KR100372777B1 - 아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 내열성 디엔에이중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 분리된 내열성 DNA 중합효소 (thermostable DNA polymerase)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명자들은 아퀴펙스 애오리커스 (Aquifex aeolicus)의 DNA 중합효소 유전자를 탐침자로 사용하여 아퀴펙스 파이로필러스의 게노믹 DNA로부터 내열성 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase) 유전자를 포함하는 절편들을 선별하였다. 전기 절편들을 대장균에 클로닝하여 콜로니 하이브리다이제이션 방법으로ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 양성 클론들을 선별한 다음, 양성으로 판명된 클론들로부터ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여 전기 양성 클론들이ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있음을 재확인하였다. 이어서,ApyDNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하였는데,ApyDNA 중합효소 유전자는 종지코돈을 포함하여 1725 bp로 이루어져 있고, 574개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다.ApyDNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 내열성 DNA 중합효소들 및 대장균 DNA 중합효소I의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의ApyDNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소들과 높은 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었으며, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)과 함께 DNA 중합시에 정확도를 높여주는 교정 활성 (proof-reading activity)도 가지고 있을 것으로 추정되었다. 본 발명의ApyDNA 중합효소 유전자는 내열성 DNA 중합효소를 산업적으로 대량생산하거나, 유전자 조작을 통한 단백질공학적 방법을 이용하여 원래의 효소에 비하여 보다 기능이 향상된 고효율·고기능성의 재조합 내열성 DNA 중합효소를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 내열성 디엔에이 중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열 {Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Aquifex pyrophilus and Amino Acid Sequence Deduced Therefrom}

본 발명은 새로운 내열성 DNA 중합효소 (thermostable DNA polymerase)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로는 본 발명은 초고온균에 속하는 아퀴펙스 (Aquifex)속 균주의 일종인 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 분리된 내열성 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase)의 유전자 및 그로 부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

DNA 중합효소 (deoxyribonucleic acid polymerase, DNA polymerase, E.C. number 2.7.7.7)는 생명체에 있어 DNA 복제나 수선시에 가장 중요한 효소로서, 주형 DNA에 의존하여 5′→3′ 방향으로 DNA를 합성하는 작용을 한다 (참조: Lehninger, A. L.et al., 1993, Principles of biochemistry,2nd ed., Worth Publishers). DNA 중합효소는 1957년 콘버그 (Kornberg) 등에 의해 대장균에서 최초로 발견되었는데 (Kornberg, A. and Baker, T., 1992, DNA replication,2nd ed., Freeman Company), 이 대장균 DNA 중합효소I (Escherichia coliDNA polymeraseI,E. coliDNA polymeraseI)은 5′→3′ 핵산말단가수분해효소 활성 (5′→3′ exonuclease activity), 교정 활성 (proof-reading activity)이라 불리는 3′→5′ 핵산말단가수분해효소 활성 (3′→5′ exonuclease activity) 및 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)인 5′→3′ 중합효소 활성 (5′→3′ polymerase activity)을 함께 가진다.

내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔 (Chien) 등에 의해 고온균인 써머스 아쿠아티커스 YT-1 (Thermus aquaticusYT-1)에서 최초로 분리된 이후, 같은 써머스속에 속하는 써머스 플라버스 (Thermus flavus), 써머스 써모필러스 HB8 (Thermus thermophilusHB8) 등에서 분리되어, 그 특성들이 밝혀졌으나, 그다지 주목을 받지 못하였다 (참조: Chien, A.et al., 1976,J. Bacteriol. 127, 1550-1557; Kaledin, A. S.et al., 1981,Biokhimiya 46, 1576-1584; Ruettimann, C.et al., 1985,Eur. J. Biochem. 149, 41-46). 그러나, 1988년 사이키 (Saiki) 등에 의해 내열성 DNA 중합효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction,PCR) 기술이 개발되면서 (참조: Saiki,et al., 1988,Science 239, 487-491), 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하여, 현재까지 써모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis), 파이로코커스 퓨리오서스 (Pyrococcus furiosus), 써머스 칼도필러스 GK24 (Thermus caldophilusGK24) 및 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis) 등의 여러 고온균 및 초고온균들로부터 내열성 DNA 중합효소가 경쟁적으로 개발되어져 왔다 (참조: Mattila, P.et al., 1991,Nucleic Acids Res. 19, 4967-4973; Lundberg, K. S.et al., 1991,Gene 108, 1-6; Park, J. H.et al., 1993,Eur. J. Biochem. 214, 135-140; Jung, S. E.et al., 1997,Mol. Cells 7, 769-776).

