KR100269979B1 - 써무스 필리포미스로부터 분리된 내열성 dna 중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 써무스 필리포미스(Thermus filiformis)로부터 분리된 내열성 DNA 중합효소 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명자들은 써무스 필리포미스(T. filiformis)의 게노믹 DNA로부터 Taq pol Ⅰ유전자의 일부를 탐침으로 이용하여 Tfi DNA 중합효소 유전자를 포함하는 절편들을 선별하고, 전기 절편들을 대장균에 클로닝하여 콜로니 하이브리다이제이션 방법으로 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 양성 클론을 선별한 다음, 양성으로 판명된 클론으로부터 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여 전기 양성 클론이 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있음을 재확인하였다. 이어서, Tfi DNA 중합효소 유전자 절편의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여, 종래의 내열성 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Tfi DNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소와 높은 서열상동성을 가지는 신규한 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다. 본 발명의 Tfi DNA 중합효소 유전자는 내열성 DNA 중합효소를 산업적으로 대량생산하거나, 유전자 조작을 통하여 야생형 효소에 비하여 보다 기능이 향상된 내열성 DNA 중합효소를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

써무스 필리포미스로부터 분리된 내열성 ＤＮＡ 중합효소의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열
본 발명은 신규한 내열성 DNA 중합효소 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 고도고온균인 써무스(Thermus)속 균주의 일종인 써무스 필리포미스(Thermus filiformis)로부터 분리된 내열성 DNA 중합효소 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다.
내열성 DNA 중합효소에 관한 연구는 주로 두 가지 발현균주 즉, 고도고온균(extreme thermophile)과 초고온균(hyper thermophile)에서 이루어져 왔는데(참조: Brock, T. D., Thermophiles, pp. 27-28, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, 1986), 고도고온균은 생육적온이 70 내지 85℃로 미국 및 일본의 온천지대에서 분리한 써무스속의 균주이고, 초고온균은 생육적온이 85℃ 이상으로 해저 열수공 근처에서 분리한 알키박테리아(Archaebacteria)이다.
내열성 DNA 중합효소는 1976년 치엔(Chien) 등이 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq) YT-1로부터, 1980년 칼레인(Kalein) 등이 써무스 루버(Thermus ruber)로부터 각각 분리, 정제하여 일반적인 특성을 밝혔으나, 그다지 주목을 받지 못하였다(참조: Chien et al., J. of Bacteriology, 127:1550-1557, 1976; Kalein et al., Biokhimiya, 45:644-651, 1980). 그러나, 1987년에 내열성 DNA 중합효소를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 기술이 소개되면서, 내열성 DNA 중합효소가 주목을 받기 시작하였으며(참조: Saiki et al., Science, 239:487-491, 1988), 전기 Taq DNA 중합효소에 이어서 써모플라스마 액시도필룸(Thermoplasma acidophilum)의 DNA 중합효소(참조: Hamal et al., Eur. J. Biochem., 190:517-521, 1990), 써무스 칼도필러스(Thermus caldophilus, Tca) GK24의 DNA 중합효소(참조: Park et al., Eur. J. Biochem., 214:135-140, 1993) 등이 분리, 정제되어 그 효소 특성이 상세히 밝혀졌다. 특히, 로이어(Lawyer) 등은 Taq DNA 중합효소 유전자를 클로닝하여, DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 완전히 밝혔다(참조: Lawyer et al., J. Biol. Chem., 264:6427-6437, 1989). Taq DNA 중합효소 유전자의 전사해독틀(open reading frame)은 총 2499개의 염기쌍으로 구성되어 있고, Taq pol I의 경우 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 38%의 상동성을 보이며. 분자량은 94 kDa으로 대장균 DNA 중합효소와 비교하여, 3′→5′엑소뉴클라아제 활성을 가지는 영역이 존재하지 않는 것이 특징으로, 대장균 DNA 중합효소에 비하여 푸루프 리딩(proof reading) 효율이 낮을 것으로 예상된다. 1995년에는 Taq DNA 중합효소의 크리스탈 구조를 규명하는데 성공함으로써 Taq DNA 중합효소의 완전한 전체구조가 처음으로 밝혀졌는데(참조: Eom et al., Acta. Crystallographica, D51:1080-1088, 1995; Kim et al., Nature, 376:612-616, 1995), 대장균 DNA 중합효소의 3′→5′엑소뉴클라아제 영역에서 발견되는 금속이온과의 결합에 요구되는 잔기들이 Taq pol Ⅰ에서는 금속이온들이 결합할 수 없는 잔기로 치환되어 있는 것으로 확인되었다.
