KR100586623B1 - 초고온성 고세균 스태필로써머스 마리너스 유래의 신규한내열성 디엔에이 중합효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria) 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus) 균주 유래 내열성 DNA 중합효소 (Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase, 이하 ‘Sma DNA 중합효소’라고 함)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, Sma DNA 중합효소 유전자의 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 발현 및 정제, 이를 통해 생산된 Sma DNA 중합효소의 특성 및 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)에의 이용에 관한 것이다.

본 발명자들은 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA (genomic DNA)로부터 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션 (agarose gel membrane hybridization) 방법과 콜로니 하이브리다이제이션 (colony hybridization) 방법을 이용하여 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함하는 절편들을 선별하였다. 다음으로, Sma DNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였는데, Sma DNA 중합효소 유전자는 종지코돈 (stop codon)을 포함하여 2406 bp로 이루어져 있고, 801개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다. Sma DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소 (family B type DNA polymerase)들의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Sma DNA 중합효소는 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들과 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임이 확인되었으며, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)과 함께 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성 (proofreading activity)도 가지고 있을 것으로 추정되었다. 상기 Sma DNA 중합효소 유전자를 PCR 증폭하여 발현벡터 (expression vector) pET-28b(+)에 삽입한 다음, 대장균 BL21(DE3)에 클로닝 (cloning)하여 발현시킨 후, 열처리와 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정들을 통해 전기 효소를 정제하여 여러 가지 효소 특성들을 살펴본 결과, Sma DNA 중합효소는 pH 7.5와 70-80℃에서 최대 DNA 중합 활성을 나타냈으며, 열에 대한 안정성이 뛰어나 100℃와 95℃에서 각각 3.5시간과 5시간의 반감기 (half-life)를 보였고, 아미노산 서열 비교분석에서 추정된 바와 같이 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성을 가지고 있었다. 이어서, 내열성 DNA 중합효소가 가장 중요하게 이용되어지는 PCR에 있어 Sma DNA 중합효소의 이용 가능성을 살펴본 결과, 전기 Sma DNA 중합효소는 PCR에 이용 가능하였으며, 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 50 mM KCl / 10 mM (NH₄)₂SO₄ / 2 mM MgSO₄ / 1% Triton X-100으로 구성된 반응 완충용액 (reaction buffer) 하에서 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR을 통해 6 kb까지 합성이 가능함을 확인하였다. 또한, PCR 정확성 (PCR fidelity)을 조사한 결과, 상당히 낮은 에러율 (error rate)을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명은 유전공학 및 분자생물학 실험을 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에 이용되어지는 PCR에 있어 가장 중요한 요소인 우수한 DNA 중합 활성을 가지는 내열 성 효소를 제공한다는 데에 의의가 있다. 특히, 본 발명의 Sma DNA 중합효소는 높은 교정 활성을 가지고 있어 PCR 증폭시에 에러율을 낮출 수 있으므로 정확성을 요구하는 PCR에 유용하게 사용될 수 있다는 데에 큰 의의가 있다. 또한, 내열성 Sma DNA 중합효소의 발현 시스템의 구축 및 정제 과정의 확립은 산업적으로 중요한 기술인 PCR에 절대적으로 필요한 내열성 DNA 중합효소의 대량생산을 용이하게 할 뿐만 아니라 생산비용 절감 효과가 있다는 데에 의의가 있다.

스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소(Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase), DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity), 교정 활성 (proofreading activity), 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR), PCR 정확성 (PCR fidelity)

Description

초고온성 고세균 스태필로써머스 마리너스 유래의 신규한 내열성 디엔에이 중합효소{Thermostable DNA polymerase of hyperthermophilic archaebacteria, Staphylothermus marinus}

도 1은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있는 2.5 kb HindIII 절편 (pSIVH)과 2.4 kb EcoRI 절편 (pSIVE)의 제한효소 지도 및 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자의 위치를 나타낸 것이다.

도 2는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.

도 3은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pESMPOL의 구축 과정을 나타낸 것이다.

도 4는 대장균 내에서 발현된 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 정제 단계에 따른 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 pH에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 6은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 온도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 7은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 열안정성을 나타낸 그래프 이다.

도 8는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 KCl 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 9는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 (NH₄)₂SO₄ 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 10은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 2가 양이온 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

도 11은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 핵산말단가수분해효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 12는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 pH에 따른 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 KCl과 (NH₄)₂SO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다.

도 14는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 MgCl₂와 MgSO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸 것이다.

도 15는 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 최적 반응 완충용액 하에서 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 새로운 내열성 DNA 중합효소 (thermostable DNA polymerase)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 발현 및 정제, 효소 특성 및 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)에의 이용에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria)에 속하는 균주인 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus)로부터의 내열성 DNA 중합효소 (Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase, 이하 ‘Sma DNA 중합효소’라고 함)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, Sma DNA 중합효소 유전자의 대장균 내에서의 발현 및 정제, 이를 통해 생산된 Sma DNA 중합효소의 특성 및 PCR에의 이용에 관한 것이다.

DNA 중합효소 (deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 주형 DNA (template DNA)에 의존하여 5′→3′ 방향으로 DNA를 합성하는 효소로서, 생명체에 있어 DNA 복제 (DNA replication)나 수리 (DNA repair)시에 가장 중요한 역할을 하는 효소이다 (참조: Lehninger, A. L. et al., 1993, Principles of biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers). DNA 중합효소는 1957년 콘버그 (Kornberg) 등에 의해 대장균에서 최초로 발견되었는데 (참조: Konberg, A. and Baker, T., 1992, DNA replication, 2nd ed., Freeman Company), 이 대장균 DNA 중합효소Ⅰ (Escherichia coli DNA polymeraseⅠ, E. coli DNA polymeraseⅠ)은 5′→3′ 핵산말단가수분해효소 활성 (5′→3′ exonuclease activity), 교정 활성 (proofreading activity)이라 불리는 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity) 및 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)인 5′→3′ 중합효소 활성 (5′→3′ polymerase activity)을 함께 가진다.

내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔 (Chien) 등에 의해 고온균인 써머스 아쿠아티커스 와이티-1 (Thermus aquaticus YT-1)에서 최초로 분리된 이후, 같은 써머스 속 (genus)에 속하는 써머스 플라버스 (Thermus flavus), 써머스 써모필러스 에이치비8 (Thermus thermophilus HB8) 등에서 분리되어 그 특성들이 밝혀졌으나, 그다지 주목을 받지 못했다 (참조: Chien, A. et al., 1976, J. Bacteriol. 127, 1550-1557; Kaledin, A. S. et al., 1981, Biokhimiya 46, 1576-1584; Ruettimann, C. et al., 1985, Eur. J. Biochem. 149, 41-46). 그러나, 1988년 사이키 (Saiki) 등에 의해 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR 기술이 개발 (참조: Saiki, R. K. et al., 1988, Science 239, 487-491)되면서 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하여, 현재까지 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 써머스 칼도필러스 지케이24 (Thermus caldophilus GK24), 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis) 및 파이로코커스 워세이 (Pyrococcus woesei) 등의 여러 고온균 및 초고온성 고세균들로부터 내열성 DNA 중합효소가 경쟁적으로 개발되어져 왔다 (참조: Mattila, P. et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19, 4967-4973; Lundberg, K. S. et al., 1991, Gene 108 , 1-6; Park, J. H. et al., 1993, Eur. J. Biochem. 214, 135-140; Jung, S. E. et al., 1997, Mol. Cells 7, 769-776; Dabrowski, S. and Kur, J., 1998, Protein Expres. Purif. 14, 131-138). 특히, 써모코커스와 파이로코커스 속 균주 유래 DNA 중합효소들은 써머스 속 균주 유래 DNA 중합효소들과는 달리 교정 활성을 갖는 내열성 DNA 중합효소들이라는 점에서 더욱 주목을 받아왔으며, 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 사용되어져 왔다.

