BR112020011605A2 - Dna polimerases - Google Patents
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Abstract
a presente invenção fornece uma dna polimerase que inclui a sequência da seq id no. 1 ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à mesma, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 da seq id no. 1, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente. além disso, fornece dna polimerases que compreendem as sequências de aminoácidos de seq id no. 2, 11 e 12 e variantes das mesmas. a presente invenção também fornece ácidos nucleicos que codificam as dna polimerases, um método para produzir as ditas dna polimerases, e composições, vetores de expressão e células hospedeiras ou vírus que compreendem as ditas dna polimerases. a presente invenção também fornece usos das ditas dna polimerases em reações de polimerização, amplificação e sequenciamento de nucleotídeos.
Description
[0001] A presente invenção referese a DNA polimerases. Em particular, a presente invenção refere-se a DNA polimerases modificadas com atividade de deslocamento de cadeia aprimorada (SDA).
[0002] O padrão ouro de identificação microbiana ainda permanece a cultura e a subsequente diferenciação fenotípica do agente causador, um processo que geralmente leva vários dias para ser executado e analisado, e esse atraso pode ter um grande impacto na morbidade e mortalidade de uma doença infecciosa. Além disso, muitos organismos não podem crescer em meios de cultura, portanto, não serão detectados pelos métodos de cultura existentes.
[0003] Existe uma necessidade global de monitorar e diagnosticar doenças infecciosas críticas, tais como HIV/AIDS, tuberculose, malária, cólera, etc. O desafio se torna ainda mais crítico em possíveis situações epidêmicas tais como Ebola, surtos de influenza aviária e suína. Apesar dos avanços nas tecnologias de diagnóstico, muitos pacientes com suspeita de infecção recebem terapia antimicrobiana empírica, em vez de terapia apropriada ditada pela rápida identificação do agente infeccioso. O resultado é o uso excessivo do pequeno estoque de antimicrobianos eficazes, cujos números continuam diminuindo devido ao desenvolvimento da resistência aos antimicrobianos. Existe uma clara demanda por novos e rápidos testes de diagnóstico molecular no sítio, que permite a identificação de patógenos específicos.
[0004] A reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionou de várias maneiras o campo da genética molecular e do diagnóstico. O trabalho pesado na tecnologia de PCR são DNA polimerases de alta fidelidade termostáveis que, juntamente com eventos cíclicos de aquecimento e resfriamento para obter a separação de cadeias, hibridização e alongamento do iniciador, levam à amplificação de uma sequência de DNA alvo.
A tecnologia de PCR agora é amplamente utilizada em pesquisas biomédicas e de ciências da vida, bem como em diagnósticos moleculares.
[0005] Os diagnósticos de ponto de atendimento (POC) são descritos como ferramentas ou dispositivos médicos que permitem o diagnóstico de doenças na comunidade de um paciente fora de um ambiente hospitalar. O teste diagnóstico ideal deve atender aos critérios “ASSURED"”: Acessível (do inglês Affordable), Sensível (do inglês Sensitive), Específico (do inglês Specific), Fácil de ser utilizado (do inglês User-friendly), Rápido e robusto (do inglês Rapid and robust), Livre de equipamento (do inglês Equipment-free) e Entregue (do inglês Delivered) a quem precisa. Os métodos POC são preferencialmente simples e não requerem uma fonte de calor ou fonte de energia estável, pois normalmente não estão disponíveis no POC. Assim, as enzimas e reagentes utilizados devem funcionar à temperatura ambiente.
[0006] Embora a tecnologia de PCR tenha um alto potencial, ela ainda possui limitações estritas e requer o uso de equipamento de ciclo térmico de alta precisão acionado eletricamente para processos repetidos de aquecimento e resfriamento e pessoal versado para operar o equipamento. À amplificação não específica devido à iniciação espúria no processo de hibridização é problemática e a PCR também é propensa a compostos inibitórios em amostras "brutas". Além disso, o projeto volumoso dos dispositivos de PCR torna a PCR uma solução imperfeita para incorporação nas plataformas de tecnologia POC e dificulta a utilização de métodos baseados em PCR como o principal acionador de tecnologia no diagnóstico de POC.
[0007] Ultimamente, surgiu um foco maior em métodos não baseados em PCR, em particular os métodos de amplificação isotérmica (IA). Nestes métodos, a amplificação de ácido nucleico ocorre a temperaturas constantes e não necessita de ciclos e controles de temperatura de alta precisão, ou enzimas estáveis a altas temperaturas. Os métodos de amplificação isotérmica são relatados como tendo sensibilidades e especificidades analíticas comparáveis à PCR, bem como uma maior tolerância a compostos inibidores, enquanto permitem menor tempo para resultados e uso mais fácil. Esses atributos tornam os métodos de amplificação isotérmica altamente desejáveis para aqueles que desenvolvem plataformas de diagnóstico molecular de POC e buscam atender aos critérios “ASSURED”. Um número de diferentes métodos foi publicado na última década para a amplificação isotérmica de ácidos nucleicos (RNA e DNA) (Revisado por Gill, P. e A. Ghaemi (2008) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27 (3): 224 a 243; Craw, P. W. e Balachandran (2012) Lab Chip 12 (14):. 2469 a 2486; de Paz, HD et a/. (2014) Expert Rev Mol Diagn 14 (7): 827 a 843; Yan, L. et al. (2014) Mol Biosyst 10 (5): 970 a 1003 e novos estão sendo continuamente desenvolvidos (Liu, W. et al. (2015) Sci Reports 5: 12723). Em vários dos métodos, o sucesso depende da atividade de deslocamento de cadeia inerente (SDA) da DNA polimerase usada na configuração da reação. O termo deslocamento de cadeia descreve a capacidade da polimerase de deslocar o DNA a jusante encontrado durante a síntese.
[0008] Além do diagnóstico (POC), outras áreas de interesse também se beneficiam da tecnologia de amplificação isotérmica capacitada pela DNA polimerase. A este respeito, a amplificação total do genoma (amplificação por deslocamento múltiplo) é importante, especialmente quando uma quantidade extremamente limitada de DNA está presente, tal como em abordagens de célula única. Além disso, nas abordagens de sequenciamento de próxima geração, as polimerases de deslocamento de cadeia são importantes, conforme exemplificado pela tecnologia de sequenciamento de DNA da Pacific Biosciences Single Molecule Real Time (SMRT) e um método de amplificação isotérmica para o sequenciamento de próxima geração publicado em 2013 por Ma et al. (Ma, Z. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 110(35): 14320 a 14323).
[0009] O atual conjunto de ferramentas de enzimas polimerase que funcionam bem à temperatura ambiente é, no entanto, muito limitado. Tipicamente, diferentes métodos isotérmicos requerem temperaturas de reação entre 30 e 65 ºC, que são determinadas principalmente pela faixa de trabalho das polimerases usadas nas reações e são propensas à inibição pelo sal.
[0010] Uma polimerase adaptada ao frio de Psychrobacillus sp. (PB) que pertence à família A de DNA polimerases foi caracterizada. Esta enzima possui alta atividade de polimerase em temperatura ambiente, mas ainda possui boa estabilidade em temperaturas elevadas de até 40 “ºC. De particular interesse, a enzima marinha derivada também possui boa tolerância ao sal e forte atividade de deslocamento de cadeia (SDA), bem como processabilidade proficiente a 25 ºC, e é comparável às enzimas comerciais do estado da técnica (WO 2017/162765).
[0011] Em muitos métodos de IA, apenas uma polimerase é necessária, e a eficácia do método depende fortemente da SDA dessa polimerase. Portanto, qualquer coisa que serviu para aumentar a SDA da PB ou de outras polimerases usadas na IA seria altamente desejável.
[0012] Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que uma mutação pontual no domínio dos dedos de certas polimerases da família A, em particular a substituição de um único resíduo Asp, leva a SDA significativamente aprimorada.
[0013] Portanto, em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma DNA polimerase, a dita DNA polimerase incluindo a sequência da SEQ ID NO. 1 ou uma sequência que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, 78%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 92% ou 95%, idêntica à mesma, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 da SEQ ID NO. 1, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0014] A SEQ ID NO. 1 é um fragmento da sequência de aminoácidos da PB polimerase |, este abrange os aminoácidos 405 a 436 na sequência truncada de PB do tipo selvagem truncada (sem o domínio 5"- 3"- exonuclease). Essa região (405 a 436) no domínio do dedo é altamente conservada entre algumas da família da DNA polimerase A (também conhecida como família pol |), consulte as Figuras 1 e 5. As DNA polimerases da invenção seriam tipicamente classificadas como do tipo de DNA polimerase | ou A.