한편, 초고온균의 내열성 DNA 중합효소는 써모코쿠스 리토리스(Thermococcus litoralis, 참조: Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19:4967-4973, 1991), 파이로코쿠스 퓨리오수스(Pyrococcus furiosus, 참조: Uemori et al., Nucleic Acids Res., 21:259-265, 1993), 설포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus, 참조: Pisani et al., Nucleic Acids Res., 20:2711-2716, 1992) 등에서 연구되었다. 특히, Tli DNA 중합효소는 3'→5′ 엑소뉴클라아제 활성을 소유하고 있으므로, 푸루프 리딩 기능이 있는 내열성 효소로서 주목을 받고 있다.
내열성 DNA 중합효소는 PCR에 의한 유전자의 증폭 및 DNA 염기서열 결정 등에 매우 유용한 효소로서, 유전공학 실험을 비롯하여 유전병 진단, 암 유전자와 바이러스 유전자의 조기진단 및 법의학적 연구에 이르기까지 광범위한 분야에서 사용되고 있으며, 그 수요가 날로 증가하고 있다. 특히, PCR은 극미량의 주형 DNA와 DNA 중합효소 및 프라이머 DNA를 이용하여, 프라이머 서냉복원(60℃), DNA 중합(72℃), DNA 변성(94℃)의 3 단계 과정을 연속적으로 반복함으로써, 원하는 염기서열을 증폭시키는 방법으로, 반응 특성상 고온을 요하기 때문에, 내열성 DNA 중합효소의 발견은 PCR 반응효율을 혁신적으로 향상시켰다.
일반적으로 고온균(thermophile)이 생산하는 효소는 중온성 세균(mesophile)이 생산하는 효소와 동일한 기능을 가지는 동시에, 고온 반응조건에서도 상당히 안정하다는 특성을 지니고 있다. 특히, 고온균 유래의 내열성 효소의 유전자를 중온성 세균인 대장균에 클로닝하면, 열처리에 의하여 중온성 세균 유래의 단백질을 대부분 제거하고, 용이하게 내열성 효소 단백질을 정제할 수 있기 때문에, 내열성 DNA 중합효소는 효소학 및 생화학적 차원에서는 물론, 산업적으로도 중요한 의의를 갖는다.
이에, 본 발명자들은 고도고온균주인 써무스속 균주의 일종으로 형태학적으로 특이한 써무스 필리포미스(Thermus filiformis, Tfi)로부터 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고자 예의 연구노력한 결과, Tfi 게노믹 DNA로부터 Tfi DNA 중합효소 유전자를 선별하고, 전기 유전자를 대장균에 클로닝한 다음, 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 결정하여, Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열이 종래의 DNA 중합효소와 높은 서열 상동성을 가지는 신규한 내열성 DNA 중합효소임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 신규한 내열성 DNA 중합효소인 Tfi DNA 중합효소의 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 유전자로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
도 1은 pKTPOL10에 클로닝되어 있는 Taq DNA 중합효소 유전자의 제한효소 지도이다.
도 2는 pTFPL과 pTFPS의 제한효소 지도 및 Tfi DNA 중합효소 유전자의 위치를 나타내는 그림이다.