PCR은 DNA 중합효소와 프라이머 (primer)를 이용하여 극미량의 주형 DNA를 대량으로 증폭시키는 기술로서, DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 40-65℃) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃)의 3단계 과정을 연속적으로 반복한다. 따라서, 반응 특성상 고온을 필요로 하기 때문에, PCR에 있어 가장 중요한 요소인 내열성 DNA 중합효소의 개발은 다양한 PCR 기술의 개발과 발전을 위해 필수불가결하다 (참조: Erlich, H. A., 1989, PCR technology: principles and applications for DNA amplification, Stockton Press). 내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 확인 및 증폭, DNA 염기서열 결정, 임상진단 등에 있어 매우 유용한 효소로서, 유전공학 및 분자생물학 실험을 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다.

현재까지 초고온성 고세균인 스태필로써머스 마리너스로부터 DNA 중합효소 유전자의 염기서열이나 전기 유전자가 암호화하는 내열성 DNA 중합효소에 대한 특 성 또는 이용에 대하여 밝혀진 것이 없다. 따라서, 본 발명자들은 초고온성 고세균 스태필로써머스 마리너스로부터 내열성 DNA 중합효소 유전자를 분리하고, 전기 유전자가 암호화하고 있는 효소를 대장균 내에서 발현시켜 정제한 다음, 효소 특성을 밝히고 PCR에 이용하고자 하였다. 이는 현재까지 그 예가 없는 스태필로써머스 마리너스로부터의 내열성 DNA 중합효소의 산업적 이용을 위해 중요한 의의를 가질 것이다.

이에, 본 발명자들은 초고온성 고세균 (hyperthermophilic archaebacteria)의 일종인 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus)로부터 교정 활성 (proofreading activity)을 가지는 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝 (cloning)하고자 예의 연구노력한 결과, 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA (genomic DNA)로부터 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 (Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase, 이하 ‘Sma DNA 중합효소’라고 함) 유전자를 선별하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여, Sma DNA 중합효소가 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소 (family B type DNA polymerase)들과 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임을 확인하였다. 다음으로, 상기 유전자를 발현벡터 (expression vector)에 삽입한 다음, 대장균 (Escherichia coli)에 클로닝하여 발현시킨 후, 열처리와 3단계의 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정들을 통해 정제하였다. 이어서, 정제된 Sma DNA 중합효소의 효소 특성들을 조사함 으로써, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)에 있어서의 특성을 알 수 있었으며, DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 마지막으로, Sma DNA 중합효소를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)을 수행함으로써, 정제된 Sma DNA 중합효소가 PCR에 이용될 수 있음을 확인하였으며, 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 전기 효소를 이용한 PCR을 통해 6 kb까지 합성이 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 우수한 DNA 중합 활성 및 교정 활성을 가지는 스태필로써머스 마리너스 균주 유래 내열성 DNA 중합효소를 이용하여 적절한 조건 하에서 PCR을 수행하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 스태필로써머스 마리너스로부터 교정 활성을 가지는 새로운 내열성 DNA 중합효소인 Sma DNA 중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PCR에 있어 유용한 효소인 Sma DNA 중합효소를 대량생산하는 대장균 내에서의 발현 시스템과 정제 방법을 제공함과 함께, 전기와 같이 생산되는 Sma DNA 중합효소의 효소 특성을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 여러 가지 제한효소 (restriction enzyme)로 각각 절단된 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus)의 게노믹 DNA (genomic DNA)로부터 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션 (agarose gel membrane hybridization) 방법으로 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 (Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase, 이하 ‘Sma DNA 중합효소’라고 함) 유전자를 포함하는 절편들을 선별하고, 전기 절편들을 벡터 (vector)에 삽입한 다음, 대장균 (Escherichia coli)에 클로닝 (cloning)하였다. 이어서, 콜로니 하이브리다이제이션 (colony hybridization) 방법으로 전기 형질전환된 대장균들 중에서 Sma DNA 중합효소의 유전자 절편을 포함하는 양성 클론 (positive clone)들을 선별하고, 양성으로 판명된 클론들로부터 Sma DNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여 상기와 동일한 방법으로 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 전기 양성 클론들이 Sma DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있음을 재확인하였다. 다음으로, Sma DNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였는데, Sma DNA 중합효소 유전자는 종지코돈 (stop codon)을 포함하여 2406 bp로 이루어져 있고, 92369 Da의 추정 분자량을 가지는 801개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다. Sma DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소 (family B type DNA polymerase)들의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Sma DNA 중합효소는 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들과 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임이 확인되었으며, DNA 중합 활성(DNA polymerization activity)과 함께 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성(proofreading activity)도 가지고 있을 것으로 추정되었다. 상기 Sma DNA 중합효소 유전자를 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR’이라고 함)을 통해 증폭하여 발현벡터 (expression vector) pET-28b(+)에 삽입한 다음, 대장균 BL21(DE3)에 클로닝(cloning)하여 발현시킨 후, 열처리와 3단계의 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정들을 통해 전기 효소를 정제하여 여러 가지 효소 특성들을 살펴본 결과, Sma DNA 중합효소는 pH 7.5와 70-80℃에서 최대 DNA 중합 활성을 나타냈으며, 열에 대한 안정성이 뛰어나 100℃와 95℃에서 각각 3.5시간과 5시간의 반감기 (half-life)를 보였고, DNA 중합 활성에 있어 최적 KCl, (NH₄)₂SO₄ 및 Mg²⁺ 농도는 각각 60-100 mM, 20-30 mM 및 12-20 mM이었다. 또한, 아미노산 서열 비교분석에서 추정된 바와 같이 Sma DNA 중합효소는 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성을 가지고 있었다. 이어서, 내열성 DNA 중합효소가 가장 중요하게 이용되어지는 PCR에 있어 Sma DNA 중합효소의 이용 가능성을 살펴본 결과, 전기 Sma DNA 중합효소는 PCR에 이용 가능하였는데, PCR 반응 완충용액 (reaction buffer)의 최적 pH는 8.0-9.0이었고, 최적 KCl, (NH₄)₂SO₄, MgCl₂ 및 MgSO₄ 농도는 각각 50-80 mM, 25-30 mM, 2-6 mM 및 2-6 mM이었다. 또한, 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 50 mM KCl / 10 mM (NH₄)₂SO₄ / 2 mM MgSO₄ / 1% Triton X-100으로 구성된 반응 완충용액 하에서 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR을 수행해 본 결과, 6 kb까지 합성이 가능함을 확인할 수 있었다. 마지막으로, Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 PCR 정확성 (PCR fidelity)을 조사해 본 결과, 상당히 낮은 에러율 (error rate)을 나타냄을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 생육적온이 85-90℃로 알려진 스태필로써머스 마리너스로부터 높은 교정 활성을 가지는 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자를 대장균 내에서 발현시켜 정제한 다음, 이와 같이 생산된 내열성 Sma DNA 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하고자 하였다. 먼저, 기존에 보고된 초고온성 고세균 유래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들에 잘 보존되어 있는 모티프 (motif)들인 PolⅠ과 PolⅡ의 아미노산 서열을 바탕으로 프라이머들을 제작한 다음, 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 나온 증폭산물을 Sma DNA 중합효소 유전자를 선별하기 위한 탐침자(probe)로 사용하였다. 다음으로, 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 여러 가지 제한효소를 각각 처리하여 완전히 절단시킨 후, 각 제한효소에 의하여 생성된 DNA 절편들에 대하여 상기 탐침자를 이용해서 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 약 2.4 kb 위치에서 검출되는 제한효소 EcoRI으로 절단된 게노믹 DNA의 절편이 Sma DNA 중합효소 유전자의 일부 또는 전체를 포함하고 있을 것으로 예상되었으므로, 전기 절편을 벡터에 삽입한 다음, 대장균에 클로닝하였다. 형질전환된 대장균을 아가 플레이트(agar plate)상의 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에서 배양한 다음, 상기 탐침자를 이용한 콜로니 하이브리다이제이션을 실시하여 양성 클론들을 얻었고, 이들이 Sma DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있을 것으로 예상하였다. 이어서, 상기 양성 클론으로부터 삽입 유전자 절편을 분리한 다음, 상기와 동일한 방법으로 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시하여 상기 양성 클론이 분명히 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있음을 재확인한 후, 염기 서열을 결정한 결과, 상기 양성 클론은 Sma DNA 중합효소 유전자의 상당 부분을 포함하고 있었지만, 개시코돈(start codon)을 포함한 앞쪽 일부를 포함하고 있지 않음을 알 수 있었다. 따라서, Sma DNA 중합효소 유전자의 나머지 부분을 포함하는 절편을 선별하기 위해 상기 양성 클론의 유전자 절편을 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단한 다음, 이를 통해 얻어진 0.9 kb의 단편을 새로운 탐침자로 사용해서 상기와 같이 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션과 콜로니 하이브리다이제이션을 수행하여 양성 클론을 얻었고, 이 양성 클론이 가지는 유전자 절편의 염기서열을 결정하여 Sma DNA 중합효소 유전자의 나머지 부분을 포함하고 있음을 확인하였다. 상기와 같이 결정된 Sma DNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 분석하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였는데, Sma DNA 중합효소 유전자는 종지코돈을 포함하여 2406 bp로 이루어져 있고, 92369 Da의 추정 분자량을 가지는 801개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다. Sma DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들인 파이로딕티움 오큘튬(Pyrodictium occultum), 파이로바큘럼 아이스란디큠(Pyrobaculum islandicum) 및 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus)의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Sma DNA 중합효소는 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들과 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임이 확인되었으며, DNA 중합 활성과 함께 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성도 가지고 있을 것으로 추정되었다.

