KR102594174B1 - Dna 중합효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 서열 또는 그것에 대해 적어도 70% 동일하지만, 서열번호 1의 위치 18의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있는 서열을 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 발명은 추가로 서열번호 2, 11 및 12의 아미노산 서열 및 그것의 변이체를 포함하는 DNA 중합효소를 제공한다. 본 발명은 또한 DNA 중합효소를 암호화하는 핵산, 상기 DNA 중합효소의 제조 방법, 및 상기 DNA 중합효소를 포함하는 조성물, 발현 벡터 및 숙주 세포 또는 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 뉴클레오타이드 중합반응, 증폭 및 서열분석 반응에서의 상기 DNA 중합효소의 용도를 제공한다.

Description

DNA 중합효소

본 발명은 DNA 중합효소에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 향상된 가닥 대체 활성(SDA)을 가진 변형된 DNA 중합효소에 관한 것이다.

미생물 확인의 표준 검사법(gold standard)은 여전히, 종종, 수행 및 분석에 여러날이 걸리는 과정인 원인 물질의 배양 및 후속되는 표현형 분화로 남아 있고, 이런 지연은 감염성 질환의 이환율 및 사망률에 주요한 영향을 미칠 수 있다. 이에 더불어, 많은 유기체는 배양 배지에서 성장할 수 없고, 따라서 기존의 배양 방법에 의해 검출되지 않을 것이다.

세계적으로 HIV/AIDS, 결핵, 말라리아, 콜레라 등과 같은 위독한 감염성 질환을 모니터링하고 진단할 필요성이 있다. 이러한 과제는 에볼라, 조류 및 돼지 인플루엔자 발생과 같은 잠재적 유행병 상황에서 훨씬 더 중요한 것이 된다. 진단 기술의 발전에도 불구하고, 감염이 의심되는 많은 환자가 감염원의 신속한 확인에 의해 지시된 적절한 치료법보다는 경험적 항미생물 요법을 받는다. 그 결과는 항미생물제 내성 발생으로 인해 그 수가 계속해서 줄어드는 효과적인 항미생물제의 소량 재고의 남용이다. 특정 병원체의 확인을 가능하게 하는 새롭고 신속한 현장 분자 진단 테스트에 대한 분명한 수요가 있다.

중합효소 연쇄 반응(PCR)은 많은 방식으로 분자 유전학 및 진단 분야를 크게 혁신시켰다. PCR 기술에서의 주력은, 가닥 분리, 프라이머 어닐링 및 신장을 얻기 위한 가열 및 냉각의 순환 사건과 함께, 표적 DNA 서열의 증폭으로 이어지는 열안정성 고충실도(high-fidelity) DNA 중합효소이다. PCR 기술은 이제 분자적 진단뿐 아니라 생체의학 및 생명 과학 연구에서 광범위하게 사용된다.

현장 검사(POC, Point-of-care) 진단법은 병원 외부의 환자 집단에서의 질환 진단을 가능하게 하는 의료 도구 또는 장치로서 기술된다. 이상적인 진단 테스트는 "ASSURED" 기준을 충족해야 한다: 경제적이고, 민감하며, 특이적이고, 사용자 친화적이며, 빠르고 강력하며, 장비가 필요없고 이것을 필요로 하는 사람들에게 제공되어야 함. POC 방법은 바람직하게는 간단하고, 열원 또는 안정적인 동력 공급을 필요로 하지 않는데, 이것들은 전형적으로 POC에서 이용할 수 없는 것이기 때문이다. 그러므로 사용되는 효소 및 시약은 주변 온도에서 작용해야 한다.

비록 PCR 기술이 높은 잠재력을 갖고 있지만, 여전히 엄격한 제한이 있으며 반복된 가열 및 냉각 과정을 위한 고정밀도 전기식 열순환 장비의 사용과 장비를 작동시키기 위한 숙련된 사람을 필요로 한다. 어닐링 과정에서 가짜 프라이밍(spurious priming)으로 인한 비특이적 증폭이 문제가 되며, PCR은 또한 "미정제" 샘플에서 억제성 화합물에 취약하다. 이에 더불어, PCR 장치의 대규모 설계는 PCR을 POC 기술 플랫폼에 포함시키기에는 불완전한 솔루션으로 만들고 PCR-기반 방법을 POC 진단법에서 주요 기술 구동원으로서 사용하기 어렵게 만든다.

최근에, 비-PCR 기반 방법, 특히 등온 증폭(IA) 방법에 대해 관심이 점점 증가되었다. 이들 방법에서, 핵산 증폭은 일정한 온도에서 수행되고 고정밀도 온도 순환 및 제어, 또는 고온에서 안정적인 효소가 요구되지 않는다. 등온 증폭 방법은 PCR에 견줄만한 분석적 민감성 및 특이성뿐만 아니라 억제성 화합물에 대해 더 높은 내성을 가지는 한편, 결과를 얻기까지 더 짧은 시간과 더 용이한 사용을 허용하는 것으로 보고된다. 이들 특징은 POC 분자 진단 플랫폼을 개발하고 "ASSURED" 기준을 충족시키는 것을 목표로 하는 사람들에게 등온 증폭 방법을 매우 바람직한 것으로 만든다. 지난 십년 동안 핵산(RNA 및 DNA 둘 다)의 등온 증폭에 대한 많은 상이한 방법이 공개되었고(Gill, P. and A. Ghaemi(2008) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27(3): 224-243; Craw, P. and W. Balachandran(2012) Lab Chip 12(14): 2469-2486; de Paz, H. D. et al.(2014) Expert Rev Mol Diagn 14(7): 827-843; Yan, L. et al.(2014) Mol Biosyst 10(5): 970-1003 검토) 새로운 것들이 계속해서 개발되고 있다(Liu, W. et al.(2015) Sci Reports 5: 12723). 여러 방법에서, 성공은 반응 설정에서 사용된 DNA 중합효소의 고유한 가닥 대체 활성(SDA, strand displacement activity)에 의존한다. 용어 “가닥 대체”는 합성 중에 만나는 하류 DNA를 대체하는 중합효소의 능력을 나타낸다.

(POC) 진단법에 더불어 또한 관심의 다른 영역도 DNA 중합효소에 의해 강력해진 등온 증폭 기술로부터 이점이 있다. 이런 관점에서, 전체 게놈 증폭(다중 대체 증폭, multiple displacement amplification)은 특히 단일 세포 접근법에서와 같이 매우 제한된 양의 DNA가 존재할 때 중요하다. 또한, 차세대 서열분석 접근법에서 가닥 대체 중합효소는 Pacific Biosciences사의 단일 분자 실시간(SMRT) DNA 서열분석 기술 및 2013년에 Ma 등에 의해 발표된 차세대 서열분석에 대한 등온 증폭 방법(Ma, Z. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110(35): 14320-14323)에 의해 예시되는 것과 같이 중요하다.

그러나, 주변 온도에서 잘 기능하는 중합효소의 현재의 툴박스(toolbox)는 매우 제한된다. 전형적으로, 상이한 등온 방법은 주로 반응에 사용된 중합효소의 작동 범위에 의해 결정되고 염에 의해 억제되기 쉬운, 30 내지 65℃의 반응 온도를 필요로 한다.

DNA 중합효소의 A-패밀리에 속하는 싸이크로바실루스 종(Psychrobacillus sp., PB)로부터의 저온-적응 중합효소가 특성확인되었다. 이 효소는 주변 온도에서 높은 중합효소 활성을 갖고 있지만 40℃까지의 상승 온도에서도 여전히 양호한 안정성을 가진다. 특히 관심있는 것은, 해양 유래 효소 또한 25℃에서 능숙한 가공성뿐만 아니라 양호한 염 내성 및 강력한 가닥-대체 활성(SDA)을 가지며, 최신 상용 효소(WO　2017/162765)와 비슷하다는 것이다.

많은 IA 방법에서 중합효소만이 필요하며 방법의 유효성은 그 중합효소의 SDA에 대부분 의존한다. 그러므로 IA에 사용된 PB 또는 다른 중합효소의 SDA를 증가시키기 위해 작용하는 어떤 것이든지 매우 바람직할 것이다.

본 발명자들은 놀랍게도 A 패밀리의 특정 중합효소의 핑거 도메인(finger domain)에서의 단일 점 돌연변이, 특히 단일 Asp 잔기의 대체가 상당히 향상된 SDA로 이어지는 것을 발견하였다.

그러므로, 제1 양태에서, 본 발명은 DNA 중합효소를 제공하는데, 상기 DNA 중합효소는 서열번호 1의 서열 또는 그것에 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 78%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 92% 또는 95% 동일하지만, 서열번호 1의 위치 18에 있는 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있는 서열을 포함한다.

서열번호 1은 PB 중합효소 I의 아미노산 서열의 단편이며, 절단된(5'- 3'-엑소뉴클레아제 도메인이 없음) 야생형 PB 서열의 아미노산 405 내지 436에 걸쳐 있다. 핑거 도메인 내의 상기 영역(405-436)은 일부 DNA 중합효소 A 패밀리(pol I 패밀리로도 알려져 있음) 중에서 고도로 보존되어 있다(도 1 및 5 참조). 본 발명의 DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 중합효소 I 또는 A형의 것으로 분류될 것이다.

본 발명의 바람직한 DNA 중합효소는 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10의 서열을 포함하지만 각 서열의 위치 18의 아스파르트산 잔기는 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 서열번호 1과 비교하여 단일 또는 다중 아미노산 변경(첨가, 치환, 삽입 또는 결실)을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 상기 언급된 Asp 잔기의 대체 외에 바람직하게는 최대 8, 7 또는 6개 이하, 예컨대 단지 1, 2, 3, 4 또는 5개, 바람직하게는 1, 2 또는 3개, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 변경된 아미노산을 함유할 수 있다. 치환은 보존성 또는 비보존성 아미노산으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 변경은 보존성 아미노산 치환이다.

본 발명의 바람직한 중합효소는 변형된 PB 중합효소이며, 추가로 바람직한 중합효소는 제오바실루스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus, Bst로 알려져 있음), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Bsu로 알러져 있음), 바실루스 스미티이(Bacillus smithii, Bsm으로 알려져 있음) 및 우레이바실루스 써모스파에리쿠스(Ureibacillus thermosphaericus, Ubts로 알려져 있음) 종으로부터의 변형된 중합효소이다.

용어 "DNA 중합효소"는 개별적인 뉴클레오타이드로부터 DNA의 5'→3' 합성을 촉매하는 효소를 나타내며, 반응은 프라이머 연장 및 주형 가닥에 대한 염기쌍 형성의 표준 왓슨-크릭 규칙을 토대로 한다. 마찬가지로, "DNA 중합효소 활성"은 개별적인 뉴클레오타이드로부터 DNA의 5'→3' 합성을 나타내며, 반응은 프라이머 연장 및 주형 가닥에 대한 염기쌍 형성의 표준 왓슨-크릭 규칙을 토대로 한다. 자연적으로 발생하는 또는 변형된 중합효소의 효소적으로 활성(촉매적으로 활성) 단편은 용어 "DNA 중합효소" 내에 포함된다. 중합효소는 또한, 3'→5' 엑소뉴클레아제 및/또는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 가질 수 있지만, 그렇지 않을 수도 있다. 바람직하게 본 발명의 DNA 중합효소는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 없다.

본 발명자들은 상기 언급된 아스파르트산 잔기의 대체가 DNA 중합효소 A로서 알려져 있는 패밀리의 여러 상이한 DNA 중합효소에서 SDA를 상당히 증가시키는 것을 발견하였고, 본 발명에 따라 변형으로부터 이익을 취할 수 있는 효소는 서열번호 1(PB 효소의 핑거 도메인의 특정 영역)과 높은 서열 동일성 및 위치 18 또는 다른 효소/서열의 동등한 위치에서의 아스파르트산 잔기에 의해 특성화된다. 서열번호 1(또는 다른 서열)과 "다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기"는 Clustal X2(Larkin, M.A. et al.(2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23:2947-2948)와 같은 표준 서열 정렬 기법을 사용함으로써 쉽게 확인될 수 있다.

물론, 서열번호 1 자체가 완전히 기능적인 DNA 중합효소를 정의하지 않는다. 바람직한 구현예에서 본 발명의 DNA 중합효소는, 바람직하게 야생형 싸이크로바실루스 종 DNA 중합효소 I 서열에 존재하는 5'-3'- 엑소뉴클레아제 도메인이 없는, PB DNA 중합효소 I의 아미노산 서열을 토대로 한다. 바람직한 구현예에서, 5'-3'- 엑소뉴클레아제 도메인은, 5'-3'- 엑소뉴클레아제 활성이 증폭 혼합물에서 프라이머 및/또는 생성물을 분해할 수 있기 때문에 일반적으로 원치 않는 것이라서 DNA 중합효소 효소에 없다. 이런 절단된 야생형 PB 서열은 본원에서 서열번호 2로서 언급된다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 2와 적어도 60% 동일하지만 서열번호 2의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 또는 그것으로 이루어지는 DNA 중합효소를 제공한다.

바람직한 양태 및 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 서열번호 2에 대해 적어도 70%, 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5%이거나, 서열번호 2와 동일하지만 서열번호 2의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있는 아미노산 서열을 포함한다(또는 그것으로 이루어진다). 서열번호 1의 위치 18 및 서열번호 2의 위치 422는 동등하고, 서열번호 1은 서열번호 2의 위치 405 내지 436의 단편인 것으로 이해될 것이다.

도 5는 PB, Bst 및 Ubts DNA 중합효소의 정렬을 도시한다. 핵심 Asp 잔기는 각 경우에 위치 422에 있다.

다른 바람직한 구현예 또는 양태에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 서열번호 11 또는 12에 대해 적어도 60%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%, 예컨대 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5% 동일하지만 서열번호 11 또는 12의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있는 아미노산 서열을 포함한다(또는 그것으로 이루어진다). 넘버링은 도 5에 따르는 서열 정렬을 토대로 한다. 서열번호 11 및 12는 각각 야생형 Bst 및 Ubts 중합효소 서열의 (절단된) 변이체이다.

바람직하게는, 본 발명의 DNA 중합효소는 서열번호 2, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하거나 그것으로 이루어지지만 서열번호 2, 11 또는 12의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있다.

일 구현예에서, DNA 중합효소는 서열번호 4(또한 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인을 포함함)의 아미노산 서열 또는 그것의 변이체 또는 단편을 포함하지만(또는 그것으로 이루어지지만) 서열번호 4의 위치 719의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기는 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있다. 본원에서 기술된 서열번호 2의 변이체 및 단편의 유형은, 준용되어, 서열번호 4의 변이체 및 단편에 적용되는데, 예컨대 변이체는 서열번호 4에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80% 또는 90% 서열 동일성을 가질 것이다.

본 발명의 DNA 중합효소는 천연 중합효소의 효소적으로 활성인 단편을 포함한다. 효소적으로 활성인 단편은 DNA 중합효소 활성을 가지는 단편이다. 효소적으로 활성인 단편은 길이가 적어도 400개, 적어도 450개, 적어도 475개, 적어도 500개, 적어도 525개, 적어도 550개, 적어도 560개, 적어도 570개 또는 적어도 575개의 아미노산일 수 있다. 바람직한 단편은 길이가 적어도 525개, 적어도 550개, 적어도 560개, 적어도 570개 또는 적어도 575개의 아미노산이다. 단편은 서열번호 2, 11 또는 12의 상응하는 부분에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 95%(예컨대 적어도 98% 또는 99% 또는 99.5%), 또는 100% 동일하지만 서열번호 2, 11 또는 12의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기는 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있다.