도 3은 Tfi DNA 중합효소 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열이다.
도 4는 Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열과 Taq, Tca 및 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 그림이다.
본 발명자들은 제한효소로 절단된 써무스 필리포미스(T. filiformis)의 게노믹 DNA로부터 Taq pol Ⅰ유전자의 일부를 탐침으로 이용한 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션(hybridization) 방법으로 Tfi DNA 중합효소 유전자를 포함하는 절편들을 선별하고, 전기 절편들을 플라스미드 벡터에 삽입한 다음, 대장균을 형질전환시켰다. 이어서, 전기 탐침을 이용한 콜로니 하이브리다이제이션 방법으로 전기 형질전환된 대장균 중에서 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하는 양성 클론을 선별하고, 양성으로 판명된 클론으로부터 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여, 상기와 동일한 방법으로 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션을 실시함으로써, 전기 양성 클론이 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있음을 재확인하였다. 클로닝된 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편의 염기서열을 결정하고, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여, 종래의 내열성 DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Tfi DNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소와 높은 서열상동성을 가지는 신규한 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 뉴질랜드의 온천에서 분리되었고, 독특한 필라멘트 형태를 취하고 있으며, 생육적온이 73℃로 알려진 써무스 필리포미스(T. filiformis, ATCC 43280T)로부터 내열성 DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고자 하였다. 먼저, 써무스 필리포미스의 게노믹 DNA를 추출한 다음, 여러 가지 제한효소를 한 가지씩 처리하여 전기 게노믹 DNA를 완전히 절단하고, 각 제한효소에 의하여 생성된 DNA 절편들에 대하여 Taq pol Ⅰ 유전자의 5' 부위와 3'부위를 탐침으로 이용하여 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 결과, 이미 알려진 다른 내열성 DNA 중합효소 유전자의 염기서열에 근거하여 약 4.8kb와 2.2kb 위치에서 검출되는 BamHI 절편이 Tfi DNA 중합효소 유전자의 일부 또는 전체를 포함하고 있을 것으로 예상되었으므로, 전기 두 개의 절편을 각각 플라스미드 벡터에 삽입한 다음, 대장균을 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 아가플레이트 상의 니트로셀룰로오스 필터에서 배양하여, 전기 탐침을 이용한 콜로니 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 두 개의 클론이 양성으로 판정됨으로써, 이들이 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 포함하고 있는 것으로 예상되었다. 따라서, 전기 양성 클론으로부터 삽입 유전자 절편을 분리하여, 상기와 동일한 방법으로 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션을 실시한 결과, 전기 두 개의 양성 클론은 분명히 Tfi DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있음이 확인되었다. 두 클론으로부터 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 분리하여, 염기서열 결정에 유용한 플라스미드 벡터에 서브클로닝하고, 염기서열을 결정한 다음, 전기 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하여, Taq, Tca DNA 중합효소 및 대장균 DNA 중합효소의 아미노산 서열과 비교분석한 결과, 본 발명의 Tfi DNA 중합효소는 종래의 DNA 중합효소와 높은 서열상동성을 가지고 있는 신규한 내열성 DNA 중합효소임이 확인되었다. 특히, 전기 DNA 중합효소들은 중합효소 활성을 보유하는 COOH-말단 부위와 5'→3' 엑소뉴클라아제 활성을 보유하는 NH2-말단 부위에서 매우 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 것으로 확인되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: Tfi 게노믹 DNA의 분리