다음으로, 본 발명자들은 결정된 Sma DNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 5′ 말단 및 3′ 말단에 각기 상보적인 프라이머를 제작한 후, 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 Sma DNA 중합효소 유전자를 증폭시킨 다음, 발현벡터 pET-28b(+)에 삽입하여 Sma DNA 중합효소 생산을 위한 재조합 플라스미드(recombinant plasmid) pESMPOL을 구축하였다. 상기 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 클로닝하여 발현시킨 후, 열처리와 HiTrap Heparin HP 컬럼, HiTrap Q FF 컬럼, HiTrap SP FF 컬럼을 이용한 3단계의 컬럼 크로마토그래피 (column chromatography) 과정들을 통해 전기 효소를 정제하여 여러 가지 효소 특성들을 살펴본 결과, Sma DNA 중합효소는 pH 7.5와 70-80℃에서 최대 DNA 중합 활성을 나타냈으며, 열에 대한 안정성이 뛰어나 100℃와 95℃에서 각각 3.5시간과 5시간의 반감기를 보였고, DNA 중합 활성에 있어 최적 KCl, (NH₄)₂SO₄ 및 Mg²⁺ 농도는 각각 60-100 mM, 20-30 mM 및 12-20 mM이었다. 또한, 아미노산 서열 비교분석에서 추정된 바와 같이 Sma DNA 중합효소는 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 교정 활성을 가지고 있었다. 이어서, 내열성 DNA 중합효소가 가장 중요하게 이용되어지는 PCR에 있어 Sma DNA 중합효소의 이용 가능성을 살펴본 결과, 전기 Sma DNA 중합효소는 PCR에 이용 가능하였는데, PCR 반응 완충용액의 최적 pH는 8.0-9.0이었고, 최적 KCl, (NH₄)₂SO₄, MgCl₂ 및 MgSO₄ 농도는 각각 50-80 mM, 25-30 mM, 2-6 mM 및 2-6 mM이었다. 또한, 람다 파아지 (λ phage)의 게노믹 DNA를 주형으로 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 50 mM KCl / 10 mM (NH₄)₂SO₄ / 2 mM MgSO₄ / 1% Triton X-100으로 구성된 반응 완충용액 하에서 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR을 수행해 본 결과, 6 kb 까지 합성이 가능함을 확인할 수 있었다. 마지막으로, Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 PCR 정확성을 조사해 본 결과, 상당히 낮은 에러율을 나타냄을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 결과들을 통해 Sma DNA 중합효소가 고도의 정확성을 요구하는 PCR에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 스태필로써머스 마리너스 균주의 배양

스태필로써머스 마리너스 균주 (DSM 3639)(참조: Stetter, K. O. et al., 1986, Int. J. Syst. Bacteriol. 36, 573-576)는 약간 변형된 DSMZ 377 배지에서 배양하였다. 약간 변형된 DSMZ 377 배지의 준비는 다음과 같이 하였다. 배지 성분들(1 ℓ당 펩톤 (peptone) 5.0 g, 효모추출물 (yeast extract) 1.0 g, elemental sulfur 30.0 g, NaCl 13.85 g, MgSO₄?7H₂O 3.5 g, MgCl₂?6H₂O 2.75 g, KCl 0.325 g, NaBr 0.05 g, H₃BO₃ 0.015 g, SrCl₂?6H₂O 7.5 mg, (NH₄ )₂SO₄ 10.0 mg, citric acid 5.0 mg, KI 0.05 mg, CaCl₂?2H₂O 0.75 g, KH₂PO₄ 0.5 g, NiCl ₂?6H₂O 2.0 mg, rezazurin 1.0 mg, 미량원소 용액 (trace element solution) 10.0 ㎖)을 준비한 다 음, 5 N 황산으로 pH 6.3-6.5를 맞췄다. 120 ㎖ serum bottle (Wheaton Co., USA)에 전기 배지 용액 100 ㎖을 넣고, 질소가스로 배지 용액을 포함한 serum bottle 내부의 가스를 30분간 교환한 다음, 고무병마개와 알루미늄 링으로 serum bottle의 입구를 막은 후, 5% Na₂S?9H₂O 용액을 소량 주입하고, 95℃에서 3-5일간 멸균하였다. 이렇게 준비된 배지에 멸균된 주사기를 이용하여 스태필로써머스 마리너스 균주를 1% 접종한 후, 90℃에서 5-7일간 배양하였다.