써머스 아쿠아티커스 YT-1 DNA 중합효소 (Thermus aquaticusYT-1 DNA polymerase,TaqDNA polymerase)를 비롯한 써머스속 유래의 DNA 중합효소들은 대장균 DNA 중합효소I과 비교하여, 교정 활성을 거의 가지지 않는다는 특징이 있다. 1995년 엄 (Eom)등에 의해TaqDNA 중합효소의 결정 구조가 해석됨으로써, 전기 중합효소의 완전한 전체구조가 밝혀졌는데, 이를 살펴보면TaqDNA 중합효소의 경우에는 대장균 DNA 중합효소I에 존재하는 교정 활성을 가지는 데 중요한 역할을 하는 아미노산 잔기들이 결실되어 있거나 다른 아미노산 잔기로 치환되어져 있어 교정 활성이 거의 없는 것으로 확인되었다 (참조: Eom, S. H.et al., 1995,Acta. Crystallographica D 51, 1086-1088; Kim, Y.et al., 1995,Nature 376, 612-616). 이에 비해, 써모코커스 리토랄리스 및 파이로코커스 퓨리오서스로부터의 DNA 중합효소들은 교정 활성을 갖는 내열성 DNA 중합효소들이라는 점에서 주목을 받고있다.

PCR은 DNA 중합효소와 프라이머 (primer)를 이용하여 극미량의 주형 DNA (template DNA)를 대량으로 증폭하는 기술로서, 프라이머 어닐링 (primer annealing, 40 - 65℃), DNA 증폭 (DNA extension, 72℃) 및 DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃)의 3단계 과정을 연속적으로 반복한다. 따라서, 반응 특성상 고온을 필요로 하기 때문에, PCR에 있어 가장 중요한 요소인 내열성 DNA 중합효소의 개발은 다양한 PCR 기술의 개발과 발전을 위해 필수불가결하다 (참조: Erlich, H. A., 1989, PCR technology: principles and applications for DNA amplification, Stockton Press). 내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 확인 및 증폭, DNA 염기서열 결정, 임상진단 등에 있어 매우 유용한 효소로서, 유전공학 및 분자생물학 실험을 비롯하여 유전병 진단, 암 유전자와 바이러스 유전자의 조기진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다.

전체 게놈 염기서열 (full genome sequence)이 결정된 아퀴펙스 애오리커스 (Aquifex aeolicus)의 DNA 중합효소 유전자를 제외하고 (참조: Deckert, G.et al., 1998,Nature 392, 353-358), 현재까지 초고온균인 아퀴펙스속으로부터 DNA 중합효소 유전자의 염기서열이나 아퀴펙스 애오리커스 DNA 중합효소 유전자를 포함한 아퀴펙스속으로부터의 DNA 중합효소 유전자가 암호화하는 내열성 DNA 중합효소에 대한 특성이나 이용에 대하여 밝혀진 것이 없다. 따라서, 본 발명자들은 아퀴펙스 애오리커스와 다른 균주인 초고온균 아퀴펙스 파이로필러스로부터 내열성DNA 중합효소 유전자를 분리하고, 그로부터 아미노산 서열을 유추하고자 하였다. 이는 현재까지 그 예가 없는 아퀴펙스속으로부터의 내열성 DNA 중합효소의 산업적 이용을 위해 중요한 의의를 갖는다.

이에, 본 발명자들은 초고온균에 속하는 아퀴펙스 (Aquifex)속 균주의 일종인 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 교정 활성 (proof-reading activity)을 가지는 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고자 예의 연구노력한 결과, 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA로부터 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase) 유전자를 선별하고, 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여,ApyDNA 중합효소가 종래의 DNA 중합효소들과 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 새로운 내열성 DNA 중합효소임을 확인하였으며, DNA 중합시에 정확도를 높여주는 교정 활성을 가지고 있을 것으로 추정하였다. 또한, 전기 유전자를 발현벡터에 삽입한 다음, 대장균에 클로닝하여 발현시킨 후, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)을 측정함으로써, 전기 유전자가ApyDNA 중합효소를 암호화하고 있음을 다시 한번 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 교정 활성을 가지는 새로운 내열성 DNA 중합효소인ApyDNA 중합효소의 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 유전자로부터 유추되는ApyDNA 중합효소의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

도 1의 (A)는 아퀴펙스 파이로필러스의 게노믹 DNA를 제한효소EcoRI,HindIII,PstI 및SacI으로 각각 절단하여 0.7% 아가로스 겔에 전기영동한 결과이다. (B)는 아퀴펙스 애오리커스의 DNA 중합효소 유전자를 탐침자로 사용하여 상기 제한효소들로 절단된 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA에 하이브리다이제이션한 결과이다. 도 1에서 M은 DNA 사이즈 마커 (DNA size marker, 1 kb ladder)를 나타내고, E, H, P 및 S는 각각EcoRI,HindIII,PstI 및SacI으로 절단된 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA를 나타낸다.