DNA 중합효소 활성은 루프 구조를 내포하고 8mer 스템(stem) 내에서 형광 도너로서 FAM 및 억셉터(비형광 소광제)로서 Dabcyl을 사용하는 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 평가될 수 있다. 상기 스템은 프라이머의 결합을 허용하여 DNA 중합효소에 대한 주형으로서 작용하는 3'-연장부를 포함한다. 상기 스템은 연장이 진행될 때 DNA 중합효소에 의해 개방될 것이다. 2개의 라벨의 이어지는 분리는 FAM 방출의 복원에 의해 기록된다. 이런 유형의 적합한 검정은 실시예에서 기술된다.

본 발명의 DNA 중합효소는 양호한 가닥 대체 활성을 가진다. 이것은 많은 등온 증폭 방법에서 성공이 반응 설정에서 사용된 DNA 중합효소의 고유한 가닥 대체 활성에 의존하기 때문에 중요한 특성이다. 용어 "가닥 대체"란 합성 중에 만나는 하류 DNA를 대체하는 중합효소의 능력을 나타낸다.

DNA 중합효소의 가닥 대체 활성을 평가하기 위한 적합한 검정은 당 기술분야에 알려져 있고 당업자는 적합한 검정을 쉽게 선택할 수 있다. 예시의 가닥 대체 활성 검정에서, 그것의 3' 말단에서 형광단(예컨대 TAMRA)으로 표지된 "콜드" 프라이머 및 리포터 가닥은 그것의 5' 말단에 소광제(예컨대 BHQ2)를 가지는(따라서 형광단은 아주 가까이 있는 소광제에 의해 소광됨) 주형 가닥에 어닐링되어서 어닐링된 "콜드" 프라이머의 3' 말단과 어닐링된 리포터 가닥의 5' 말단 사이에 한 개의 뉴클레오타이드 갭이 있게 되고; DNA 중합효소의 가닥 대체 활성으로 형광단 표지된 올리고뉴클레오타이드(리포터 가닥)는 주형 가닥으로부터 대체되고 그 결과 형광단 및 소광제는 더 이상 가까이 있지 않게 되며 형광의 증가가 측정될 수 있다.

가닥 대체 활성은 (i) 5' 말단에 소광제(형광 소광제)를 가지는 주형 DNA 분자를 제공하는 단계, (ii) 상기 주형 DNA 분자에 콜드 프라이머(즉 비-형광 올리고뉴클레오타이드) 및 3' 말단에서 형광단으로 표지된 리포터 가닥(리포터 올리고뉴클레오타이드)을 어닐링하는 단계로, 어닐링된 "콜드" 프라이머의 3' 말단과 어닐링된 리포터 가닥의 5' 말단 사이에 한 개의 뉴클레오타이드 갭이 있고, 그로써 상기 소광제가 서로 근접함으로써 형광단을 소광하게 되는 단계, (iii) 상기 주형-콜드 프라이머-리포터 가닥 복합체를 DNA 중합효소, Me²⁺ 및 dNTP와 함께 인큐베이션하는 단계, 및 (iv) 이전에 소광된 형광단의 증가하는 형광을 측정하는 단계로서, 상기 형광은 가닥 대체 활성을 나타내는 것인 단계를 가지는 검정으로 평가될 수 있다.

바람직한 프라이머, 리포터 가닥 및 주형 가닥은 실시예에서 기술되는 것과 같다.

바람직한 구현예에서, 가닥 대체 활성(SDA)은 실시예 단락에서 기술된 가닥 대체 활성 검정에 따라 평가된다. SDA는 바람직하게는 그 중합효소에 대한 거의 최적의 온도에서 측정된다. PB 및 다른 중온성 균의 경우 그것은 약 25℃-37℃일 수 있다.

본 발명은 야생형 DNA 중합효소의 SDA가 향상되는 것을 허용한다. PB의 경우에 SDA는 가장 많이 상업적으로 이용 가능한 중합효소와 비교하여 이미 높지만 SDA는 여전히 본원에서 기술된 위치 18/422에서 아미노산 변형을 실행함으로써 상당히 증가될 수 있다(도 3 참조). 본 발명에 포함된 열안정성 중합효소, 예컨대 Ubts 및 Bst의 경우, 기본 SDA는 주변 온도(25-37℃)에서 아주 낮다. 그러나 SDA는 또한 아스파르트산 잔기가 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기로 대체되는 경우 37℃에서 상당히 향상된다. 상이한 중합효소가 상이한 시나리오로 유용할 수 있는데, 예컨대 Bst 및 Ubts는 열안정적이고(각각 66℃ 및 62℃의 Tm), 따라서 이들 효소 중 어느 것에 대해서도 SDA를 향상시키는 능력이 매우 유용하다(도 6 및 7 참조).

그러므로, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 서열번호 1 또는 2에 대하여 정확히 동일한 서열을 갖지만, 위치 18 또는 422, 또는 다른 서열의 동등한 위치에서 아스파르트산을 가진 DNA 중합효소보다 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100% 이상의 SDA를 가진다. 바람직하게는 관찰된 % 증가는 적어도 각 효소가 그것의 최대 SDA를 나타내는 조건 하에서 찾을 수 있을 것이다. 달리 표현하면, 각 효소가 수행할 수 있는 최선에 대해, 본 발명의 중합효소는 바람직하게 그것의 아스파르트산 함유 동등물보다 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 100% 더 높은 SDA를 가질 것이다.

상기에서 논의된 아스파르트산 잔기가 음전하가 없는 잔기로 대체되는 상기 변형은 본 발명에 의해 제공되는 이점에서 중요하다. 대체는 전형적으로 또 다른 아미노산 잔기로의 치환을 포함하지만 일부 구현예에서 아스파르트산 잔기는 그것의 음전하를 제거하기 위해 변형될 수 있었다. 그러므로, 본 발명의 중합효소의 위치 18/422에서의 잔기는 중성이거나 양으로 대전될 것이다. 중성 아미노산은 극성 아미노산과 소수성 아미노산을 포함한다. 적합한 대체 아미노산으로는 Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Ile, Leu, Tyr, Val, Lys 및 Arg을 들 수 있다. 중성 또는 양으로 대전된 비표준, 즉 유전자 코딩이 되지 않은 아미노산이 포함될 수 있다. Ala가 특히 바람직하다.

본 발명자들은 또한 발명의 일부 중합효소가 상기 논의된 Asp 잔기를 함유한 효소와 비교하여 상승된 [NaCl] 및 [KCl]에서 개선된 SDA 성능을 나타내는 것을 발견하였다(표 2 및 4 참조). 그러므로 향상된 염 내성은 본 발명에 의해 제공될 수 있는 추가의 이익이다.

본 발명의 바람직한 DNA 중합효소는 염(NaCl 및/또는 KCl) 농도 범위에 걸쳐 유용한 수준의 중합효소 활성을 가진다. 달리 말하면, 본 발명의 바람직한 DNA 중합효소는 광범위한 염 농도에 걸쳐 최대 중합효소 활성이 관찰되는 염 농도에서 관찰된 DNA 중합효소 활성의 상당한 부분을 나타낸다. DNA 중합효소 활성을 측정하기 위한 적합한 검정은 본원의 다른 곳에서 기술된다. DNA 중합효소 활성을 측정하기 위한 바람직한 검정은 실시예 단락에서 기술되는 것과 같다.

일부 구현예에서, 약 20 mM 내지 200 mM NaCl 또는 KCl 또는 이들의 혼합물의 농도 범위에 걸쳐, 본 발명의 DNA 중합효소는 이것의 최대 중합효소 활성의 상당한 부분(예컨대 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 60%)을 나타낸다.

추가의 양태에서 본 발명은 본 발명의 DNA 중합효소를 포함하는 분자(예컨대 단백질, 예컨대 융합 단백질)를 제공한다.

전체 출원에서 내내 사용되는 바, "하나"를 나타내는 용어는, 그 후에 상한 또는 배제가 구체적으로 진술되는 경우를 제외하고, 그것이 "적어도 하나", "적어도 제1", "하나 이상" 또는 "복수의" 참조된 구성요소 또는 단계를 의미하는 것으로 사용된다. 조합의 작동 가능한 한계 및 파라미터는, 임의의 단일 작용제의 양처럼, 본 개시의 관점에서 기술분야의 숙련자들에게 알려질 것이다.

본원에서 규정된 본 발명의 DNA 중합효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 핵산 분자, 또는 그것에 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 발명의 추가의 양태를 형성한다. 바람직한 핵산 분자는 서열번호 2의 DNA 중합효소 I을 암호화하는 핵산, 또는 그것에 실질적으로 상동하는(예컨대 그것에 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한) 서열이지만 서열번호 2의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 다른 서열의 동등한 아스파르트산 잔기는 음으로 대전되지 않은 아미노산 잔기에 의해 대체되어 있다.

바람직한 핵산 분자는 서열번호 13, 14 또는 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하며(또는 그것으로 이루어지며), 또는 그것에 실질적으로 상동하는 서열이다. 선택적으로, 서열번호 13, 14 또는 15의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 생략될 수 있다. 발명의 핵산 서열은 서열번호 13, 14 또는 15에 대해 적어도 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%의 서열 동일성을 가지는 서열을 포함한다. 그러므로 발명의 핵산 서열은 서열번호 13, 14 또는 15의 서열에 대해 단일 또는 다중 염기 변경(첨가, 치환, 삽입 또는 결실)을 포함한다.

특히 바람직한 핵산 분자는 서열번호 13, 14 또는 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진다.

본 발명은 또한 본원에서 기술된 핵산 분자의 축퇴성 버전, 예컨대 서열번호 13, 14 또는 15를 포함하는(또는 그것으로 이루어지는) 핵산 분자의 축중(degenerate) 버전인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는(또는 그것으로 이루어지는) 핵산 분자로 확장된다.

발명의 핵산 분자는 바람직하게는 "분리된" 또는 "정제된"다.

상동성(예컨대 서열 동일성)은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열간 상동성(예컨대 동일성) 정도를 결정하기 위하여, 서열의 다중 정렬을 실행하는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Clustal W(Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680, 1994)가 유용하다. 필요에 따라, Clustal W 알고리즘은 BLOSUM 62 채점 매트릭스(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919, 1992) 및 10의 갭 개방 페널티 및 0.1의 갭 연장 페널티와 함께 사용될 수 있어서, 두 서열 사이에 최고 차수 매치가 얻어지고 이때 서열 중 하나의 총 길이의 적어도 50%가 정렬에 포함된다. Clustal X는 Clustal W에 대한 편리한 창 인터페이스(window interface)이다(Thompson, J.D. et al(1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25:4876-4882).

서열을 정렬하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 최고 차수 매치가 두 서열 사이에서 얻어지고 동일한 아미노산의 수가 두 서열 사이에서 결정되도록 Smith and Waterman에 의해 개정된 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981) Needleman and Wunsch의 정렬 방법(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970)이다. 두 아미노산 서열 사이의 백분율 동일성을 계산하기 위한 다른 방법은 일반적으로 당업계에서 인식되고, 예를 들어, Carillo and Lipton에 의해 기술된 방법들(Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48:1073, 1988) 및 Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects에서 기술된 방법들을 들 수 있다.

일반적으로, 컴퓨터 프로그램이 이러한 계산에 사용될 것이다. ALIGN(Myers and Miller, CABIOS, 4:11-17, 1988), FASTA(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183:63-98, 1990) 및 갭이 있는 BLAST(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), BLASTP, BLASTN, 또는 GCG(Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12:387, 1984)와 같이, 서열을 비교하고 서열의 쌍을 정렬하는 프로그램이 또한 이 목적에 유용하다. 나아가, 유럽 생물정보학 연구소(European Bioinformatics institute)의 Dali 서버는 단백질 서열의 구조-기반 정렬을 제공한다(Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20:478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233:123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26:316-9, 1998).

기준점을 제공함으로써, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성 등을 가지는 본 발명에 따르는 서열은 디폴트 파라미터를 포함한 ALIGN 프로그램(예를 들어 GENESTREAM 네트워크 서버, IGH (Montpellier, France)에서 인터넷 상으로 이용 가능함)을 사용하여 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 치환이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 패밀리는 기술분야에서 정의되어 있다.

본 발명의 DNA 중합효소는 유전자상으로 암호화된 아미노산을 포함하지만, 또한 하나 이상의 유전자상으로 암호화되지 않은 아미노산을 함유할 수 있다.

DNA 중합효소와 같은 단백질 또는 폴리펩타이드 분자와 관련하여 사용될 때, 용어 "분리된" 또는 "정제된"은 전형적으로 그것이 유래되는 공급원으로부터 세포 물질 또는 다른 단백질이 실질적으로 없는 단백질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이러한 분리된 또는 정제된 단백질은 재조합 기법에 의해 생성될 때 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.

일 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자, 또는 그것의 단편, 및 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 벡터(바람직하게는 재조합 발현 벡터)를 제공한다.

가능한 발현 벡터는, 한정하는 것은 아니지만, 벡터가 사용된 숙주 세포와 부합되는 한, 코스미드 또는 플라스미드를 포함한다. 발현 벡터는 "숙주 세포의 형질전환에 적합한" 것이고, 이것은 발현 벡터가 발명의 핵산 분자 및 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된, 발현에 사용될 숙주 세포를 기반으로 선택된 조절 서열을 함유하는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된이란 핵산이 그 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된 것을 의미하는 것으로 의도된다.

적합한 조절 서열은 박테리아, 진균, 바이러스, 포유류, 또는 곤충 유전자를 포함한 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있고 기술분야에 잘 알려져 있다. 적절한 조절 서열의 선택은 하기에서 논의되는 것과 같이 선택된 숙주 세포에 좌우되고, 기술분야의 숙련된 지식을 가진 사람에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예로는: 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 중합효소 결합 서열, 번역 개시 신호를 포함한, 리보솜 결합 서열을 들 수 있다. 추가적으로, 선택된 숙주 세포 및 사용된 벡터에 따라, 다른 서열, 예컨대 복제 기원, 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사 유도성을 부여하는 서열이 발현 벡터에 포함될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 또한 본 발명의 재조합 분자로 형질전환된 또는 형질주입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 또한 재조합 단백질의 증가된 발현; 재조합 단백질의 증가된 용해도를 제공하는 및/또는 친화성 정제에서 리간드로서 작용함으로써 표적 재조합 단백질의 정제를 보조하는 융합 모이어티를 암호화하는 유전자를 함유할 수 있다(예를 들어 정제 및/또는 확인을 가능하게 하기 위한 적절한 "태그", 예컨대 His 태그 또는 myc 태그가 존재할 수 있다).

재조합 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 생성하기 위해 숙주세포에 도입될 수 있다. 용어 "~로 형질전환된", "~로 형질주입된", "형질전환" 및 "형질주입"은 기술분야에 공지되어 있는 많은 가능한 기법 중 하나에 의해 세포로의 핵산(예컨대, 벡터)의 도입을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질주입하기에 적합한 방법은 Sambrook et al., 1989(Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 및 다른 실험실 텍스트북에서 찾아볼 수 있다.

적합한 숙주 세포는 광범위한 원핵 숙주 세포 및 진핵 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 단백질은 박테리아 숙주 세포, 예컨대 대장균에서 발현될 수 있다.

다른 분자, 예컨대 단백질(예컨대 에피토프 태그)에 컨쥬게이트된 본 발명의 DNA 중합효소 및 단백질을 포함하는 N-말단 또는 C-말단 융합 단백질은 재조합 기법을 통한 융합에 의해 제조될 수 있다.