[0015] As DNA polimerases preferenciais da invenção compreendem a sequência da SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 ou 10, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 de cada sequência foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0016] Em algumas modalidades, a DNA polimerase da invenção compreende uma sequência de aminoácidos que tem alterações únicas ou múltiplas de aminoácidos (adições, substituições, inserções ou deleções) em comparação com a SEQ ID NO: 1, Tais sequências preferencialmente podem conter até 8, 7 ou 6, por exemplo, apenas 1, 2, 3, 4 ou 5, preferencialmente 1, 2 ou 3, mais preferencialmente 1 ou 2, aminoácidos alterados, além da substituição de resíduo de Asp acima mencionado. As substituições podem ser com aminoácidos conservadores ou não conservadores. De preferência, as ditas alterações são substituições conservadoras de aminoácidos.
[0017] Uma polimerase preferencial da invenção é uma PB polimerase modificada, outras polimerases preferenciais são polimerases modificadas da espécie Geobacillus stearothermophilus (conhecida como Bst), de Bacillus subtilis (conhecida como Bsu), de Bacillus smithii (conhecida como Bsm) e Ureibacillus thermosphaericus (conhecida como Ubts).
[0018] O termo "DNA polimerase" refere-se a uma enzima que catalisa a síntese 5'>3' de DNA a partir de nucleotídeos individuais, sendo a reação baseada na extensão do iniciador e nas regras padrão de Watson-Crick de emparelhamento de bases com uma cadeia de modelo. Da mesma forma, "atividade da DNA polimerase" refere-se à síntese 5>3' de DNA a partir de nucleotídeos individuais, a reação sendo baseada na extensão do iniciador e nas regras padrão de Watson-Crick de emparelhamento de bases com uma cadeia de modelo. Fragmentos enzimaticamente ativos (cataliticamente ativos) de polimerases de ocorrência natural ou modificadas estão incluídos no termo "DNA polimerase". A polimerase também pode ter, mas pode não ter, exonuclease 3'->5' e/ou atividade de exonuclease 53. Preferencialmente, as DNA polimerases da presente invenção carecem de atividade de exonuclease 53".
[0019] Os presentes inventores descobriram que a substituição do resíduo de ácido aspártico mencionado acima aumenta significativamente a SDA em várias DNA polimerases diferentes da família conhecida como DNA polimerase A, as enzimas que podem se beneficiar da modificação de acordo com a presente invenção são caracterizadas por uma alta identidade de sequência com SEQ ID NO. 1 (uma região específica do domínio dos dedos da enzima de PB) e um resíduo de ácido aspártico na posição 18 ou na posição equivalente em outras enzimas/sequências. Um "resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências" que a SEQ ID NO. 1 (ou outras sequências) podem ser facilmente identificadas usando técnicas de alinhamento de sequência padrão, tais como Clustal X2 (Larkin, MA et al. (2007) Clustal W e Clustal X versão 2.0. Bioinformatics, 23: 2947 a 2948).
[0020] Certamente, SEQ ID NO. 1 não define por si só uma DNA polimerase totalmente funcional. Em modalidades preferenciais, a DNA polimerase da presente invenção é baseada na sequência de aminoácidos da PB DNA polimerase |, de preferência que carece do domínio 5'-3'- exonuclease que está presente na sequência de DNA polimerase | da espécie Psychrobacillus de tipo selvagem. Em modalidades preferenciais, o domínio 5'- 3'-exonuclease está ausente na enzima DNA polimerase, pois a atividade da 5'- 3'-exonuclease é tipicamente indesejada, pois pode degradar os iniciadores e/ou produtos em uma mistura de amplificação. Esta sequência de PB truncada de tipo selvagem é referida neste documento como SEQ ID NO. 2.
[0021] A invenção fornece uma DNA polimerase que compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO: 2, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0022] Em aspectos e modalidades preferenciais, a DNA polimerase da invenção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% ou 75%, preferencialmente pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95%, por exemplo, em pelo menos 98% ou 99% ou 99,5%, idêntico à SEQ ID NO: 2, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente. Será entendido que a posição 18 na SEQ ID NO. 1 e 422 na SEQ ID NO. 2 são equivalentes, SEQ ID NO. 1 é um fragmento da posição 405 a 436 da SEQ ID NO. 2.
[0023] A Figura 5 mostra um alinhamento das DNA polimerases PB, Bst e Ubts. O resíduo chave Asp está na posição 422 em cada caso.
[0024] Em outras modalidades ou aspectos preferenciais, a DNA polimerase da invenção compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60%, 70% ou 75%, preferencialmente pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95%, por exemplo, pelo menos 98% ou 99% ou 99,5%, idêntica à SEQ ID NO. 11 ou 12, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 11 ou 12, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente. A numeração é baseada em um alinhamento de sequência de acordo com a Figura 5. As SEQ ID Nos. 11 e 12 são as variantes (truncadas) das sequências de polimerase de tipo selvagem Bst e Ubts, respectivamente.
[0025] Preferencialmente, a DNA polimerase da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, 11 ou 12, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, 11 ou 12, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0026] Em uma modalidade, a DNA polimerase compreende a (ou consiste na) sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 (incorporando também o domínio de exonuclease 5'>-3') ou uma variante ou fragmento do mesmo, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 719 da SEQ ID NO. 4, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente. Os tipos de variantes e fragmentos de SEQ ID NO: 2 descritos neste documento aplicam-se, mutatis mutandis, a variantes e fragmentos de SEQ ID NO: 4, por exemplo, variantes terão pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80% ou 90% de identidade de sequência para SEQ ID.NO: 4.
[0027] As DNA polimerases da invenção incluem fragmentos enzimaticamente ativos de polimerases nativas. Fragmentos enzimaticamente ativos são fragmentos que possuem atividade de DNA polimerase. Os fragmentos enzimaticamente ativos podem ter pelo menos 400, pelo menos 450, pelo menos 475, pelo menos 500, pelo menos 525, pelo menos 550, pelo menos 560, pelo menos 570 ou pelo menos 575 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos preferenciais têm pelo menos 525, pelo menos 550, pelo menos 560, pelo menos 570 ou pelo menos 575 aminoácidos de comprimento. Os fragmentos são pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% (por exemplo, pelo menos 98% ou 99% ou 99,5%) ou 100% idênticos à porção correspondente da SEQ ID NO: 2, 11 ou 12, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, 11 ou 12, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0028] A atividade da DNA polimerase pode ser avaliada com uso de um farol molecular que suporta uma estrutura em laço e usa FAM como doador de fluorescência e Dabcyl como um aceitador (inibidor não fluorescente) dentro de uma haste de 8mero. Esta haste suporta uma extensão de 3'- que permite a aglutinação de um iniciador e atua como molde para a DNA polimerase. A haste será aberta pela DNA polimerase quando a extensão prosseguir. A seguinte separação das duas etiquetas é registrada pela restauração da emissão de FAM. Um ensaio adequado deste tipo é descrito nos Exemplos.
[0029] As DNA polimerases da presente invenção têm boa atividade de deslocamento de cadeia. Esta é uma propriedade importante, pois em muitos métodos de amplificação isotérmica o sucesso depende da atividade inerente de deslocamento da cadeia da DNA polimerase usada na configuração da reação. O termo "deslocamento de cadeia" descreve a capacidade da polimerase de deslocar o DNA a jusante encontrado durante a síntese.
[0030] Os ensaios adequados para avaliar a atividade de deslocamento de cadeia de uma DNA polimerase são conhecidos na técnica e um versado na técnica é capaz de selecionar prontamente um ensaio adequado. Em um ensaio exemplificativo de atividade de deslocamento de cadeia, um iniciador "frio" e uma cadeia repórter que são rotulados com um fluoróforo (por exemplo, TAMRA) na extremidade 3' do mesmo são hibridizados em uma cadeia modelo que tem um inibidor (por exemplo, BHQ2) na extremidade 5' do mesmo (o fluoróforo é assim inibido pela proximidade do inibidor) de modo que exista uma lacuna de nucleotídeo entre a extremidade 3' do iniciador "frio" hibridizado e a extremidade 5' da cadeia repórter hibridizada; após a atividade de deslocamento da cadeia da DNA polimerase, o oligonucleotídeo marcado com fluoróforo (cadeia repórter) é deslocado da cadeia modelo e, como consequência, o fluoróforo e o inibidor não estão mais próximos e um aumento na fluorescência pode ser medido.