실시예 2: 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA의 분리

게노믹 DNA의 분리는 칼러(Kahler)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다(참조: Kahler, M., 2000, J. Bacteriol. 182, 655-663). 혐기적 조건 하에서 배양된 배양액으로부터 황을 제거하고, 원심분리를 통해 균체를 회수한 후, 20% 수크로스(sucrose)를 포함하는 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액으로 균체를 현탁하고, 얼렸다 녹이기(freezing and thawing)를 2회 반복하여 세포막을 약화시킨 다음, Triton X-100을 최종 농도가 0.3%가 되도록 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 SET (150 mM NaCl / 1 mM EDTA / 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)) 완충용액을 첨가하고, SDS와 RNase를 첨가하여 55℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, proteinase K를 첨가하여 37℃에서 1시간, 55℃에서 2시간 반응시켰다. 이어서, 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform/isoamylalcohol)(24:1) 동량을 첨가하여 흔들어주면서 하룻밤 반응시킨 후, 2배 부피의 100% 에탄올 (ethanol)과 1/10배 부피의 3 M sodium acetate (pH 5.2)를 첨가하여 게노믹 DNA를 침전시킨 다음, 70% 에탄올로 세척하여 진공건조시키고, TE(10 mM Tris-HCl (pH 7.6) / 1 mM EDTA)완충용액에 녹였다. 상기와 같이 분리된 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA는 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

실시예 3: 탐침자의 제조 및 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션

스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA로부터 Sma DNA 중합효소 유전자를 선별하기 위한 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션의 탐침자로 사용하고자, 기존에 보고된 초고온성 고세균 유래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들에 잘 보존되어 있는 PolⅠ과 PolⅡ의 아미노산 서열을 바탕으로 프라이머들을 제작한 후, 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 약 440 bp 정도의 증폭산물을 얻었다. 상기 PCR 증폭산물의 염기서열을 결정하여 내열성 B 계열 DNA 중합효소들과 높은 서열 상동성이 있음을 확인한 후, 방사선 동위원소 [α-³²P]dCTP와 Random Primer DNA Labeling Kit(Takara Inc., Japan)를 사용하여 상기 PCR 증폭산물을 표식(labeling)한 다음, 정제하여 탐침자로 사용하였다.

상기 실시예 2에서 분리한 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA와 상기와 같이 제조한 탐침자를 이용하여 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 수행하였다 (참조: 권석태 등, 1991, 분자생물학노트 - 유전공학실험서, 한국과학기술연구원 유전공학연구소 발행). 먼저, 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 제한효소들로 각각 절단하여 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 이어서, 0.5 N NaOH / 0.1 M NaCl 용액으로 상기 겔을 1시간 동안 변성시킨 후, 증류수로 30분간 세척한 다음, 겔을 종이타월 사이에 넣고 약 1 ㎏ 정도 무게의 물체를 올려놓는 방법으로 압축하여 약 1 ㎜ 두께가 되도록 하였다. 압축된 겔을 Whatman 3MM Paper(USA)로 옮겨 65℃에서 30분간 진공건조시켜서 막(membrane) 상태로 만든 후, 증류수로 세척하여 잔류 NaOH 및 Whatman 3MM Paper를 완전히 제거하였다. 다음으로, 막 상태의 겔을 프리하이브리다이제이션(pre-hybridization)용액 (6X SSC, 5X Denhart's solution, 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.1% SDS, 100 ㎍/㎖ sonicated salmon sperm DNA)에 넣어 65℃에서 1시간 반응시킨 후, 상기 탐침자를 첨가한 하이브리다이제이션 용액에 넣어 50℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 하이브리다이제이션이 끝난 겔의 세척은 0.1% SDS를 포함하는 6X, 3X, 1X, 0.1X SSC 용액으로 실온에서 15분씩 단계적으로 수행하였다. 상기의 세척한 겔을 공기 중에서 건조시킨 후, 오토라디오그래피 (autoradiography)를 수행한 다음, 필름을 현상하여 탐침자와 하이브리다이제이션하는 밴드(band)들을 찾아 Sma DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 목적 DNA들의 크기를 확인하였다. 밴드들 중에서 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함할 것으로 예상되면서 클로닝하기에 적합한 크기인 2.4 kb EcoRI 밴드를 선별하였다.

실시예 4: 저융점 아가로스 겔로부터 Sma DNA 중합효소 유전자 절편의 회수 및 형질전환

상기 실시예 3에서 EcoRI으로 절단된 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA를 0.7% 저융점 아가로스 겔 (low melting agarose gel)에 DNA 사이즈 마커 (DNA size marker)와 함께 전기영동한 다음, EcoRI 2.4 kb 위치에 해당하는 겔 단편을 회수하였다. 상기 겔 단편을 65℃에서 가열하여 완전히 녹인 다음, 2배 부피의 TE 완충용액을 첨가하여 다시 5분간 가열한 후, TE 포화 페놀 (TE saturated phenol) 및 클로로포름/이소아밀알코올(24:1) 동량으로 DNA를 추출하였다. 이어서, 에탄올 침전을 통해 DNA 절편을 회수하였다.

상기와 같이 회수한 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제(T4 DNA ligase)를 사용하여 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pBluescript SK-에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 MV1184(Takara Inc., Japan)에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

실시예 5: 콜로니 하이브리다이제이션

Sma DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 클론들을 선별하기 위하여 다음과 같이 콜로니 하이브리다이제이션을 수행하였다(참조: Hanahan, D. and Meselson, M., 1980, Gene 10, 63-67). 먼저, 100 ㎍/㎖ 농도로 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 아가 플레이트(LB agar plate) 상에 니트로셀룰로스 막을 깔고, 그 위에 형질전환체(transformant)들을 멸균된 이쑤시개로 찍은 다음, 37℃에서 배양하여 콜로니(colony)들을 형성시켰다. 상기 콜로니들이 약 1 ㎜ 크기로 생육되었을 때, 니트로셀룰로스 막을 0.5 N NaOH / 1.5 M NaCl 용액으로 5분간 처리한 후, 1.5 M NaCl / 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) 용액으로 5분간 처리한 다음, 0.2 M Tris-HCl (pH 7.5) / 2X SSC 용액으로 5분간 처리하였다. 이어서, 상기 니트로셀룰로스 막을 UV 조사로 크로스 링킹(cross-linking)시킨 다음, 상기 실시예 3의 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션에서와 동일한 방법으로 하이브리다이제이션 및 오토라디오그래피를 수행하여, 상기 탐침자와 하이브리다이제이션하는 양성 클론들을 확인하였다.

상기 양성 클론들을 재확인하기 위하여 알카리 용균법(alkaline lysis method)에 의해 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 분리한 다음(참조: Sambrook, J. et al., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2.4 kb EcoRI 절편이 클로닝되었다고 예상되는 양성 클론들의 플라스미드 DNA들을 제한효소 EcoRI으로 절단하여 아가로스 겔에 전기영동한 후, 상기 실시예 3의 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션에서와 동일한 방법으로 하이브리다이제이션 및 오토라디오그래피를 수행하여, 상기 탐침자와 하이브리다이제이션하는 밴드들을 재확인하였다. 상기 방법에 의해 2.4 kb EcoRI 절편을 포함하는 양성 클론을 pSIVE라 명명하였다.

