JP2003507072A - 耐塩性を改善した、Ｅ６８１にアミノ酸置換を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびその同族体 - Google Patents
耐塩性を改善した、Ｅ６８１にアミノ酸置換を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびその同族体Info
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼと比較して、シグナルの均一性の実質的改善を生ずるＥ４１０Ｒ置換を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。当該ＤＮＡポリメラーゼは、耐塩性の改善が見られ、配列決定反応中に正味の陽性荷電または正味の陰性荷電を有するターミネーターの組み込みの修飾が見られる。
Description
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、３５ＵＳＣ§１１９(ｅ)に基づく１９９９年８月２１日出願の米国
仮出願番号６０／１５０，１６７および１９９９年９月１７日出願の米国仮出願
番号６０／１５４，７３９(これらはすべて引用により本明細書に加える)の優先
権を主張する。
仮出願番号６０／１５０，１６７および１９９９年９月１７日出願の米国仮出願
番号６０／１５４，７３９(これらはすべて引用により本明細書に加える)の優先
権を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本開示は、効力および効率を改善した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関する。
特に、本ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定反応物中で用いるとき、Ｔａｑ
Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼと比較してシグナルの
均一性の実質的改善が見られる。
特に、本ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定反応物中で用いるとき、Ｔａｑ
Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼと比較してシグナルの
均一性の実質的改善が見られる。
【０００３】
背景技術
ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応(“ＰＣＲ”)による核酸増幅、
自己維持配列複製(self-sustained sequence replication)(“３ＳＲ”)、およ
び高温ＤＮＡ配列決定(high temperature DNA sequencing)のような多くの組換
えＤＮＡ技術に有用な酵素である。熱安定性ポリメラーゼが特に有用である。熱
によりポリメラーゼ活性が破壊されないため、変性ステップごとに更なるポリメ
ラーゼを加える必要がない。
自己維持配列複製(self-sustained sequence replication)(“３ＳＲ”)、およ
び高温ＤＮＡ配列決定(high temperature DNA sequencing)のような多くの組換
えＤＮＡ技術に有用な酵素である。熱安定性ポリメラーゼが特に有用である。熱
によりポリメラーゼ活性が破壊されないため、変性ステップごとに更なるポリメ
ラーゼを加える必要がない。
【０００４】
天然に存在するＤＮＡポリメラーゼは、非標識ヌクレオチドを、相当する標識
ヌクレオチドよりもポリヌクレオチド中へ優先的に組み込む。蛍光性標識ヌクレ
オチドを識別するこのＤＮＡポリメラーゼの能力は、標識ヌクレオチドの酵素学
的添加を必要とする多くの分子生物学的手法、例えば標識ジデオキシターミネー
ターシーケンシングにおいて望ましくない効果を有していた。不明瞭な配列決定
は、不釣合いな数の標識および非標識ジデオキシターミネーターおよびヌクレオ
チドから生ずる。キャピラリー電気泳動配列決定ユニットから得られる電気泳動
図において、この現象は、むらのあるピークとして見られる。多量の組み込まれ
た標識ｄｄＮＴＰに起因する大きなシグナル(幅の広いピークとして見られる)は
、より小さなシグナルを不明瞭にし、不明瞭な配列決定を生ずる。加えて、現在
利用可能な多くの酵素が、高い塩環境下で感受性である。
ヌクレオチドよりもポリヌクレオチド中へ優先的に組み込む。蛍光性標識ヌクレ
オチドを識別するこのＤＮＡポリメラーゼの能力は、標識ヌクレオチドの酵素学
的添加を必要とする多くの分子生物学的手法、例えば標識ジデオキシターミネー
ターシーケンシングにおいて望ましくない効果を有していた。不明瞭な配列決定
は、不釣合いな数の標識および非標識ジデオキシターミネーターおよびヌクレオ
チドから生ずる。キャピラリー電気泳動配列決定ユニットから得られる電気泳動