[0031] A atividade de deslocamento de cadeia pode ser avaliada em um ensaio com as etapas de (i) fornecer uma molécula de DNA modelo com um inibidor (inibidor de fluorescência) na extremidade 5' do mesmo, (ii) hibridizar com a dita molécula de DNA modelo um iniciador frio (isto é, oligonucleotídeo não fluorescente) e uma cadeia repórter (oligonucleotídeo repórter) que é marcada com um fluoróforo na extremidade 3', em que existe uma lacuna de um nucleotídeo entre a extremidade 3' do iniciador "frio" hibridizado e a extremidade 5' da cadeia repórter hibridizada, em que o inibidor inibe o fluoróforo em virtude de proximidade um do outro, (iii) incubar o dito complexo de cadeia iniciador-repórter fria com molde com uma DNA polimerase, Me?* e dNTPs e (iv) medir a fluorescência crescente do fluoróforo anteriormente inibido, em que a dita fluorescência é indicativa da atividade de deslocamento da cadeia.
[0032] Iniciadores preferenciais, cadeias repórteres e cadeias modelo são os descritos nos Exemplos.
[0033] Em uma modalidade preferencial, a atividade de deslocamento de cadeia (SDA) é avaliada de acordo com o ensaio de atividade de deslocamento de cadeia descrito na seção Exemplo. A SDA é, de preferência, medida aproximadamente à temperatura ideal para essa polimerase. Para PB e outros mesófilos que podem estar em torno de 25 “Ca 37"C.
[0034] A presente invenção permite que a SDA de uma DNA polimerase de tipo selvagem seja aprimorada. No caso de PB, a SDA já é alta em comparação com a maioria das polimerases disponíveis comercialmente, mas a SDA ainda pode ser significativamente aumentada (consultar Figura 3) implementando a modificação de aminoácidos na posição 18/422 descrita neste documento. Para polimerases termoestáveis incluídas na invenção, por exemplo, Ubts e Bst, a SDA nativa é bastante baixa à temperatura ambiente (25 a 37 ºC). No entanto, a SDA ainda é significativamente aumentada a 37 ºC quando o resíduo de ácido aspártico é substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente. Polimerases diferentes podem ser úteis em diferentes cenários, por exemplo, Bst e Ubts são termoestáveis (Tm de 66 “C e 62 ºC, respectivamente) e, portanto, a capacidade de aprimorar a SDA para qualquer uma dessas enzimas é muito útil (consultar as Figuras 6 e 7).
[0035] Assim, em modalidades preferenciais, as DNA polimerases da invenção têm pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 100% maior SDA do que uma DNA polimerase com exatamente a mesma sequência, mas com ácido aspártico na posição 18 ou 422, em relação às SEQ ID NOs. 1 e 2, respectivamente, ou na posição equivalente em outras sequências. Preferencialmente, a % de aumento observada será pelo menos observada nas condições em que cada enzima exibe a SDA máxima da mesma. Em outras palavras, para o melhor que cada enzima pode executar, a polimerase da invenção terá preferencialmente pelo menos 30%, mais preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 100% de SDA superior ao equivalente da mesma contendo ácido aspártico.
[0036] O resíduo de ácido aspártico discutido acima, cuja modificação é essencial para os benefícios proporcionados pela presente invenção, é substituído por um resíduo sem carga negativa. A substituição tipicamente envolverá a substituição por outro resíduo de aminoácido, mas em algumas modalidades o resíduo de ácido aspártico pode ter sido modificado para remover a carga negativa do mesmo. Assim, o resíduo na posição 18/422 da polimerase da invenção será neutro ou carregado positivamente. Aminoácidos neutros incluem aminoácidos polares e aminoácidos hidrofóbicos. Os aminoácidos de substituição adequados incluem Ser, Thr, Asn, Gin, Ala, Ile, Leu, Tyr, Val, Lys e Arg. Aminoácidos não padronizados, isto é, não geneticamente codificados, podem ser incorporados com carga neutra ou positiva. Ala é particularmente preferencial.
[0037] Os inventores também descobriram que algumas das polimerases da invenção exibem execução melhorada de SDA em [NaCl] e [KCI] elevados em comparação com enzimas que contêm o resíduo Asp discutido acima (consulte as tabelas 2 e 4). A tolerância aprimorada ao sal é assim um benefício adicional que pode ser proporcionado pela presente invenção.
[0038] As DNA polimerases preferenciais da presente invenção têm níveis úteis de atividade da polimerase através de uma faixa de concentrações de sal (NaCl e/ou KCI). Em outras palavras, as DNA polimerases preferenciais da presente invenção exibem em uma ampla faixa de concentrações de sal uma proporção substancial da atividade da DNA polimerase observada na concentração de sal na qual a atividade máxima da polimerase é observada. Ensaios adequados para determinar a atividade da DNA polimerase são descritos alhures neste documento. Um ensaio preferencial para determinar a atividade da DNA polimerase é conforme descrito na seção Exemplo.
[0039] Em algumas modalidades, em uma faixa de concentração de cerca de 20 mM a 200 mM de NaCl ou KCI ou uma mistura dos mesmos, as DNA polimerases da presente invenção exibem uma proporção substancial (por exemplo, pelo menos 40%, preferencialmente pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 60%) da atividade máxima da mesma da polimerase.
[0040] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece moléculas (por exemplo, proteínas, tais como proteínas de fusão) que compreendem DNA polimerases da presente invenção.
[0041] Conforme usado em todo o pedido, os termos “um" e “uma" são usados no sentido em que significam "pelo menos um", "pelo menos um primeiro", "um ou mais" ou "uma pluralidade" dos componentes ou etapas referenciados, exceto nos casos em que um limite superior ou exclusão for posteriormente especificado especificamente. Os limites e parâmetros operáveis das combinações, como com as quantidades de qualquer agente único, serão conhecidos pelos versados na técnica à luz da presente divulgação.
[0042] Moléculas de ácido nucleico que compreendem sequências nucleotídicas que codificam DNA polimerases da presente invenção como definidas neste documento ou fragmentos das mesmas, ou moléculas de ácido nucleico substancialmente homólogas às mesmas, formam ainda outros aspectos da invenção. Uma molécula de ácido nucleico preferencial é um ácido nucleico que codifica uma DNA polimerase | da SEQ ID NO: 2 ou uma sequência substancialmente homóloga à mesma (por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica), mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, ou o resíduo equivalente de ácido aspártico em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
[0043] Uma molécula de ácido nucleico preferencial compreende a (ou consiste na) sequência nucleotídica conforme estabelecido na SEQ ID NO: 13, 14 ou 15, ou é uma sequência substancialmente homóloga à mesma. Opcionalmente, os três nucleotídeos finais da SEQ ID NO: 13, 14 ou podem ser omitidos. As sequências de ácido nucleico da invenção incluem sequências com pelo menos 70% ou 75%, preferencialmente pelo menos 80%, e ainda mais preferencialmente pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13, 14 ou 15. As sequências de ácido nucleico da invenção incluem, portanto, alterações de base única ou múltipla (adições, substituições, inserções ou deleções) na sequência da SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.
[0044] Uma molécula de ácido nucleico particularmente preferencial compreende a, ou consiste na, sequência nucleotídica conforme estabelecido na SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.
[0045] A presente invenção também se estende a moléculas de ácido nucleico que compreendem (ou consistem em) sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas de moléculas de ácido nucleico descritas neste documento, por exemplo, versões degeneradas de uma molécula de ácido nucleico que compreende (ou consiste em) SEQ ID NO: 13, 14 ou 15.
[0046] As moléculas de ácido nucleico da invenção são preferencialmente "isoladas" ou "purificadas”".
[0047] A homologia (por exemplo, identidade de sequência) pode ser avaliada por qualquer método conveniente. No entanto, para determinar o grau de homologia (por exemplo, identidade) entre sequências, programas de computador que fazem múltiplos alinhamentos de sequências são úteis, por exemplo, Clustal W (Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22: 4673 a 4680, 1994). Se desejado, o algoritmo Clustal W pode ser usado junto com a matriz de pontuação BLOSUM 62 (Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89: 10915 a 10919, 1992) e uma penalidade de lacuna de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,1, de modo que a correspondência de ordem mais alta seja obtida entre duas sequências, em que pelo menos 50% do comprimento total de uma das sequências está envolvido no alinhamento. Clustal X é uma interface de janelas conveniente para Clustal W (Thompson, JD et al (1997) The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 25: 4876 a 4882).
[0048] Outros métodos que podem ser utilizados para alinhar sequências são o método de alinhamento de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970), conforme revisado por Smith e Waterman (Smith e Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981) para que seja obtida a correspondência de ordem mais alta entre as duas sequências e o número de aminoácidos idênticos seja determinado entre as duas sequências. Outros métodos para calcular a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos são geralmente reconhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os descritos por Carillo e Lipton (Carillo e Lipton, SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988) e os descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, e.d.
Oxford University Press, Nova York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects.
