빈도
KOD Plus	Tks	0.000%
	Tsi	0.021%
	KOD plus	0.082%
전용 버퍼	파이로베스트	0.023%
KOD＃1	KOD	0.022%

표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Tks 및 Tsi DNA 폴리메라아제는 KOD, KOD Plus 및 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 중 어느 것보다 변이 빈도가 적은 것을 확인할 수 있었다. 이 때문에, KOD, KOD plus 및 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 보다 클로닝용 효소로서 우수하다는 것이 명백해졌다.

(4) Tks 및 Tce DNA 폴리메라아제의 충실도

Tks 및 Tce DNA 폴리메라아제의 충실도를 조사하였다. 대조로서, KOD DNA 폴리메라아제, KOD plus DNA 폴리메라아제 (모두 Toyobo 제) 및 파이로베스트 DNA 폴리메라아제 (Takara Bio Inc. 제)를 사용하였다.

주형으로서, 서머스 서모필러스 HB8 게놈 DNA (Takara Bio Inc. 제)를 사용하였다. 또한, 서열표의 서열번호 36 및 37 기재의 c240/RA18-F 및 -R 프라이머를 사용하였다.

충실도의 측정은 서머스 서모필러스 HB-8 게놈 DNA 10 ng을 주형으로 하여, 상기 c240/RA18-F 및 -R 프라이머의 조합으로 50 ㎕의 용량으로 PCR을 행하였다. 상기 프라이머 쌍으로 증폭하는 영역의 GC 함량은 70%로 높기 때문에, DMSO를 농도 2%가 되도록 첨가하였다. 완충액은 KOD＃1 버퍼를 사용하여, 이의 첨부 프로토콜에 따라 사용하였다. KOD DNA 폴리메라아제를 사용하는 경우는 KOD＃1 버퍼를 사용하여, KOD DNA 폴리메라아제 첨부 프로토콜에 따라 사용하였다. PCR 조건 및 충실도의 산출 방법은 상기 실시예 6-(3) 기재의 방법과 동일하게 하였다. 이의 결과를 표 5에 나타낸다.

완충액	효소명	변이 빈도
KOD＃1	Tks	0.000%
	Tce	0.000%
	KOD	0.064%

표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Tks 및 Tce DNA 폴리메라아제는 KOD 보다 변이 빈도가 적은 것을 확인할 수 있었다. 이 때문에, 클로닝용 효소로서 우수하다는 것이 명백해졌다.

실시예 7:

(1) 각종 DNA 폴리메라아제의 최적온도

Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 최적온도를 측정하였다. 주형으로는 20 ㎍ 활성형 송아지 흉선 DNA를 사용하였다. 또한, 완충액으로는 파이로베스트 DNA 폴리메라아제에 첨부된 버퍼를 사용하였다. DNA 폴리메라아제의 활성 측정은 이하의 방법으로 행하였다.

우선, 활성을 측정하고자 하는 효소 시료 5 mU (실시예 6-(1)에 기재된 취입 활성의 측정방법에 의해 산출), 상기 주형, 200 μM dATP, 200 μM dGTP, 200 μM dCTP, 100 μM dTTP, 0.204 μM [³H]-메틸 TTP (Amersham 제), 1 × 파이로베스트 DNA 폴리메라아제에 첨부된 버퍼 (Takara Bio Inc. 제)를 포함하는 계 50 ㎕의 반응액을 조제하였다. 다음에, 각각의 효소 시료에 관해서, 65℃∼85℃의 원하는 온도에서 5분간 반응시켰다. 반응액 중 40 ㎕를 DE81 페이퍼 (Whatman 제)에 스폿하여, 5% Na₂PO₄로 4회 세정을 행한 후에 DE81 페이퍼 상에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 상기 효소 활성 측정방법으로 측정된 활성과 반응온도의 관계를 도 1에 나타낸다. 또한, 도 1에서는 80℃에서의 반응에 있어서의 활성을 100%로 하고 있다.

도 1에 나타내는 바와 같이, Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제는 활성형 송아지 흉선 DNA를 주형으로서 사용한 경우에는 75℃∼85℃의 최적온도를 갖는다.