도 2는 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있는 2.2 kbHindIII 절편 (pADPH) 및 1.8 kbSacI 절편 (pADPSI)의 제한효소 지도 및 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소 유전자의 위치를 나타낸다. 도 2에서 E, H, P, SI 및 SII는 각각 제한효소EcoRI,HindIII,PstI,SacI 및SacII를 나타낸다.

도 3은 아퀴펙스 파이로필러스 분리된 DNA 중합효소 유전자를 포함한 염기서열 및 그로부터 유추되는 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 3에서 *는 종지코돈을 나타낸다.

도 4는 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 종래의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다. 도 4에서Apy,Aae,Tfi,Taq및Eco는 각각 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소, 아퀴펙스 애오리커스 DNA 중합효소, 써머스 필리포미스 DNA 중합효소, 써머스 아쿠아티커스 YT-1 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소I을 나타내며, 박스 부분은 아미노산 서열의 보존부위이다. 또한, 도 4에서 *는 교정 활성 (proof-reading activity)에 중요한 역할을 하는 아미노산들을 나타내며, #은 DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)에 중요한 역할을 하는 아미노산들을 나타낸다.

본 발명자들은 여러 가지 제한효소로 절단된 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)의 게노믹 DNA로부터 아퀴펙스 애오리커스 DNA 중합효소 (Aquifex aeolicusDNA polymerase,AaeDNA polymerase)(이하AaeDNA polymerase라 함) 유전자를 탐침자(probe)로 이용한 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션 (agarose gel membrane hybridization) 방법으로 아퀴펙스 파이로필러스 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase)(이하ApyDNA 중합효소라 함) 유전자를 포함하는 절편들을 선별하고, 전기 절편들을 플라스미드 벡터에 삽입한 다음, 대장균에 형질전환시켰다. 이어서, 전기 탐침자를 이용한 콜로니 하이브리다이제이션 (colony hybridization) 방법으로 전기 형질전환된 대장균들 중에서ApyDNA 중합효소의 유전자 절편을 포함하는 양성 클론들을 선별하고, 양성으로 판명된 클론들로부터ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여 상기와 동일한 방법으로 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 전기 양성 클론들이ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있음을 재확인하였다. 다음으로,ApyDNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여, 종래의 내열성 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소I의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의ApyDNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소들과 높은 서열 상동성을 가지면서, 또한 DNA 중합시에 정확도를 높여주는 교정 활성 (proof-reading activity)을 가질 것으로 추정되는 새로운 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다. 마지막으로, 전기 유전자를 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭하여 발현벡터에 삽입한 다음, 대장균에 형질전환시킨 후, DNA 중합 활성 (DNA polymerization activity)을 측정한 결과, 전기 유전자가ApyDNA 중합효소를 암호화하고 있음이 다시 한번 확인되었다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 생육적온이 85℃로 알려진 아퀴펙스 파이로필러스로부터 교정 활성을 가지는 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고자 하였다. 먼저, 이미 전체 게놈의 염기서열이 결정된 아퀴펙스 애오리커스 (Aquifex aeolicus)로부터 DNA 중합효소 유전자에 해당하는 부위의 5′ 말단과 3′ 말단에 결합할 수 있는 프라이머를 제작한 후, PCR을 통해 DNA 중합효소 유전자를 증폭시켜, 이를ApyDNA 중합효소 유전자를 선별하기 위한 탐침자로 사용하였다. 다음으로, 아퀴펙스 파이로필러스의 게노믹 DNA를 추출한 후, 여러 가지 제한효소를 각각 처리하여 전기 게노믹 DNA를 완전히 절단하고, 각 제한효소에 의하여 생성된 DNA 절편들에 대하여AaeDNA 중합효소 유전자를 탐침자로 이용해서 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 결과, 이미 알려진 다른 내열성 DNA 중합효소 유전자의 염기서열에 근거하여 약 2.2 kb와 1.8 kb 위치에서 검출되는 절편이ApyDNA 중합효소 유전자의 일부 또는 전체를 포함하고 있을 것으로 예상되었으므로, 전기 두 개의 절편을 각각 플라스미드 벡터에 삽입한 다음, 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 아가 플레이트 (agar plate)상의 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에서 배양한 다음, 전기 탐침자를 이용한 콜로니 하이브리다이제이션을 실시하여 양성 클론들을 얻었고, 이들이ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있을 것으로 예상하였다. 따라서, 전기 양성 클론들로부터 삽입 유전자 절편을 분리하여, 상기와 동일한 방법으로 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 전기 양성 클론들은 분명히ApyDNA 중합효소 유전자를 포함하고 있음이 확인되었다. 양성 클론들로부터ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여 염기서열 결정을 하기에 적당한 크기로 절단한 후, 플라스미드 벡터에 서브클로닝한 다음, 염기서열을 결정하여ApyDNA 중합효소 유전자가 종지코돈을 포함하여 1725 bp로 이루어져 있고, 574개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인하였다. 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여 아퀴펙스 애오리커스, 써머스 필리포미스 (Thermus filiformis), 써머스 아쿠아티커스 YT-1 (Thermus aquaticusYT-1) 및 대장균의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의ApyDNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소들과 높은 서열 상동성을 가지면서, 또한 DNA 중합시에 정확도를 높여주는 교정 활성을 가질 것으로 추정되는 새로운 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다. 특히, 전기 DNA 중합효소들은 DNA 중합 활성을 나타내는 카르복실 말단 부위에서 매우 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 결정된ApyDNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 5′ 말단 및 3′ 말단에 각기 상보적인 프라이머를 제작한 후, PCR을 통해ApyDNA 중합효소 유전자를 증폭시킨 다음, 발현벡터 pJR에 삽입하여ApyDNA중합효소 생산을 위한 재조합 플라스미드 pRAPDP를 구축하였다. 전기 재조합 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후, 발현시킨 다음, 열처리를 하여 DNA 중합 활성을 측정한 결과, DNA 중합 활성이 있는 것으로 나타나, 전기 유전자가ApyDNA 중합효소 유전자임을 다시 한번 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 아퀴펙스 파이로필러스 균주의 배양