図において、この現象は、むらのあるピークとして見られる。多量の組み込まれ
た標識ｄｄＮＴＰに起因する大きなシグナル(幅の広いピークとして見られる)は
、より小さなシグナルを不明瞭にし、不明瞭な配列決定を生ずる。加えて、現在
利用可能な多くの酵素が、高い塩環境下で感受性である。
【０００５】
そのため、識別性を改善し(そのためシグナルの均一性が改善する)および高い
塩条件に対する耐性を増加する、改善ＤＮＡポリメラーゼの存在が今も必要とさ
れている。これらおよび他の関連事項を以下でより詳細に取り扱う。
塩条件に対する耐性を増加する、改善ＤＮＡポリメラーゼの存在が今も必要とさ
れている。これらおよび他の関連事項を以下でより詳細に取り扱う。
【０００６】
本発明の簡単な要旨
本開示は、図２または３に示すアミノ酸配列を含む、精製組換え熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼを提供する。本開示はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする単離核酸(この場合、当該核酸は、図２または３に示すヌクレオチド配列
からなる)、ならびに当該核酸を含む組換えＤＮＡベクター、および当該ベクタ
ーで形質転換された組換え宿主細胞を提供する。本開示はまた、正味の陰性荷電
または正味の陽性荷電を有する少なくとも１つの鎖終結試薬および１以上のヌク
レオチドトリホスフェートの存在下ＤＮＡポリメラーゼで配列決定するＤＮＡか
ら鎖終結フラグメントを生ずるステップ、および当該フラグメントの大きさから
当該ＤＮＡの配列を決定するステップを含むＤＮＡを配列決定する方法を提供す
る。本開示はまた、ＤＮＡポリメラーゼ、および正味の陰性荷電または正味の陽
性荷電を有する核酸ターミネーターを含むＤＮＡを配列決定するキットを提供す
る。
Ａポリメラーゼを提供する。本開示はまた、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコー
ドする単離核酸(この場合、当該核酸は、図２または３に示すヌクレオチド配列
からなる)、ならびに当該核酸を含む組換えＤＮＡベクター、および当該ベクタ
ーで形質転換された組換え宿主細胞を提供する。本開示はまた、正味の陰性荷電
または正味の陽性荷電を有する少なくとも１つの鎖終結試薬および１以上のヌク
レオチドトリホスフェートの存在下ＤＮＡポリメラーゼで配列決定するＤＮＡか
ら鎖終結フラグメントを生ずるステップ、および当該フラグメントの大きさから
当該ＤＮＡの配列を決定するステップを含むＤＮＡを配列決定する方法を提供す
る。本開示はまた、ＤＮＡポリメラーゼ、および正味の陰性荷電または正味の陽
性荷電を有する核酸ターミネーターを含むＤＮＡを配列決定するキットを提供す
る。
【０００７】
詳細な説明
本開示の１つの目的は、蛍光色素ＤＮＡ配列決定における色素ターミネーター
組み込みの均一性の増大である。１つの重要なＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細
菌Thermus aquaticusから単離のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そのアミノ
酸配列は図１に示している。全長の酵素はトランケートされ、５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性がなくなっており、タンパク質分解および熱処理に対しより安
定なポリペプチドを提供する。トランケート酵素は、ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２
Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼとして知られており、Thermo Sequenase(登
録商標)ＤＮＡポリメラーゼとしてAmersham Pharmacia Biotechから商業的に入
手可能である。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼ
中の１位(アミノ酸Ｍｅｔ)は、全長Ｔａｑポリメラーゼの２７２位に相当する。
本開示で使用する番号付けはＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡ
ポリメラーゼのものであって、Ｔａｑポリメラーゼのものではない点に注意すべ
きである。
組み込みの均一性の増大である。１つの重要なＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細
菌Thermus aquaticusから単離のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、そのアミノ
酸配列は図１に示している。全長の酵素はトランケートされ、５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性がなくなっており、タンパク質分解および熱処理に対しより安