(2) 각종 DNA 폴리메라아제의 최적 pH

Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제의 최적 pH를 측정하였다. 주형으로는 10 ㎍ 활성형 송아지 흉선 DNA를 사용하였다. 또한, 완충액으로는 75℃에서의 pH가 pH 5.0∼pH 8.0의 원하는 값으로 조정된 120 mM 트리스-HCl를 사용하였다. DNA 폴리메라아제의 활성 측정은 이하의 방법으로 행하였다.

우선, 활성을 측정하고자 하는 효소 시료 0.05 U (실시예 6-(1)에 기재된 취입 활성의 측정방법에 의해 산출), 상기 주형, 상기 완충액, 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 0.001% BSA, 1 mM MgCl₂, 40 μM dNTP, 0.204 μM [³H]메틸-TTP (Amersham 제)를 포함하는 계 50 ㎕의 반응액을 조제하였다. 다음에, 각각의 효소 시료에 대하여, 75℃에서 5분간 반응시켰다. 반응액 중 40 ㎕를 DE81 페이퍼 (Whatman 제)에 스폿하여, 5% Na₂PO₄로 4회 세정을 행한 후에 DE81 페이퍼 상에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다. 상기 효소 활성 측정방법으로 측정된 활성과 pH의 관계를 도 2에 나타낸다. 또한, 도 2에서는 pH 6.0 (75℃)에서의 활성을 100%로 하고 있다.

도 2에 나타내는 바와 같이, Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제는 활성형 송아지 흉선 DNA를 주형으로서 사용한 경우에 pH 5.5∼pH 6.5 (75℃)의 최적 pH를 갖는다.

실시예 8:

본 발명의 DNA 폴리메라아제의 PCR 반응에서의 성능을 KOD DNA 폴리메라아제와 비교하기 위해, λ-DNA를 주형으로 한 PCR 반응을 행하였다. Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제용 반응액 조성은 1 × KOD plus DNA 폴리메라아제에 첨부된 완충액, 200 μM dNTP, 1 mM (NH₄)₂SO₄로 하고, KOD DNA 폴리메라아제용 반응액 조성은 1 × KOD DNA 폴리메라아제에 첨부된 완충액, 200 μM dNTP, 1 mM MgCl₂로 하여, 1 ng / 50 ㎕ λ-DNA (Takara Shuzo 제), 10 pmol / 50 ㎕ 프라이머 λ-1, 10 pmol / 50 ㎕ 프라이머 λ-9B, 0.625 U / 50 ㎕ DNA 폴리메라아제를 포함하는 반응액 50 ㎕를 조제하였다.

프라이머 λ-1 및 프라이머 λ-9B의 염기서열을 서열표의 서열번호 38 및 서열번호 39에 각각 나타낸다. 상기 반응액에 대하여 98℃, 10초∼68℃, 10분을 1 사이클로 한 30 사이클의 PCR 반응을 행한 후, 반응액 중 3 ㎕를 아가로스 겔 전기영동시켜, 에티듐브로마이드 염색에 의해 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 그 결과, KOD DNA 폴리메라아제를 사용한 것에서는 DNA 단편의 증폭이 확인되지 않았다. 이것에 대하여, Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제에서는 어느 DNA 폴리메라아제를 사용한 경우에 있어서도 약 12 킬로염기쌍의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다.

다음에, 프라이머를 프라이머 λ-1 및 프라이머 λ-10D로 변경하여 실험을 행하였다. 프라이머 λ-10D의 염기서열을 서열표의 서열번호 40에 나타낸다. 상기 동일한 반응액 조성으로 1 ng / 50 ㎕ λ-DNA (Takara Shuzo 제), 10 pmol / 50 ㎕ 프라이머 λ-1, 10 pmol / 50 ㎕ 프라이머 λ-10d, 0.625 U / 50 ㎕ DNA 폴리메라아제를 포함하는 반응액 50 ㎕를 조제하였다. 상기 반응액에 대하여 98℃, 10초∼68℃, 10분을 1 사이클로 한 30 사이클의 PCR 반응을 행한 후, 반응액 중 3 ㎕를 아가로스 겔 전기영동시켜, 에티듐브로마이드 염색에 의해 증폭된 DNA 단편을 확인하였다. 그 결과, KOD DNA 폴리메라아제를 사용한 것에서는 DNA 단편의 증폭이 확인되지 않았다. 이것에 대하여, Tks, Tce 및 Tsi DNA 폴리메라아제에서는 어느 DNA 폴리메라아제를 사용한 경우에 있어서도 약 15 킬로염기쌍의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다.