독일 종균협회로 부터 입수한 아퀴펙스 파이로필러스 균주 (DSM 6858)(참조: Huber, R.et al., 1992,System. Appl. Microbiol. 15, 340-351)는 약간 변형된 SME 배지 (참조: Stteter, K. O.et al., 1983,System. Appl.. Microbiol. 4, 535-551)에서 배양하였다. 약간 변형된 SME 배지의 준비는 다음과 같이 하였다. 배지 성분들 (1 ℓ당 NaCl 30 g, MgSO₄· 7H₂O 7 g, MgCl₂·6H₂O 5.5 g, KCl 0.65 g, Na₂S₂O₃2.0 g, NaBr 0.1 g, NaHCO₃2.0 g, NH₄Cl 0.15 g, K₂HPO₄0.15 g, CaCl₂·2H₂O 0.5 g, Trace element solution 10.0 ㎖)을 준비한 다음, 5 N 황산(sulfuric acid)로 pH 6.7을 맞췄다. 120 ㎖ 세럼 보틀(serum bottle)(Wheaton Co., USA)에 전기배지 용액 20 ㎖을 넣고, H₂: CO₂: O₂혼합가스 (혼합비율 80% : 20% : 0.5%)로 배지 용액을 포함한 serum bottle 내부의 가스를 충분히 교환한 다음, 고무병마개와 알루미늄 링으로 serum bottle의 입구를 막은 후, 121℃에서 20분간 멸균하였다. 이렇게 준비된 배지에 멸균된 serum bottle 내부의 압력이 300 kPa이 되도록 전기 혼합가스를 이용하여 충진시킨 다음, 멸균된 주사기를 이용하여 아퀴펙스 파이로필러스 균주를 5% 접종한 후, 85℃에서 배양하였다.

실시예 2: 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA의 분리

게노믹 DNA의 분리는 마머 (Marmur)의 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 수행하였다 (참조: Marmur, J., 1961,J. Mol. Biol.3, 208-218). 200 ㎖의 진탕배양한 균체를 원심분리를 통해 회수한 다음, SETB (20% sucrose / 50 mM EDTA / 50 mM Tris-HCl (pH 7.6))로 현탁하고, 얼렸다 녹이기 (freazing and thawing)를 5회 반복하여 세포막을 약화시킨 후, 각각 최종 농도가 10 ㎎/㎖과 100 ㎍/㎖이 되도록 라이소자임(lysozyme)과 RNase A를 첨가하여 37℃에서 40분간 반응시켰다. 여기에 1% 농도로 SDS를 첨가한 다음, 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform / isoamylalcohol)(24 : 1)을 첨가하여 천천히 흔들어주면서 하룻밤 반응시킨 후, TE 세쳐레이티드 페놀(saturated phenol) 및 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform / isoamylalcohol) (24 : 1)을 동량으로 DNA를 추출하였다. 다음으로, 1 ㎎/㎖ 농도로 프로티나제(proteinase K)를 첨가하여 37℃에서 30분, 55℃에서 20분간 반응시킨 후, TE saturated phenol 및 chloroform / isoamylalcohol (24 : 1)을 동량으로 DNA를 추출하였다. 전기 추출액에 2배 부피의 100% 에탄올(ethanol)과 1/10배 부피의 3 M 소디움 아세테이트(sodium acetate) (pH 5.2)를 첨가하여 게노믹 DNA를 침전시킨 후, 70% 에탄올(ethanol)로 3회 세척(washing)하여 진공건조시킨 다음, TE 완충액(buffer)(10 mM Tris-HCl (pH 7.6) / 1 mM EDTA)에 녹이고, 260 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