定なポリペプチドを提供する。トランケート酵素は、ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２
Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼとして知られており、Thermo Sequenase(登
録商標)ＤＮＡポリメラーゼとしてAmersham Pharmacia Biotechから商業的に入
手可能である。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼ
中の１位(アミノ酸Ｍｅｔ)は、全長Ｔａｑポリメラーゼの２７２位に相当する。
本開示で使用する番号付けはＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡ
ポリメラーゼのものであって、Ｔａｑポリメラーゼのものではない点に注意すべ
きである。
【０００８】
単一のアミノ酸置換をＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙポリメラーゼ
に導入した。これらの置換は、Ｅ３４４Ｑ、Ｉ３６７Ｖ、Ｆ３６７Ｙ、Ｅ４１６
ＫおよびＥ４１０Ｒとして設計した。各置換ポリメラーゼを発現させ、精製し、
そしてシグナル均一性による評価として、蛍光性塩基配列の研究において色素タ
ーミネーター組み込みの均一性を分析した。Ｅ４１０Ｒ置換では、ＴａｑΔ２７
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼと比較してシグナルの均一性
の実質的改善という結果が見られた。
に導入した。これらの置換は、Ｅ３４４Ｑ、Ｉ３６７Ｖ、Ｆ３６７Ｙ、Ｅ４１６
ＫおよびＥ４１０Ｒとして設計した。各置換ポリメラーゼを発現させ、精製し、
そしてシグナル均一性による評価として、蛍光性塩基配列の研究において色素タ
ーミネーター組み込みの均一性を分析した。Ｅ４１０Ｒ置換では、ＴａｑΔ２７
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼと比較してシグナルの均一性
の実質的改善という結果が見られた。
【０００９】
本明細書で開示のＤＮＡポリメラーゼは、正味の陽性荷電または正味の陰性荷
電を有するターミネーターを用いる配列決定反応物に特に適当である。驚くべき
ことに、本ＤＮＡポリメラーゼでは、配列決定反応の間のターミネーターの組み
込みの修飾が見られた。例えば図１４を参照。更に、その核酸ターミネーター(
相当する核酸ターミネーター分解産物と共に)は、配列決定反応産物とは異なる
速さで分離媒体中を移動し、改善された配列決定データが得られる。これらの核
酸ターミネーターはまた、分離媒体に核酸配列反応物を直接負荷することができ
る。この目的を達成するため、陰性荷電部分または陽性荷電部分をターミネータ
ー分子に結合させる。その荷電部分を含む非反応性または分解性ターミネーター
は、ＤＮＡ配列決定産物よりも速く移動するか(陰性荷電)、またはＤＮＡ配列決
定産物とは逆方向に移動する(陽性荷電)。
電を有するターミネーターを用いる配列決定反応物に特に適当である。驚くべき
ことに、本ＤＮＡポリメラーゼでは、配列決定反応の間のターミネーターの組み
込みの修飾が見られた。例えば図１４を参照。更に、その核酸ターミネーター(
相当する核酸ターミネーター分解産物と共に)は、配列決定反応産物とは異なる
速さで分離媒体中を移動し、改善された配列決定データが得られる。これらの核
酸ターミネーターはまた、分離媒体に核酸配列反応物を直接負荷することができ
る。この目的を達成するため、陰性荷電部分または陽性荷電部分をターミネータ
ー分子に結合させる。その荷電部分を含む非反応性または分解性ターミネーター
は、ＤＮＡ配列決定産物よりも速く移動するか(陰性荷電)、またはＤＮＡ配列決
定産物とは逆方向に移動する(陽性荷電)。
【００１０】
例えば、図１５に示す構造は、荷電部分がターミネーターに結合し得る可能性
のある部位を示す。図１５についていうと、塩基には、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃまたは７
−デアザプリン、イノシン、ユニバーサル塩基のような類似体が含まれ得る。糖
には、フラノース、ヘキソース、モノ−ジ−トリホスフェート、モルホリン、ジ
デヒドロ、ジデオキシリボース、デオキシリボースが含まれ得る。リンカーには
、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓおよびハロゲンを含む１−１００原子、好ましくは２−５
０原子を含み得る。移動性変更因子(Mobility modifier)には、全体および分解
物の電気泳動の易動性を変化させる荷電種、例えば、α−スルホ−β−アラニン
、システイン酸、スルホン酸、カルボン酸、リン酸、リン酸ジエステル、ホスホ