실시예 9:

(1) 마우스 하이브리도마 세포계의 작성

실시예 3에서 조제한 Tks DNA 폴리메라아제 표본 210 ㎍ (100 ㎕), 실시예 4에서 조제한 Tce DNA 폴리메라아제 표본 210 ㎍ (100 ㎕), 실시예 5에서 조제한 Tsi DNA 폴리메라아제 표본 200 ㎍ (100 ㎕)의 각각에 PBS 800 ㎕를 가해, 프로인트 컴플리트 애드주번트 (complete Freund's adjuvant; Difco Lab. 제) 1 ml와 함께 에멀젼화시켜, 항원 조정물로 하였다. 이들 항원 조제물을 각각 Balb/c 마우스 (10 주령의 암컷, CREA Japan 제) 4 마리씩 등분하여 복강내 투여하였다. 2 주간 후와 5 주간 후에, 상기와 동량의 DNA 폴리메라아제 표본에 PBS 900 ㎕, 리비 (RIBI) 애드주번트 (RIBI 제)를 가한 항원 조제물을 조제하고, 각 마우스에 등분하여 복강내 투여하여 추가 면역을 행하였다. 또한, 초회의 항원 투여로부터 6 주간 후에, 상기와 동량의 각 DNA 폴리메라아제 표본에 PBS 900 ㎕를 가한 항원 조정물을 조제하여, 각 군의 마우스로 등분하여 복강내 투여하여, 최종 면역하였다.

최종 면역의 3일 후에 면역 동물 2 마리로부터 비장을 적출하여, 50% 폴리에틸렌글리콜 존재하에 P3-X63-Ag8-U1 마우스 마이얼로마 (myeloma) 세포와 세포융합하였다. 얻어진 세포는 96웰 플레이트 10 매에 분주하여 배양하였다.

(2) 하이브리도마 세포계의 스크리닝

실시예 9-(1)에서 항원으로 사용한 각 DNA 폴리메라아제 표본의 용액 (5 ㎍/ml)을 사용하여, 각 DNA 폴리메라아제로 코트된 96웰 플레이트를 제작하였다. 상기 세포융합으로 얻어진 세포 중, 세포의 생육이 관찰되는 웰로부터 상청액을 채취하여, 상기 DNA 폴리메라아제 코트 플레이트 상에서 ELISA법을 실시하여 배양 상청액 중의 항 DNA 폴리메라아제 항체의 유무를 검정하였다. 각 DNA 폴리메라아제를 항원으로서 얻어진 900주 이상의 세포주에 대해서 이 검정을 실시하였다. 이 조작에 의해 항체가 생산되는 것으로 판정된 주 (Tks DNA 폴리메라아제: 95주, Tce DNA 폴리메라아제: 103주, Tsi DNA 폴리메라아제: 61주)를 선택하였다.

선택한 세포주를 원주세포로서 배양하여, 이의 배양 상청액에 대하여 각 DNA 폴리메라아제의 42℃에서의 폴리메라아제 활성의 저해를 확인하였다. 저해 활성의 측정은 각 하이브리도마의 배양 상청액 중의 IgG를 결합시킨 항 마우스 IgG 마그넷 비드 (Dynabeads M-280 Sheep anti-Mouse IgG, Dynal Biotech 제)와 DNA 폴리메라아제를 실온에서 10분간 인큐베이트한 후, 42℃에서 DNA 폴리메라아제 활성을 측정하여, DNA 폴리메라아제 단독에서의 DNA 폴리메라아제 활성 측정 결과와 비교한다는 방법으로 행하였다. 그 결과, Tks DNA 폴리메라아제: 18주, Tce DNA 폴리메라아제: 28주, Tsi DNA 폴리메라아제: 11주의 배양 상청액에서 DNA 폴리메라아제 활성의 저해가 확인되었다. 이들 세포주에 대하여, 한계 희석법에 의해 클로닝을 실시하였다.