실시예 3: 탐침자의 제조 및 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션

아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA로부터ApyDNA 중합효소 유전자를 선별하기 위한 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션의 탐침자로 사용하고자, 이미 전체 게놈의 염기서열이 결정된 아퀴펙스 애오리커스의 DNA 중합효소 유전자 (GenBank accession number AE000657)에 해당하는 부위의 5′ 말단과 3′ 말단에 결합할 수 있는 프라이머를 제작한 후, PCR을 통해AaeDNA 중합효소 유전자를 증폭하였다. 전기의 증폭된AaeDNA 중합효소 유전자의 방사선 동위원소 라벨링 (labeling)에는 베링거만하임게엠베하(Boehringer Mannheim GmbH, Germany)의 랜덤 프라임 디앤에이 라벨링 키트(Random Primed DNA Labeling Kit)를 사용하였다. 전기의 증폭된AaeDNA 중합효소 유전자 50 ng을 100℃에서 5분간 변성시킨 후 얼음에서 급냉시킨 다음, dCTP / dGTP / dTTP mixture 3 ㎕, hexanucleotide가 포함된 10X (반응완충액)reaction buffer 2 ㎕, [α-³²P]dATP (3000 Ci/mmol) 6 ㎕ (60 μCi) 및 클레노우 절편(Klenow fragment) 1 ㎕를 첨가하여 25℃에서 16시간 반응시켜 라벨링하고. 전기 라벨링 반응액을 세파덱스 G-25 미니컬럼 (Sephadex G-25 mini-column)으로 정제하여 미반응의 [α-³²P]dATP를 제거한 후, 탐침자로 사용하였다.

상기 실시예 2에서 분리한 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA와 상기와 같이 제조한 탐침자를 이용하여 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션을 수행하였다 (참조: 권석태 등, 1991, 분자생물학노트 - 유전공학실험서, 한국과학기술연구원 유전공학연구소 발행). 먼저, 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA를 제한효소EcoRI,HindIII,PstI 및SacI으로 각각 절단하여 0.7% 아가로스 겔에 전기영동한 다음, UV 램프하에서 사진을 찍었다 (참조: 도 1의 (A)). 이어서, 0.5 N NaOH / 0.1 N NaCl 용액으로 전기 겔을 60분간 변성시킨 후, 증류수로 30분간 세척한 다음, 겔을 종이타월 사이에 넣고 약 1 ㎏ 정도 무게의 물체를 올려놓는 방법으로 압축하여 약 1 ㎜ 두께가 되도록 하였다. 압축된 겔을 와트만(Whatman) 3MM Paper (USA)로 옮겨 65℃에서 30분간 진공건조시켜서 막 (membrane) 상태로 만든 후, 증류수로 세척하여 잔류 NaOH 및 와트만(Whatman) 3MM Paper를 완전히 제거하였다. 다음으로, 막 상태의 겔을 프리하이브리다이제이션 (pre-hybridization) 용액 (6X SSC, 5X Denhart's solution, 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.1% SDS, 100 ㎍/㎖ sonicated salmon sperm DNA)에 넣어 65℃에서 1시간 반응시킨 후, 전기 탐침자를 첨가한 하이브리다이제이션 용액에 넣어 50℃에서 16시간 이상 반응시켰다. 하이브리다이제이션이 끝난 겔의 세척은 0.1% SDS를 포함하는 6X, 3X, 1X, 0.1X SSC 용액으로 실온에서 15분씩 단계적으로 수행하였다. 전기의 세척한 겔을 공기중에서 건조시킨 후, 오토라디오그래피 (autoradiography)를 수행한 다음, 필름을 현상하여 탐침자와 하이브리다이제이션하는 밴드 (band)들을 찾아ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 목적 DNA들의 크기를 확인하였다 (참조: 도 1의 (B)). 밴드들 중에서ApyDNA 중합효소 유전자를 포함할 것으로 예상되면서 클로닝하기에 적합한 크기인 2.2 kbHindIII 밴드 및 1.8 kbSacI 밴드를 선별하였다.

실시예 4: 저융점 아가로스 겔로부터ApyDNA 중합효소 유전자 절편의 회수 및 형질전환

상기 실시예 3에서HindIII와SacI으로 절단된 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA를 0.7% 저융점 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커 (DNA size marker)와 함께 전기영동한 다음,HindIII 2.2 kb와SacI 1.8 kb 위치에 해당하는 겔 단편들을 각각 회수하였다. 전기 겔 단편들을 65℃에서 가열하여 완전히 녹인 다음, 2배 부피의 TE 완충용액(buffer)를 첨가하고 다시 5분간 가열한 후, TE saturated phenol 및 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform / isoamylalcohol) (24 : 1) 동량으로 DNA를 추출하였다. 이어서, 에탄올(ethanol) 침전을 통해 DNA 절편들을 회수하였다.