실시예 6: 제한효소 지도 작성, 서브클로닝 및 염기서열 결정

상기 pSIVE를 다양한 제한효소로 절단하여 다음과 같이 제한효소 지도를 작성하였다. 먼저, 하나 또는 둘 이상의 제한효소들로 pSIVE를 절단한 다음, 0.8% 및 2.0% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동 후, DNA 사이즈 마커와 비교함으로써 절단된 DNA 단편들의 크기를 측정하여, 제한효소 위치에 따라 그 순서대 로 제한효소 지도를 작성하였다(참조: 도 1). 도 1은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있는 2.5 kb HindIII 절편(pSIVH)과 2.4 kb EcoRI 절편(pSIVE)의 제한효소 지도 및 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자의 위치를 나타낸 것으로서, 도 1에서 E, H, P, S 및 X는 각각 제한효소 EcoRI, HindIII, PstI, SacI 및 XhoI을 나타내며, 화살표는 Sma DNA 중합효소 유전자의 위치와 크기를 나타낸다.

상기와 같이 작성한 제한효소 지도를 참조하여, 염기서열 결정에 적합한 크기가 되도록 pSIVE를 절단한 다음, 각기 동일한 제한효소로 절단된 벡터 pBluescript SK-에 삽입한 후, 대장균에 형질전환시킴으로써 DNA 단편들을 서브클로닝 (subcloning)하였다.

상기와 같이 서브클로닝된 DNA 단편들을 포함하는 플라스미드 DNA들을 알카리 용균법에 의해 분리한 다음, 주식회사 마크로젠 (Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 상기 2.4 kb EcoRI 절편은 Sma DNA 중합효소 유전자의 상당 부분을 포함하고 있었지만, 개시코돈(start codon)을 포함한 앞쪽 일부를 포함하고 있지 않음을 알 수 있었다.

실시예 7: 새로운 탐침자의 제조, 하이브리다이제이션 및 염기서열 결정

Sma DNA 중합효소 유전자의 나머지 부분을 포함하는 절편을 선별하기 위한 탐침자로 사용하고자, 상기 pSIVE를 제한효소 EcoRI과 XhoI으로 절단한 다음, 2.4 kb EcoRI 절편 내에 위치하는 0.9 kb 단편을 상기 실시예 4에서와 같이 저융점 아 가로스 겔로부터 회수하였다. 이 회수된 0.9 kb EcoRI / XhoI 단편을 상기 실시예 3에서와 같이 방사선 동위원소 [α-³²P]dCTP와 Random Primer DNA Labeling Kit를 사용하여 표식한 다음, 정제하여 새로운 탐침자로 사용하였다. 이어서, 상기 실시예 3, 4, 5에서와 동일한 방법으로 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션, 저융점 아가로스 겔로부터 DNA 절편의 회수, 형질전환 및 콜로니 하이브리다이제이션을 수행하여, 2.5 kb HindIII 절편을 포함하는 양성 클론을 얻었고, 이를 pSIVH라 명명하였다. 다음으로, 상기 실시예 6에서와 동일한 방법으로 제한효소 지도 작성 (참조: 도 1), 서브클로닝 및 염기서열 결정을 수행하여, 2.5 kb HindIII 절편이 상기 2.4 kb EcoRI 절편에 포함되어 있지 않은 Sma DNA 중합효소 유전자의 나머지 부분을 포함하고 있음을 확인하였다. Sma DNA 중합효소 유전자는 종지코돈을 포함하여 2406 bp로 이루어져 있으며, 92369 Da의 추정 분자량을 가지는 801개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다 (서열번호 1및 2). 상기 Sma DNA 중합효소 유전자는 한국농용미생물보존센터(KACC)에 2004년 2월 6일 기탁번호 KACC 95020 로서 기탁되어 있다.

실시예 8: Sma DNA 중합효소의 아미노산 서열 결정 및 종래의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과의 비교분석

서열 분석 소프트웨어인 DNASIS(Hitachi Software Engineering Co., Japan)를 이용하여 상기 실시예 6과 7에서 결정된 Sma DNA 중합효소 유전자의 염기서열로 부터 아미노산 서열을 유추한 다음, 컴퓨터 프로그램인 NCBI BLAST Search를 이용하여 전기 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들인 파이로딕티움 오큘튬, 파이로바큘럼 아이스란디큠 및 파이로코커스 퓨리오서스의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교분석하였다(참조: 도 2). 도 2는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 B 계열 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것으로서, 도 2에서 Sma, Poc, Pis 및 Pfu는 각각 스태필로써머스 마리너스, 파이로딕티움 오큘튬, 파이로바큘럼 아이스란디큠 및 파이로코커스 퓨리오서스 DNA 중합효소를 나타내고, 박스 부분은 아미노산 서열의 보존부위를 나타내며, PolⅠ-Ⅵ 및 ExoⅠ-Ⅲ는 각각 DNA 중합 활성 및 교정 활성에 중요한 역할을 하는 모티프들을 나타낸다. Sma DNA 중합효소는 아미노 말단(NH₂-terminus)이 류신(leucine, L)으로 시작하여 카르복실 말단(COOH-terminus)이 라이신 (lysine, K)으로 끝나는 801개의 아미노산으로 구성되어진 새로운 내열성 B 계열 DNA 중합효소임이 확인되었으며, 파이로딕티움 오큘튬, 파이로바큘럼 아이스란디큠 및 파이로코커스 퓨리오서스의 DNA 중합효소들과 각각 66%, 52% 및 44%의 아미노산 서열 상동성을 보였다. 또한, Sma DNA 중합효소는 내열성 B 계열 DNA 중합효소들에 잘 보존되어 있는 6개의 DNA 중합 활성 관련 모티프들과 3개의 교정 활성 관련 모티프들을 가지고 있음이 확인되었다.