ネート、アミン、第四級アミン(quaternised amines)、およびホスホニウムが含
まれ得る。移動性変更因子には、互いに共有結合する多数のこれらのユニットが
含まれ得る。標識には、放射性同位体、電気化学的タグ、蛍光性タグ、エネルギ
ー転移(ＥＴ)標識、マススペクトロメトリータグ、ラマンタグ、ハプテン、化学
ルミネセンス群、酵素、クロモホア、および２以上の標識が含まれ得る。標識は
また、荷電していてもよく、例えば、Ｃｙ５．５、ビス−スルホン酸化カルボキ
シフルオレセイン、または荷電部分に結合した色素、例えば、システイン酸に結
合したカルボキシフルオレセインもしくは類似の荷電種である。これらおよび他
の化合物を作成する方法は、１９９８年８月３１日出願の米国仮特許出願番号６
０／０９８，４６９および１９９８年２月４日出願の米国特許出願番号９０／０
１８，６９５、および１９９８年４月２日出願のＰＣＴ／ＧＢ９８／００９７８
（１９９８年１０月８日に公開されている）に開示されている。各出願の開示は
引用により本明細書に加える。
のある部位を示す。図１５についていうと、塩基には、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃまたは７
−デアザプリン、イノシン、ユニバーサル塩基のような類似体が含まれ得る。糖
には、フラノース、ヘキソース、モノ−ジ−トリホスフェート、モルホリン、ジ
デヒドロ、ジデオキシリボース、デオキシリボースが含まれ得る。リンカーには
、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｓおよびハロゲンを含む１−１００原子、好ましくは２−５
０原子を含み得る。移動性変更因子(Mobility modifier)には、全体および分解
物の電気泳動の易動性を変化させる荷電種、例えば、α−スルホ−β−アラニン
、システイン酸、スルホン酸、カルボン酸、リン酸、リン酸ジエステル、ホスホ
ネート、アミン、第四級アミン(quaternised amines)、およびホスホニウムが含
まれ得る。移動性変更因子には、互いに共有結合する多数のこれらのユニットが
含まれ得る。標識には、放射性同位体、電気化学的タグ、蛍光性タグ、エネルギ
ー転移(ＥＴ)標識、マススペクトロメトリータグ、ラマンタグ、ハプテン、化学
ルミネセンス群、酵素、クロモホア、および２以上の標識が含まれ得る。標識は
また、荷電していてもよく、例えば、Ｃｙ５．５、ビス−スルホン酸化カルボキ
シフルオレセイン、または荷電部分に結合した色素、例えば、システイン酸に結
合したカルボキシフルオレセインもしくは類似の荷電種である。これらおよび他
の化合物を作成する方法は、１９９８年８月３１日出願の米国仮特許出願番号６
０／０９８，４６９および１９９８年２月４日出願の米国特許出願番号９０／０
１８，６９５、および１９９８年４月２日出願のＰＣＴ／ＧＢ９８／００９７８
（１９９８年１０月８日に公開されている）に開示されている。各出願の開示は
引用により本明細書に加える。
【００１１】
以下の実施例は本発明の目的を解説するのみに用い、添付の請求の範囲を限定
するという意味に用いるものでは全くない。
するという意味に用いるものでは全くない。
【００１２】
実施例
実施例１
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼの構成、
発現および精製を以下に述べる。上記のように名付けた他の置換体は、同様の方
法で構成され、発現され、精製した。
発現および精製を以下に述べる。上記のように名付けた他の置換体は、同様の方
法で構成され、発現され、精製した。
【００１３】
構成
プライマーBamHIFOR(5'ccg ctt ggg cag agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc g
ag ga)およびNheIREV(5'tcg taa ggg atg gct agc cgc tgg gag agg cgg tgg gc
c gac)を標準のＰＣＲ反応に用い、pREFY2pref(ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／
Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼをクローニングした)中のBamHIおよびNheI制限
酵素部位間の領域を増幅した。プライマーBamHIFORは、BamHI制限酵素部位を含
み、その部位は、pREFY2pref中の同じ特有部位に相当するものであり、プライマ
ーNheIREVは、NheI制限酵素部位を含み、その部位は、pREFY2pref中の同じ特有
部位に相当するものである。加えて、プライマーNheIREVは、４１０位のコドン
をｇａｇ(アミノ酸Ｅ、グルタミン酸をコードする)からｃｇｇ(アミノ酸Ｒ、ア
ルギニン)に変えるように設計した。ＰＣＲ産物を適当な酵素で消化し、アガロ