[0049] Geralmente, programas de computador serão utilizados para esses cálculos. Programas que comparam e alinham pares de sequências, como ALIGN (Myers e Miller, CABIOS, 4: 11 a 17, 1988), FASTA (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444 a 2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183: 63 a 98, 1990) e BLAST com lacunas (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 a 3402, 1997), BLASTP, BLASTN ou GCG (Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12: 387, 1984) também são úteis para este propósito. Além disso, o servidor Dali no Instituto Europeu de Bioinformática oferece alinhamentos baseados em estruturas de sequências de proteínas (Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20: 478 a 480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233: 123 a 138, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26: 316 a 319, 1998).
[0050] A fim de proporcionar um ponto de referência, as sequências de acordo com a presente invenção que têm 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência etc. podem ser determinadas com uso do programa ALIGN com parâmetros padrão (por exemplo, disponível na Internet no servidor de rede GENESTREAM, IGH, Montpellier, França).
[0051] Uma "substituição de aminoácido conservativa”, conforme usado neste documento, é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos possuindo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica.
[0052] As DNA polimerases da presente invenção compreendem aminoácidos codificados geneticamente, mas também podem conter um ou mais aminoácidos não codificados geneticamente.
[0053] Quando utilizado em conexão com uma molécula de proteína ou polipeptídeo, tal como uma DNA polimerase, o termo "isolado" ou "purificado" refere-se tipicamente a uma proteína substancialmente livre de material celular ou outras proteínas da fonte da qual é derivada. Em algumas — modalidades, tais proteínas isoladas ou purifcadas são substancialmente livres de meio de cultura quando produzidas por técnicas recombinantes ou precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente.
[0054] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um vetor de expressão (de preferência um vetor de expressão recombinante) que contém uma molécula de ácido nucleico da invenção, ou um fragmento da mesma, e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de proteína codificada pela molécula de ácido nucleico da invenção.
[0055] Os possíveis vetores de expressão incluem, mas não estão limitados a, cosmídeos ou plasmídeos, desde que o vetor seja compatível com a célula hospedeira usada. Os vetores de expressão são "adequados para a transformação de uma célula hospedeira", o que significa que os vetores de expressão contêm uma molécula de ácido nucleico da invenção e sequências reguladoras selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, as quais estão operacionalmente ligadas à molécula de ácido nucleico. Operacionalmente ligado pretende significar que o ácido nucleico está ligado a sequências reguladoras de uma maneira que permita a expressão do ácido nucleico.
[0056] Sequências reguladoras adequadas podem ser derivadas de uma variedade de fontes, incluindo genes bacterianos, fúngicos, virais, mamíferos ou de insetos e são bem conhecidas na técnica. À seleção de sequências reguladoras apropriadas é dependente da célula hospedeira escolhida conforme discutido abaixo, e pode ser prontamente realizada por um versado na técnica. Exemplos de tais sequências reguladoras incluem: um promotor e aprimorador transcricional ou sequência de aglutinação à RNA polimerase, uma sequência de aglutinação ribossômica, incluindo um sinal de início de tradução. Além disso, dependendo da célula hospedeira escolhida e do vetor utilizado, outras sequências, tais como uma origem de replicação, sítios de restrição de DNA adicionais, aprimoradores e sequências que conferem indutibilidade de transcrição podem ser incorporadas no vetor de expressão.
[0057] Os vetores de expressão recombinantes da invenção também podem conter um gene marcador selecionável que facilita a seleção de células hospedeiras transformadas ou transfectadas com uma molécula recombinante da invenção.
[0058] Os vetores de expressão recombinantes também podem conter genes que codificam uma fração de fusão que fornece expressão aumentada da proteína recombinante; maior solubilidade da proteína recombinante e/ou ajuda na purificação da proteína recombinante alvo agindo como um ligante na purificação por afinidade (por exemplo, "marcadores" apropriados para permitir a purificação e/ou identificação podem estar presentes, por exemplo, marcadores His ou marcadores myc).
[0059] Os vetores de expressão recombinantes podem ser introduzidos nas células hospedeiras para produzir uma célula hospedeira transformada. Os termos "transformado com", "transfectado com", "transformação" e "transfecção" pretendem abranger a introdução de ácido nucleico (por exemplo, um vetor) em uma célula por uma das muitas técnicas possíveis conhecidas na técnica. Métodos adequados para transformar e transfectar células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et al., 1989 (Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros livros didáticos de laboratório.
[0060] As células hospedeiras adequadas incluem uma grande variedade de células hospedeiras procarióticas e células eucarióticas. Preferencialmente, as proteínas da invenção podem ser expressas em células hospedeiras bacterianas, tais como Escherichia coli.
[0061] As proteínas de fusão N-terminal ou C- terminal que compreendem DNA polimerases e proteínas da invenção conjugadas com outras moléculas, tais como proteínas (por exemplo, marcadores de epítopos), podem ser preparadas por fusão através de técnicas recombinantes.
[0062] Um outro aspecto ainda fornece uma célula hospedeira ou vírus que compreende uma ou mais construções de expressão ou vetores de expressão da invenção. Também são fornecidas células hospedeiras ou vírus que compreendem uma ou mais das moléculas de ácido nucleico da invenção. Uma célula hospedeira ou vírus capaz de expressar uma DNA polimerase da invenção forma ainda um outro aspecto. As células hospedeiras preferenciais incluem as células Rosetta 2 (DE3) (Novagen).
[0063] As DNA polimerases da invenção podem ser produzidas de forma recombinante em uma célula hospedeira e isoladas e purificadas a partir das mesmas. As DNA polimerases da invenção podem, portanto, ser consideradas enzimas recombinantes, em particular enzimas recombinantes isoladas. Em certas modalidades, a DNA polimerase é produzida por técnicas recombinantes em uma célula hospedeira que não é, ou não é a partir de, um organismo que é o mesmo daquele do qual a DNA polimerase foi derivada.
[0064] As DNA polimerases da presente invenção podem ser geradas com uso da tecnologia de DNA recombinante. Alternativamente, um sistema de expressão livre de células pode ser usado para a produção da DNA polimerase. Alternativamente, as DNA polimerases da presente invenção podem ser geradas usando síntese química, de modo que a DNA polimerase seja gerada por alongamento gradual, um aminoácido de cada vez. Tais técnicas de síntese química (por exemplo, síntese em fase sólida) são bem conhecidas na química de proteínas.
[0065] Um outro aspecto da invenção fornece um método para produzir uma DNA polimerase da presente invenção compreendendo uma etapa de cultura das células hospedeiras da invenção. Os métodos preferenciais compreendem as etapas de (i) cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ou mais dos vetores de expressão recombinantes ou uma ou mais das moléculas de ácido nucleico da invenção em condições adequadas para a expressão da DNA polimerase ou proteína codificada; e opcionalmente (ii) isolamento ou obtenção da DNA polimerase ou proteína da célula hospedeira ou do meio de crescimento/sobrenadante. Tais métodos de produção também podem compreender uma etapa de purificação da DNA polimerase ou produto proteico e/ou formulação da polimerase ou produto de DNA em uma composição que inclui pelo menos um componente adicional, tal como um tampão ou veículo aceitável.
[0066] A DNA polimerase pode ser separada ou isolada das células hospedeiras/meio de cultura com uso de qualquer uma das técnicas de purificação para proteínas conhecidas na técnica e amplamente descritas na literatura ou qualquer combinação das mesmas. Tais técnicas podem incluir, por exemplo, precipitação, ultrafiltração, diálise, várias técnicas cromatográficas, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, eletroforese, centrifugação, etc. Conforme discutido acima, a DNA polimerase da invenção pode ser modificada para transportar motivos de aminoácidos ou outras etiquetas proteicas ou não proteicas, por exemplo etiquetas poli-histidina (por exemplo, etiqueta Hiss), para auxiliar no isolamento, solubilização e/ou purificação ou identificação.
[0067] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma DNA polimerase da invenção para polimerização de nucleotídeos (por exemplo, dNTP). Por conseguinte, as DNA polimerases da invenção podem ser usadas para estender uma cadeia de ácido nucleico (DNA) por um ou mais nucleotídeos.
[0068] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma DNA polimerase da invenção em uma reação de amplificação ou sequenciamento de ácido nucleico (DNA).
[0069] Em outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma DNA polimerase da invenção em um ensaio de farol molecular ou em um ensaio de deslocamento de cadeia, por exemplo, conforme descrito neste documento.
[0070] De preferência, nas utilizações e métodos da presente invenção, as DNA polimerases da presente invenção são utilizadas a uma temperatura constante, isto é, sem ciclagem térmica. Consequentemente, a utiização de DNA polimerases da invenção em reações isotérmicas é particularmente preferencial.
[0071] O uso de DNA polimerases da invenção em reações de amplificação isotérmica é particularmente preferencial. As reações isotérmicas são executadas a uma temperatura constante. Muitas técnicas de amplificação isotérmica são conhecidas na técnica e incluem Amplificação isotérmica mediada por laço (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) e amplificação cruzada de iniciador (CPA).