또 다른 양태는 본 발명의 발현 작제물 또는 발현 벡터를 하나 이상 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스를 제공한다. 또한 본 발명의 핵산 분자를 하나 이상 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스가 제공된다. 발명의 DNA 중합효소를 발현할 수 있는 숙주 세포 또는 바이러스가 또 다른 양태를 형성한다. 바람직한 숙주 세포는 Rosetta 2(DE3) 세포(Novagen)를 들 수 있다.

본 발명의 DNA 중합효소는 숙주 세포에서 재조합에 의해 생성되고 그것으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 그러므로 본 발명의 DNA 중합효소는 재조합 효소, 특히 분리된 재조합 효소로 여겨질 수 있다. 특정 구현예에서 DNA 중합효소는 재조합 기법에 의해 DNA 중합효소가 유래된 것과 동일한 유기체가 아닌, 또는 그것으로부터 유래되지 않은 숙주 세포에서 생성된다.

본 발명의 DNA 중합효소는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 대안으로, 세포-유리 발현 시스템이 DNA 중합효소의 생성을 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 DNA 중합효소는 DNA 중합효소가 단계적 신장에 의해, 한 번에 한 개의 아미노산이 생성되도록 화학적 합성을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 화학적 합성 기법(예컨대 고체 상 합성)은 단백질 화학분야에서 잘 알려져 있다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 DNA 중합효소의 제조 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 (i) 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 벡터 또는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 암호화된 DNA 중합효소 또는 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 선택적으로 (ii) 숙주 세포로부터 또는 성장 배지/상층액으로부터 DNA 중합효소 또는 단백질을 분리 또는 수득하는 단계를 포함한다. 이러한 제조 방법은 또한 DNA 중합효소 또는 단백질 생성물의 정제 단계 및/또는 DNA 중합효소 또는 단백질 생성물을 적어도 하나의 추가적인 구성요소, 예컨대 허용 가능한 완충제 또는 담체를 포함하는 조성물로 제제화하는 단계를 포함할 수 있다.

DNA 중합효소는 숙주 세포/배양 배지로부터 기술분야에 알려져 있고 문헌에서 광범위하게 기술되어 있는 단백질에 대한 임의의 정제 기법 또는 그것의 조합을 사용하여 분리될 수 있다. 이러한 기법으로, 예를 들어, 침전, 한외여과, 투석, 다양한 크로마토그래피 기법, 예컨대 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 등을 들 수 있다. 상기에서 논의된 것과 같이, 본 발명의 DNA 중합효소는 아미노산 모티프 또는 다른 단백질 또는 비단백질 태그, 예컨대 폴리히스티딘 태그(예컨대 His₆-태그)를 분리, 가용화 및/또는 정제 또는 확인을 보조하기 위하여 운반하기 위해 변형될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오타이드(예컨대 dNTP) 중합반응을 위한 본 발명의 DNA 중합효소의 용도를 제공한다. 따라서, 발명의 DNA 중합효소는 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 핵산(DNA) 가닥을 연장하기 위해 사용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 핵산(DNA) 증폭 또는 서열분석 반응에서 본 발명의 DNA 중합효소의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은, 예컨대 본원에서 기술된 것과 같이, 분자 비콘 검정에서 또는 가닥 대체 검정에서 본 발명의 DNA 중합효소의 용도를 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 용도 및 방법에서, 본 발명의 DNA 중합효소는 일정한 온도에서, 즉 열 순환 없이 사용된다. 따라서, 등온 반응에서 본 발명의 DNA 중합효소의 사용이 특히 바람직하다.

등온 증폭 반응에서 본 발명의 DNA 중합효소의 사용이 특히 바람직하다. 등온 반응은 일정한 온도에서 수행된다. 많은 등온 증폭 기법이 기술분야에 알려져 있고 루프 매개된 등온 증폭(LAMP), 롤링 써클 증폭(RCA), 가닥 대체 증폭(SDA), 다중 대체 증폭(MDA) 및 교차 프라이밍 증폭(CPA)을 들 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 중합효소를 사용하는 뉴클레오타이드 중합반응 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 본 발명의 DNA 중합효소, 주형 핵산 분자, 주형 핵산 분자의 일부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 종(예컨대 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, dNTP)을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 주형 핵산 분자에 어닐링되고 상기 DNA 중합효소가 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시키는 조건 하에서 상기 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 적합한 조건은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 바람직하게 일정한 온도가 사용되며 바람직한 온도는 본원의 다른 곳에서 설정된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 생성물의 생성이 검출된다(예컨대 겔 전기영동을 통해).

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 중합효소를 사용하여 핵산(DNA)을 증폭시키는 방법을 제공한다. 전형적으로, 상기 방법은 본 발명의 DNA 중합효소, 주형 핵산 분자, 주형 핵산 분자의 일부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)(예컨대 2, 3, 4, 5 또는 6개 프라이머와 같이 2개 이상의 프라이머), 및 뉴클레오타이드(예컨대 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, dNTP)를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계, 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)가 주형 핵산 분자에 어닐링되고 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 상기 DNA 중합효소가 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)를 연장시키는 조건 하에서 상기 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 적합한 조건은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 바람직한 핵산 증폭 방법은 등온 증폭 방법이다. 본 발명의 등온 증폭 방법은 일정한 온도에서 수행되며 바람직한 온도는 본원의 다른 곳에서 설정된다. 선택적으로, 폴리뉴클레오타이드 생성물의 생성이 검출된다(예컨대 겔 전기영동을 통해).

예시의 등온 증폭 방법은 루프 매개된 등온 증폭(LAMP), 롤링 써클 증폭(RCA), 가닥 대체 증폭(SDA), 다중 대체 증폭(MDA) 및 교차 프라이밍 증폭(CPA)을 들 수 있다.

일부 구현예에서, 특히 PB 서열을 토대로 한 DNA 중합효소를 사용하는 구현예에서, 본 발명의 방법 및 용도에 사용된 일정한 온도는 저온 내지 중간 온도이며, 예를 들어, 0℃ 내지 약 42℃의 범위 내에서 선택되고, 바람직하게는 약 10℃ 내지 약 40℃, 또는 약 20℃ 내지 약 40℃, 또는 약 25℃ 내지 약 40℃, 또는 약 30℃ 내지 약 40℃ 또는 약 35℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃ 내지 약 40℃의 범위 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 15℃, 또는 약 10℃ 내지 약 20℃의 범위 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 30℃의 범위 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 20℃ 내지 약 30℃의 범위 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 10℃ 내지 약 25℃의 범위 내에서 선택된다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 약 20℃ 내지 약 25℃의 범위 내에서 선택된다. 약 25℃의 일정한 온도가 바람직하다. 일부 구현예에서, 일정한 온도는 25℃이다.

본 발명의 다른 중합효소, 예를 들어 호열성인 유기체로부터의 서열을 토대로 한 중합효소를 사용하면, 일정한 온도는 중간 내지 고온일 수 있고, 예컨대 25℃-65℃, 바람직하게는 40℃-65℃의 범위 내에서 선택된다.

온도는 반응 중에 온도를 변화시키기 위해 활성 단계가 수행되지 않을 때, 예컨대 열 순환이 없을 때 일정한 것으로 간주될 수 있다. '일정한' 온도는 또한 방법 중에 예컨대 최대 약 5℃, 전형적으로 3℃ 또는 2℃ 이하의 온도 변동을 허용할 수 있다.

본 발명의 DNA 중합효소는 현장 검사 분자 진단 플랫폼에 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA 중합효소는 전체 게놈 증폭에 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA 중합효소는 차세대 서열분석 방법에 사용될 수 있다. 소위 "차세대" 또는 "제2 세대" 서열분석 접근법("제1 세대" 접근법으로서 생거(Sanger) 디데옥시뉴클레오타이드 방법과 관련하여)이 널리 확산되었다. 이들 새로운 기법은, 예컨대 병렬, 예컨대 대용량 병렬 서열분석 반응의 사용의 결과로서, 또는 단축 시간-소모 단계를 통한 고처리량을 특징으로 한다. 다양한 고처리량 서열분석 방법은 단일 분자 서열분석을 제공하고 피로서열분석(pyrosequencing), 가역적 종결자 서열분석, 결찰에 의한 절단 가능한 프로브 서열분석, 결찰에 의한 비-절단성 프로브 서열분석, DNA 나노볼(nanoball), 실시간 단일 분자 서열분석과 같은 기법을 사용한다.

본 발명의 DNA 중합효소에 대한 본원의 참조는 문맥상 분명히 다르지 않는 한 활성 단편을 포함한다.

본 발명의 용도 및 방법은 일반적으로 시험관내(in vitro)에서 수행된다.

본 발명은 또한 본 발명의 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 바람직하게는 완충제를 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 조성물은 핵산 증폭 반응(예컨대 등온 증폭 반응)을 수행하기 위해 하나 이상의 필요한 시약, 예컨대 증폭될 주형 DNA의 영역에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 뉴클레오타이드(예컨대 dNTP)를 추가로 포함한다. 일반적으로 조성물은 수성이고 Tris, HEPES, 등과 같은 표준 완충제로 완충될 것이다.

본 발명은 하나 이상의 발명의 DNA 중합효소, 또는 하나 이상의 본 발명의 조성물, 또는 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자, 또는 하나 이상의 본 발명의 발현 벡터, 또는 하나 이상의 본 발명의 숙주 세포 또는 바이러스를 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 바람직하게 상기 키트는 본원에서 기술된 것과 같은 방법 및 용도에, 예컨대 핵산 증폭 방법, 예컨대 등온 증폭 반응에서 사용하기 위한 것이다. 바람직하게 상기 키트는 키트 구성요소의 사용을 위한, 예를 들어 핵산 증폭을 위한 설명서를 포함한다.

본원에 개시된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 및 그것들의 서열 식별자(서열번호, SEQ ID NO)

모든 뉴클레오타이드 서열은 본원에서 이 기술 분야의 관례를 따라 5'에서 3' 방향으로 인용된다.

서열번호 1 - 싸이크로바실루스 종으로부터의 DNA 중합효소 I의 핑거 도메인의 영역의 아미노산 서열

서열번호 1

MRRAAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLDITRKEA

서열번호 2 - 싸이크로바실루스 종(PB)으로부터 분리된 절단된 DNA 중합효소 I의 아미노산 서열

서열번호 2

TEVAFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCSWLENATNK

KYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAP

EIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIELPLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNI

KLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILFEKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQL

GKLNSTYIEGLLKEIHEDDGKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFA

ADYSQIELRVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISDYGLS

QNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSSNFNLRSFAERTAMN

TPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPEEIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKV

DYAFGSSWYDTK

서열번호 3 - 서열번호 2의 싸이크로바실루스 종 DNA 중합효소 I 서열을 암호화하는 핵산 서열

서열번호 3

ACAGAAGTAGCATTCGAGATTGTTGAAGAAATTGACTCTACAATATTAGATAAAGTAATGTCAGTCCATTT

AGAAATGTATGATGGGCAATATCATACAAGCGAATTATTAGGTATTGCTTTATCAGATGGAGAAAAGGGTT

ATTTTGCTCCTGCTGATATAGCTTTTCAATCGAAGGATTTTTGTTCTTGGTTAGAAAATGCTACGAATAAA

AAGTATTTAGCAGACTCCAAAGCAACACAAGCAGTGAGTAGAAAACATAATGTGAATGTACATGGAGTGGA

ATTCGACCTTCTTTTAGCAGCGTATATAGTAAATCCTGCTATCTCTTCAGAGGATGTTGCTGCTATTGCTA

AAGAATTTGGATATTTTAACTTGCTGACAAACGATAGTGTTTATGGGAAAGGTGCCAAAAAAACCGCACCT

GAAATCGAGAAAATTGCAGAACATGCCGTAAGAAAAGCAAGGGCTATTTGGGACTTGAAAGAAAAGTTAGA

AGTAAAACTGGAAGAAAATGAACAATATGCGTTGTATAAAGAAATAGAGCTACCGCTTGCATCTATCCTTG

GTACGATGGAATCAGATGGGGTGCTGGTGGATAAACAAATTCTTGTAGAAATGGGTCATGAGCTTAATATT

AAGTTACGAGCGATTGAACAAGACATTTATGCGTTAGCTGGTGAAACGTTTAATATTAATTCACCTAAACA

ATTAGGTGTAATACTATTTGAAAAAATTGGTCTTACCCCTATTAAAAAGACAAAAACGGGCTATTCAACTG

CAGCAGATGTTTTGGAAAAACTAGCAAGTGAACATGAAATAATAGAGCAAATTTTACTATATCGTCAATTA

GGTAAACTCAATTCCACATATATCGAAGGATTATTAAAAGAGATTCATGAAGATGATGGGAAGATCCATAC

CCGATATCAACAAGCCCTAACTTCAACTGGGCGTTTGAGTTCGATCAATCCAAACCTTCAAAATATACCAG

TTCGTTTAGAAGAAGGTAGAAAAATACGTAAAGCCTTTGTTCCTTCACAACCGGGATGGGTAATGTTTGCG

GCGGATTACTCTCAAATTGAATTGCGTGTTCTTGCCCATATGTCTGAGGATGAAAACCTGGTAGAAGCTTT

TAATAATGATCTGGATATTCATACTAAAACGGCTATGGATGTATTCCATGTGGAGCAGGAAGCAGTAACGT

CCGATATGCGCCGTGCTGCTAAGGCAGTTAACTTTGGGATTGTGTATGGTATTAGTGATTATGGTTTATCA

CAAAACCTAGATATTACTAGAAAAGAAGCGGCGACATTTATCGAGAATTATTTAAATAGCTTCCCAGGTGT

AAAAGGATATATGGATGATATCGTTCAAGATGCGAAACAAACAGGCTACGTTACAACAATTTTGAATAGAC

GAAGATATTTGCCTGAAATAACAAGTTCTAACTTTAATCTCCGCAGTTTTGCAGAACGTACTGCTATGAAT

ACACCAATTCAAGGGAGTGCAGCCGATATTATTAAAAAAGCAATGATCGATATGGCGGAAAGATTAATATC

AGAAAATATGCAGACCAAAATGCTACTACAAGTACATGATGAATTAATTTTTGAGGCTCCACCAGAGGAAA

TTGCAATGCTAGAAAAAATAGTGCCAGAGGTGATGGAAAACGCTATTAAACTGATTGTACCTTTGAAAGTG

GATTATGCCTTTGGTTCATCTTGGTATGACACGAAGTAG

서열번호 4 - 싸이크로바실루스 종으로부터 분리된 전장 DNA 중합효소 I의 아미노산 서열

서열번호 4

MYLSTEKILLLDGNSLAYRAFFALPLLTNEHGIHTNAVYGFTMMLQKIMDEENPTHMLVA

FDAGKTTFRHSTFGDYKGGRQKTPPELSEQFPYIRKLIDAYGIKRYELEMYEADDIIGTL

SKRADEKGQQVVIVSGDKDLTQLATDKTTVYITRKGITDIEKYTPEHVQEKYGLTPLQII

DMKGLMGDASDNIPGVPGVGEKTAIKLLKEHGSVEDLYKALDTVSGVKLKEKLIANEEQA

IMSKALATIETAAPIQISIDDLSYTGPNMEEVIEVWKELAFKTLLEKSDYISEESETTEV

AFEIVEEIDSTILDKVMSVHLEMYDGQYHTSELLGIALSDGEKGYFAPADIAFQSKDFCS

WLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHGVEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIAKEFGY

FNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAEHAVRKARAIWDLKEKLEVKLEENEQYALYKEIEL

PLASILGTMESDGVLVDKQILVEMGHELNIKLRAIEQDIYALAGETFNINSPKQLGVILF

EKIGLTPIKKTKTGYSTAADVLEKLASEHEIIEQILLYRQLGKLNSTYIEGLLKEIHEDD

GKIHTRYQQALTSTGRLSSINPNLQNIPVRLEEGRKIRKAFVPSQPGWVMFAADYSQIEL

RVLAHMSEDENLVEAFNNDLDIHTKTAMDVFHVEQEAVTSDMRRAAKAVNFGIVYGISDY

GLSQNLDITRKEAATFIENYLNSFPGVKGYMDDIVQDAKQTGYVTTILNRRRYLPEITSS

NFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDMAERLISENMQTKMLLQVHDELIFEAPPE

EIAMLEKIVPEVMENAIKLIVPLKVDYAFGSSWYDTK

서열번호 5 - 서열번호 4의 싸이크로바실루스 종 DNA 중합효소 I 서열을 암호화하는 핵산 서열.