미합중국종균협회로부터 입수한 써무스 필리포미스(Thermus filiformis, ATCC 43280T)를 ATCC 배지 697과 723을 사용하여 72℃에서 16시간 동안 진탕배양하였다. 그런 다음, 다음과 같이 변형된 마무르(Marmur)의 방법에 따라 Tfi 게노믹 DNA를 분리하였다(참조: Marmur, J., J. Mol. Biol., 3:208-218, 1961): 200㎖의 전기 진탕배양한 균체를 원심분리로 회수하고, SETB(20% sucrose/50 mM Tris·HCl, pH 7.6/50mM EDTA) 완충액 4㎖로 현탁시킨 다음, 동결(freezing)과 해동(thawing)을 5회 반복 실시하여 세포막을 약화시키고, 라이소자임(lysozyme)과 RNase A를 각각 최종 농도가 10㎎/㎖과 100㎍/㎖이 되도록 첨가하여, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어서, 전기 반응액에 3㎖의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1, v/v)을 첨가하여, 37℃에서 12시간 동안 천천히 진탕하고, 페놀 추출에 이어 클로로포름:이소아밀알코올을 처리하고, 윈심분리하여 상등액을 취하였다. 전기 상등액에 1/10배 부피의 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2)와 2배 부피의 에탄올을 가하여 게노믹 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 3회 세척하여 진공건조시킨 다음, TE(10mM Tris·HCl, pH 7.6/1mM EDTA) 완충액으로 DNA 침전물을 용해시키고, 100㎍/㎖의 농도로 프로티나제(proteinase) K를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 다음, 페놀 추출로 단백질을 제거하고, 에탄올로 DNA를 침전시켜 TE 완충액에 용해시키고, 260nm에서 흡광도를측정하여 DNA를 정량하였다.
실시예 2: 하이브리다이제이션을 위한 DNA 탐침(probe)의 제조 및 표지
내열성 Tfi DNA 중합효소 유전자를 클로닝하고자, 약 2.5kb 크기의 Taq 중합효소 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드 pKTPOL10(참조: Kwon et al., Mol. Cells(Korea), 1:369-375, 1991)을 중복되게 제한효소로 절단하였다(참조: 도 1). 즉, 전기 플라스미드 pKTPOL10을 제한효소 EcoRⅠ/BamHⅠ 또는 HindⅢ로 완전히 절단한 다음, 0.8%의 저융점 아가로오스 젤로 전기영동하여 약 1.7kb 크기의 EcoRⅠ/BamHⅠ 절편 또는 약 1.8kb 크기의 HindⅢ/HindⅢ 절편을 분리하였다. 이어서, 전기 절편들을 포함하는 부위를 겔로부터 잘라내어, 동량의 TE 완충액을 가하고, 65℃에서 완전히 용해시킨 다음, 페놀 추출 및 클로로포름:이소아밀알코올(24:1, v/v) 추출과 에탄올 침전을 거쳐 젤로부터 전기 DNA 절편들을 회수하였다, 전기 두 가지 크기의 절편들 중에서, Taq 중합효소 유전자의 5′영역으로부터 유래된 약 1.7kb 크기의 EcoRⅠ/BamHⅠ 절편을 탐침 A로, 3′영역으로부터 유래된 약 1.8kb 크기의 HindⅢ/HindⅢ 절편을 탐침 B로 각각 정하였다.
이어서, 탐침 DNA를 멀티프라임 DNA 표지 시스템즈 RNP. 1600Y(Multiprime DNA labelling systems RNP. 1600Y, Amersham, U.S.A.)와 〔α-32P〕dATP(3000 Ci/mmol, Amersham, U.S.A.)를 사용하여 다음과 같은 표준 멀티프라임 DNA 표지 방법에 따라 표지하였다: 전기 탐침 A와 탐침 B 각 0.15㎍에 각각 멸균수를 가하고, 100℃에서 5분간 가열한 다음, 0℃에서 10분간 급냉시켰다. 이어서, 용액 2(탐침 용액)를 5㎕ 가하고, 50℃에서 5분, 그리고 20℃에서 20분간 반응시킨 다음, dNTP 각 4㎕, 용액 1(반응 완충액) 5㎕,〔α-32P〕dATP 3㎕ 및 용액 3(클레노우 절편) 2㎕를 가하고, 20℃에서 1시간 그리고 25℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음, DNA 합성에 사용되지 않은 〔α-32P〕dATP들을 10㎝ 길이의 세파덱스 G-50(Sephadex G-50, Pharmacia, U.S.A.) 컬럼을 사용하여 제거하였다.