[0072] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de polimerização de nucleotídeos com uso de uma DNA polimerase da presente invenção. De preferência, o dito método compreende fornecer uma mistura de reação que compreende uma DNA polimerase da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico modelo, um iniciador oligonucleotídico que é capaz de hibridização com uma porção da molécula de ácido nucleico modelo e uma ou mais espécies de nucleotídeos (por exemplo, desoxinucleotídeo-trifosfatos, dNTPs) e incubar a dita mistura de reação sob condições em que os iniciadores oligonucleotídicos hibridiza com o molde de molécula de ácido nucleico e a dita DNA polimerase estende o dito iniciador oligonucleotídico por polimerização de um ou mais nucleotídeos. As condições adequadas são bem conhecidas na técnica. Preferencialmente, é usada uma temperatura constante e as temperaturas preferenciais são definidas alhures neste documento. Opcionalmente, a geração do produto polinucleotídico é detectada (por exemplo, por eletroforese em gel).
[0073] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de amplificação de um ácido nucleico (DNA) com uso de uma DNA polimerase da presente invenção. Tipicamente, o dito método compreende o fornecimento de uma mistura de reação que compreende uma DNA polimerase da presente invenção, uma molécula modelo de ácido nucleico, um iniciador (ou iniciadores) de oligonucleotídico (por exemplo, 2 ou mais iniciadores, tais como 2, 3, 4, 5 ou 6 iniciadores) que é capaz de hibridizar com uma porção da molécula de ácido nucleico molde e nucleotídeos (por exemplo, desoxinucleotídeo-trifosfatos, dNTPs) e incubar a referida mistura de reação sob condições em que o iniciador (ou iniciadores) de oligonucleotídeo hibridiza com a molécula de ácido nucleico molde e a dita DNA polimerase estende o dito iniciador (ou iniciadores) de oligonucleotídico polimerizando um ou mais nucleotídeos para gerar um polinucleotídeo. As condições adequadas são bem conhecidas na técnica. Métodos preferenciais de amplificação de ácido nucleico são os métodos de amplificação isotérmica. Métodos de amplificação isotérmica da invenção são executados a uma temperatura constante e as temperaturas preferenciais são definidas alhures neste documento. Opcionalmente, a geração do produto polinucleotídico é detectada (por exemplo, por eletroforese em gel).
[0074] Métodos exemplificativos de amplificação isotérmica incluem amplificação isotérmica mediada por laço (LAMP), amplificação de círculo rolante (RCA), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação de deslocamento múltiplo (MDA) e amplificação de iniciador cruzado (CPA).
[0075] Em algumas modalidades, particularmente aquelas que utilizam DNA polimerases com base na sequência de PB, a temperatura constante usada nos métodos e usos da presente invenção é uma temperatura baixa a moderada, por exemplo, é escolhida dentro da faixa de 0 ºC a cerca de 42 ºC, de preferência é escolhida dentro da faixa de cerca de 10 ºC a cerca de 40 ºC, ou cerca de 20 “C a cerca de 40 ºC, ou cerca de 25 ºC a cerca de 40 ºC, ou cerca de 30 “C a cerca de 40 ºC ou cerca de 35 ºC a cerca de 40 ºC, ou cerca de 37 ºC a cerca de 40 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura constante é escolhida dentro da faixa de cerca de 10 ºC a cerca de 15 ºC, ou cerca de 10 ºC a cerca de 20 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura constante é escolhida dentro da faixa de cerca de 10 ºC a cerca de 30 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura constante é escolhida dentro da faixa de cerca de 20 ºC a cerca de 30 *C. Em algumas modalidades, a temperatura constante é escolhida dentro da faixa de cerca de 10 ºC a cerca de 25 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura constante é escolhida dentro da faixa de cerca de 20 ºC a cerca de 25 ºC. É preferencial uma temperatura constante de cerca de 25 ºC. Em algumas modalidades, a temperatura constante é de 25 “ºC.
[0076] Com outras polimerases da invenção, por exemplo aquelas baseadas em sequências de organismos que são termofílicos, a temperatura constante pode ser de moderada a alta, por exemplo, é escolhida dentro da faixa de 25 ºC a 65 ºC, preferencialmente 40 ºC a 65 ºC.
[0077] Uma temperatura pode ser considerada constante quando nenhuma etapa ativa é tomada para modificar a temperatura durante a reação, por exemplo, nenhuma ciclagem térmica. Uma temperatura 'constante' ainda pode permitir flutuações de temperatura durante o método, por exemplo, até cerca de 5 ºC, normalmente não mais que 3 ºC ou 2ºC.
[0078] As DNA polimerases da presente invenção podem ser usadas em plataformas de diagnóstico molecular no ponto de atendimento.
[0079] As DNA polimerases da presente invenção podem ser usadas na amplificação total do genoma.
[0080] As DNA polimerases da presente invenção podem ser utilizadas em métodos de sequenciamento de próxima geração. As chamadas abordagens de sequenciamento de "próxima geração" ou "segunda geração" (em referência ao método de didesoxinucleotídeo de Sanger como a abordagem de "primeira geração") tornaram-se difundidas. Essas técnicas mais recentes são caracterizadas por altas taxas de transferência, por exemplo, como consequência do uso de paralelas, por exemplo, reações de sequenciamento massivamente paralelas ou por etapas menos demoradas. Vários métodos de sequenciamento de alto rendimento fornecem sequenciamento de molécula única e utilizam técnicas tais como pirossequenciamento, sequenciamento de terminador reversível, sequenciamento de sondas cliváveis por ligação, sequenciamento de sondas não cliváveis por ligação, nanoesferas de DNA e sequenciamento de moléculas únicas em tempo real.
[0081] As referências feitas neste documento às DNA polimerases da invenção abrangem fragmentos ativos, a menos que seja de outro modo claro a partir do contexto.
[0082] Os usos e métodos da presente invenção são tipicamente executados in vitro.
[0083] A presente invenção também fornece composições que compreendem uma DNA polimerase da invenção. Tais composições compreendem preferencialmente um tampão. Opcionalmente, as composições da presente invenção compreendem ainda um ou mais dos reagentes necessários para realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico (por exemplo, uma reação de amplificação isotérmica), por exemplo, iniciadores oligonucleotídicos capazes de hibridização com uma região do DNA modelo a ser amplificada e/ou nucleotídeos (por exemplo, dNTP's). Tipicamente, as composições serão aquosas e tamponadas com um tampão padrão, tais como Tris, HEPES, etc.
[0084] A invenção inclui ainda kits que compreendem uma ou mais das DNA polimerases da invenção, ou uma ou mais composições da invenção, ou uma ou mais das moléculas de ácido nucleico da invenção, ou um ou mais vetores de expressão da invenção, ou uma ou mais células hospedeiras ou vírus da invenção. Preferencialmente, os ditos kits são para uso nos métodos e usos conforme descritos neste documento, por exemplo, em métodos de amplificação de ácidos nucleicos, tais como reações de amplificação isotérmica. Preferencialmente, os ditos kits compreendem instruções para a utilização dos componentes do kit, por exemplo, para amplificação de ácidos nucleicos.
DIVULGADAS NESTE DOCUMENTO E IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA DAS MESMAS (SEQ ID NOs)
[0085] Todas as sequências nucleotídicas neste documento são citadas 5' a 3' de acordo com a convenção neste campo técnico.
[0086] SEQ ID NO: 1 - sequência de aminoácidos de uma região do domínio dos dedos da DNA polimerase | de um Psychrobacillus sp.
[0087] SEQ ID NO: 1
[0088] SEQ ID NO: 2 - sequência de aminoácidos da DNA polimerase truncada isolada de um Psychrobacillus sp. (PB).
[0089] SEQ ID NO: 2
SDGEKGYFAPADIAFQOSKDFCSWLENATNKKYLADSKATQAVSRKHNVNVHG VEFDLLLAAYIVNPAISSEDVAAIlAKEFGYFNLLTNDSVYGKGAKKTAPEIEKIAE
[0090] SEQ ID NO: 3 - sequência de ácido nucleico que codifica a sequência da DNA polimerase | da espécie Psychrobacillus da SEQ ID NO: 2.
[0091] SEQID NO: 3
[0092] SEQ ID NO: 4 - sequência de aminoácidos da DNA polimerase | de comprimento total isolada de um Psychrobacillus sp.
[0093] SEQID NO: 4
[0094] SEQ ID NO: 5 - sequência de ácido nucleico que codifica a sequência da DNA polimerase | da espécie Psychrobacillus da SEQ ID NO: 4.