실시예 9: Sma DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 및 발 현 시스템의 구축

상기 실시예 7에서 결정된 Sma DNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 5′ 말단 및 3′ 말단에 각각 상보적인 프라이머들을 제작하였다. 5′ 말단 프라이머 (5′-NNNNCC ATG GGTGAGAAAATAAACTTGGAATTC-3′)는 절단부위 내에 개시코돈 (ATG)을 가지는 제한효소 NcoI 절단 부위 (CCATGG)를 포함하여 33개의 염기로 합성하였으며, 3′ 말단 프라이머 (5′-NNNNGTCGAC CTATTTTTTACCACC AAAGAAATC-3′)는 Sma DNA 중합효소 유전자의 종지코돈(TAG) 및 제한효소 SalI 절단부위(GTCGAC)를 포함하여 34개의 염기로 합성하였다. 5′ 말단 프라이머의 경우, 발현벡터의 개시코돈을 그대로 이용하기 위해 Sma DNA 중합효소 유전자의 개시코돈(TTG) 및 2번째 코돈 (AGT)이 각각 ATG 및 GGT로 치환되었다. 이어서, 상기 실시예 2에서 분리된 스태필로써머스 마리너스의 게노믹 DNA를 주형으로 다음과 같이 PCR을 수행하여 Sma DNA 중합효소 유전자를 증폭시켰다. Super Taq Plus DNA 중합효소 (슈퍼바이오 주식회사, Korea)를 제외한 PCR 반응 혼합물 (0.2 ㎍ 스태필로써머스 마리너스 게노믹 DNA와 20 pmole 5′ 말단 프라이머 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 1X Super Taq Plus DNA 중합효소 반응 완충용액)에 100℃에서 5분간 열을 가하여 전기 게노믹 DNA를 변성시키고 얼음에서 급냉시킨 다음, Super Taq Plus DNA 중합효소 2.5 유닛(unit)을 첨가하여 DNA 변성(DNA denaturation, 94℃, 1분), 프라이머 어닐링(primer annealing, 55℃, 1분 30초) 및 DNA 증폭(DNA extension, 72℃, 2분 30초, 단 마지막 회에서는 10분)의 3단계 과정을 30회 반복한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 2.4 kb 위치에 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. 다음으로, 반응이 끝난 PCR 반응 혼합물에 TE 포화 페놀 및 클로로포름 / 이소아밀알코올(24 : 1)을 동량으로 처리하여 PCR을 통해 증폭된 DNA 단편을 추출한 후, 에탄올 침전을 통해 회수하였다. 회수된 DNA 단편을 제한효소 NcoI 및 SalI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 저융점 아가로스 겔에 전기영동한 다음, 상기 실시예 4에서와 같이 제한효소 절단된 DNA 단편을 회수하였다. 회수된 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함하는 제한효소 절단된 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pET-28b(+) (Stratagene, USA)에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 방법으로 대장균 BL21(DE3) (Stratagene, USA)에 클로닝하였다. 이어서, 형질전환체들로부터 알카리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소 NcoI 및 SalI으로 절단한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함하는 DNA 단편이 정확히 삽입되어 있는 형질전환체를 선별하였다. 이와 같이 구축된 Sma DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드를 pESMPOL이라 명명하였으며(참조: 도 3), 이 재조합 플라스미드 pESMPOL을 가지는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 대장균 BL21(DE3) / pESMPOL이라 명명하였다. 도 3은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pESMPOL의 구축 과정을 나타낸 것으로서, 도 3에서 Ori, Kan^r 및 LacⅠ는 각각 복제 개시부위, 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자 및 lac 억제 유전자 (lac repressor gene)를 나타낸다.

실시예 10: 대장균 내에서 발현된 Sma DNA 중합효소의 정제

상기 실시예 9에서 구축된 재조합 플라스미드 pESMPOL을 가지는 대장균 BL21(DE3)를 최종 농도가 50 ㎍/㎖이 되도록 카나마이신을 첨가한 2X YT 배지 40 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 정도 전배양한 후, 최종 농도가 50 ㎍/㎖이 되도록 카나마이신을 첨가한 2X YT 배지 2 ℓ에 1% 접종하여 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양한 다음, 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 IPTG (isopropyl β-D-galactopyranoside)를 첨가하고, 다시 6시간 동안 본배양을 계속하였다. 이어서, 원심분리를 통해 균체를 회수한 다음, 회수된 균체를 lysis A (50 mM Tris-HCl (pH 7.9) / 1 mM EDTA / 50 mM glucose / 1 ㎎/㎖ lysozyme) 용액에 현탁하고, lysis B (10 mM Tris-HCl (pH 7.9) / 50 mM KCl / 1 mM EDTA / 1 mM PMSF / 0.5% Tween 20 / 0.5% Nonidet P40) 용액을 첨가하여 초음파 파쇄한 후, 원심분리를 통해 회수하였다. 다음으로, 85℃에서 40분간 열처리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수함으로써 대장균 유래의 단백질들을 대부분 제거하였다. 상기 상층액을 완충용액 A (10 mM Tris-HCl (pH 7.9) / 1 mM EDTA / 1 mM PMSF)에 투석 (dialysis)한 다음, HiTrap Heparin HP 컬럼 (Amersham Biosciences, Sweden), HiTrap Q FF 컬럼 (Amersham Biosciences, Sweden) 및 HiTrap SP FF 컬럼 (Amersham Biosciences, Sweden)을 이용한 3단계의 컬럼 크로마토그래피를 통해 최종적으로 정제함으로써, 내열성 Sma DNA 중합효소를 대량생산하였다. 상기와 같이 정제된 Sma DNA 중합효소는 저장 완충용액 (storage buffer)(50 mM Tris-HCl (pH 8.2) / 0.1 mM EDTA / 1 mM DTT / 0.1% Tween 20 / 0.1% Nonidet P40 / 50% glycerol)에 투석한 다음, -20℃에 보관하면서 Sma DNA 중합효소의 효소 특성을 조사할 때와 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR을 수행할 때 사용되었다. 재조합 플라스미드 pESMPOL을 가지는 대장균 BL21(DE3)로부터 내열성 Sma DNA 중합효소를 정제하는 데 있어, 정제 단계별 결과는 하기의 표 1과 같았다.

Purification steps	Total protein (㎎)	Total activity(Units)	Specific activity(U/㎎)	Recovery (%)
Sonicated extract	760.0	4758421.0	6268.08	100
Heat treatment	333.0	3193606.0	9590.41	67.11
HiTrap Heparin HP	12.7	617361.9	38345.46	12.97
HiTrap Q FF	12.3	566327.1	46230.79	11.90
HiTrap SP FF	10.1	470644.4	46830.29	9.89

정제 단계별 단백질의 양은 BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, UK)를 사용하여 결정되었다. 또한, 변성 겔 전기영동 (sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)을 수행하여 정제 정도를 확인하였고, 이를 통해 Sma DNA 중합효소의 분자량이 92000 Da으로 확인되었는데, 전기 변성 겔 전기영동 상의 분자량은 상기 실시예 7에서 아미노산 서열로부터 추정한 추정 분자량과 거의 일치하였다 (참조: 도 4). 도 4는 대장균 내에서 발현된 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 정제 단계에 따른 변성 겔 전기영동 결과를 나타낸 것으로서, 도 4에서 lane 1은 IPTG 유도(induction)를 하지 않고 배양한 대장균 BL21(DE3) / pESMPOL 균체의 추출물, lane 2는 IPTG 유도를 하여 배양한 대장균 BL21(DE3) / pESMPOL 균체를 초음파 파쇄한 후의 시료, lane 3은 85℃에서 40분간 열처리한 후의 시료, lane 4는 HiTrap Heparin HP 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후의 시료, lane 5는 HiTrap Q FF 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후의 시료, lane 6은 HiTrap SP FF 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후의 시료, lane M은 단백질 저분자량 마커 (low molecular weight marker)를 나타낸다.