클론화된 세포의 배양 상청액에 관해서, 각 DNA 폴리메라아제의 42℃에서의 폴리메라아제 활성의 저해를 확인하였다. 폴리메라아제 활성을 95% 이상 저해하는 하이브리도마 클론주로서, Tks DNA 폴리메라아제: 1주, Tce DNA 폴리메라아제: 2주, Tsi DNA 폴리메라아제: 2주가 선택되었다. 이들 하이브리도마 클론주가 생산하는 항체의 이소타입을 검토한 바, Tks, Tce DNA 폴리메라아제에 대한 항체는 IgG2b 타입, Tsi DNA 폴리메라아제에 대한 항체는 IgG1 타입과 G2b 타입의 것이었다. 또한, 이들 하이브리도마의 배양 상청액으로부터 조제한 항체를 94℃, 5분 가열한 경우에는 DNA 폴리메라아제를 저해하는 활성은 완전히 소실하였다. 따라서, 이들 항체는 저온시 특이적으로 내열성 DNA 폴리메라아제의 활성을 저해할 수 있는 것으로 나타났다.

본 발명에 의해, 클로닝, 시퀀싱, 핵산 증폭 중 어느 것에 있어서도 유용한 충실도가 높고, 프라이머 신장에 적합한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 및 이 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법이 제공된다. 본 발명의 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 사용함으로써, 예를 들면 PCR에 있어서 많은 사이클수이어도 에러율이 적은 증폭 산물을 얻을 수 있다. 따라서, 카피수가 적은 표적 핵산의 해석/동정에 있어서 유용하다.

서열표 전문

서열번호 1; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TPPolBF4

서열번호 2; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TPPolBF5

서열번호 3; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TTPolBR1

서열번호 4; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TTPolBR4

서열번호 5; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks01

서열번호 6; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 태그 서열 영역

서열번호 7; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks04

서열번호 8; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks02

서열번호 9; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리 고뉴클레오티드 프라이머 TksNde

서열번호 10; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks1EndBg

서열번호 11; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks2StaBg

서열번호 12; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks2EndBal

서열번호 13; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tks3StaBal

서열번호 14; 서모코커스 sp. KS-1 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TksBgPs

서열번호 17; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TPPolBF1

서열번호 18; 서모코커스 sp. 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TTPolBR5

서열번호 19; 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tce01

서열번호 20; 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tce02

서열번호 21; 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴 클레오티드 프라이머 TceNde

서열번호 22; 서모코커스 셀러 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TceBgPs

서열번호 25; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tsi01

서열번호 26; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 Tsi06

서열번호 27; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TsiNde

서열번호 28; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TsiA

서열번호 29; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TsiB

서열번호 30; 서모코커스 시쿨리 유래 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 TsiBamPst

서열번호 33; M13의 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 HT

서열번호 34: 서머스 서모필러스 HB-8 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 c280/RG34-F

서열번호 35; 서머스 서모필러스 HB-8 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고 뉴클레오티드 프라이머 c280/RG34-R

서열번호 36; 서머스 서모필러스 HB-8 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 c240/RA18-F

서열번호 37; 서머스 서모필러스 HB-8 게놈 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 c240/RA18-R

서열번호 38; 박테리오파아지 λ의 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 λ-1

서열번호 39; 박테리오파아지 λ의 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 λ-9B

서열번호 40; 박테리오파아지 λ의 DNA를 증폭하는 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머 λ-10D

도 1은 DNA 폴리메라아제의 활성과 반응온도의 관계를 나타내는 도면이다. 도면 중 ◇는 Tks DNA 폴리메라아제, △는 Tce DNA 폴리메라아제, ○는 Tsi DNA 폴리메라아제에 대한 결과를 나타낸다.