[0095] SEQID NO: 5
[0096] As SEQ ID NOS: 6 a 10 são, como SEQ ID NO: 1, uma sequência de aminoácidos de uma região do domínio dos dedos da DNA polimerase | das espécies Bacillus C3 41*, Ureibacillus thermosphaericus, Bacillus — subtilis, Bacillus smithii e Geobacilus stearotherm-ophilus respectivamente (* = Bei et a/. 2005, Arch Microbiol, 186: 203 a 209; número de acesso ao Genbank DQ309765).
[0097] SEQID NO: 6
[0098] SEQ ID NO: 7
[0099] SEQ ID NO: 8
[0100] SEQID NO: 9
[0101] SEQ ID NO: 10
[0102] A SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos da DNA polimerase truncada isolada de Geobacillus stearothermophilus (Bst).
[0103] SEQ ID NO: 11 AKMAFTLADRVTEEMLADKAALVVEVVEENYHDAPIVG|
[0104] A SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos da DNA polimerase truncada isolada de Ureibacillus thermosphaericus (Ubts).
[0105] SEQ ID NO: 12
[0106] A SEQ ID NO: 13 é a sequência de ácido nucleico otimizada para códon (para expressão de E. coli) que codifica o mutante PB D422A.
[0107] SEQ ID NO: 13
[0108] SEQ ID NO: 14 - é a sequência de ácido nucleico otimizada por códon que codifica o mutante Bst D-A.
[0109] SEQ ID NO: 14
[0110] SEQ ID NO: 15- é a sequência de ácido nucleico otimizada por códon que codifica o mutante Ubts D>-A.
[0111] SEQ ID NO: 15
[0112] A invenção será agora descrita por meio de um Exemplo não limitativo com referência às figuras seguintes, nas quais:
[0113] A Figura 1 fornece a sequência de uma região dentro do domínio dos dedos da DNA polimerase | de várias espécies que podem ser modificadas de acordo com a presente invenção. O principal resíduo de ácido aspártico está em negrito.
[0114] A Figura 2 mostra uma visão geral da configuração do ensaio de atividade de deslocamento de cadeia. F = fluoróforo. Q = inibidor.
[0115] A Figura 3 mostra uma comparação da atividade de deslocamento de cadeia a 25 ºC de PB e do mutante PB D422A, bem como para várias enzimas comerciais, incluindo o fragmento Klenow (KF).
[0116] A Figura 4 mostra a atividade da polimerase de tipo selvagem e PB polimerase mutante em várias concentrações de NaCl e KCI (25 ºC).
[0117] A Figura 5 é um alinhamento de sequência das sequências de aminoácidos do tipo selvagem (truncadas) das DNA polimerases de PB, Bst e Ubts. A seta grande indica a posição 422 onde o Asp (D) é mutado para Ala (A). O alinhamento é produzido com uso de Clustal X2 e visualizado no servidor ESPript 3.0.
[0118] A Fiqura 6 mostra o efeito da mutação D422A na atividade de deslocamento de cadeia da polimerase | (Bst) de Bacillus stearothermophilus (fragmento grande) a 37 ºC na presença de 10 mM de KCl.
[0119] A Figura 7 mostra o efeito da mutação D422A na atividade de deslocamento de cadeia da polimerase | (Ubts) de Ureibacillus thermosphaericus (fragmento grande) a 37 “C na presença de 10 mM de KCI.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
CLONAGEM DE SEQUÊNCIAS PB POLIMERASE | TIPO SELVAGEM (FRAGMENTO GRANDE) E MUTANTE D422A
[0120] O gene (SEQ ID NO: 3) que codifica o fragmento grande de DNA polimerase | (isto é, omite o domínio de exonuclease 5'-3' da proteína) do Psychrobacillus sp. foi clonado no vetor pET151/D-TOPO?. A variante otimizada para códon também contendo a mutação D422A (SEQ ID NO: 13) foi clonada no vetor pET-11a. Em cada caso, o construto codificou um marcador Hiss no terminal N da polimerase, seguido pela sequência de reconhecimento da protease TEV, permitindo assim a clivagem do marcador.
BST POLIMERASE | (FRAGMENTO GRANDE) E UBTS POLIMERASE | (FRAGMENTO GRANDE) E MUTANTE D422A DAS MESMAS
[0121] Os genes otimizados por códon que codificam o fragmento grande de polimerase | de Geobacillus stearothermophilus (Bst) e Ureibacilus — thermosphaericus —(Ubts, número de acesso Genbank WP 016837139) foram adquiridos do serviço Invitrogen GeneArt Gene Synthesis disponível junto à Thermo Fisher Scientific. Os genes (SEQ ID NOS: 14 e 15) foram clonados no vetor pTrc99A que codifica uma etiqueta His: de N terminal por FastCloning (Li et a/. (2011), BMC Biotechnology, 11: 92). A mutação correspondente de Asp para Ala na posição 422 (fragmento grande de PB polimerase |) foi introduzida com uso do Kit de mutagênese direcionada ao sítio QuikChange Il (Agilent Technologies) e confirmada por análise de sequência.
PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PB POLIMERASE | TIPO SELVAGEM (FRAGMENTO GRANDE) E MUTANTE D422A
[0122] A produção recombinante de proteínas foi executada em células Rosetta 2 (DE3) (Novagenº). As células cresceram em meio Terrific Broth e a expressão gênica foi induzida a ODeoo nm 1,0 por adição de 0,1 mM de IPTG. A produção de proteínas foi efetuada 15 ºC por 6 a 8 h. Para purificação de proteínas, o sedimento de uma cultura de 1 | foi ressuspenso em 50 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol|, 5% de glicerol, pH 7,5, 0,15 mg/ml de lisozima, 1 comprimido de inibidor de protease (cOmplete”, Mini, EDTA livre de em inibidores de protease, Roche) e incubados em gelo por 30 minutos. A ruptura celular foi executada pela prensa francesa (1,37 kbar) e subsequentemente por sonicação com o VCX 750 disponível junto à Sonicsº (pulso 1,0/1,0, 5 minutos, amplitude 25%). Na primeira etapa, a parte solúvel da proteína marcada com Hiss presente após centrifugação (48.384 g, 45 minutos, 4 ºC) foi purificado por cromatografia de afinidade com Ni?* imobilizada. Após uma etapa de lavagem com 50 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 50 mM de imidazol, 5% de glicerol, pH 7,5, a proteína foi eluída a uma concentração de imidazol de 250 mM e posteriormente transferida para 50 mM de HEPES, 500 MM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 5% de glicerol, pH 7,5, utilizando uma coluna de dessalinização.
[0123] O segundo passo foi a clivagem do marcador pela protease TEV executada durante a noite a 4 ºC em 50 mM de Tris pH 8,0, 0,5 mM de EDTA e 1 mM de DTT. Para separar a proteína da protease de marcador His e TEV de marcador Hiss, uma segunda cromatografia de afinidade com Ni?* foi executada na terceira etapa, aplicando 50 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 5% de glicerol, pH 7,5. O quarto e último passo da purificação da proteína foi a cromatografia de exclusão por tamanho em um HiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare) em 50 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 5% de glicerol, pH 7,5. A solução proteica final foi concentrada e armazenada com 50% de glicerol a -20 ºC.
BST POLIMERASE | E UBTS POLIMERASE | (FRAGMENTO GRANDE) E MUTANTES D422A DAS MESMAS
[0124] A produção de proteínas recombinantes para a polimerase Bst e Ubts (fragmento grande) e mutante D422A das mesmas foi executada em células Rosetta 2 (DE3) (Novagenº). As células cresceram em meio Luria Bertani a 37 ºC e a expressão gênica foi induzida a ODeoo nm 0,5 por adição de 0,5 mM de IPTG. A produção de proteínas foi efetuada 37 ºC por 4 horas. Para purificação de proteínas, o pélete de uma cultura de 0,5 | foi ressuspenso em 50 mM de Tris, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10 mM de imidazol, 0,15 mg/ml de lisozima, 1 comprimido inibidor de protease (cOmplete'", Mini, Cocktail de Inibidor de Protease livre de EDTA, Roche) e incubado em gelo por 30 minutos. A ruptura das células foi executada por sonicação com o VCX 750 disponível junto à Sonicsº (pulso 1,0/1,0, 15 min, amplitude 25%). A parte solúvel da proteína marcada com Hiss presente após centrifugação (48.384 g, 45 minutos, 4 ºC) foi purificada por cromatografia de afinidade com Ni?* imobilizado. Após um passo de lavagem com 50 mM de Tris, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10 mM de imidazol, a proteína foi eluída com um aumento gradual do imidazol para 500 MM. As frações contendo a proteína foram coletadas e a troca de tampão foi executada para 20 mM de Tris pH 7,1, 100 mM de KCl, 2 mM de DTT, 0,2 mM de EDTA e 0,2 Triton X-100 por dessalinização. A solução proteica final foi concentrada e armazenada com 50% de glicerol a -20 ºC.