서열번호 5

ATGTATTTGTCAACCGAGAAAATCCTATTATTAGACGGCAATAGTTTGGCATACCGAGCTTTTTTTGCCCT

ACCTTTATTAACAAATGAACATGGAATACATACAAACGCAGTATATGGCTTTACAATGATGCTACAAAAAA

TTATGGATGAAGAAAATCCTACTCATATGCTCGTGGCATTTGATGCCGGGAAAACGACCTTCCGTCACTCT

ACTTTTGGGGATTATAAAGGTGGAAGACAAAAAACACCACCAGAACTATCGGAACAATTCCCTTATATACG

CAAGTTAATCGATGCTTATGGTATTAAGCGATACGAACTGGAAATGTACGAAGCAGACGATATTATCGGTA

CTTTAAGCAAGCGTGCAGACGAAAAAGGGCAGCAAGTTGTAATTGTCTCAGGTGATAAAGATTTAACACAA

CTAGCTACAGATAAAACAACTGTGTATATCACAAGAAAAGGCATAACCGATATTGAAAAATATACACCTGA

ACATGTACAAGAAAAGTATGGCTTAACTCCATTACAGATTATAGACATGAAAGGTTTAATGGGAGATGCTT

CTGATAATATTCCAGGAGTTCCTGGTGTCGGAGAAAAAACAGCTATTAAGCTTTTAAAAGAACATGGTTCG

GTAGAGGATTTATATAAAGCACTTGATACAGTTAGTGGTGTTAAACTAAAGGAAAAACTCATCGCCAACGA

AGAGCAGGCAATTATGAGTAAGGCATTAGCTACGATTGAAACAGCTGCACCGATACAGATTTCTATAGACG

ATCTTTCATATACTGGTCCTAATATGGAAGAAGTAATTGAAGTTTGGAAGGAACTAGCTTTTAAAACTCTT

CTTGAGAAATCTGACTATATTTCTGAGGAATCCGAAACTACAGAAGTAGCATTCGAGATTGTTGAAGAAAT

TGACTCTACAATATTAGATAAAGTAATGTCAGTCCATTTAGAAATGTATGATGGGCAATATCATACAAGCG

AATTATTAGGTATTGCTTTATCAGATGGAGAAAAGGGTTATTTTGCTCCTGCTGATATAGCTTTTCAATCG

AAGGATTTTTGTTCTTGGTTAGAAAATGCTACGAATAAAAAGTATTTAGCAGACTCCAAAGCAACACAAGC

AGTGAGTAGAAAACATAATGTGAATGTACATGGAGTGGAATTCGACCTTCTTTTAGCAGCGTATATAGTAA

ATCCTGCTATCTCTTCAGAGGATGTTGCTGCTATTGCTAAAGAATTTGGATATTTTAACTTGCTGACAAAC

GATAGTGTTTATGGGAAAGGTGCCAAAAAAACCGCACCTGAAATCGAGAAAATTGCAGAACATGCCGTAAG

AAAAGCAAGGGCTATTTGGGACTTGAAAGAAAAGTTAGAAGTAAAACTGGAAGAAAATGAACAATATGCGT

TGTATAAAGAAATAGAGCTACCGCTTGCATCTATCCTTGGTACGATGGAATCAGATGGGGTGCTGGTGGAT

AAACAAATTCTTGTAGAAATGGGTCATGAGCTTAATATTAAGTTACGAGCGATTGAACAAGACATTTATGC

GTTAGCTGGTGAAACGTTTAATATTAATTCACCTAAACAATTAGGTGTAATACTATTTGAAAAAATTGGTC

TTACCCCTATTAAAAAGACAAAAACGGGCTATTCAACTGCAGCAGATGTTTTGGAAAAACTAGCAAGTGAA

CATGAAATAATAGAGCAAATTTTACTATATCGTCAATTAGGTAAACTCAATTCCACATATATCGAAGGATT

ATTAAAAGAGATTCATGAAGATGATGGGAAGATCCATACCCGATATCAACAAGCCCTAACTTCAACTGGGC

GTTTGAGTTCGATCAATCCAAACCTTCAAAATATACCAGTTCGTTTAGAAGAAGGTAGAAAAATACGTAAA

GCCTTTGTTCCTTCACAACCGGGATGGGTAATGTTTGCGGCGGATTACTCTCAAATTGAATTGCGTGTTCT

TGCCCATATGTCTGAGGATGAAAACCTGGTAGAAGCTTTTAATAATGATCTGGATATTCATACTAAAACGG

CTATGGATGTATTCCATGTGGAGCAGGAAGCAGTAACGTCCGATATGCGCCGTGCTGCTAAGGCAGTTAAC

TTTGGGATTGTGTATGGTATTAGTGATTATGGTTTATCACAAAACCTAGATATTACTAGAAAAGAAGCGGC

GACATTTATCGAGAATTATTTAAATAGCTTCCCAGGTGTAAAAGGATATATGGATGATATCGTTCAAGATG

CGAAACAAACAGGCTACGTTACAACAATTTTGAATAGACGAAGATATTTGCCTGAAATAACAAGTTCTAAC

TTTAATCTCCGCAGTTTTGCAGAACGTACTGCTATGAATACACCAATTCAAGGGAGTGCAGCCGATATTAT

TAAAAAAGCAATGATCGATATGGCGGAAAGATTAATATCAGAAAATATGCAGACCAAAATGCTACTACAAG

TACATGATGAATTAATTTTTGAGGCTCCACCAGAGGAAATTGCAATGCTAGAAAAAATAGTGCCAGAGGTG

ATGGAAAACGCTATTAAACTGATTGTACCTTTGAAAGTGGATTATGCCTTTGGTTCATCTTGGTATGACAC

GAAGTAG

서열번호 6-10은, 서열번호 1과 같이, 각각 바실루스 종 C3_41*, 우레이바실루스 써모스파에리쿠스, 바실루스 서브틸리스, 바실루스 스미티이 및 제오바실루스 스테아로써모필루스로부터의 DNA 중합효소 I의 핑거 도메인의 영역의 아미노산 서열이다(* = Bei et al. 2005, Arch Microbiol, 186: 203-209; Genbank 수탁 번호 SDQ309765).

서열번호 6

MRRAAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLDITRKEA

서열번호 7

MRRAAKAVNFGIIYGISDYGLSQNLDISRKEA

서열번호 8

MRRQAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLGITRKEA

서열번호 9

MRRQAKAVNFGIVYGISDYGLSQNLGITRKEA

서열번호 10

MRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNISRKEA

서열번호 11은 제오바실루스 스테아로써모필루스(Bst)로부터 분리된 절단된 DNA 중합효소 I의 아미노산 서열이다.

서열번호 11

AKMAFTLADRVTEEMLADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQ

FVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKM

KQYEAVRPDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWELERPFLDELRRNEQDRLLVE

LEQPLSSILAEMEFAGVKVDTKRLEQMGKELAEQLGTVEQRIYELAGQEFNINSPKQLGV

ILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPYHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVR

PDTKKVHTIFNQALTQTGRLSSTEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSESDWLIFAADYSQ

IELRVLAHIAEDDNLMEAFRRDLDIHTKTAMDIFQVSEDEVTPNMRRQAKAVNFGIVYGI

SDYGLAQNLNISRKEAAEFIERYFESFPGVKRYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDI

TSRNFNVRSFAERMAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLNARLKEERLQAHLLLQVHDELILEA

PKEEMERLCRLVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGSTWYDAK

서열번호 12는 우레이바실루스 써모스파에리쿠스(Ubts)로부터 분리된 절단된 DNA 중합효소 I의 아미노산 서열이다.

서열번호 12

AALSFKIVREIAEDLFTDTMAVHVELENEHYHTCNILGFGFTDGSNTFFVPTEVLQKSER

LKSYFEDETKKKYMSDLKAAQCILKRHGINLRGVEFDLLLASYIVNPAISGDDVATLAKE

FGYTDVRSNEAVYGKGAKWALPSEEVLAEHVCRKAFAIWSCKERVSNKLKENEQFDLYHD

LELPLAVILGKMESEGIKVNISTLETMGQELEDKIAKLETEIYELAGETFNINSPKQLGV

ILFEKLGLPVIKKTKTGYSTAADVLEKLKSEHQIVQLILEYRTLAKLQSTYIEGLIKEVH

PKDSKVHTRFMQALTSTGRLSSTDPNLQNIPIRLEEGRKIRKAFVPSHDGWLLFSADYSQ

IELRVLAHMSKDKNLVEAFNQGMDIHTRTAMEVFHVSQDDVTSNMRRAAKAVNFGIIYGI

SDYGLSQNLDISRKEAGEFIEKYFESFPGVKEYMDNIVQEAKLKGYVTTILNRRRYLPDI

TSKNFNLRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMLDIDARLNSEGLQAKLLLQVHDELIFEA

PKEEIEKLEKIVPEVMESAILLDVPLKVDISYGETWYDAK

서열번호 13은 PB D422A 돌연변이를 암호화하는 코돈 최적화된(대장균 발현을 위한) 핵산 서열이다.

서열번호 13

ACCGAAGTTGCATTTGAAATTGTGGAAGAAATCGATAGCACCATCCTGGATAAAGTTATGAGCGTTCATCT

GGAAATGTATGATGGTCAGTATCATACCAGCGAACTGCTGGGTATTGCACTGAGTGATGGTGAAAAAGGTT

ATTTTGCACCGGCAGATATTGCCTTTCAGAGCAAAGATTTTTGTAGCTGGCTGGAAAATGCCACCAACAAA

AAATACCTGGCAGATAGCAAAGCAACCCAGGCAGTTAGCCGTAAACATAATGTTAATGTTCACGGCGTGGA

ATTTGATCTGCTGCTGGCAGCATATATTGTTAATCCGGCAATTAGCAGCGAAGATGTTGCAGCAATTGCAA

AAGAATTCGGCTATTTTAACCTGCTGACCAACGATAGCGTTTATGGTAAAGGTGCAAAAAAAACCGCACCG

GAAATTGAAAAAATTGCCGAACATGCAGTTCGTAAAGCACGTGCAATTTGGGATCTGAAAGAAAAACTGGA

AGTGAAACTGGAAGAGAACGAACAGTATGCCCTGTATAAAGAAATTGAACTGCCGCTGGCAAGCATTCTGG

GCACCATGGAAAGTGATGGTGTTCTGGTTGATAAACAAATCCTGGTTGAAATGGGTCACGAGCTGAACATT

AAACTGCGTGCAATTGAACAGGATATTTATGCACTGGCAGGCGAAACCTTTAACATTAATAGCCCGAAACA

GCTGGGTGTGATCCTGTTTGAAAAAATCGGTCTGACCCCGATCAAAAAAACCAAAACCGGTTATAGCACCG

CAGCAGATGTTCTGGAAAAACTGGCAAGCGAACATGAAATTATTGAGCAGATTCTGCTGTATCGTCAGCTG

GGTAAACTGAATAGCACCTATATTGAAGGTCTGCTGAAAGAAATCCATGAGGATGATGGTAAAATCCATAC

CCGTTATCAGCAGGCACTGACCAGCACCGGTCGTCTGAGCAGCATTAATCCGAATCTGCAGAATATTCCGG

TTCGTCTGGAAGAAGGTCGTAAAATTCGTAAAGCATTTGTTCCGAGCCAGCCTGGTTGGGTTATGTTTGCA

GCAGATTATAGCCAGATTGAACTGCGTGTTCTGGCACATATGAGCGAAGATGAAAATCTGGTTGAAGCCTT

TAACAACGATCTGGATATTCATACCAAAACCGCCATGGATGTTTTTCACGTTGAACAAGAAGCAGTTACCA

GCGATATGCGTCGTGCAGCAAAAGCAGTTAATTTTGGTATTGTGTATGGCATCAGCGCTTATGGTCTGAGC

CAGAATCTGGATATTACCCGTAAAGAAGCAGCCACCTTTATCGAAAACTACCTGAATAGCTTTCCGGGTGT

GAAAGGCTATATGGATGATATTGTTCAGGATGCAAAACAGACCGGTTATGTTACCACCATTCTGAATCGTC

GTCGTTATCTGCCGGAAATTACCAGCAGCAACTTTAATCTGCGTAGCTTTGCAGAACGTACCGCAATGAAT

ACCCCGATTCAGGGTAGCGCAGCAGATATTATCAAAAAAGCCATGATTGATATGGCCGAACGTCTGATTAG

CGAAAATATGCAGACCAAAATGCTGCTGCAGGTTCATGATGAACTGATTTTTGAAGCACCGCCTGAAGAAA

TTGCAATGCTGGAAAAAATTGTTCCGGAAGTGATGGAAAACGCCATTAAACTGATTGTTCCGCTGAAAGTG

GATTATGCATTTGGTAGCAGTTGGTACGATACCAAATAA

서열번호 14는 Bst D→A 돌연변이를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이다.

서열번호 14

GCCAAAATGGCATTTACCCTGGCAGATCGTGTTACCGAAGAAATGCTGGCAGATAAAGCAGCACTGGTTGT

TGAAGTTGTGGAAGAAAATTATCATGATGCACCGATTGTTGGTATTGCCGTTGTTAATGAACATGGCCGTT

TTTTTCTGCGTCCGGAAACCGCACTGGCCGATCCGCAGTTTGTTGCATGGCTGGGTGATGAAACCAAAAAA

AAGAGCATGTTTGATAGCAAACGTGCAGCAGTTGCACTGAAATGGAAAGGTATTGAACTGTGCGGTGTTTC

ATTTGATCTGCTGCTGGCAGCATATCTGCTGGATCCGGCACAGGGTGTTGATGATGTTGCAGCAGCAGCAA

AGATGAAACAGTATGAAGCAGTTCGTCCGGATGAAGCCGTTTATGGTAAAGGTGCAAAACGTGCCGTGCCG

GATGAACCGGTGCTGGCCGAACATCTGGTTCGTAAAGCAGCCGCAATTTGGGAATTAGAACGTCCGTTTCT

GGATGAACTGCGTCGTAATGAACAGGATCGTCTGCTGGTTGAACTGGAACAGCCGCTGAGCAGCATTCTGG

CAGAAATGGAATTTGCCGGTGTTAAAGTGGATACCAAACGTCTGGAACAAATGGGTAAAGAACTGGCAGAA

CAGCTGGGCACCGTTGAACAGCGTATTTATGAGCTGGCAGGTCAAGAATTTAACATCAATAGCCCGAAACA

ACTGGGCGTGATTCTGTTTGAAAAACTGCAGCTGCCGGTTCTGAAAAAAACCAAAACCGGTTATAGCACCA

GCGCAGATGTTCTGGAAAAACTGGCACCGTATCATGAAATTGTGGAAAACATTCTGCATTATCGCCAGCTG

GGTAAACTGCAGAGCACCTATATTGAAGGTCTGCTGAAAGTTGTTCGTCCCGATACCAAAAAAGTGCACAC

CATTTTTAACCAGGCACTGACCCAGACCGGTCGTCTGAGCAGTACCGAACCGAATCTGCAGAATATTCCGA

TTCGTCTGGAAGAAGGTCGTAAAATTCGTCAGGCCTTTGTTCCGAGCGAAAGCGATTGGCTGATTTTTGCA

GCAGATTATAGCCAGATTGAACTGCGCGTTCTGGCACATATTGCCGAAGATGATAATCTGATGGAAGCATT

TCGTCGCGATCTGGATATTCATACCAAAACAGCCATGGATATTTTTCAGGTGAGCGAAGATGAAGTTACCC

CGAATATGCGTCGTCAGGCAAAAGCAGTTAATTTTGGTATTGTGTATGGCATTAGCGCATATGGTCTGGCA

CAGAATCTGAATATTAGCCGTAAAGAAGCAGCCGAGTTTATCGAACGTTATTTTGAAAGTTTTCCGGGTGT

GAAACGCTATATGGAAAATATTGTTCAAGAAGCCAAACAGAAAGGCTATGTTACCACACTGCTGCATCGTC

GTCGTTATCTGCCGGATATTACCAGCCGTAACTTTAATGTTCGTAGCTTTGCAGAACGTATGGCAATGAAT

ACCCCGATTCAGGGTAGCGCAGCCGATATTATCAAAAAAGCAATGATTGATCTGAACGCACGCCTGAAAGA

AGAACGTCTGCAGGCACATCTGCTGTTACAGGTTCATGATGAACTGATTCTGGAAGCCCCTAAAGAAGAGA

TGGAACGTCTTTGTCGTCTGGTTCCGGAAGTTATGGAACAGGCAGTTACCCTGCGTGTTCCGCTGAAAGTG

GATTATCATTATGGTAGCACCTGGTATGATGCCAAATAA

서열번호 15는 Ubts D→A 돌연변이를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이다.