ース電気泳動で単離した。pREFY2prefのBamHI/NheI消化から生ずる大きなフラグ
メントがまた、ゲル精製され、上記ＰＣＲフラグメントに連結した。E. coliへ
の形質転換後、プラスミドＤＮＡを単離し、その後に塩基配列を決定し、Ｅ４１
０Ｒ置換の存在を確認した。Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４
１０Ｒ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を図２に示す。
ag ga)およびNheIREV(5'tcg taa ggg atg gct agc cgc tgg gag agg cgg tgg gc
c gac)を標準のＰＣＲ反応に用い、pREFY2pref(ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／
Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼをクローニングした)中のBamHIおよびNheI制限
酵素部位間の領域を増幅した。プライマーBamHIFORは、BamHI制限酵素部位を含
み、その部位は、pREFY2pref中の同じ特有部位に相当するものであり、プライマ
ーNheIREVは、NheI制限酵素部位を含み、その部位は、pREFY2pref中の同じ特有
部位に相当するものである。加えて、プライマーNheIREVは、４１０位のコドン
をｇａｇ(アミノ酸Ｅ、グルタミン酸をコードする)からｃｇｇ(アミノ酸Ｒ、ア
ルギニン)に変えるように設計した。ＰＣＲ産物を適当な酵素で消化し、アガロ
ース電気泳動で単離した。pREFY2prefのBamHI/NheI消化から生ずる大きなフラグ
メントがまた、ゲル精製され、上記ＰＣＲフラグメントに連結した。E. coliへ
の形質転換後、プラスミドＤＮＡを単離し、その後に塩基配列を決定し、Ｅ４１
０Ｒ置換の存在を確認した。Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４
１０Ｒ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を図２に示す。
【００１４】
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼの発現およ
び精製 ラムダｐＬプロモーターを保持するベクターｐＲＥ２を、熱不安定性リプレッ
サータンパク質ｃＩ８５７を有するE. coli株と共に用い、ＴａｑΔ２７１／Ｆ
２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼを発現した。この組み合わせに
より、３０℃での培養が可能となり、４２℃のような高い温度でのプラスミド産
生タンパク質の発現が可能となる。液体培養を典型的には３０℃で行い、ＯＤ６ ００ で〜１．０とし、次いで、〜２．５時間４２℃に移した。細菌細胞を遠心分
離により回収し、溶菌緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.5、1 mM EDTA、0.1% Tween-
20、0.1% Triton X-100、10 mM MgCl2および16 mM (NH4)2SO4)で再懸濁し、次い
で、８０℃で２０分間加熱し、E. coliタンパク質を沈殿させた。この熱処理ラ
イゼートを遠心分離により、透明にし300 mM NaClを添加し、ＤＥ５２陰イオン
交換カラム(Whatmanから商業的に入手可能)に適用した。フロースルーを緩衝液
Ａ(50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA、10%グリセロール、0.1 % Triton X-100
および0.1 % Tween-20)で希釈し、ＮａＣｌ濃度を100 mMにまで減少させ、ヘパ
リンセファロースカラム(Pharmacia Inc.より商業的に入手可能)に適用した。当
該カラムを、緩衝液Ａ中、100から700 mM NaClへ直線勾配により変化させた。当
該酵素は〜250mM NaClで溶出した。ポリメラーゼ活性を含むフラクションをプー
ルし、Centriprep-50装置(Amiconから商業的に入手可能)で濃縮し、20 mM Tris-
HCl pH 8.5、50%グリセロール、0.1 mM EDTA、0.5% Tween-20、0.5% Triton X-1
00、100 mM KC1および1 mM DTTを含む最終緩衝液で大量に透析した。ポリメラー
ゼ調製物の純度をSDS-PAGEで確認した。
び精製 ラムダｐＬプロモーターを保持するベクターｐＲＥ２を、熱不安定性リプレッ
サータンパク質ｃＩ８５７を有するE. coli株と共に用い、ＴａｑΔ２７１／Ｆ
２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼを発現した。この組み合わせに