[0125] O ensaio de atividade da polimerase é baseado em um ensaio molecular de farol (modificado de Summerer (2008), Methods Mol. Biol.; 429: 225 a 235). O modelo de farol molecular consiste em um laço de 23mero que é conectado por uma região de haste de 8mero rica em GC (a sequência é indicada em itálico) e uma extensão de 43mero 3'. Devido à estrutura de haste-laço, as moléculas FAM (doador) e Dabcy| (aceitador, inibidor não fluorescente) estão próximas e, assim, o sinal de fluorescência da FAM é inibido. Após a extensão do iniciador pela DNA polimerase, a haste é aberta e o aumento na distância dos dois corantes é medido pela restauração da fluorescência de FAM como unidades de fluorescência relativa em intervalos de tempo apropriados, excitando a 485 nm e registrando a emissão a 518 nm. À medição foi executada em um leitor de microplacas SpectraMaxº M2º (Molecular Devices).
[0126] modelo de farol molecular
[0127] 5- GGCCCGTP?PY'AGGAGGAAAGGACATCTTCTAGCATMPAMACGGGCCGTCAAG TTCATG GCCAGTCAAGTCGTCAGAAATTTCGCACCAC -3' (SEQ ID NO: 16)
[0128] iniciador
[0129] 5“- GTGGTGCGAAATTTCTGAC -3' (SEQ ID NO: 17)
[0130] O substrato do farol molecular foi produzido pela incubação de 20 ul de modelo de farol molecular de 10 uM e iniciador de 15 UM em 10 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de NaCl por 5 minutos a 95 ºC. À reação foi então deixada esfriar em temperatura ambiente por 2 horas. A solução de substrato foi armazenada a -20 ºC com uma concentração final de 10 uM.
CONFIGURAÇÃO DO ENSAIO PARA ANALISAR O EFEITO DE DIFERENTES [SAIS] NA ATIVIDADE DA POLIMERASE DE PB E PB D422A
[0131] As reações de cinquenta microlitros consistiram em 200 nM de substrato e 200 uM de dNTP (quantidades equimolares de dATP, dGTP, dCTP e dTTP). A reação continha ainda 5 mM de MgCl2 em 50 mM de Bis-Tris propano, a pH 8,5, 1 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA e 2% de glicerol. A concentração final de sal no tampão de reação foi ajustada para 25 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 110 mM, 160 mM e 210 mM de
NaCl ou KCI para PB e 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM e 200 mM de NaCl ou KCI para PB D422A. O ensaio de atividade foi efetuado a 25 ºC em placas de ensaio de fluorescência pretas de 96 poços (Corningº). A reação foi iniciada por adição de solução proteica, isto é, adição de polimerase.
[0132] Os resultados são mostrados na Figura 4.
CONFIGURAÇÃO DO ENSAIO PARA ANALISAR A ATIVIDADE ESPECÍFICA DA POLIMERASE DE PB E PB D422A EM 100 MM 150 MM E 200 MM DE NACL
[0133] As reações de cinquenta microlitros consistiram em 200 nM de substrato e 200 uM de dNTP (quantidades equimolares de dATP, dGTP, dCTP e dTTP). A reação continha ainda 5 mM de MgCl2 em 50 mM de Bis-Tris propano, a pH 8,5, 1 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA e 2% de glicerol. A concentração final de sal no tampão de reação foi ajustada para 100 mM, 150 mM e 200 mM de NaCl, respectivamente. O ensaio foi efetuado a 25 ºC em placas de ensaio de fluorescência pretas de 96 poços (Corningº). A reação foi iniciada por adição de solução proteica, isto é, adição de polimerase.
[0134] Os resultados são mostrados na Tabela 3 (no final do Exemplo).
[0135] Uma visão geral da configuração do ensaio é mostrada na Figura 2. O ensaio é baseado em um aumento no sinal de fluorescência que é medido após o deslocamento da cadeia repórter inibida que só é possível através da atividade de deslocamento da cadeia da DNA polimerase.
[0136] O substrato para o ensaio de atividade de deslocamento de cadeia consiste em um iniciador "frio" de 19 oligonucleotídeos (SEQ ID NO: 18) e uma cadeia repórter consistindo em 20 oligonucleotídeos que são rotulados com o fluoróforo TAMRA (F) na extremidade 3' da mesma (SEQ ID NO: 19). A cadeia modelo consiste em 40 oligonucleotídeos e é marcada com o Black Hole Quencher 2 (BHQ2) na extremidade 5' da mesma (SEQ ID NO: 20). Os iniciadores são emparelhados com a cadeia modelo deixando um espaço de um nucleotídeo na posição 20 na cadeia modelo. As etiquetas estão próximas e, então, o fluoróforo TAMRA é inibido pelo BHQ2. Após a atividade de deslocamento da cadeia da DNA polimerase |, o oligonucleotídeo marcado com TAMRA é deslocado da cadeia molde. Como consequência, o fluoróforo e o inibidor não estão mais próximos e um aumento na fluorescência TAMRA pode ser medido como unidades de fluorescência relativa em intervalos de tempo apropriados (excitação 525 nm, emissão 598 nm, SpectraMaxº M2º Microplate Reader (Molecular Devices)). 5" = TATCCACCAATACTACCCT CGATACTTTGTCCACTCAAT[TAMRA] -3' 3" - ATAGGTGGTTATGATGGGATGCTATGAAACAGGTGAGTTA[BHQ2] -5'
[0137] O substrato para o ensaio da atividade de deslocamento de cadeia foi produzido incubando 20 ul de 10 uM de iniciador "frio", 10 uM de cadeia repórter e 10 uM de cadeia modelo em 10 mM de Tris- HCI pH 8,0, 100 mM de NaCl a 95 ºC por 5 minutos. A reação foi então deixada esfriar à temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de substrato foi armazenada a -20 ºC com uma concentração final de 10 uM.
CONFIGURAÇÃO DO ENSAIO PARA COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE ESPECÍFICA DE DESLOCAMENTO DE CADEIA DE PB, PB D422A
[0138] As reações de cinquenta microlitros consistiram em 200 nM de substrato e 200 uM de dNTP (quantidades equimolares de dATP, dGTP, dCTP e dTTP). Para PB polimerase | a reação continha ainda 5 mM de MgCl,z em 50 mM de Bis-Tris propano, a pH 8,5, 100 mM de NaCl, 1 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA e 2% de glicerol. Para a polimerase comercialmente conhecida foi usado o tampão de reação respectivo fornecido pela New England Biolabs. A concentração final de sal no tampão de reação foi ajustada para 100 mM de acordo com o sal ideal para as respectivas polimerases. O ensaio de atividade foi efetuado a 25 ºC em placas de ensaio de fluorescência pretas de 96 poços (Corningº). A reação foi iniciada pela adição de solução de proteína (isto é, adição de polimerase).
[0139] Os resultados são mostrados na Figura 3.
CONFIGURAÇÃO DO ENSAIO PARA ATIVIDADE ESPECÍFICA DE DESLOCAMENTO DE CADEIA DE PB E PB D422A A 100 MM, 150 MM E 200 MM DE NACL
[0140] As reações de cinquenta microlitros consistiram em 200 nM de substrato e 200 UM de dNTP (quantidades equimolares de dATP, dGTP, dCTP e dTTP). A reação continha ainda 5 mM de MgCl2 em 50 mM de Bis-Tris propano, a pH 8,5, 1 mM de DTT, 0,2 mg/ml de BSA e 2% de glicerol. A concentração final de sal no tampão de reação foi ajustada para 100 mM, 150 mM e 200 mM de NaCl, respectivamente. O ensaio foi efetuado a 25 ºC em placas de ensaio de fluorescência pretas de 96 poços (Corningº). A reação foi iniciada por adição de solução proteica, isto é, adição de polimerase.
[0141] Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo.
CONFIGURAÇÃO DO ENSAIO PARA ANALISAR A ATIVIDADE DE DESLOCAMENTO DE CADEIA DE BST/BSTD422A E UBTS/UBTSD422A
[0142] As reações de cinquenta microlitros consistiram em 200 nM de substrato e 200 uM de dNTP (quantidades equimolares de dATP, dGTP, dCTP e dTTP). A reação continha adicionalmente mM de Tris pH 7,9 (a 25º), 10 mM de KCl, 10 mM de (NHa)2SO,4, 2 mM de MgSO:, 0,1% de Triton X-100.