서열번호 15

GCAGCACTGAGCTTTAAAATCGTTCGTGAAATTGCAGAGGACCTGTTTACCGATACCATGGCAGTTCATGT

TGAACTGGAAAACGAACATTATCACACGTGCAACATTCTTGGTTTTGGTTTTACCGATGGCAGCAACACCT

TTTTTGTTCCGACCGAAGTGCTGCAGAAAAGCGAACGTCTGAAAAGCTATTTTGAGGATGAAACCAAAAAA

AAGTATATGAGCGATCTGAAAGCAGCCCAGTGTATTCTGAAACGTCATGGTATTAATCTGCGTGGCGTTGA

ATTTGATCTGCTGCTGGCAAGCTATATTGTTAATCCGGCAATTAGCGGTGATGATGTTGCAACCCTGGCAA

AAGAATTTGGCTATACCGATGTTCGTAGCAATGAAGCCGTTTATGGTAAAGGTGCAAAATGGGCACTGCCG

AGCGAAGAGGTTCTGGCAGAACATGTTTGTCGTAAAGCATTTGCAATTTGGAGCTGCAAAGAACGCGTTAG

CAATAAACTGAAAGAGAACGAACAGTTCGATCTGTATCATGATCTGGAACTGCCGCTGGCCGTTATTCTGG

GTAAAATGGAAAGCGAAGGCATCAAAGTGAATATCAGCACCCTGGAAACCATGGGTCAAGAACTGGAAGAT

AAAATTGCCAAACTGGAAACCGAGATCTATGAACTGGCAGGCGAAACCTTTAACATTAATAGCCCGAAACA

GCTGGGTGTGATCCTGTTTGAAAAACTGGGTCTGCCGGTTATCAAAAAAACGAAAACCGGTTATAGCACCG

CAGCAGATGTTCTGGAAAAACTGAAATCAGAACATCAGATTGTGCAGCTGATTCTGGAATATCGTACCCTG

GCCAAACTGCAGAGCACCTATATTGAAGGTCTGATCAAAGAAGTGCATCCGAAAGATAGCAAAGTGCATAC

CCGTTTTATGCAGGCACTGACCAGCACCGGTCGTCTGAGCAGCACCGATCCGAATCTGCAGAATATTCCGA

TTCGTCTGGAAGAAGGTCGTAAAATTCGCAAAGCCTTTGTGCCGAGCCATGATGGTTGGCTGCTGTTTAGC

GCAGATTATAGCCAGATTGAACTGCGTGTTCTGGCACATATGAGCAAAGATAAAAATCTGGTGGAAGCCTT

TAACCAAGGCATGGATATTCATACCCGTACCGCAATGGAAGTTTTTCATGTTAGCCAGGATGATGTGACCA

GCAATATGCGTCGTGCAGCAAAAGCAGTTAATTTCGGTATTATCTATGGCATTAGCGCATATGGTCTGAGC

CAGAATCTGGATATTTCACGTAAAGAAGCAGGCGAATTCATCGAGAAATACTTTGAAAGTTTTCCGGGTGT

GAAAGAATATATGGACAACATTGTTCAAGAGGCCAAGCTGAAAGGTTATGTTACCACCATTCTGAATCGTC

GTCGTTATCTGCCGGATATTACCAGCAAAAATTTCAATCTGCGTAGCTTTGCAGAACGTACCGCCATGAAT

ACCCCGATTCAGGGTAGCGCAGCCGATATCATCAAAAAAGCAATGCTGGATATTGATGCCCGTCTGAATAG

CGAAGGTCTGCAGGCAAAACTGCTGCTGCAGGTTCACGATGAACTGATTTTTGAAGCACCGAAAGAAGAG

TCGAGAAGCTGGAAAAAATTGTTCCGGAAGTTATGGAAAGTGCCATTCTGCTGGATGTTCCGCTGAAAGTT

GATATTAGCTATGGTGAAACCTGGTACGATGCCAAATAA

본 발명은 이제 다음의 도면을 참조로 비제한적 실시예에 의해 기술될 것이다.
도 1 은 본 발명에 따라 변형될 수 있는 많은 종으로부터의 DNA 중합효소 I의 핑거 도메인 내의 영역의 서열을 도시한다. 핵심 아스파르트산 잔기는 진하게 표시된다.
도 2 는 가닥-대체 활성 검정 환경의 개요를 도시한다. F= 형광단. Q= 소광제.
도 3 은 PB와 PB D422A 돌연변이의 25℃에서의 가닥-대체 활성의 비교뿐만 아니라 클레노우 단편(KF)을 포함한 다양한 상용 효소에 대한 비교를 도시한다.
도 4 는 다양한 NaCl 및 KCl 농도(25℃)에서의 야생형 및 돌연변이 PB 중합효소의 중합효소 활성을 도시한다.
도 5 는 PB, Bst 및 Ubts로부터의 DNA 중합효소의 야생형(절단된) 아미노산 서열의 서열 정렬을 도시한다. 큰 화살표는 Asp(D)가 Ala(A)로 돌연변이되어 있는 422 위치를 나타낸다. 정렬은 Clustal X2 를 사용하여 이루어지고 ESPript 3.0 서버를 사용하여 시각화된다.
도 6 은 10 mM KCl의 존재 하에서 37℃에서의 바실루스 스테아로써모필루스(큰 단편) 중합효소 I(Bst)의 가닥-대체 활성에 미치는 D422A 돌연변이의 영향을 도시한다.
도 7 은 10 mM KCl의 존재 하에서 37℃에서의 우레이바실루스 써모스파에리쿠스(큰 단편) 중합효소 I(Ubts)의 가닥-대체 활성에 미치는 D422A 돌연변이의 영향을 도시한다.

실시예

실시예 1

서열의 클로닝

PB 중합효소 I 야생형(큰 단편) 및 D422A 돌연변이

싸이크로바실루스 종으로부터의 DNA 중합효소 I 큰 단편(즉 단백질의 5'-3' 엑소뉴클레아제 도메인이 생략되어 있음)을 암호화하는 유전자(서열번호 3)를 벡터 pET151/D-TOPO^®에 클로닝하였다. D422A 돌연변이(서열번호 13)를 또한 함유하는 코돈-최적화된 변이체를 벡터 pET-11a에 클로닝하였다. 각각의 경우에 작제물은 중합효소의 N-말단에서 His₆ 태그와 이어서 TEV 프로테아제에 대한 인식 서열을 암호화하였고, 그로써 태그의 절단이 가능해졌다.

Bst 중합효소 I(큰 단편) 및 Ubts 중합효소 I(큰 단편) 및 이것들의 D422A 돌연변이

제오바실루스 스테아로써모필루스(Bst) 및 우레이바실루스 써모스파에리쿠스(Ubts, Genbank 수탁 번호 WP_016837139)로부터의 중합효소 I 큰 단편을 암호화하는 코돈-최적화된 유전자를 Thermo Fisher Scientific사로부터 Invitrogen GeneArt 유전자 합성 서비스로부터 구입하였다. 유전자(서열번호 14 및 15)를 FastCloning(Li et al.(2011), BMC Biotechnology, 11:92)에 의해 N-말단 His₆-태그를 암호화하는 벡터 pTrc99A에 클로닝하였다. 위치 422(PB 중합효소 I 큰 단편)에서 Asp로부터 Ala로의 상응하는 돌연변이를 QuikChange II 부위-특정 돌연변이생성 키트(Agilent Technologies)를 사용하여 도입하고 서열 분석에 의해 확인하였다.

단백질 제조 및 정제

PB 중합효소 I 야생형(큰 단편) 및 D422A 돌연변이

재조합 단백질 제조를 Rosetta 2(DE3) 세포(Novagen^®)에서 수행하였다. 세포를 테러픽 브로스(Terrific Broth) 배지에서 성장시키고 유전자 발현을 OD_{600 nm} 1.00에서 0.1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 단백질 제조를 15℃에서 6-8시간 동안 수행하였다. 단백질 정제를 위해 1-l 배양의 펠릿을 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, pH 7.5, 0.15 mg/ml 리소자임, 1개의 프로테아제 억제제 정제(cOmplete^TM, Mini, EDTA-유리 프로테아제 억제제 칵테일, Roche)에 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 파괴를 프렌치 프레스(1.37 kbar)와 계속해서 Sonics^®로부터의 VCX 750으로의 초음파처리(펄스 1.0/1.0, 5분, 진폭 25%)에 의해 수행하였다. 제1 단계로 원심분리(48384 g, 45분, 4℃) 후 존재하는 His₆-태그 단백질의 가용성 부분을 고정된 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 50 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, pH 7.5에서의 세척 단계 후에 단백질을 250 mM의 이미다졸 농도에서 용출하고 추가로 탈염 칼럼을 사용함으로써 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5% 글리세롤, pH 7.5에 옮겼다.

제2 단계는 밤새 4℃에서 50 mM Tris pH 8.0, 0.5 mM EDTA 및 1 mM DTT에서 수행한 TEV 프로테아제에 의한 태그의 절단이었다. 제3 단계는 단백질을 His₆-태그 및 His₆-태그 TEV 프로테아제로부터 분리하기 위하여 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, pH 7.5를 적용함으로써 제2 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피를 수행하였다. 단백질 정제의 제4 및 최종 단계는 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 5% 글리세롤, pH 7.5에서 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE Healthcare) 상에서의 크기-배제 크로마토그래피였다. 최종 단백질 용액을 농축하고 -20℃에서 50% 글리세롤과 함께 보관하였다.

Bst 중합효소 I 및 Ubts 중합효소 I(큰 단편) 및 이것들의 D422A 돌연변이

Bst 및 Ubts 중합효소 I(큰 단편) 및 이것들의 D422A 돌연변이에 대한 재조합 단백질 제조를 Rosetta 2(DE3) 세포(Novagen^®)에서 수행하였다. 세포를 루리아 버타니(Luria Bertani) 배지에서 37℃에서 성장시키고 유전자 발현을 OD_{600 nm} 0.5에서 0.5 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 단백질 제조를 37℃에서 4시간 동안 수행하였다. 단백질 정제를 위해 0.5-l 배양의 펠릿을 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM 이미다졸, 0.15 mg/ml 리소자임, 1개의 프로테아제 억제제 정제(cOmplete^TM, Mini, EDTA-유리 프로테아제 억제제 칵테일, Roche)에 재현탁하고 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포 파괴를 Sonics^®로부터의 VCX 750으로의 음파처리(펄스 1.0/1.0, 15분, 진폭 25%)에 의해 수행하였다. 원심분리(48384 g, 45분, 4℃) 후 존재하는 His₆-태그 단백질의 가용성 부분을 고정된 Ni²⁺-친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM 이미다졸로의 세척 단계 후에 이미다졸을 500 mM로 점차로 증가시켜서 단백질을 용출하였다. 단백질을 함유한 분획을 수집하고 완충액 교환을 20 mM Tris pH 7.1, 100 mM KCl, 2 mM DTT, 0.2 mM EDTA 및 0.2 Triton X-100으로 탈염에 의해 수행하였다. 최종 단백질 용액을 농축하고 -20℃에서 50% 글리세롤과 함께 보관하였다.

활성 측정

중합효소 활성

중합효소 활성 검정은 분자 비콘 검정(Summerer(2008), Methods Mol. Biol.; 429: 225-235로부터 변형됨)을 토대로 한다. 분자 비콘 주형은 GC가 풍부한 8mer 스템 영역(서열은 이탤릭체로 표시됨)에 의해 연결된 23mer 루프 및 43mer 연장부로 이루어진다. 스템-루프 구조로 인해 FAM(도너) 및 Dabcyl(억셉터, 비형광 소광제) 분자는 아주 가까이 있고 따라서 FAM 형광 신호가 소광(Quenched)된다. DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장시 스템은 개방되고, 485 nm에서 여기하고(exciting) 518 nm에서의 방출을 기록함으로써 적절한 시간 간격의 상대적 형광 단위로서 FAM 형광의 복원에 의해 두 염료의 거리의 증가가 측정된다. 측정을 SpectraMax^® M2^e 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 수행하였다.

분자 비콘 주형

5´- GGCCCGT ^Dabcyl AGGAGGAAAGGACATCTTCTAGCAT ^FAM ACGGGCCGTCAAGTTCATG GCCAGTCA

AGTCGTCAGAAATTTCGCACCAC -3' (서열번호 16)

프라이머

5´- GTGGTGCGAAATTTCTGAC -3' (서열번호 17)

분자 비콘 기질을 20 μl의 10 μM 분자 비콘 주형 및 15 μM 프라이머를 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl에서 5분 동안 95℃에서 인큐베이션함으로써 제조하였다. 그런 후 반응을 실온에서 냉각되도록 2시간 동안 놓아두었다. 기질 용액을 10 μM의 최종 농도로 -20℃에서 보관하였다.

PB 및 PB D422A의 중합효소 활성에 미치는 상이한 [염]의 영향을 분석하기 위한 검정 설정

50 마이크로리터의 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP(등몰량의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 이루어졌다. 반응은 추가로 50 mM BIS-Tris 프로판, pH 8.5 중의 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2% 글리세롤을 함유하였다. 반응 완충액 중의 최종 염 농도를 PB의 경우 25 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 110 mM, 160 mM 및 210 mM NaCl 또는 KCl로 및 PB D422A의 경우 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM 및 200 mM NaCl 또는 KCl로 조정하였다. 활성 검정을 25℃에서 검은색 96-웰 형광 검정 플레이트(Corning^®)에서 수행하였다. 반응은 단백질 용액의 첨가, 즉 중합효소의 첨가에 의해 시작되었다.

결과를 도 4에 도시한다.