도 2는 DNA 폴리메라아제의 활성과 pH의 관계를 나타내는 도면이다. 도면 중 ◇는 Tks DNA 폴리메라아제, △는 Tce DNA 폴리메라아제, ○는 Tsi DNA 폴리메라아제에 대한 결과를 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Polypeptide having DNA polymerase activity <130> 665234 <150> JP 2004-166541 <151> 2004-06-04 <160> 40 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TPPolBF4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n stands for any base <400> 1 ttaatacgac tcactatagg cacaacgtct crccngayac 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TPPolBF5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n stands for any base <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n stands for any base <400> 2 ttaatacgac tcactatagg gagagcgtta cngcntgggg 40 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TTPolBR1 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <400> 3 gctagttatt gctcagcgga cctggttctc katrtarta 39 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TTPolBR4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <400> 4 gctagttatt gctcagcggg taacgctctc kgcrcaytc 39 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 5 cttcatcttc ttctttatct t 21 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide Tag sequence region to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <400> 6 ttacgtctga cgtgtg 16 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks04 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 7 attcccatac ttttctaact c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 8 accggtcccc acgttgccgt t 21 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TksNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 9 gattatgggg gatgacatat gatcctcgac actgac 36 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks1EndBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 10 ggggtacaga gatctaaaat ctaggtacac tat 33 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks2StaBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 11 gtacctagat tttagatctc tgtacccctc aatcatcatc 40 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks2EndBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 12 gtagccgtag tagctgttgg ccaggatctt gat 33 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tks3StaBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 13 atcaagatcc tggccaacag ctactacggt tactacggct 40 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TksBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1 <400> 14 tccgctggaa aacctgcaga gatctcaagt tcccttcgg 39 <210> 15 <211> 2325 <212> DNA <213> Thermococcus sp. KS-1 <400> 15 atgatcctcg acactgacta cataactgag aatggaaaac ccgtcataag gattttcaag 60 aaggagaacg gcgagtttaa gattgagtac gataggactt ttgaacccta catttacgcc 120 ctcctgaagg acgattctgc cattgaggag gtcaagaaga taaccgccga gaggcacgga 180 acggttgtaa cggttaagcg ggctgaaaag gttcagaaga agttcctcgg gagaccagtt 240 gaggtctgga aactctactt tactcaccct caggacgtcc cagcgataag ggacaagata 300 cgagagcatc cagcagttat tgacatctac gagtacgaca tacccttcgc caagcgctac 360 ctcatagaca agggattagt gccaatggaa ggcgacgagg agctgaaaat gcttgccttt 420 gatatcgaga cgctctacca tgagggcgag gagttcgccg aggggccaat ccttatgata 480 agctacgccg acgaggaagg ggccagggtg ataacgtgga agaacgcgga tctgccctac 540 gttgacgtcg tctcgacgga gagggagatg ataaagcgct tcctaaaggt ggtcaaagag 600 aaagatcctg acgtcctaat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctaaaa 660 aaacgctgtg aaaagcttgg aataaacttc acgctcggaa gggacggaag cgagccgaag 720 attcagagga tgggcgacag gtttgccgtc gaagtgaagg gacggataca cttcgatctc 780 tatcctgtga taagacggac gataaacctg cccacataca cgcttgaggc cgtttatgaa 840 gccgtcttcg gtcagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg agatagctac agcttgggag 900 agcggtgaag gccttgagag agtagccaga tactcgatgg aagatgcgaa ggtcacatac 960 gagcttggga aggagttttt ccctatggag gcccagcttt ctcgcttaat cggccagtcc 1020 ctctgggacg tctcccgctc cagcactggc aacctcgttg agtggttcct cctcaggaag 1080 gcctacgaga ggaatgagct ggccccgaac aagcccgatg aaaaggagct ggccagaaga 1140 cgacagagct atgaaggagg ctatgtaaaa gagcccgaga gagggttgtg ggagaacata 1200 gtgtacctag attttagatc tctgtacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccg 1260 gatactctca acagggaagg atgcaaggaa tatgacgttg ccccccaggt cggtcaccgc 1320 ttctgcaagg acttcccagg atttatcccg agcctgcttg gagacctcct agaggagagg 1380 cagaagataa agaagaagat gaaggccacg attgacccga tcgagaggaa gctcctcgat 1440 tacaggcaga gggccatcaa gatcctggcc aacagctact acggttacta cggctatgca 1500 agggcgcgct ggtactgcaa ggagtgtgca gagagcgtaa cggcctgggg aagggagtac 1560 ataacgatga ccatcagaga gatagaggaa aagtacggct ttaaggtaat ctacagcgac 1620 accgacggat tttttgccac aatacctgga gccgatgctg aaaccgtcaa aaagaaggcg 1680 atggagttcc tcaagtatat caacgccaaa ctcccgggcg cgcttgagct cgagtacgag 1740 ggcttctaca aacgcggctt cttcgtcacg aagaagaagt acgcggtgat agacgaggaa 1800 ggcaagataa caacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgcg actggagcga gatagcgaaa 1860 gagacgcagg cgagggttct tgaagctttg ctaaaggacg gtgacgtcga gaaggccgtg 1920 aggatagtca aagaagttac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctg 1980 gtgatccacg agcagataac gagggattta aaggactaca aggcaaccgg tccccacgtt 2040 gccgttgcca agaggttggc cgcgagagga gtcaaaatac gccctggaac ggtgataagc 2100 tacatcgtgc tcaagggctc tgggaggata ggcgacaggg cgataccgtt cgacgagttc 2160 gacccgacga agcacaagta cgacgccgag tactacattg agaaccaggt tctcccagcc 2220 gttgagagaa ttctgagagc cttcggttac cgcaaggaag acctgcgcta ccagaagacg 2280 agacaggttg gtctgggagc ctggctgaag ccgaagggaa cttga 2325 <210> 16 <211> 774 <212> PRT <213> Thermococcus sp. KS-1 <400> 16 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr 130 135 140 Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ala 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys 180 185 190 Arg Phe Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Arg Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu 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oligonucleotide primer TTPolBR5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. <400> 18 gctagttatt gctcagcggg tatctggyga gacrttrtg 39 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tce01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer <400> 19 cgtggtaaga gggtctcgaa t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer Tce02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer <400> 20 ctcaagggct ccggaaggat a 21 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TceNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer <400> 21 aatccaacgg gtggtcatat gatcctcgac gctgac 36 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TceBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer <400> 22 cagagaggag catgcagatc ttcacccctt ccccgcgtt 39 <210> 23 <211> 2325 <212> DNA <213> Thermococcus celer <400> 23 atgatcctcg 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tacgccgggg agatagtgga ggcctgggaa 900 accggcgagg gtcttgagag ggttgcccgc tactccatgg aggacgcaaa ggttaccttc 960 gagctcggga gggagttctt cccgatggag gcccagctct cgaggctcat cggccagggt 1020 ctctgggacg tctcccgctc gagcaccggc aacctggtcg agtggttcct cctgaggaag 1080 gcctacgaga ggaacgaact ggccccgaac aagccgagcg gccgggaagt ggagatcagg 1140 aggcgtggct acgccggtgg ttacgttaag gagccggaga ggggtttatg ggagaacatc 1200 gtgtacctcg actttcgctc tctttacccc tccatcatca taacccacaa cgtctcgccc 1260 gataccctaa acagggaggg ctgtgagaac tacgacgtcg ccccccaggt ggggcataag 1320 ttctgcaaag attttccggg cttcatcccg agcctgctcg gaggcctgct tgaggagagg 1380 cagaagataa agcggaggat gaaggcctct gtggatcccg ttgagcggaa gctcctcgat 1440 tacaggcaga gggccatcaa gatactggcc aacagcttct acggatacta cggctacgcg 1500 agggcgaggt ggtactgcag ggagtgcgcg gagagcgtta ccgcctgggg cagggagtac 1560 atcgataggg tcatcaggga gctcgaggag aagttcggct tcaaggtgct ctacgcggac 1620 acggacggac tgcacgccac gatccccggg gcggacgccg ggaccgtcaa ggagagggcg 1680 agggggttcc tgagatacat caaccccaag ctccccggcc tcctggagct cgagtacgag 1740 gggttctacc tgaggggttt cttcgtgacg aagaagaagt acgcggtcat agacgaggag 1800 ggcaagataa ccacgcgcgg cctcgagata gtcaggcggg actggagcga ggtggccaag 1860 gagacgcagg cgagggtcct ggaggcgata ctgaggcacg gtgacgtcga ggaggccgtt 1920 agaatcgtca gggaggtaac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaaactg 1980 gtgatccacg agcagataac gagggatttg agggactaca aagccacggg accgcacgtg 2040 gcggtggcga agcgcctggc