실시예 11: Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성 조사

Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성은 다음과 같은 DNA 중합 활성 측정 방법을 기본으로 하여 조사되었다 (참조: Choi, J. J. et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 19-25). 반응 혼합물 (상기 실시예 10에서 정제된 Sma DNA 중합효소, 1.25 ㎍ activated calf thymus DNA, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 mM KCl, 14 mM MgCl₂, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 μM dATP, dCTP 및 dGTP, 10 μM dTTP, 0.5 μCi [methyl-³H]thymidine 5′-triphosphate)을 75℃에서 10분간 반응시킨 후, 얼음에서 급냉시켰다. 상기 반응액을 DE-81 filter paper disk (23 ㎜, Whatman Co., USA)에 점적하여 65℃에서 건조시킨 후, 0.5 M sodium phosphate (pH 7.0) 완충용액에 10분, 70% 에탄올에 5분간 순서대로 세척한 다음, 다시 65℃에서 건조시켰다. 상기와 같이 준비된 DE-81 filter paper disk를 LS 6500 scintillation system (Beckman Co., USA)을 이용하여 DNA 중합 활성을 측정하는데 사용하였다. DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성을 조사할 때에는 상기 방법에서 반응 혼합물의 pH 또는 각 성분의 농도를 다르게 하거나 반응 온도를 다르게 하여 수행하였다.

Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 pH의 영향은 pH 5.0-7.0 범위에서는 50 mM MES-NaOH 완충용액, pH 7.0-9.0 범위에서는 50 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하여 조사되었다. 그 결과, Sma DNA 중합효소는 pH 7.5에서 최대 DNA 중합 활성을 나타냈다 (참조: 도 5). 도 5는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 pH에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프로 ○는 50 mM MES-NaOH 완충용액을 사용한 결과를 나타내며, ●는 50 mM Tris-HCl 완충용액을 사용한 결과를 나타낸다.

Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 온도의 영향을 40-95℃ 범위에서 조사한 결과, 70-80℃에서 최대 DNA 중합 활성을 나타냈다 (참조: 도 6). 도 6은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 온도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다. 다음으로, Sma DNA 중합효소를 각각 100℃, 95℃, 85℃ 및 75℃에서 8시간 동안 보관하면서 1시간 간격으로 시료를 채취한 후, 상기와 같이 DNA 중합 활성을 측정함으로써 열안정성을 조사해 본 결과, Sma DNA 중합효소는 열에 대한 안정성이 뛰어나 100℃에서 3.5시간, 95℃에서 5시간 동안 50% 이상의 DNA 중합 활성을 유지하였다 (참조: 도 7). 도 7은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 열안정성을 나타낸 그래프로 ●, ○, ■ 및 □는 각각 75℃, 85℃, 95 ℃ 및 100℃에서 보관된 Sma DNA 중합효소의 결과를 나타낸다.

Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 1가 양이온 (monovalent cation)들의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 60-100 mM이었으며 (참조: 도 8), 최적 (NH₄)₂SO₄ 농도는 20-30 mM이었다 (참조: 도 9). 도 8은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 KCl 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이고, 도 9는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 (NH₄)₂SO₄ 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프이다.

Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어 2가 양이온 (divalent cation)들의 영향을 조사한 결과, 최적 Mg²⁺ 농도는 12-20 mM이었으며, 최적 Mn²⁺ 농도는 4 mM이었는데, Mn²⁺보다는 Mg²⁺ 존재 하에서 훨씬 더 높은 DNA 중합 활성을 나타내었다 (참조: 도 10). 도 10은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 2가 양이온 농도에 따른 DNA 중합 활성 정도를 상대적으로 나타낸 그래프로 ○는 Mg²⁺를 사용한 결과를 나타내며, ●는 Mn²⁺를 사용한 결과를 나타낸다.

실시예 12: Sma DNA 중합효소의 핵산말단가수분해효소 활성 측정

Sma DNA 중합효소의 핵산말단가수분해효소 활성은 다음과 같이 측정되었다. 먼저, 5′→3′ 핵산말단가수분해효소 활성 (5′→3′ exonuclease activity)을 측정하기 위한 기질로 사용하기 위해, pBluescript SK- 벡터를 제한효소 SmaI으로 절 단시킨 다음, 방사선 동위원소 [γ-³²P]ATP와 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 (T4 polynucleotide kinase)를 사용하여 전기 제한효소로 절단된 pBluescript SK- 벡터의 5′ 말단을 표식하였다. 또한, 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity)을 측정하기 위한 기질로 사용하기 위해, pBluescript SK- 벡터를 제한효소 NotI으로 절단시킨 다음, 방사선 동위원소 [α-³²P]dCTP와 클레나우 단편 (Klenow fragment)을 사용하여 전기 제한효소로 절단된 pBluescript SK- 벡터의 3′ 말단을 표식하였다. 다음으로, 반응혼합물 (상기 실시예 10에서 정제된 Sma DNA 중합효소, 상기 5′ 말단 또는 3′ 말단에 방사선 동위원소 표식된 기질, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80 mM KCl, 14 mM MgCl₂, 0.01% BSA)을 각각 dNTP 존재 또는 부재 하에서 75℃에서 1시간 동안 보관하면서 10분 간격으로 시료를 채취하여 얼음에서 급냉시킨 후, 5% 트리클로로아세트산 (trichloroacetic acid) 용액을 첨가하여 원심분리를 한 다음, 상층액을 회수하여 LS 6500 scintillation system을 이용해서 핵산말단가수분해효소 활성을 측정하였다. 그 결과, Sma DNA 중합효소는 5′→3′ 핵산말단가수분해효소 활성은 가지고 있지 않음이 확인되었으며, 아미노산 서열 비교분석에서 추정된 바와 같이 교정 활성이라 불리며 DNA 중합시에 정확성을 높여주는 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성은 가지고 있음이 확인되었다 (참조: 도 11). 도 11은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소의 핵산말단가수분해효소 활성을 나타낸 그래프로 ○ 및 ●는 각각 dNTP 존재 및 부재 하에서의 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 측정의 결과를 나타내며, □ 및 ■는 각각 dNTP 존 재 및 부재 하에서의 5′→3′ 핵산말단가수분해효소 활성 측정의 결과를 나타낸다.

실시예 13: Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR의 최적 조건 결정

내열성 DNA 중합효소가 가장 중요하게 이용되어지는 PCR에 있어 Sma DNA 중합효소의 이용 가능성을 살펴보고, 또한 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 반응 완충용액의 조성을 결정하기 위해, 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 5 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 1 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 상기 실시예 11에서 Sma DNA 중합효소의 DNA 중합 활성에 있어서의 효소 특성 조사를 통해 결정된 최적 조건들을 바탕으로 구성한 1X Sma DNA 중합효소 반응 완충용액 및 1.25 유닛의 상기 실시예 10에서 정제된 Sma DNA 중합효소를 반응 혼합물로 하여 95℃에서 3분간 반응시키고, 94℃에서 20초, 60℃에서 20초, 72℃에서 3분의 과정을 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시킨 후, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 결과를 확인하였다. Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 최적 반응 완충용액의 조성을 결정할 때에는 반응 완충용액의 pH 또는 각 성분의 농도를 다르게 하여 수행하였다.

Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 pH의 영향을 조사한 결과, PCR 반응 완충용액의 최적 pH는 8.0-9.0이었다. (참조: 도 12). 도 12는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 pH에 따른 결과를 나타낸 것으로서, 도 12에서 M은 DNA 사이즈 마커를 나타낸다.

Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 1가 양이온들의 영향을 조사한 결과, 최적 KCl 농도는 50-80 mM이었으며, 최적 (NH₄)₂SO₄ 농도는 25-30 mM이었다 (참조: 도 13). 도 13은 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 KCl과 (NH₄)₂SO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸 것으로서, 도 13에서 M은 DNA 사이즈 마커를 나타내고, 이를 기준으로 왼쪽은 KCl 농도에 따른 결과를 나타내며, 오른쪽은 (NH₄)₂SO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸다.

Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 2가 양이온 Mg²⁺의 영향을 조사한 결과, MgCl₂와 MgSO₄ 사용시에 모두 최적 농도는 2-6 mM이었는데, MgCl₂보다는 MgSO₄를 사용시에 약간 더 PCR 증폭이 잘됨을 확인할 수 있었다 (참조: 도 14). 도 14는 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 있어 MgCl₂와 MgSO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸 것으로서, 도 14에서 M은 DNA 사이즈 마커를 나타내고, 이를 기준으로 왼쪽은 MgCl₂ 농도에 따른 결과를 나타내며, 오른쪽은 MgSO₄ 농도에 따른 결과를 나타낸다..

상기 결과들을 통해 Sma DNA 중합효소가 PCR에 이용 가능함을 알 수 있었으며, Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어 최적 반응 완충용액의 조성은 안정제인 Triton X-100을 포함시켜 30 mM Tris-HCl (pH 8.4) / 50 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄ / 2 mM MgSO₄ / 1% Triton X-100으로 결정하였다.

실시예 14: 최적 조건 하에서의 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR

5 ng의 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 각각 1 pmole의 5′ 말단 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 상기 실시예 13에서 결정된 1X Sma DNA 중합효소 최적 반응 완충용액 및 상기 실시예 10에서 정제된 Sma DNA 중합효소를 반응 혼합물로 하여 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR의 증폭 가능 길이를 조사하고자 예상되는 목적 증폭산물의 길이에 따라 다음과 같이 PCR을 수행하였다. 0.5-1 kb 길이로 예상되는 DNA 단편은 95℃에서 3분간 반응시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분의 과정을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰고, 2-3 kb 길이로 예상되는 DNA 단편은 95℃에서 3분간 반응시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 3분의 과정을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰으며, 4-6 kb 길이로 예상되는 DNA 단편은 95℃에서 3분간 반응시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 6분의 과정을 30회 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응이 끝난 다음, 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 하여 PCR 결과를 확인한 결과, Sma DNA 중합효소는 최적 반응 완충용액 하에서 람다 파아지의 게노믹 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 6 kb까지 합성이 가능함을 확인할 수 있었다 (참조: 도 15). 도 15는 람다 파아지 게노믹 DNA를 주형으로 최적 반응 완충용액 하에서 스태필로써머스 마리너스 DNA 중합효소를 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 수행한 결과를 나타낸 것으로서, 도 15에서 lane 1은 0.5 kb, lane 2는 1 kb, lane 3은 2 kb, lane 4는 4 kb, lane 5는 6 kb 증폭산물을 나타내고, M은 DNA 사이즈 마커를 나타낸다.

실시예 15: Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 정확성 조사

Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성 (PCR fidelity)은 룬드버그(Lundberg)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Lundberg et al., 1991, Gene 108, 1-6). 먼저, lacZ 유전자가 삽입되어 있는 발현벡터 pJR-lacZ의 α 단편 부분만을 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR을 통해 증폭시켰다. 이 때, Sma DNA 중합효소 대신에 이미 상품으로 나와 있는 DNA 중합효소들을 사용하여 동일하게 PCR을 수행함으로써 나중에 Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR의 결과와 비교할 수 있도록 하였다. 다음으로, 상기 PCR 증폭산물들을 제한효소 BamHI과 ClaI으로 각각 절단한 다음, 동일한 제한효소들로 절단된 상기 발현벡터에 재삽입시킨 후, 일렉트로포레이션 방법으로 대장균에 형질전환시키고, 선별을 위한 항생제 암피실린 및 IPTG와 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)이 포함된 아가 플레이트 배지에 고르게 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 아가 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 보관한 후, 파란색 콜로니 (blue colony)와 흰색 콜로니 (white colony)의 수를 센 다음, 이를 바탕으로 돌연변이 빈도 (mutation frequency)와 에러율을 계산하였다. 그 결과는 하기의 표 2와 같으며, Sma DNA 중합효소를 이용한 PCR에 있어서의 PCR 정확성은 Pfu DNA polymerase 에 비해서는 약간 낮았으나, 일반적인 PCR에 주로 이용되어지는 Super Taq Plus와 Super Taq에 비해서는 훨씬 높아 Sma DNA 중합효소가 고 도의 정확성을 요구하는 PCR에 이용되어질 수 있음을 확인하였다.

DNA 중합효소	Mutation frequency (%)	Error rate (x 10-6)
Sma	5.879 ± 2.16	2.370 ± 0.87
Super Taq	12.281 ± 2.35	4.952 ± 0.95
Super Taq Plus	8.628 ± 2.84	3.479 ± 1.14
Pfu	4.581 ± 2.20	1.847 ± 0.99

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 스태필로써머스 마리너스 (Staphylothermus marinus)로부터 교정 활성 (proofreading activity)을 가지는 새로운 내열성 DNA 중합효소인 Sma DNA 중합효소 (Staphylothermus marinus DNA polymerase, Sma DNA polymerase, 이하 ‘Sma DNA 중합효소’라고 함)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하고, 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 ‘PCR'이라고 함)에 있어 유용한 효소인 Sma DNA 중합효소를 대량생산하는 대장균 (Escherichia coli) 내에서의 발현 시스템과 정제 방법을 제공함과 함께, 전기와 같이 생산되는 Sma DNA 중합효소의 효소 특성을 제공하며, 우수한 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity) 및 교정 활성을 가지는 스태필로써머스 마리너스 균주 유래 내열성 DNA 중합효소를 이용하여 적절한 조건 하에서 PCR을 수행하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유전공학 및 분자생물학 실험을 비롯하여 바이러스 유전자와 암 유전자의 조기진단, 유전병 진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에 이용되어지는 PCR에 있어 가장 중요한 요소인 우수한 DNA 중합 활성을 가지는 내열성 효소를 제공한다는 데에 의의가 있다. 특히, 본 발명의 Sma DNA 중합효소는 높은 교정 활성을 가지고 있어 PCR 증폭시에 에러율을 낮출 수 있으므로 정확성을 요구하는 PCR에 유용하게 사용될 수 있다는 데에 큰 의의가 있다. 또한, 내열성 Sma DNA 중합효소의 발현 시스템의 구축 및 정제 과정의 확립은 산업적으로 중요한 기술인 PCR에 절대적으로 필요한 내열성 DNA 중합효소의 대량생산을 용이하게 할 뿐만 아니라 생산비용 절감 효과가 있다는 데에 의의가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 스태필로써머스 마리너스로부터 분리된 내열성 Sma DNA 중합효소 유전자
2. 제 1항의 서열번호 1로 기재된 염기서열로부터 유추된 서열번호 2로 기재되는 내열성 Sma DNA 중합효소
3. 제 1항의 내열성 Sma DNA 중합효소 유전자를 포함하고 도3에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 플라스미드
4. 제 3항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균
5. 삭제

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