100 mM, 150 mM 및 200 mM NaCl에서 PB 및 PB D422A의 특이적 중합효소 활성을 분석하기 위한 검정 설정

50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP(등몰량의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 이루어졌다. 반응은 추가로 50 mM BIS-Tris 프로판, pH 8.5 중의 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2% 글리세롤을 함유하였다. 반응 완충액 중의 최종 염 농도를 각각 100 mM, 150 mM 및 200 mM NaCl로 조정하였다. 검정을 25℃에서 검은색 96-웰 형광 검정 플레이트(Corning^®)에서 수행하였다. 반응은 단백질 용액의 첨가, 즉 중합효소의 첨가에 의해 시작되었다.

결과를 표 3(실시예 끝부분)에 나타낸다.

가닥-대체 활성 검정

검정 설정의 개요를 도 2에 도시한다. 검정은 DNA 중합효소의 가닥-대체 활성을 통해서만 달성될 수 있는 퀀칭된 리포터 가닥의 대체시에 측정되는 형광 신호의 증가를 토대로 한다.

가닥-대체 활성 검정에 대한 기질은 19개 올리고뉴클레오타이드(서열번호 18)의 "콜드" 프라이머 및 그것의 3' 말단에서 TAMRA 형광단(F)으로 표지된 20개 올리고뉴클레오타이드(서열번호 19)로 이루어진 리포터 가닥으로 이루어진다. 주형 가닥은 40개 올리고뉴클레오타이드로 이루어지고 그것의 5' 말단에서 블랙홀(Black Hole) 소광제 2(BHQ2)로 표지된다(서열번호 20). 프라이머를 주형 가닥의 위치 20에서 한개의 뉴클레오타이드 갭을 남기고 주형 가닥에 어닐링한다. 표지는 아주 가까이 있어서 형광단 TAMRA가 BHQ2에 의해 소광된다. DNA 중합효소 I의 가닥-대체 활성으로 TAMRA 표지된 올리고뉴클레오타이드가 주형 가닥으로부터 대체된다. 그 결과 형광단 및 소광제는 더 이상 아주 가까이 있지 않고 TAMRA 형광의 증가를 적절한 시간 간격의 상대적인 형광 단위로서 측정할 수 있다 (여기 525 nm, 방출 598 nm, SpectraMax M2^e 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)).

5'- TATCCACCAATACTACCCT CGATACTTTGTCCACTCAAT[TAMRA] -3'

3'- ATAGGTGGTTATGATGGGATGCTATGAAACAGGTGAGTTA[BHQ2] -5'

가닥-대체 활성 검정에 대한 기질을 20 μl의 10 μM "콜드" 프라이머, 10 μM 리포터 가닥 및 10 μM 주형 가닥을 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl에서 95℃에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 제조하였다. 그런 후 반응을 실온에서 냉각되도록 2시간 동안 놓아두었다. 기질 용액을 10 μM의 최종 농도로 -20℃에서 보관하였다.

PB, PB D422A 및 상업적으로 알려져 있는 중합효소의 특이적 가닥-대체 활성의 비교를 위한 검정 설정

50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP(등몰량의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 이루어졌다. PB 중합효소 I의 경우 반응은 추가로 pH 8.5 에서 50 mM BIS-TRIS 프로판 중 5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2% 글리세롤을 함유하였다. 상업적으로 알려져 있는 중합효소 I의 경우 New England Biolabs에 의해 공급된 각각의 반응 완충액을 사용하였다. 반응 완충액 중의 최종 염 농도를 각각의 중합효소에 대한 최적 염에 따라 100 mM로 조정하였다. 활성 검정을 25℃에서 검은색 96-웰 형광 검정 플레이트(Corning^®)에서 수행하였다. 반응은 단백질 용액의 첨가(즉 중합효소의 첨가)에 의해 시작되었다.

그 결과를 도 3에 도시한다.

100 mM, 150 mM 및 200 mM NaCl에서 PB 및 PB D422A의 특이적 가닥-대체 활성에 대한 검정 설정

50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP(등몰량의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 이루어졌다. 반응은 추가로 pH 8.5에서 50 mM BIS-Tris 프로판 중 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0.2 mg/ml BSA 및 2% 글리세롤을 함유하였다. 반응 완충액의 최종 염 농도를 각각 100 mM, 150 mM 및 200 mM NaCl로 조정하였다. 검정을 25℃에서 검은색 96-웰 형광 검정 플레이트(Corning^®)에서 수행하였다. 반응은 단백질 용액의 첨가, 즉 중합효소의 첨가에 의해 시작되었다.

그 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

Bst/BstD422A 및 Ubts/UbtsD422A의 가닥-대체 활성을 분석하기 위한 검정 설정

50 마이크로리터 반응은 200 nM 기질 및 200 μM dNTP(등몰량의 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP)로 이루어졌다. 반응은 추가로 20 mM Tris, pH 7.9(25℃), 10 mM KCl, 10 mM(NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100을 함유하였다.

검정을 37℃에서 검은색 96-웰 형광 검정 플레이트(Corning^®)에서 수행하였다. 반응은 단백질 용액의 첨가(Bst 및 BstD422A의 경우 20 ng, Ubts 및 UbtsD422A의 경우 100 ng), 즉 중합효소의 첨가에 의해 시작되었다. 더 높은 KCl에서의 특이적 가닥-대체 활성(mRFU/분/μg)의 측정을 위해 최종 농도를 150 mM KCl로 설정하였다. TAMRA 형광의 증가를 525 nm에서 여기시키고 598 nm에서 방출을 기록함으로서 적절한 시간 간격의 상대적 형광 단위로서 측정하였다. 측정을 SpectraMax^® M2^e 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 수행하였다.

이 가닥-대체 활성 검정을 토대로 한 결과를 도 6 및 7 및 하기 표 4에 나타낸다. 돌연변이 효소는 전부 향상된 활성을 보인다.

표

wtPB 및 D422A 돌연변이(25℃에서)에 대한 상이한 효소적 특성의 요약.

변이체	가닥-대체 활성(100 mM NaCl)	중합효소 활성(100 mM NaCl)	Tm	MgCl2	NaCl KCl (> 80% 활성)	pH
PB D422A	310%	120%	44.8℃	4-6 mM	25-200 mM40-200 mM	8.5
PB pol I 야생형	100%	100%	44.8℃	3-8 mM	25-125 mM25-115 mM	8.5

100 내지 200 mM NaCl의 존재 하에 wtPB와 비교된 PB D422A 돌연변이의 가닥-대체 활성.

가닥-대체 활성
NaCl	활성 [mRFU/분/μg]
	wtPB	PBD422A	비율(PB D422A/wtPB)
100	9,35E+04	28,8E+04	3,1
150	7,54E+04	20,5E+04	2,7
200	4,65E+04	18,1E+04	3,9

100 내지 200 mM NaCl의 존재 하에 wt PB와 비교된 PB D422A 돌연변이의 DNA 중합효소 활성.

중합효소 활성
NaCl [mM]	활성 [mRFU/분/μg]
	wtPB	PBD422A	비율(PB D422A/wtPB)
100	1,42E+06	1,66E+06	1,2
150	1,02E+06	1,50E+06	1,5
200	0,55E+06	1,37E+06	2,5

150 mM KCl의 존재 하에 wt 효소와 비교된 Bst 및 Ubt 의 D422A 돌연변이의 가닥-대체 활성.

SDA(mRFU/분/μg)			SDA(mRFU/분/μg)
Bst(wt)	BstD422A	비율 BstD422A/Bst	Ubt(wt)	UbtD422A	비율 UbtD422A/Ubt
3,52E+05	6,99E+05	2,0	0,59E+05	2,14E+05	3,6

실시예 2

추가의 싸이크로바실루스 종(PB) DNA 중합효소 돌연변이를 또한 제조하고 테스트하였다:

부위-특정 돌연변이생성

위치 422에서 각각 Asp로부터 Ser, Lys, Val, Leu 및 Asn으로의 상응하는 돌연변이를 QuikChange II 부위-특정 돌연변이생성 키트(Agilent Technologies)를 사용하여 도입하였다.

D422V 및 D422L(상이한 길이의 소수성 잔기),

D422S(작은 친수성),

D422N(더 큰 친수성) 및

D422K(양으로 대전).

시작 지점은 D422A 돌연변이의 플라스미드 DNA였다. 돌연변이를 서열분석에 의해 확인하였다.

단백질 제조 및 단백질 정제

재조합 단백질 제조를 Rosetta 2(DE3) 세포(Novagen^®)에서 수행하였다. 세포를 테러픽 브로스 배지에서 성장시키고 유전자 발현을 OD_{600 nm} 1.0에서 0.1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 단백질 제조를 15℃에서 6-8시간 동안 수행하였다. 단백질 정제를 위해 50-ml 배양의 펠릿을 1 ml 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, pH 7.5, 0.15 mg/ml 리소자임에 재현탁하고 얼음에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포 파괴를 Sonics^®로부터의 VCX 750으로의 음파처리(펄스 1.0/1.0, 1분, 진폭 20%)에 의해 수행하였다.

원심분리(16000 g, 30분, 4℃) 후 존재하는 His₆-태그 단백질의 가용성 부분을 PureProteome^TM 자기 비드(Millipore)로 정제하고 50 μl 50 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, 5% 글리세롤, pH 7.5에서 용출하였다.

가닥-대체 검정을 실시예 1에서 기술한 것과 같이 수행하였다.

이들 다른 돌연변이는 전부 wt PB 중합효소와 비교하여 가닥 대체 활성의 검정에서 더 잘 수행하였지만(데이터 미도시), PB D422A 돌연변이만큼은 아니었다.