상기와 같이 회수한 DNA 절편들을 T4 DNA 리가아제 (T4 DNA ligase)를 사용하여 각각 동일한 제한효소로 절단된 플라스미드 벡터 pBluescript SK-에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 MV1184 (EscherichiacoliMV1184, Takara Co., Japan)에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J.et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press).

실시예 5: 콜로니 하이브리다이제이션

ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 클론들을 선별하기 위하여 다음과 같이 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization)을 수행하였다 (참조: Hanahan, D. and Meselson, M., 1980,Gene 10, 63-67). 먼저, 100 ㎍/㎖ 농도로 암피실린 (ampicillin)이 첨가된 LB 아가 플레이트 (LB agar plate)상에 니트로셀룰로스 막을 깔고, 그 위에 형질전환체 (transformant)들을 멸균된 이쑤시개로 찍은 다음, 37℃에서 배양하여 콜로니들을 형성시킨다. 전기 콜로니들이 약 1 ㎜ 크기로 생육되었을 때, 니트로셀룰로스 막을 0.5 N NaOH / 1.5 M NaCl 용액으로 5분간 처리한 후, 1.5 M NaCl / 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) 용액으로 5분간 처리한 다음, 0.2 M Tris-HCl (pH 7.5) / 2X SSC 용액으로 5분간 처리하였다. 이어서, 전기 니트로셀룰로스 막을 UV 조사로 크로스 링킹 (cross-linking)시킨 다음, 상기 실시예 3의 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션에서와 같이 동일한 방법으로 하이브리다이제이션 및 오토라디오그래피를 수행하여, 전기 탐침자와 하이브리다이제이션하는 양성 클론들을 확인하였다.

전기 양성 클론들을 재확인하기 위하여 알카리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음 (참조: Sambrook, J.et al., 1989, Molecular cloning, alaboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press), 2.2 kbHindIII 절편이 클로닝되었다고 예상되는 양성 클론들의 플라스미드 DNA들은 제한효소HindIII로 절단하고 1.8 kbSacI 절편이 클로닝되었다고 예상되는 양성 클론들의 플라스미드 DNA들은 제한효소SacI으로 절단하여, 아가로스 겔에 전기영동한 후, 상기 실시예 3의 아가로스 겔 막 하이브리다이제이션에서와 같이 동일한 방법으로 하이브리다이제이션 및 오토라디오그래피를 수행하여, 전기 탐침자와 하이브리다이제이션하는 밴드들을 재확인하였다. 상기 방법에 의해 최종적으로 2.2 kbHindIII 절편과 1.8 kbSacI 절편을 포함하는 양성 클론들을 각각 pADPH와 pADPSI이라 명명하였다.

실시예 6:ApyDNA 중합효소 유전자의 제한효소 지도 작성 및 서브클로닝

전기 실시예 6에서 수득한 pADPH와 pADPSI을 다양한 제한효소로 절단하여,ApyDNA 중합효소 유전자의 제한효소 지도를 작성하였다. 먼저, 하나 또는 둘 이상의 제한효소들로 pADPH와 pADPSI을 절단한 다음, 0.8% 및 2.0% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동한 후, DNA 사이즈 마커와 비교함으로써 절단된 DNA 절편들의 크기를 측정하여, 제한효소 위치에 따라 그 순서대로 제한효소 지도를 작성하였다 (참조: 도 2).

상기와 같이 작성한 제한효소 지도를 참조하여, 가능한 절편의 크기가 염기서열 결정에 적합한 0.5 kb 이하가 되도록 pADPH와 pADPSI을 절단한 다음, 각기 동일한 제한효소로 절단된 플라스미드 벡터 pBluescript SK-에 삽입한 후, 대장균에형질전환시킴으로써 DNA 절편들을 서브클로닝하였다.

실시예 7:ApyDNA 중합효소 유전자의 염기서열 결정

상기 실시예 6에서와 같이 서브클로닝된 DNA 절편들의 염기서열을 하토리 (Hattori) 등의 다이디옥시 방법 (dideoxy method)으로 결정하였다 (참조: Hattori, M. and Sakaki, Y., 1986,Anal. Biochem. 152, 232-238). 먼저, 서브클로닝된 DNA 절편들을 포함하는 플라스미드 DNA들을 알카리 용균법에 의해 분리한 다음, NaOH 용액을 사용하여 전기 플라스미드 DNA들을 변성시킨 후, 디아자 G/A^T7시퀀싱 믹시즈 (Deaza G/A^T7Sequencing Mixes, Pharmacia LKB, USA)를 사용하여 다이디옥시 사슬 종결법 (dideoxy chain termination method)으로 염기서열을 결정하였다 (참조: 도 3).ApyDNA 중합효소 유전자는 종지코돈을 포함하여 1725 bp로 이루어져 있으며, 574개의 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하고 있는 것으로 확인되었다.