실시예 3: 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션
상기 실시예 1에서 수득한 Tfi 게노믹 DNA와 상기 실시예 2에서 제조한 탐침 DNA를 이용하여, 실하비(Silhavy)의 방법으로 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션을 수행하였다(참조: Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, pp. 189-195, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1984). 먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 Tfi 게노믹 DNA를 제한효소 BamHⅠ, HindⅢ, PstⅠ 또는 SacⅠ으로 완전히 절단하여. 0.8% 아가로오스 젤(5mm 두께, 0.5㎍/㎖ 에티디움 브로마이드 포함)로 전기영동하고, UV 램프 하에서 형광자와 함께 사진을 찍었다. 이어서, 0.5N NaOH/0.1N NaCl 수용액 중에서 전기 젤을 60분간 변성시키고, 증류수로 30분간 세척한 다음, 젤을 종이 타월 사이에 넣고 약 1kg 정도의 무게의 물체를 올려 놓아 젤을 압축하여 젤이 약 1mm 두께가 되도록 하였다. 압축된 젤을 와트만(Whatman) 3MM 페이퍼 상으로 옮기고, 60℃에서 30분간 진공건조시켜 막상태로 만들고, 증류수로 세척하여 잔류 NaOH와 와트만 3MM 페이퍼를 완전히 제거한 다음, 약 10분간 6X SSC 용액에 함침시켰다. 이어서, 막상태의 젤을 프리하이브리다이제이션 용액(prehybridization solution, 6X SSC, 5X Denhardt's solution, 50mM sodium phosphate buffer, pH 6.5, 100㎍/㎖ sonicated salmon testis DNA(typeⅢ Na salt, Sigma, U.S.A.)에 함침시켜, 65℃에서 1시간 동안 프리하이브리다이제이션시키고, 이어서 다시 전기 탐침 A 또는 B를 첨가한 하이브리다이제이션 용액에 함침시켜, 60℃에서 16시간 이상 하이브리다이제이션시켰다. 하이브리다이제이션이 끝난 젤의 세척은 55℃에서 2X SSC 용액으로 10분씩 2회, 그리고 1X, 0.5X, 0.3X, 및 0.1X SSC 용액으로 각각 10분씩 수행하였다. 세척한 막 상태의 젤을 공기 중에서 건조시킨 다음, 오토라디오그라피(autoradiography)를 수행하여, 탐침 DNA와 하이브리다이제이션하는 밴드를 찾아 목적 DNA의 크기를 확인하였다. 탐침 A로 하이브리다이제이션시킨 경우, 4.8kb BamHⅠ 절편, 12kb HindⅢ 절편, 6kb PstⅠ 절편 및 3.5kb SacⅠ 절편이 검출되었고, 탐침 B로 하이브리다이제이션시킨 경우, 4.8kb와 2.2kb BamHⅠ 절편, 12kb HindⅢ 절편, 6kb와 4.5kb PstⅠ 절편 및 3.5kb와 2kb SacⅠ 절편이 검출되었는데, 그 중에서 4.8kb와 2.2kb BamHⅠ 절편이 Tfi DNA 중합효소 전체 유전자를 포함하고 있을 것으로 예상되었다.
실시예 4: 저융점 아가로오스 젤로부터 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편의 회수
상기 실시예 3의 BamHI으로 절단된 Tfi 게노믹 DNA를 0.8% 저융점 아가로오스 젤에서 DNA 분자량 마커와 함께 전기영동하고, 4.8kb와 2.2kb 위치에 해당하는 젤 단편을 회수하였다. 전기 젤 단편을 65℃로 가열하여 완전히 용융시키고, 용융된 젤의 부피와 동량의 TE 완충액을 가한 다음, 다시 5분간 가열하였다. 이어서, 페놀 추출 및 클로로포름:이소아밀알코올 추출과 에탄올 침전으로 DNA 절편을 회수하였다.