<110> UNIVERSITETET I TROMSO - NORGES ARKTISKE UNIVERSITET <120> DNA Polymerases <130> MPI20-007 <150> GB1721053.5 <151> 2017-12-15 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> PRT <213> Psychrobacillus sp. <400> 1 Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 2 <211> 580 <212> PRT <213> Psychrobacillus sp. <400> 2 Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu 1 5 10 15 Asp Lys Val Met Ser Val His Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His 20 25 30 Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp 50 55 60 Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr 65 70 75 80 Gln Ala Val Ser Arg Lys His Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu 100 105 110 Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr 115 120 125 Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile 130 135 140 Glu Lys Ile Ala Glu His Ala Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp 145 150 155 160 Leu Lys Glu Lys Leu Glu Val Lys Leu Glu Glu Asn Glu Gln Tyr Ala 165 170 175 Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Leu Gly Thr Met 180 185 190 Glu Ser Asp Gly Val Leu Val Asp Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Gly 195 200 205 His Glu Leu Asn Ile Lys Leu Arg Ala Ile Glu Gln Asp Ile Tyr Ala 210 215 220 Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val 225 230 235 240 Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly Leu Thr Pro Ile Lys Lys Thr Lys Thr 245 250 255 Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Ser Glu His 260 265 270 Glu Ile Ile Glu Gln Ile Leu Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Asn 275 280 285 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Glu Ile His Glu Asp Asp Gly 290 295 300 Lys Ile His Thr Arg Tyr Gln Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu 305 310 315 320 Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Leu Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala Phe Val Pro Ser Gln Pro Gly Trp Val 340 345 350 Met Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His 355 360 365 Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp 370 375 380 Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala 385 390 395 400 Val Thr Ser Asp Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile 405 410 415 Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr 420 425 430 Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro 435 440 445 Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr 450 455 460 Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile 465 470 475 480 Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met 485 490 495 Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 500 505 510 Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu Ile Ser Glu Asn Met Gln Thr Lys Met 515 520 525 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu 530 535 540 Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile 545 550 555 560 Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp 565 570 575 Tyr Asp Thr Lys 580 <210> 3 <211> 1743 <212> DNA <213> Psychrobacillus sp. <400> 3 acagaagtag cattcgagat tgttgaagaa attgactcta caatattaga taaagtaatg 60 tcagtccatt tagaaatgta tgatgggcaa tatcatacaa gcgaattatt aggtattgct 120 ttatcagatg gagaaaaggg ttattttgct cctgctgata tagcttttca atcgaaggat 180 ttttgttctt ggttagaaaa tgctacgaat aaaaagtatt tagcagactc caaagcaaca 240 caagcagtga gtagaaaaca taatgtgaat gtacatggag tggaattcga ccttctttta 300 gcagcgtata tagtaaatcc tgctatctct tcagaggatg ttgctgctat tgctaaagaa 360 tttggatatt ttaacttgct gacaaacgat agtgtttatg ggaaaggtgc caaaaaaacc 420 gcacctgaaa tcgagaaaat tgcagaacat gccgtaagaa aagcaagggc tatttgggac 480 ttgaaagaaa agttagaagt aaaactggaa gaaaatgaac aatatgcgtt gtataaagaa 540 atagagctac cgcttgcatc tatccttggt acgatggaat cagatggggt gctggtggat 600 aaacaaattc ttgtagaaat gggtcatgag cttaatatta agttacgagc gattgaacaa 660 gacatttatg cgttagctgg tgaaacgttt aatattaatt cacctaaaca attaggtgta 720 atactatttg aaaaaattgg tcttacccct attaaaaaga caaaaacggg ctattcaact 780 gcagcagatg ttttggaaaa actagcaagt gaacatgaaa taatagagca aattttacta 840 tatcgtcaat taggtaaact caattccaca tatatcgaag gattattaaa agagattcat 900 gaagatgatg ggaagatcca tacccgatat caacaagccc taacttcaac tgggcgtttg 960 agttcgatca atccaaacct tcaaaatata ccagttcgtt tagaagaagg tagaaaaata 1020 cgtaaagcct ttgttccttc acaaccggga tgggtaatgt ttgcggcgga ttactctcaa 1080 attgaattgc gtgttcttgc ccatatgtct gaggatgaaa acctggtaga agcttttaat 1140 aatgatctgg atattcatac taaaacggct atggatgtat tccatgtgga gcaggaagca 1200 gtaacgtccg atatgcgccg tgctgctaag gcagttaact ttgggattgt gtatggtatt 1260 agtgattatg gtttatcaca aaacctagat attactagaa aagaagcggc gacatttatc 1320 gagaattatt taaatagctt cccaggtgta aaaggatata tggatgatat cgttcaagat 1380 gcgaaacaaa caggctacgt tacaacaatt ttgaatagac gaagatattt gcctgaaata 1440 acaagttcta actttaatct ccgcagtttt gcagaacgta ctgctatgaa tacaccaatt 1500 caagggagtg cagccgatat tattaaaaaa gcaatgatcg atatggcgga aagattaata 1560 tcagaaaata tgcagaccaa aatgctacta caagtacatg atgaattaat ttttgaggct 1620 ccaccagagg aaattgcaat gctagaaaaa atagtgccag aggtgatgga aaacgctatt 1680 aaactgattg tacctttgaa agtggattat gcctttggtt catcttggta tgacacgaag 1740 tag 1743 <210> 4 <211> 877 <212> PRT <213> Psychrobacillus sp. <400> 4 Met Tyr Leu Ser Thr Glu Lys Ile Leu Leu Leu Asp Gly Asn Ser Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro Leu Leu Thr Asn Glu His Gly 20 25 30 Ile His Thr Asn Ala Val Tyr Gly Phe Thr Met Met Leu Gln Lys Ile 35 40 45 Met Asp Glu Glu Asn Pro Thr His Met Leu Val Ala Phe Asp Ala Gly 50 55 60 Lys Thr Thr Phe Arg His Ser Thr Phe Gly Asp Tyr Lys Gly Gly Arg 65 70 75 80 Gln Lys Thr Pro Pro Glu Leu Ser Glu Gln Phe Pro Tyr Ile Arg Lys 85 90 95 Leu Ile Asp Ala Tyr Gly Ile Lys Arg Tyr Glu Leu Glu Met Tyr Glu 100 105 110 Ala Asp Asp Ile Ile Gly Thr Leu Ser Lys Arg Ala Asp Glu Lys Gly 115 120 125 Gln Gln Val Val Ile Val Ser Gly Asp Lys Asp Leu Thr Gln Leu Ala 130 135 140 Thr Asp Lys Thr Thr Val Tyr Ile Thr Arg Lys Gly Ile Thr Asp Ile 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Thr Pro Glu His Val Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Leu Gln Ile Ile Asp Met Lys Gly Leu Met Gly Asp Ala Ser Asp Asn 180 185 190 Ile Pro Gly Val Pro Gly Val Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Leu Leu 195 200 205 Lys Glu His Gly Ser Val Glu Asp Leu Tyr Lys Ala Leu Asp Thr Val 210 215 220 Ser Gly Val Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Asn Glu Glu Gln Ala 225 230 235 240 Ile Met Ser Lys Ala Leu Ala Thr Ile Glu Thr Ala Ala Pro Ile Gln 245 250 255 Ile Ser Ile Asp Asp Leu Ser Tyr Thr Gly Pro Asn Met Glu Glu Val 260 265 270 Ile Glu Val Trp Lys Glu Leu Ala Phe Lys Thr Leu Leu Glu Lys Ser 275 280 285 Asp Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Glu Thr Thr Glu Val Ala Phe Glu Ile 290 295 300 Val Glu Glu Ile Asp Ser Thr Ile Leu Asp Lys Val Met Ser Val His 305 310 315 320 Leu Glu Met Tyr Asp Gly Gln Tyr His Thr Ser Glu Leu Leu Gly Ile 325 330 335 Ala Leu Ser Asp Gly Glu Lys Gly Tyr Phe Ala Pro Ala Asp Ile Ala 340 345 350 Phe Gln Ser Lys Asp Phe Cys Ser Trp Leu Glu Asn Ala Thr Asn Lys 355 360 365 Lys Tyr Leu Ala Asp Ser Lys Ala Thr Gln Ala Val Ser Arg Lys His 370 375 380 Asn Val Asn Val His Gly Val Glu Phe Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr 385 390 395 400 Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Ser Glu Asp Val Ala Ala Ile Ala Lys 405 410 415 Glu Phe Gly Tyr Phe Asn Leu Leu Thr Asn Asp Ser Val Tyr Gly Lys 420 425 430 Gly Ala Lys Lys Thr Ala Pro Glu Ile Glu Lys Ile Ala Glu His Ala 435 440 445 Val Arg Lys Ala Arg Ala Ile Trp Asp Leu Lys Glu Lys Leu Glu Val 450 455 460 Lys Leu Glu Glu Asn Glu Gln Tyr Ala Leu Tyr Lys Glu Ile Glu Leu 465 470 475 480 Pro Leu Ala Ser Ile Leu Gly Thr Met Glu Ser Asp Gly Val Leu Val 485 490 495 Asp Lys Gln Ile Leu Val Glu Met Gly His Glu Leu Asn Ile Lys Leu 500 505 510 Arg Ala Ile Glu Gln Asp Ile Tyr Ala Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn 515 520 525 Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Ile Gly 530 535 540 Leu Thr Pro Ile Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp 545 550 555 560 Val Leu Glu Lys Leu Ala Ser Glu His Glu Ile Ile Glu Gln Ile Leu 565 570 575 Leu Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Asn Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu 580 585 590 Leu Lys Glu Ile His Glu Asp Asp Gly Lys Ile His Thr Arg Tyr Gln 595 600 605 Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ile Asn Pro Asn Leu 610 615 620 Gln Asn Ile Pro Val Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala 625 630 635 640 Phe Val Pro Ser Gln Pro Gly Trp Val Met Phe Ala Ala Asp Tyr Ser 645 650 655 Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Met Ser Glu Asp Glu Asn Leu 660 665 670 Val Glu Ala Phe Asn Asn Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr Ala Met 675 680 685 Asp Val Phe His Val Glu Gln Glu Ala Val Thr Ser Asp Met Arg Arg 690 695 700 Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr 705 710 715 720 Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr Arg Lys Glu Ala Ala Thr Phe 725 730 735 Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Ser Phe Pro Gly Val Lys Gly Tyr Met Asp 740 745 750 Asp Ile Val Gln Asp Ala Lys Gln Thr Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu 755 760 765 Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Glu Ile Thr Ser Ser Asn Phe Asn Leu 770 775 780 Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser 785 790 795 800 Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Met Ala Glu Arg Leu 805 810 815 Ile Ser Glu Asn Met Gln Thr Lys Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu 820 825 830 Leu Ile Phe Glu Ala Pro Pro Glu Glu Ile Ala Met Leu Glu Lys Ile 835 840 845 Val Pro Glu Val Met Glu Asn Ala Ile Lys Leu Ile Val Pro Leu Lys 850 855 860 Val Asp Tyr Ala Phe Gly Ser Ser Trp Tyr Asp Thr Lys 865 870 875 <210> 5 <211> 2634 <212> DNA <213> Psychrobacillus sp. <400> 5 atgtatttgt caaccgagaa aatcctatta ttagacggca atagtttggc ataccgagct 60 ttttttgccc tacctttatt aacaaatgaa catggaatac atacaaacgc agtatatggc 120 tttacaatga tgctacaaaa aattatggat gaagaaaatc ctactcatat gctcgtggca 180 tttgatgccg ggaaaacgac cttccgtcac tctacttttg gggattataa aggtggaaga 240 caaaaaacac caccagaact atcggaacaa ttcccttata tacgcaagtt aatcgatgct 300 tatggtatta agcgatacga actggaaatg tacgaagcag acgatattat cggtacttta 360 agcaagcgtg cagacgaaaa agggcagcaa gttgtaattg tctcaggtga taaagattta 420 acacaactag ctacagataa aacaactgtg tatatcacaa gaaaaggcat aaccgatatt 480 gaaaaatata cacctgaaca tgtacaagaa aagtatggct taactccatt acagattata 540 gacatgaaag gtttaatggg agatgcttct gataatattc caggagttcc tggtgtcgga 600 gaaaaaacag ctattaagct tttaaaagaa catggttcgg tagaggattt atataaagca 660 cttgatacag ttagtggtgt taaactaaag gaaaaactca tcgccaacga agagcaggca 720 attatgagta aggcattagc tacgattgaa acagctgcac cgatacagat ttctatagac 780 gatctttcat atactggtcc taatatggaa gaagtaattg aagtttggaa ggaactagct 840 tttaaaactc ttcttgagaa atctgactat atttctgagg aatccgaaac tacagaagta 900 gcattcgaga ttgttgaaga aattgactct acaatattag ataaagtaat gtcagtccat 960 ttagaaatgt atgatgggca atatcataca agcgaattat taggtattgc tttatcagat 1020 ggagaaaagg gttattttgc tcctgctgat atagcttttc aatcgaagga tttttgttct 1080 tggttagaaa atgctacgaa taaaaagtat ttagcagact ccaaagcaac acaagcagtg 1140 agtagaaaac ataatgtgaa tgtacatgga gtggaattcg accttctttt agcagcgtat 1200 atagtaaatc ctgctatctc ttcagaggat gttgctgcta ttgctaaaga atttggatat 1260 tttaacttgc tgacaaacga tagtgtttat gggaaaggtg ccaaaaaaac cgcacctgaa 1320 atcgagaaaa ttgcagaaca tgccgtaaga aaagcaaggg ctatttggga cttgaaagaa 1380 aagttagaag taaaactgga agaaaatgaa caatatgcgt tgtataaaga aatagagcta 1440 ccgcttgcat ctatccttgg tacgatggaa tcagatgggg tgctggtgga taaacaaatt 1500 cttgtagaaa tgggtcatga gcttaatatt aagttacgag cgattgaaca agacatttat 1560 gcgttagctg gtgaaacgtt taatattaat tcacctaaac aattaggtgt aatactattt 1620 gaaaaaattg gtcttacccc tattaaaaag acaaaaacgg gctattcaac tgcagcagat 1680 gttttggaaa aactagcaag tgaacatgaa ataatagagc aaattttact atatcgtcaa 1740 ttaggtaaac tcaattccac atatatcgaa ggattattaa aagagattca tgaagatgat 1800 gggaagatcc atacccgata tcaacaagcc ctaacttcaa ctgggcgttt gagttcgatc 1860 aatccaaacc ttcaaaatat accagttcgt ttagaagaag gtagaaaaat acgtaaagcc 1920 tttgttcctt cacaaccggg atgggtaatg tttgcggcgg attactctca aattgaattg 1980 cgtgttcttg cccatatgtc tgaggatgaa aacctggtag aagcttttaa taatgatctg 2040 gatattcata ctaaaacggc tatggatgta ttccatgtgg agcaggaagc agtaacgtcc 2100 gatatgcgcc gtgctgctaa ggcagttaac tttgggattg tgtatggtat tagtgattat 2160 ggtttatcac aaaacctaga tattactaga aaagaagcgg cgacatttat cgagaattat 2220 ttaaatagct tcccaggtgt aaaaggatat atggatgata tcgttcaaga tgcgaaacaa 2280 acaggctacg ttacaacaat tttgaataga cgaagatatt tgcctgaaat aacaagttct 2340 aactttaatc tccgcagttt tgcagaacgt actgctatga atacaccaat tcaagggagt 2400 gcagccgata ttattaaaaa agcaatgatc gatatggcgg aaagattaat atcagaaaat 2460 atgcagacca aaatgctact acaagtacat gatgaattaa tttttgaggc tccaccagag 2520 gaaattgcaa tgctagaaaa aatagtgcca gaggtgatgg aaaacgctat taaactgatt 2580 gtacctttga aagtggatta tgcctttggt tcatcttggt atgacacgaa gtag 2634 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Bacillus species C3_41 <400> 6 Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Thr Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 32 <212> PRT <213> Ureibacillus thermosphaericus <400> 7 Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Ile Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Ser Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 8 Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Gly Ile Thr Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Bacillus smithii <400> 9 Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Gly Ile Thr Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 10 Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile 1 5 10 15 Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala 20 25 30 <210> 11 <211> 580 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 11 Ala Lys Met Ala Phe Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu 1 5 10 15 Ala Asp Lys Ala Ala Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His 20 25 30 Asp Ala Pro Ile Val Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe 35 40 45 Phe Leu Arg Pro Glu Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp 50 55 60 Leu Gly Asp Glu Thr Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala 65 70 75 80 Ala Val Ala Leu Lys Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val Ser Phe 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Ala Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp 100 105 110 Asp Val Ala Ala Ala Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro 115 120 125 Asp Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu 130 135 140 Pro Val Leu Ala Glu His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Glu 145 150 155 160 Leu Glu Arg Pro Phe Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg 165 170 175 Leu Leu Val Glu Leu Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met 180 185 190 Glu Phe Ala Gly Val Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly 195 200 205 Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Gly Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu 210 215 220 Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val 225 230 235 240 Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr 245 250 255 Gly Tyr Ser Thr Ser Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His 260 265 270 Glu Ile Val Glu Asn Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln 275 280 285 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys 290 295 300 Lys Val His Thr Ile Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu 305 310 315 320 Ser Ser Thr Glu Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Lys Ile Arg Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu 340 345 350 Ile Phe Ala Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His 355 360 365 Ile Ala Glu Asp Asp Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp 370 375 380 Ile His Thr Lys Thr Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu 385 390 395 400 Val Thr Pro Asn Met Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile 405 410 415 Val Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser 420 425 430 Arg Lys Glu Ala Ala Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro 435 440 445 Gly Val Lys Arg Tyr Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys 450 455 460 Gly Tyr Val Thr Thr Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile 465 470 475 480 Thr Ser Arg Asn Phe Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met 485 490 495 Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 500 505 510 Ile Asp Leu Asn Ala Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala His Leu 515 520 525 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu 530 535 540 Met Glu Arg Leu Cys Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val 545 550 555 560 Thr Leu Arg Val Pro Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp 565 570 575 Tyr Asp Ala Lys 580 <210> 12 <211> 580 <212> PRT <213> Ureibacillus thermosphaericus <400> 12 Ala Ala Leu Ser Phe Lys Ile Val Arg Glu Ile Ala Glu Asp Leu Phe 1 5 10 15 Thr Asp Thr Met Ala Val His Val Glu Leu Glu Asn Glu His Tyr His 20 25 30 Thr Cys Asn Ile Leu Gly Phe Gly Phe Thr Asp Gly Ser Asn Thr Phe 35 40 45 Phe Val Pro Thr Glu Val Leu Gln Lys Ser Glu Arg Leu Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe Glu Asp Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Met Ser Asp Leu Lys Ala Ala 65 70 75 80 Gln Cys Ile Leu Lys Arg His Gly Ile Asn Leu Arg Gly Val Glu Phe 85 90 95 Asp Leu Leu Leu Ala Ser Tyr Ile Val Asn Pro Ala Ile Ser Gly Asp 100 105 110 Asp Val Ala Thr Leu Ala Lys Glu Phe Gly Tyr Thr Asp Val Arg Ser 115 120 125 Asn Glu Ala Val Tyr Gly Lys Gly Ala Lys Trp Ala Leu Pro Ser Glu 130 135 140 Glu Val Leu Ala Glu His Val Cys Arg Lys Ala Phe Ala Ile Trp Ser 145 150 155 160 Cys Lys Glu Arg Val Ser Asn Lys Leu Lys Glu Asn Glu Gln Phe Asp 165 170 175 Leu Tyr His Asp Leu Glu Leu Pro Leu Ala Val Ile Leu Gly Lys Met 180 185 190 Glu Ser Glu Gly Ile Lys Val Asn Ile Ser Thr Leu Glu Thr Met Gly 195 200 205 Gln Glu Leu Glu Asp Lys Ile Ala Lys Leu Glu Thr Glu Ile Tyr Glu 210 215 220 Leu Ala Gly Glu Thr Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val 225 230 235 240 Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Leu Pro Val Ile Lys Lys Thr Lys Thr 245 250 255 Gly Tyr Ser Thr Ala Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Lys Ser Glu His 260 265 270 Gln Ile Val Gln Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Thr Leu Ala Lys Leu Gln 275 280 285 Ser Thr Tyr Ile Glu Gly Leu Ile Lys Glu Val His Pro Lys Asp Ser 290 295 300 Lys Val His Thr Arg Phe Met Gln Ala Leu Thr Ser Thr Gly Arg Leu 305 310 315 320 Ser Ser Thr Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu 325 330 335 Gly Arg Lys Ile Arg Lys Ala Phe Val Pro Ser His Asp Gly Trp Leu 340 345 350 Leu Phe Ser Ala Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His 355 360 365 Met Ser Lys Asp Lys Asn Leu Val Glu Ala Phe Asn Gln Gly Met Asp 370 375 380 Ile His Thr Arg Thr Ala Met Glu Val Phe His Val Ser Gln Asp Asp 385 390 395 400 Val Thr Ser Asn Met Arg Arg Ala Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile 405 410 415 Ile Tyr Gly Ile Ser Asp Tyr Gly Leu Ser Gln Asn Leu Asp Ile Ser 420 425 430 Arg Lys Glu Ala Gly Glu Phe Ile Glu Lys Tyr Phe Glu Ser Phe Pro 435 440 445 Gly Val Lys Glu Tyr Met Asp Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Leu Lys 450 455 460 Gly Tyr Val Thr Thr Ile Leu Asn Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile 465 470 475 480 Thr Ser Lys Asn Phe Asn Leu Arg Ser Phe Ala Glu Arg Thr Ala Met 485 490 495 Asn Thr Pro Ile Gln Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met 500 505 510 Leu Asp Ile Asp Ala Arg Leu Asn Ser Glu Gly Leu Gln Ala Lys Leu 515 520 525 Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu Ile Phe Glu Ala Pro Lys Glu Glu 530 535 540 Ile Glu Lys Leu Glu Lys Ile Val Pro Glu Val Met Glu Ser Ala Ile 545 550 555 560 Leu Leu Asp Val Pro Leu Lys Val Asp Ile Ser Tyr Gly Glu Thr Trp 565 570 575 Tyr Asp Ala Lys 580 <210> 13 <211> 1743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 13 accgaagttg catttgaaat tgtggaagaa atcgatagca ccatcctgga taaagttatg 60 agcgttcatc tggaaatgta tgatggtcag tatcatacca gcgaactgct gggtattgca 120 ctgagtgatg gtgaaaaagg ttattttgca ccggcagata ttgcctttca gagcaaagat 180 ttttgtagct ggctggaaaa tgccaccaac aaaaaatacc tggcagatag caaagcaacc 240 caggcagtta gccgtaaaca taatgttaat gttcacggcg tggaatttga tctgctgctg 300 gcagcatata ttgttaatcc ggcaattagc agcgaagatg ttgcagcaat tgcaaaagaa 360 ttcggctatt ttaacctgct gaccaacgat agcgtttatg gtaaaggtgc aaaaaaaacc 420 gcaccggaaa ttgaaaaaat tgccgaacat gcagttcgta aagcacgtgc aatttgggat 480 ctgaaagaaa aactggaagt gaaactggaa gagaacgaac agtatgccct gtataaagaa 540 attgaactgc cgctggcaag cattctgggc accatggaaa gtgatggtgt tctggttgat 600 aaacaaatcc tggttgaaat gggtcacgag ctgaacatta aactgcgtgc aattgaacag 660 gatatttatg cactggcagg cgaaaccttt aacattaata gcccgaaaca gctgggtgtg 720 atcctgtttg aaaaaatcgg tctgaccccg atcaaaaaaa ccaaaaccgg ttatagcacc 780 gcagcagatg ttctggaaaa actggcaagc gaacatgaaa ttattgagca gattctgctg 840 tatcgtcagc tgggtaaact gaatagcacc tatattgaag gtctgctgaa agaaatccat 900 gaggatgatg gtaaaatcca tacccgttat cagcaggcac tgaccagcac cggtcgtctg 960 agcagcatta atccgaatct gcagaatatt ccggttcgtc tggaagaagg tcgtaaaatt 1020 cgtaaagcat ttgttccgag ccagcctggt tgggttatgt ttgcagcaga ttatagccag 1080 attgaactgc gtgttctggc acatatgagc gaagatgaaa atctggttga agcctttaac 1140 aacgatctgg atattcatac caaaaccgcc atggatgttt ttcacgttga acaagaagca 1200 gttaccagcg atatgcgtcg tgcagcaaaa gcagttaatt ttggtattgt gtatggcatc 1260 agcgcttatg gtctgagcca gaatctggat attacccgta aagaagcagc cacctttatc 1320 gaaaactacc tgaatagctt tccgggtgtg aaaggctata tggatgatat tgttcaggat 1380 gcaaaacaga ccggttatgt taccaccatt ctgaatcgtc gtcgttatct gccggaaatt 1440 accagcagca actttaatct gcgtagcttt gcagaacgta ccgcaatgaa taccccgatt 1500 cagggtagcg cagcagatat tatcaaaaaa gccatgattg atatggccga acgtctgatt 1560 agcgaaaata tgcagaccaa aatgctgctg caggttcatg atgaactgat ttttgaagca 1620 ccgcctgaag aaattgcaat gctggaaaaa attgttccgg aagtgatgga aaacgccatt 1680 aaactgattg ttccgctgaa agtggattat gcatttggta gcagttggta cgataccaaa 1740 taa 1743 <210> 14 <211> 1743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 14 gccaaaatgg catttaccct ggcagatcgt gttaccgaag aaatgctggc agataaagca 60 gcactggttg ttgaagttgt ggaagaaaat tatcatgatg caccgattgt tggtattgcc 120 gttgttaatg aacatggccg tttttttctg cgtccggaaa ccgcactggc cgatccgcag 180 tttgttgcat ggctgggtga tgaaaccaaa aaaaagagca tgtttgatag caaacgtgca 240 gcagttgcac tgaaatggaa aggtattgaa ctgtgcggtg tttcatttga tctgctgctg 300 gcagcatatc tgctggatcc ggcacagggt gttgatgatg ttgcagcagc agcaaagatg 360 aaacagtatg aagcagttcg tccggatgaa gccgtttatg gtaaaggtgc aaaacgtgcc 420 gtgccggatg aaccggtgct ggccgaacat ctggttcgta aagcagccgc aatttgggaa 480 ttagaacgtc cgtttctgga tgaactgcgt cgtaatgaac aggatcgtct gctggttgaa 540 ctggaacagc cgctgagcag cattctggca gaaatggaat ttgccggtgt taaagtggat 600 accaaacgtc tggaacaaat gggtaaagaa ctggcagaac agctgggcac cgttgaacag 660 cgtatttatg agctggcagg tcaagaattt aacatcaata gcccgaaaca actgggcgtg 720 attctgtttg aaaaactgca gctgccggtt ctgaaaaaaa ccaaaaccgg ttatagcacc 780 agcgcagatg ttctggaaaa actggcaccg tatcatgaaa ttgtggaaaa cattctgcat 840 tatcgccagc tgggtaaact gcagagcacc tatattgaag gtctgctgaa agttgttcgt 900 cccgatacca aaaaagtgca caccattttt aaccaggcac tgacccagac cggtcgtctg 960 agcagtaccg aaccgaatct gcagaatatt ccgattcgtc tggaagaagg tcgtaaaatt 1020 cgtcaggcct ttgttccgag cgaaagcgat tggctgattt ttgcagcaga ttatagccag 1080 attgaactgc gcgttctggc acatattgcc gaagatgata atctgatgga agcatttcgt 1140 cgcgatctgg atattcatac caaaacagcc atggatattt ttcaggtgag cgaagatgaa 1200 gttaccccga atatgcgtcg tcaggcaaaa gcagttaatt ttggtattgt gtatggcatt 1260 agcgcatatg gtctggcaca gaatctgaat attagccgta aagaagcagc cgagtttatc 1320 gaacgttatt ttgaaagttt tccgggtgtg aaacgctata tggaaaatat tgttcaagaa 1380 gccaaacaga aaggctatgt taccacactg ctgcatcgtc gtcgttatct gccggatatt 1440 accagccgta actttaatgt tcgtagcttt gcagaacgta tggcaatgaa taccccgatt 1500 cagggtagcg cagccgatat tatcaaaaaa gcaatgattg atctgaacgc acgcctgaaa 1560 gaagaacgtc tgcaggcaca tctgctgtta caggttcatg atgaactgat tctggaagcc 1620 cctaaagaag agatggaacg tctttgtcgt ctggttccgg aagttatgga acaggcagtt 1680 accctgcgtg ttccgctgaa agtggattat cattatggta gcacctggta tgatgccaaa 1740 taa 1743 <210> 15 <211> 1743 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 15 gcagcactga gctttaaaat cgttcgtgaa attgcagagg acctgtttac cgataccatg 60 gcagttcatg ttgaactgga aaacgaacat tatcacacgt gcaacattct tggttttggt 120 tttaccgatg gcagcaacac cttttttgtt ccgaccgaag tgctgcagaa aagcgaacgt 180 ctgaaaagct attttgagga tgaaaccaaa aaaaagtata tgagcgatct gaaagcagcc 240 cagtgtattc tgaaacgtca tggtattaat ctgcgtggcg ttgaatttga tctgctgctg 300 gcaagctata ttgttaatcc ggcaattagc ggtgatgatg ttgcaaccct ggcaaaagaa 360 tttggctata ccgatgttcg tagcaatgaa gccgtttatg gtaaaggtgc aaaatgggca 420 ctgccgagcg aagaggttct ggcagaacat gtttgtcgta aagcatttgc aatttggagc 480 tgcaaagaac gcgttagcaa taaactgaaa gagaacgaac agttcgatct gtatcatgat 540 ctggaactgc cgctggccgt tattctgggt aaaatggaaa gcgaaggcat caaagtgaat 600 atcagcaccc tggaaaccat gggtcaagaa ctggaagata aaattgccaa actggaaacc 660 gagatctatg aactggcagg cgaaaccttt aacattaata gcccgaaaca gctgggtgtg 720 atcctgtttg aaaaactggg tctgccggtt atcaaaaaaa cgaaaaccgg ttatagcacc 780 gcagcagatg ttctggaaaa actgaaatca gaacatcaga ttgtgcagct gattctggaa 840 tatcgtaccc tggccaaact gcagagcacc tatattgaag gtctgatcaa agaagtgcat 900 ccgaaagata gcaaagtgca tacccgtttt atgcaggcac tgaccagcac cggtcgtctg 960 agcagcaccg atccgaatct gcagaatatt ccgattcgtc tggaagaagg tcgtaaaatt 1020 cgcaaagcct ttgtgccgag ccatgatggt tggctgctgt ttagcgcaga ttatagccag 1080 attgaactgc gtgttctggc acatatgagc aaagataaaa atctggtgga agcctttaac 1140 caaggcatgg atattcatac ccgtaccgca atggaagttt ttcatgttag ccaggatgat 1200 gtgaccagca atatgcgtcg tgcagcaaaa gcagttaatt tcggtattat ctatggcatt 1260 agcgcatatg gtctgagcca gaatctggat atttcacgta aagaagcagg cgaattcatc 1320 gagaaatact ttgaaagttt tccgggtgtg aaagaatata tggacaacat tgttcaagag 1380 gccaagctga aaggttatgt taccaccatt ctgaatcgtc gtcgttatct gccggatatt 1440 accagcaaaa atttcaatct gcgtagcttt gcagaacgta ccgccatgaa taccccgatt 1500 cagggtagcg cagccgatat catcaaaaaa gcaatgctgg atattgatgc ccgtctgaat 1560 agcgaaggtc tgcaggcaaa actgctgctg caggttcacg atgaactgat ttttgaagca 1620 ccgaaagaag agatcgagaa gctggaaaaa attgttccgg aagttatgga aagtgccatt 1680 ctgctggatg ttccgctgaa agttgatatt agctatggtg aaacctggta cgatgccaaa 1740 taa 1743 <210> 16 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> labelled with the fluorophore Dabcyl <220> <221> misc_feature <222> (32) <223> labelled with the fluorophore FAM <400> 16 ggcccgtagg aggaaaggac atcttctagc atacgggccg tcaagttcat ggccagtcaa 60 gtcgtcagaa atttcgcacc ac 82 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 17 gtggtgcgaa atttctgac 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 18 tatccaccaa tactaccct 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> labelled at 3' end with TAMRA fluorophore <400> 19 cgatactttg tccactcaat 20 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> labelled at 5' end with Black Hole Quencher 2 <400> 20 attgagtgga caaagtatcg tagggtagta ttggtggata 40