[0143] O ensaio foi realizado a 37 ºC em placas de ensaio de fluorescência pretas de 96 poços (Corningº). A reação foi iniciada pela adição de solução de proteína (20 ng para Bst e BstD422A, 100 ng para Ubts e UbtsD422A), isto é, adição de polimerase. Para determinação da atividade específica de deslocamento de cadeia (mMRFU/min/ug) em um KCI mais alto, a concentração final foi ajustada para 150 mM de KCI. O aumento na fluorescência do TAMRA foi medido como unidades de fluorescência relativa em intervalos de tempo apropriados, excitando a 525 nm e registrando a emissão a 598 nm. À medição foi executada em um leitor de microplacas SpectraMaxº M2º (Molecular Devices).
[0144] Os resultados baseados neste ensaio de atividade de deslocamento de cadeia são mostrados nas Figuras 6 e 7 e na Tabela 4 abaixo. Todas as enzimas mutantes mostram atividade aprimorada.
TABELAS TABELA 1. RESUMO DE DIFERENTES PROPRIEDADES ENZIMÁTICAS PARA WTPB E O MUTANTE D422A (A 25 ºC).
Variante Atividade — de | Atividade de | Tm MgChl Nac! pH deslocamento | polimerase KCl de cadeia (100 | (100 mM de (> 80% de atividade) mM de NaCl Nac! 40 a 200 mM selvagem 25a 115 mM TABELA 2. ATIVIDADE DE DESLOCAMENTO DE CADEIA DO MUTANTE PB D422A EM COMPARAÇÃO COM WTPB NA PRESENÇA DE 100 A 200 MM DE NACL.
ENE Atividade [mMRFUMming] O vv wIPB = | PBDA2A —|Razão(PBD422AWIPB) |
TABELA 3. ATIVIDADE DE DNA POLIMERASE DO MUTANTE PB D422A EM COMPARAÇÃO COM WT PB EM PESO NA PRESENÇA DE 100 A 200 MM DE NACL. Atividade de polimerase NaCl [mM Atividade [MRFU/min/ug NNE | wtPB PBD422A Razão (PB D422A/wtPB 1,42E+06 1,66E+06 150 1,02E+06 1,50E+06 0,55E+06 1,37E+06 TABELA 4. ATIVIDADE DE DESLOCAMENTO DE CADEIA DOS MUTANTES D422A DE BST E UBTS EM COMPARAÇÃO COM ENZIMAS WT NA PRESENÇA DE 150 MM DE KCL. [SDA (mRFU/minaa) O PSDA (mRFUMInvt) BstD422A/Bst UbtsD422A/Ubts EXEMPLO 2
[0145] Psychrobacillus sp. adicional Os mutantes de DNA polimerase (PB) também foram produzidos e testados:
[0146] A mutação correspondente de Asp para Ser, Lys, Val, Leu e Asn, respectivamente, na posição 422 foi introduzida com uso do Kit de mutagênese direcionada ao sítio QuikChange II (Agilent Technologies).
[0147] D422V e D422L (resíduos hidrofóbicos de diferentes comprimentos),
[0148] D422S (hidrofílico pequeno),
[0149] D422N (hidrofílico maior) e
[0150] D422K (carregado positivamente).
[0151] O ponto de partida foi o DNA do plasmídeo do mutante D422A. As mutações foram confimadas por análise de sequenciamento.
[0152] A produção recombinante de proteínas foi executada em células Rosetta 2 (DE3) (Novagenº). As células cresceram em meio Terrific Broth e a expressão gênica foi induzida a ODeoo nm 1,0 por adição de 0,1 mM de IPTG. A produção de proteínas foi efetuada 15 ºC por 6 a 8 h. Para purificação de proteínas, o sedimento de um cultivo de 50 ml foi ressuspenso em 1 ml de 50 MM de HEPES, 500 mM de NaCl, 10 mM de imidazol, 5% de glicerol, PH 7,5, 0,15 mg/ml de lisozima e incubado em gelo por 20 minutos. A ruptura das células foi executada por sonicação com o VCX 750 disponível junto à Sonicsº (pulso 1,0/1,0, 1 minuto, amplitude 20%).
[0153] A parte solúvel da proteína marcada com Hiss presente após a centrifugação (16000 g, 30 minutos, 4 ºC) foi purificada com esferas magnéticas PureProteome'Y (Millipore) e eluída em 50 ul de 50 mM de HEPES, 500 mM de NaCl, 500 mM de imidazol|, 5% de glicerol, pH 7,5.
[0154] O ensaio de deslocamento de cadeia foi executado conforme descrito no Exemplo 1.
[0155] Todos esses outros mutantes executaram melhor em ensaios de atividade de deslocamento de cadeia (dados não mostrados) em comparação com a wt PB polimerase, mas não tão bem quanto o mutante PB D422A.
Claims (26)
1. DNA polimerase caracterizada pelo fato de que inclui a sequência de SEQ ID NO. 1 ou uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à mesma, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 da SEQ ID NO. 1, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
2. DNA polimerase, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 88% idêntica à SEQ ID NO. 1, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 da SEQ ID NO. 1, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
3. DNA polimerase, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 ou 10, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 18 de cada sequência foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
4. DNA polimerase caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 2, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO. 2, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
5. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 2, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO. 2, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 2, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
6. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO. 4, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 719 da SEQ ID NO. 4, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
7. DNA polimerase caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 11 ou 12, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 60% idêntica à SEQ ID NO. 11 ou 12, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 11, ou 12, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
8. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO. 11 ou 12, mas em que o resíduo de ácido aspártico na posição 422 da SEQ ID NO. 11 ou 12, ou o resíduo de ácido aspártico equivalente em outras sequências, foi substituído por um resíduo de aminoácido não carregado negativamente.
9. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o dito resíduo de ácido aspártico foi substituído por um resíduo de alanina.
10. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita DNA polimerase é caracterizada pelo fato de que tem pelo menos 30% de atividade de deslocamento de cadeia maior do que uma DNA polimerase com exatamente a mesma sequência, mas com o ácido aspártico na posição 18 ou 422, relativamente à SEQ ID NO: 1 ou 2, respectivamente, ou na posição equivalente em outras sequências.
11. DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que em uma faixa de concentração de 20 mM a 200 mM de NaCl ou KCI ou uma mistura dos mesmos, a dita DNA polimerase exibe pelo menos 40% de atividade máxima da mesma da polimerase.
12. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, e um tampão.
13. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
14. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 70% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 13, 14 ou
15.
15. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que contém uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição e tradução da sequência de proteína codificada pela dita molécula de ácido nucleico.
16. Célula hospedeira ou vírus caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais vetores de expressão, de acordo com a reivindicação 15, ou uma ou mais moléculas de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13 ou 14.
17. Método para produzir uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) cultivar uma célula hospedeira que compreende um ou mais dos vetores de expressão recombinantes, de acordo com a reivindicação ou uma ou mais das moléculas de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, sob condições adequadas para a expressão da DNA polimerase codificada; e opcionalmente (ii) isolar ou obter a DNA polimerase a partir da célula hospedeira ou do meio de crescimento ou sobrenadante.
18. Uso de uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a polimerização de nucleotídeos.
19. Uso de uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é em uma reação de amplificação ou sequenciamento de ácido nucleico.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a dita DNA polimerase é usada a uma temperatura constante.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a dita reação é uma reação isotérmica de amplificação de ácidos nucleicos.
22. Método de polimerização de nucleotídeos com uso de uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer uma mistura de reação que compreende uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, uma molécula de ácido nucleico modelo, um iniciador de oligonucleotídeo que é capaz de hibridização com uma porção da molécula de ácido nucleico modelo e uma ou mais espécies de nucleotídeo; e (ii) incubar a dita mistura de reação sob condições em que o iniciador oligonucleotídeo hibridiza com a molécula de ácido nucleico modelo e a dita DNA polimerase estende o dito iniciador oligonucleotídeo polimerizando um ou mais nucleotídeos.
23. Método para amplificar um ácido nucleico com uso de uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende: (i) fornecer uma mistura de reação que compreende uma DNA polimerase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, uma molécula de ácido nucleico modelo, um iniciador oligonucleotídeo que é capaz (ou iniciadores oligonucleotídeos que são capazes) de hibridização com uma porção da molécula de ácido nucleico modelo e nucleotídeos; e (ii) incubar a dita mistura de reação sob condições em que o iniciador oligonucleotídico hibridiza (ou os iniciadores oligonucleotídicos hibridizam) com a molécula de ácido nucleico modelo e a dita DNA polimerase estende o dito iniciador oligonucleotídico (ou os ditos iniciadores oligonucleotídicos) polimerizando um ou mais nucleotídeos para gerar um polinucleotídeo.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que é executado a uma temperatura constante.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 20, ou método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dita temperatura constante é escolhida dentro da faixa de O Ca 42 'C.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, ou método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dita temperatura constante é escolhida dentro da faixa de 10 ºC a 25 ºC.
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