실시예 5: 라이게이션 및 형질전환
상기 실시예 4로부터 수득한 Tfi DNA 중합효소 전체 유전자를 포함하고 있는 것으로 예상되는 4.8kb와 2.2kb 크기의 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제(ligase)를 사용하여 각각 pUC18 플라스미드 벡터의 BamHⅠ 위치에 삽입하고, 대장균 MV1184(Takara, Japan)에 형질전환시켰다.
실시예 6: 콜로니 하이브리다이제이션
Tfi DNA 중합효소 유전자로 형질전환된 클론을 선별하기 위하여, 하나한(Hanahan)의 방법에 따라 콜로니 하이브리다이제이션(colony hybridization)을 수행하였다(참조: Hanahan and Meselson, Gene, 10:63-67, 1980). 먼저, 전기 형질전환된 대장균에 LB 배지 0.8㎖을 가하여 37℃에서 1시간 배양한 다음, 앰피실린이 함유된 아가 플레이트 상의 니트로셀룰로오스 필터에 도포하고, 12시간 동안 배양하였다. 형질전환체의 콜로니가 약 1mm 크기로 성장하였을 때, 또 다른 니트로셀룰로오스 필터로 전기 콜로니들의 레플리카(replica)를 찍어 배양하였다. 그런 다음, 니트로셀룰로오스 필터를 0.5N NaOH로 5분간 처리하고, 1M Tris·HCl, pH 7.6/1.5M NaCl 용액으로 중화시켜 80℃에서 2시간 동안 고정화(baking)한 다음, 전기 탐침 A와 탐침 B를 이용하여 상기 실시예 3에서 기술한 것과 동일한 방법으로 하이브리다이제이션 및 오토라디오그라피를 수행하여, 탐침 DNA와 하이브리다이제이션하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니로부터 알칼리 용균법으로 플라스미드 DNA를 분리하고, BamHI으로 절단하여 아가로오스 젤로 전기영동한 다음, 상기 실시예 3에서 기술한 것과 동일한 방법으로 아가로오스 젤 막 하이브리다이제이션 및 오토라디오그라피를 수행하여, 최종적으로 두 개의 클론이 Tfi DNA 중합효소 유전자를 포함하고 있음을 확인하고, 이들을 각각 'pTFPL'과 'pTFPS'라 명명하였다.
실시예 7: Tfi DNA 중합효소 유전자의 제한효소 지도 작성 및 서브클로닝
상기 실시예 6에서 수득한 pTFPL과 pTFPS를 다양한 제한효소로 절단하여, Tfi DNA 중합효소 유전자의 제한효소 지도를 작성하고자 하였다. 먼저, 하나 또는 둘 이상의 제한효소로 pTFPL과 pTFPS를 절단하고, 0.8% 또는 2% 아가로오스 젤로 전기영동한 다음, DNA 크기 마커와 비교함으로써 절단된 DNA 절편의 크기를 측정하여, 제한효소 위치에 따라 그 순서대로 제한효소 지도를 작성하였다(참조: 도 2).
전기에서 작성한 유전자 지도를 참조하여 가능한 절편의 크기가 0.5kb 이하가 되도록 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편을 제한효소로 절단하고, pBluescript SK+와 pBluescript SK-(Stratagene, U.S.A.)에 DNA 절편들을 서브클로닝(subcloning)하여, 후술하는 DNA 염기서열 결정에 사용하였다.