실시예 8:ApyDNA 중합효소의 아미노산 서열 결정 및 종래의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과의 비교분석

컴퓨터 프로그램인 PCGENE (Sweden)을 이용하여 상기 실시예 7에서 결정된ApyDNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추한 다음, 컴퓨터 프로그램인 NCBI BLAST Search (USA)를 이용하여 전기 아미노산 서열을 종래의 아퀴펙스 애오리커스, 써머스 필리포미스, 써머스 아쿠아티커스 YT-1 및 대장균의 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교분석하였다 (참조: 도 4).ApyDNA 중합효소는 아미노 말단이 메티오닌 (methionine, M)으로 시작하여 카르복실 말단이 아스파테이트 (aspartate, D)로 끝나는 574개의 아미노산으로 구성되어진 새로운 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다.ApyDNA 중합효소는 아퀴펙스 애오리커스, 써머스 필리포미스, 써머스 아쿠아티커스 YT-1 및 대장균의 DNA 중합효소들과 각각 78.0%, 24.2%, 24.6% 및 32.4%의 아미노산 서열 상동성을 보였는데, 특히 DNA 중합 활성을 나타내는 카르복실 말단 부위에서 매우 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한,ApyDNA 중합효소는 대장균 DNA 중합효소I이 교정 활성을 가지는 데에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 아미노산 잔기들을 가지고 있는 것으로 확인되어, 현재 가장 많이 사용되고 있는 써머스 아쿠아티커스 YT-1 DNA 중합효소 (Thermus aquaticusYT-1 DNA polymerase,TaqDNA polymerase)에 비하여 DNA 중합시에 정확도가 높을 것으로 추정되었다.

실시예 9:ApyDNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터의 구축

상기 실시예 7에서 결정된ApyDNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 5′ 말단 및 3′ 말단에 각기 상보적인 프라이머를 제작한 후, PCR을 통해ApyDNA 중합효소 유전자를 증폭시켰다. 먼저, 5′ 말단 프라이머 (5′-NNNNGAATTC AT GACCTTTGAGTATATTACGG-3′)는ApyDNA 중합효소 유전자의 개시코돈 (ATG) 및 제한효소EcoRI 절단부위를 포함하여 32개의 염기로 합성하였으며, 3′ 말단 프라이머(5′-NNNNGTCGAC TCAGTCCTTAATCCACCTCTC-3′)는ApyDNA 중합효소 유전자의 종지코돈 (TGA) 및 제한효소SalI 절단부위를 포함하여 31개의 염기로 합성하였다. 이어서, 상기 실시예 2에서 분리된 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA를 주형 DNA (template DNA)로 사용하여, 다음과 같이 PCR을 수행하였다.TaqDNA 중합효소 (Bioneer Co., Korea)를 제외한 PCR 반응 혼합물 (0.5 ㎍ 아퀴펙스 파이로필러스 게노믹 DNA, 0.1 pmole 5′ 말단 프라이머 및 3′ 말단 프라이머, 200 μM dNTPs, 10XTaqDNA 중합효소 reaction buffer)을 100℃에서 5분간 열을 가하여 전기 게노믹 DNA를 변성시키고, 얼음에서 급냉시킨 다음,TaqDNA 중합효소 2.5 units를 첨가하여, DNA 변성 (DNA denaturation, 94℃, 1분), 프라이머 어닐링 (primer annealing, 58℃, 1분) 및 DNA 증폭 (DNA extension, 72℃, 1분, 단 마지막 회에서는 5분)의 3단계 과정을 30회 반복한 후, DNA 사이즈 마커와 함께 0.8% 아가로스 겔에 전기영동하여 약 1.7 kb 위치에 밴드가 존재하는 것을 확인하였다. 다음으로, PCR이 끝난 반응 혼합물에 TE saturated phenol 및 클로로포름/이소아밀알코올(chloroform / isoamylalcohol) (24 : 1)을 동량으로 처리하여 PCR을 통해 증폭된 DNA를 추출한 후, 에탄올(ethanol) 침전을 통해 회수하였다. 전기의 회수된 DNA를 제한효소EcoRI 및SalI으로 절단한 다음, 0.8% 저융점 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여 약 1.7 kb 위치에 해당하는 겔 단편을 상기 실시예 4에서와 같이 처리하여ApyDNA 중합효소 유전자 절편을 회수한 후, T4 DNA 리가아제를 사용하여 동일한 제한효소로 절단된 발현벡터 pJR (참조: Kwon, S.-T.et al., 1997,Mol. Cells 7, 264-271)에 삽입한 다음, 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법으로 대장균 MV1184에 형질전환시켰다 (참조: Sambrook, J.et al., 1989, Molecular cloning, a laboratory manual,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이어서, 형질전환체들로부터 알카리 용균법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한 다음, 제한효소EcoRI 및SalI으로 절단한 후, 0.8% 아가로스 겔에 DNA 사이즈 마커와 함께 전기영동하여ApyDNA 중합효소 유전자가 정확히 삽입되어 있는지의 여부를 재확인하였다. 상기와 같이 구축된ApyDNA 중합효소 유전자의 발현을 위한 발현벡터를 pRAPDP라 명명하였다.