cgggaggggg gtaaggatac gccccgggac ggtgataagc 2100 tacatcgtcc tcaagggctc cggaaggata ggggacaggg cgattccctt cgacgagttc 2160 gacccgacta agcacaggta cgacgccgac tactacatcg agaaccaggt tctgccagcc 2220 gtcgagagga tcctgaaggc cttcggctac cgcaaggagg acctgaaata ccagaagacg 2280 aggcaggtgg gcctgggtgc gtggctcaac gcggggaagg ggtga 2325 <210> 24 <211> 774 <212> PRT <213> Thermococcus celer <400> 24 Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Val 1 5 10 15 Arg Ile Phe Arg Lys Glu Lys Gly Glu Phe Arg Ile Asp Tyr Asp Arg 20 25 30 Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser 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Thermococcus siculi <400> 27 tacccggtgt cccatatgat cctcgacacg gactac 36 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TsiA to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi <400> 28 ctttatgcgg acactgacgg cttcttcgcg acg 33 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TsiB to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi <400> 29 gaagccgtca gtgtccgcat aaagtacttt aaagcc 36 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer TsiBamPst to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi <400> 30 gttcacttgc tgcagggatc ctcacccctt ccccttcgg 39 <210> 31 <211> 2328 <212> DNA <213> Thermococcus siculi <400> 31 atgatcctcg acacggacta catcacggaa gatgggaaac ccgtcataag gatattcaag 60 aaagagaacg gcgagttcaa gatcgagtac gacaggactt ttgaacccta catctacgcc 120 ctcctgaagg acgactccgc gattgaggat gttaaaaaga taaccgccga gaggcacgga 180 acggtggtga aggtcaagcg cgccgaaaag 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gtgacgtcga agaggccgtg 1920 agcatagtca aagaagtgac cgagaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctc 1980 gttatccacg agcagataac gcgcgagctg aaggactaca aggcaacggg accacacgtg 2040 gcgatagcga agaggttagc cgcgagaggc gtcaaaatcc gccccgggac agtcatcagc 2100 tacatcgtgc tcaagggctc cgggaggata ggcgacaggg cgattccctt cgacgagttc 2160 gaccccacga agcacaagta cgatgcagag tactacatcg agaaccaggt tctacctgcc 2220 gtcgagagga ttctgaaggc cttcggctat cgcggtgagg agctcagata ccagaagacg 2280 aggcaggttg gacttggggc gtggctgaag ccgaagggga aggggtga 2328 <210> 32 <211> 775 <212> PRT <213> Thermococcus siculi <400> 32 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Lys 50 55 60 Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro 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primer c240/RA18-F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8 <400> 36 atatcatatg aaagtagagg aagtggttct tcccggcg 38 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer c240/RA18-R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8 <400> 37 atatagatct ttattagaag ctccccttca gggcctccac 40 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer lambda-1B to amplify a lambda DNA <400> 38 gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg 35 <210> 39 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer lambda-9B to amplify a lambda DNA <400> 39 tgtccgtcag ctcataacgg tacttcacg 29 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer lambda-10D to amplify a lambda DNA <400> 40 atatctggcg gtgcaatatc ggtactgt 28

Claims (9)

1. 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지며 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.
2. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산.
3. 제 2 항에 있어서, 서열표의 서열번호 23에 기재된 염기서열 또는 그의 일부를 갖는 핵산.
4. 제 3 항의 핵산에 상보적인 염기서열로 이루어지는 핵산과 가혹한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로, DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산.
5. 폴리펩티드를 생산하는 능력을 갖는 세포를 배양하는 공정 및 배양물로부터 상기 폴리펩티드를 채취하는 공정을 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로, 상기 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지며 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는, 폴리펩티드의 제조방법.
6. 폴리펩티드를 사용하여 핵산을 증폭하는 공정을 포함하는 핵산의 증폭방법으로, 상기 폴리펩티드는 서열표의 서열번호 24에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열 중의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 갖고, 또한 DNA 폴리메라아제 활성을 갖는 핵산의 증폭방법.
7. 제 1 항의 폴리펩티드를 함유하는 핵산 증폭용 조성물.
8. 제 1 항의 폴리펩티드를 함유하는 키트.
9. 제 1 항의 폴리펩티드에 결합하는 항체.

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