실시예 8: Tfi DNA 중합효소 유전자의 DNA 염기서열 결정
상기 서브클로닝된 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편들의 염기서열을 하토리(Hattori)의 방법에 따라 다이디옥시법(dideoxy method)으로 결정하고자 하였다(참조: Hattori and Sakaki, Anal. Biochem., 152:232-238, 1986). 먼저, 상기 Tfi DNA 중합효소 유전자 절편들이 삽입된 pBluescript SK+와 pBluescript SK-로 대장균 JM109를 형질전환시키고, 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 첨가된 LB 배지에서 배양한 다음, 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여, 서브클로닝한 DNA 절편들의 염기서열을 다음과 같은 단계에 따라 결정하였다.
실시예 8-1: 플라스미드 DNA의 알카리 변성
TE 완충액 32㎕에 용해시킨 플라스미드 DNA에 2N NaOH 8㎕를 가하고, 서서히 혼합하여 실온에서 10분간 방치하였다. 이어서, 3M 소디움 아세테이트(pH 5.2) 7㎕, 멸균수 4㎕와 95% 에탄올 120㎕를 가하고, -80℃에서 30분간 방치한 다음, 원심분리하여 DNA를 침전시키고, 70% 에탄올로 세척하여 건조시켰다. 건조된 DNA는 TE 완충액에 용해시켜 후술하는 다이디옥시 반응에 사용하였다.
실시예 8-2: 다이디옥시(dideoxy) 반응 및 전기영동
Thermus속 균주의 DNA는 G+C 함량이 65% 정도로 높기 때문에, 염기서열 결정시 4개의 염기가 동시에 압축되어 나오는 컴프레션(compression) 현상이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서, dGTP 대신에 7-deaza-GTP가 첨가된 디아자 G/AT7시퀀싱 믹시즈(Deaza G/AT7sequencing Mixes, Pharmacia, U.S.A.)를 이용하여, 제조회사가 제공하는 방법에 따라 다이디옥시 반응을 수행하였다: 먼저, T7 프로모터 또는 T3 프로모터 프라이머 10pmole과 서냉복원 완충액 및 상기 실시예 8-1에서 수득한 알카리 변성된 플라스미드를 총 반응액의 부피가 15㎕가 되도록 혼합하고, 65℃에서 2분간, 그리고 37℃에서 10분간 반응시킨 다음, 실온에서 약 10 내지 15분 동안 서서히 냉각시켰다. 이어서, 전기 반응액에 레이블링 믹스(Labelling Mix, Pharmacia, U.S.A.) 3㎕, [α-35S]dATP 1㎕(10mCi/mmole) 및 T7 DNA 중합효소 2㎕를 가하고, 40℃에서 5분간 반응시킨 다음, 종료 혼합물(termination mixture) 즉, ddT, ddC, ddG 및 ddA의 혼합물을 2.5㎕씩 미리 분주해둔 튜브에 4.5㎕씩 나누어 넣고, 40℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 완료되었을 때, 0.1% BPB(bromo phenol blue)와 0.1% XC(xylene cyanol)을 포함하는 포름아마이드 5㎕를 가하여, 95℃에서 3분간 변성시키고, 즉시 3㎕씩 시퀀싱 젤(6% polyacrylamide, 7M urea, 1X TBE(80mM Tris·Borate, pH 8.0, 2mM EDTA))에 로딩한 다음, 1X TBE를 사용하여 2300 V에서 전기영동하고, 오토라디오그라피를 수행하여 Tfi DNA 중합효소 유전자의 염기서열을 해석하였다(참조: 도 3). 도 3에서 GAGG는 대장균의 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, SD) 서열과 유사한 서열을 나타내고, ATG는 해독 개시코돈을 나타내며, *는 해독 종지코돈을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, Tfi DNA 중합효소 유전자는 개시코돈 ATG(Met)로 시작하여 종지코돈 TGA로 끝나는 2,502bp 크기의 유전자로, 개시코돈으로부터 6bp 상류로부터 대장균의 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, SD) 서열과 유사한 GAGG 염기서열을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 또한, 염기서열 중의 G+C 함량을 조사한 결과, 68.5%로 T. filiformis 염색체 DNA의 전체 G+C 함량(65%) 보다 약간 높았으며, 특히 코돈 내의 세 번째 위치에서 G+C가 선호(92,7%)되는 것으로 확인되었다.