실시예 10:ApyDNA 중합효소의 DNA 중합 활성 측정

DNA 중합 활성의 측정은 다음과 같이 수행하였다 (참조: Park, J. H.et al., 1993,Eur. J. Biochem. 214, 135-140). 상기 실시예 9에서 구축된 발현벡터 pRAPDP를 가지는 균주를 100 ㎍/㎖ 농도로 암피실린이 첨가된 LB 배지 3 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 정도 전배양한 다음, 100 ㎍/㎖ 농도로 암피실린이 첨가된 LB 배지 10 ㎖에 1% 접종하여 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.8이 될 때까지 37℃에서 배양한 후, 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 아이소프로필씨오갈락토사이드(Isopropylthiogalactoside, IPTG)를 첨가하고, 다시 6시간 동안 본배양을 계속하였다. 이어서, 원심분리를 통해 균체를 회수한 다음, 완충용액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 1 mM MgCl₂/ 1 mM DTT / 1 mM PMSF)에 현탁하여 초음파 파쇄를 실시한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수하였다. 대장균 유래의 단백질들을 제거하기 위하여 전기 상층액을 85℃에서 30분간 열처리한 후, 원심분리를 통해 상층액을 회수하여, 이를 조효소액으로 사용하였다. 다음으로, 반응 혼합물 (전기 조효소액, 1.25 ㎍ activated calf thymus DNA, 25 mM Tris-HCl (pH 8.5), 40 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM β-mercaptoethanol, 100 μM dATP, dCTP 및 dGTP, 10 μM dTTP, 0.5 μCi [methyl, 1′, 2′-³H]thymidine 5′-triphosphate)을 75℃에서 10분간 반응시킨 후, 얼음에서 급냉시켰다. 전기 반응액을 DE-81 거름종이 디스크(filter paper disk) (23 ㎜, Whatman Co., USA)에 점적하여 65℃에서 건조시킨 후, 0.5 M 소디움 포스페이트(sodium phosphate)(pH 7.0) 용액에 10분, 70% 에탄올(ethanol)에 5분간 순서대로 세척(washing)한 다음, 다시 65℃에서 건조시켰다. 상기와 같이 준비된 DE-81 filter paper disk를 LS 6500 scintillation system (Beckman Co., USA)을 이용하여 DNA 중합 활성을 측정하는데 사용한 결과, 발현벡터 pRAPDP를 가지는 균주에서 발현된 단백질은 분명하게 DNA 중합 활성을 가지는 내열성 DNA 중합효소임이 확인되어, 본 발명의 유전자는 아퀴펙스 파이로필러스로부터 분리된 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase) 유전자임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 아퀴펙스 파이로필러스 (Aquifex pyrophilus)로부터 분리된 새로운 내열성 DNA 중합효소 (Aquifex pyrophilusDNA polymerase,ApyDNA polymerase) 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의ApyDNA 중합효소 유전자는 국내 최초로 분리된 교정 활성 (proof-reading activity)을 가지는 DNA 중합효소를 암호화하는 유전자라는 데 큰 의의가 있다. 또한, 본 발명의 내열성ApyDNA 중합효소 유전자는 전기 유전자가 삽입된 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 내열성 DNA 중합효소를 산업적으로 대량생산하거나, 유전자 조작을 통한 단백질공학적 방법을 이용하여 원래의 효소에 비하여 보다 기능이 향상된 고효율·고기능성의 재조합 내열성 DNA 중합효소를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (3)

1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지는 아퀴펙스 파이로필러스(Aquifex pyrophilus)로부터 분리된 내열성 디엔에이 중합효소(ApyDNA polymerase) 유전자
2. 제 1항의 서열번호 1로 기재된 유전자 염기서열로 부터 유추되는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 아퀴펙스 파이로필러스 디엔에이 중합효소(ApyDNA polymerase)
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