Claims (36)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 서열번호 2와 적어도 99% 동일한 변이체 서열을 포함하지만, 서열번호 2의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 상기 변이체 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 알라닌(Ala)에 의해 대체되어 있는 것인, DNA 중합효소.
2. 제1항에 있어서,
   상기 DNA 중합효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하지만, 서열번호 2의 위치 422의 아스파르트산 잔기가 알라닌에 의해 대체되어 있는 것인, DNA 중합효소.
3. 서열번호 12의 아미노산 서열, 또는 서열번호 12와 적어도 99% 동일한 변이체 서열을 포함하지만, 서열번호 12의 위치 422의 아스파르트산 잔기, 또는 상기 변이체 서열의 동등한 아스파르트산 잔기가 알라닌(Ala)에 의해 대체되어 있는 것인, DNA 중합효소.
4. 제3항에 있어서,
   상기 DNA 중합효소는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하지만, 서열번호 12의 위치 422의 아스파르트산 잔기가 알라닌에 의해 대체되어 있는 것인, DNA 중합효소.
5. 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하지만, 서열번호 11의 위치 422의 아스파르트산 잔기가 알라닌에 의해 대체되어 있는 것인, DNA 중합효소.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   20 mM 내지 200 mM NaCl 또는 KCl 또는 이들의 혼합물의 농도 범위에 걸쳐, 상기 DNA 중합효소가 그것의 최대 중합효소 활성의 적어도 40%를 나타내는 것인, DNA 중합효소.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소 및 완충제를 포함하는 조성물.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
9. 제8항에 있어서,
   상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13, 14 또는 15에 대해 적어도 99% 서열 동일성을 가지는 것인 핵산 분자.
10. 제8항에 따른 핵산 분자 및 상기 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질 서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 벡터.
11. 제10항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13, 14, 또는 15에 대해 적어도 99% 서열 상동성을 가지는 것인, 발현 벡터.
12. 제10항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
13. 제10항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 바이러스.
14. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소의 제조 방법:
    (i) 제10항에 따른 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 암호화된 DNA 중합효소의 발현에 적합한 조건 하에 성장 배지에서 배양하는 단계; 및 선택적으로
    (ii) 상기 숙주 세포로부터 또는 성장 배지 또는 상기 성장 배지 유래 상층액으로부터 DNA 중합효소를 분리 또는 수득하는 단계.
15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소를 포함하는 뉴클레오타이드 중합반응용 조성물.
16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소를 포함하는 핵산 증폭 또는 서열분석 반응용 조성물.
17. 제15항에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 일정한 온도에서 사용되는 것인, 조성물.
18. 제16항에 있어서,
    상기 DNA 중합효소는 일정한 온도에서 사용되는 것인, 조성물.
19. 제16항에 있어서,
    상기 반응은 등온 핵산 중폭 반응인 것인, 조성물.
20. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소를 사용하는 뉴클레오타이드 중합반응 방법:
    (i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소, 주형 핵산 분자, 주형 핵산 분자의 일부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 하나 이상의 뉴클레오타이드 종을 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; 및
    상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 상기 주형 핵산 분자에 어닐링되고 상기 DNA 중합효소가 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 연장시키는 조건 하에서 상기 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계.
21. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소를 사용하여 핵산을 증폭시키는 방법:
    (i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소, 주형 핵산 분자, 주형 핵산 분자의 일부분에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들), 및 뉴클레오타이드를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; 및
    (ii) 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)가 상기 주형 핵산 분자에 어닐링되고 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 상기 DNA 중합효소가 하나 이상의 뉴클레오타이드를 중합시킴으로써 상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머(들)를 연장시키는 조건 하에서 상기 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계.
22. 제20항에 있어서,
    상기 방법은 일정한 온도에서 수행되는 것인, 방법.
23. 제21항에 있어서,
    상기 방법은 일정한 온도에서 수행되는 것인, 방법.
24. 제17항에 있어서,
    상기 일정한 온도는 10℃ 내지 25℃의 범위 내에서 선택되는 것인, 조성물.
25. 제18항에 있어서,
    상기 일정한 온도는 10℃ 내지 25℃의 범위 내에서 선택되는 것인, 조성물.
26. 제22항에 있어서,
    상기 일정한 온도는 10℃ 내지 25℃의 범위 내에서 선택되는 것인, 방법.
27. 제23항에 있어서,
    상기 일정한 온도는 10℃ 내지 25℃의 범위 내에서 선택되는 것인, 방법.
28. 제8항에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
29. 제8항에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 바이러스.
30. 하기 단계를 포함하는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 DNA 중합효소의 제조 방법:
    (ⅰ) 제8항에 따른 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 암호화된 DNA 중합효소의 발현에 적합한 조건 하에 성장 배지에서 배양하는 단계; 및 선택적으로
    (ⅱ) 상기 숙주 세포로부터 또는 성장 배지 또는 상기 성장 배지 유래 상층액으로부터 DNA 중합효소를 분리 또는 수득하는 단계.
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