실시예 9: Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열 결정 및 종래의 DNA 중합효소의 아미 노산 서열과의 비교분석
PCGENE(Sweden) 및 DNASIS 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 상기 실시예 8에서 결정된 Tfi DNA 중합효소 유전자의 염기서열로부터 아미노산 서열을 유추하고, 다른 Thermus속 균주 또는 대장균으로부터 생산되는 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 비교 분석하였다(참조: 도 4). 도 4에서 Taq은 Thermus aquaticus; Tca는 Thermus caldophilus; 및 Eco는 Escherichia coli를 각각 나타내고, ▒는 Tfi DNA 중합효소와 다른 DNA 중합효소의 아미노산 서열 간에 동일한 아미노산을 나타내며, ■는 대장균 DNA 중합효소에서 발견되며 3'→5' 엑소뉴클라제 활성 부위를 형성하는 것으로 알려진 ExoI, ExoII 및 ExoIII 부위를 나타낸다. 도 4에서 보듯이, Tfi DNA 중합효소 단백질은 NH2-말단이 메티오닌(Met)으로 시작하여, COOH-말단이 아스파르산(Asp)으로 끝나는 총 833개의 아미노산으로 구성되며, 분자량은 93,890Da인 신규한 내열성 DNA 중합효소임이 판명되었다. 한편, Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열은 다른 Thermus속 균주 또는 대장균으로부터 생산되는 DNA 중합효소들의 아미노산 서열과 매우 유사한 것으로 확인되었다. 즉, Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열은 Taq DNA 중합효소의 아미노산 서열과 78.5%의 서열 상동성을, Tca DNA 중합효소의 아미노산 서열과 78.4%의 서열 상동성을, 그리고 대장균 DNA 중합효소Ⅰ의 아미노산 서열과 41.8%의 서열 상동성을 보였다. 특히, 전기 효소들은 모두 중합효소 활성을 보유하는 COOH-말단 부위와 5'→3' 엑소뉴클라아제 활성을 보유하는 NH2-말단 부위에서 매우 높은 아미노산 서열 상동성을 가지는 것으로 밝혀졌다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 써무스 필리포미스(Thermus filiformis)로부터 분리된 신규한 내열성 DNA 중합효소(Tfi DNA 중합효소) 유전자 및 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 Tfi DNA 중합효소 유전자는 전기 유전자가 삽입된 단백질 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 내열성 DNA 중합효소를 산업적으로 대량생산하거나, 유전자 조작을 통하여 야생형 효소에 비하여 보다 기능이 향상된 내열성 DNA 중합효소를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (2)

  1. 다음과 같은 염기서열을 가지는 써무스 필리포미스(Thermus filiformis)로부터 분리된 내열성 DNA 중합효소(Tfi DNA 중합효소) 유전자:
  2. 제 1항의 유전자 서열로부터 유추되는 Tfi DNA 중합효소의 아미노산 서열:
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20200108283A (ko) * 2017-12-15 2020-09-17 유니벨시테테트 이 트롬소 - 노르게스 알크티스키 유니벨시테트 Dna 중합효소

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mol Cells 1997 Dec 31, 7(6) *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1436385A2 (en) * 2001-09-14 2004-07-14 Invitrogen Corporation Dna polymerases and mutants thereof
EP1436385A4 (en) * 2001-09-14 2005-12-14 Invitrogen Corp DNA POLYMERASES AND MUTANTS CORRESPONDING
KR20200108283A (ko) * 2017-12-15 2020-09-17 유니벨시테테트 이 트롬소 - 노르게스 알크티스키 유니벨시테트 Dna 중합효소
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