より、３０℃での培養が可能となり、４２℃のような高い温度でのプラスミド産
生タンパク質の発現が可能となる。液体培養を典型的には３０℃で行い、ＯＤ６ ００ で〜１．０とし、次いで、〜２．５時間４２℃に移した。細菌細胞を遠心分
離により回収し、溶菌緩衝液(50 mM Tris-HCl pH 8.5、1 mM EDTA、0.1% Tween-
20、0.1% Triton X-100、10 mM MgCl2および16 mM (NH4)2SO4)で再懸濁し、次い
で、８０℃で２０分間加熱し、E. coliタンパク質を沈殿させた。この熱処理ラ
イゼートを遠心分離により、透明にし300 mM NaClを添加し、ＤＥ５２陰イオン
交換カラム(Whatmanから商業的に入手可能)に適用した。フロースルーを緩衝液
Ａ(50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA、10%グリセロール、0.1 % Triton X-100
および0.1 % Tween-20)で希釈し、ＮａＣｌ濃度を100 mMにまで減少させ、ヘパ
リンセファロースカラム(Pharmacia Inc.より商業的に入手可能)に適用した。当
該カラムを、緩衝液Ａ中、100から700 mM NaClへ直線勾配により変化させた。当
該酵素は〜250mM NaClで溶出した。ポリメラーゼ活性を含むフラクションをプー
ルし、Centriprep-50装置(Amiconから商業的に入手可能)で濃縮し、20 mM Tris-
HCl pH 8.5、50%グリセロール、0.1 mM EDTA、0.5% Tween-20、0.5% Triton X-1
00、100 mM KC1および1 mM DTTを含む最終緩衝液で大量に透析した。ポリメラー
ゼ調製物の純度をSDS-PAGEで確認した。
【００１５】
酵素の特性解析
１)耐塩性：
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒ ＤＮＡポリメラーゼ
活性を、基質として活性化サケ精子ＤＮＡおよびプライム化したＭ１３ ＤＮＡ
の両方を用いることによりＫＣｌ滴定実験のもと試験した。両方のアッセイにお
いて、ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ Ｅ４１０Ｒは、ＫＣｌ濃度を0
から200 mMに上昇させると、ポリメラーゼ活性が低下した。しかし、酵素は、か
なり活性が低くなり、ＴＳと比較すると減少している。図４は、基質として活性
化サケ精子ＤＮＡを用いるＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７ＹおよびＴａ
ｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲのＫＣｌ滴定からのデータを
プロットする。活性化サケ精子またはプライム化Ｍ１３ＤＮＡによる、ＴａｑΔ
２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼ活性の５０％ＫＣｌ
阻害は、それぞれ１２０ｍＭおよび１００ｍＭであり、ＴＳと比べると、３５ｍ
Ｍの５０％ＫＣｌ阻害を有している。ポリメラーゼアッセイ緩衝液は、25mM TAP
S(pH9.3)、2mM MgCl2、1mM ２−メルカプトエタノールおよび0.05Ci/mmol[α-33 P]-dATPを加えた200mMの各dNTPを含む。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７
Ｙとその置換体との耐塩性データの比較は以下の表１に示す。
活性を、基質として活性化サケ精子ＤＮＡおよびプライム化したＭ１３ ＤＮＡ
の両方を用いることによりＫＣｌ滴定実験のもと試験した。両方のアッセイにお
いて、ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ Ｅ４１０Ｒは、ＫＣｌ濃度を0
から200 mMに上昇させると、ポリメラーゼ活性が低下した。しかし、酵素は、か
なり活性が低くなり、ＴＳと比較すると減少している。図４は、基質として活性
化サケ精子ＤＮＡを用いるＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７ＹおよびＴａ
ｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲのＫＣｌ滴定からのデータを
プロットする。活性化サケ精子またはプライム化Ｍ１３ＤＮＡによる、ＴａｑΔ
２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒポリメラーゼ活性の５０％ＫＣｌ
阻害は、それぞれ１２０ｍＭおよび１００ｍＭであり、ＴＳと比べると、３５ｍ
Ｍの５０％ＫＣｌ阻害を有している。ポリメラーゼアッセイ緩衝液は、25mM TAP
S(pH9.3)、2mM MgCl2、1mM ２−メルカプトエタノールおよび0.05Ci/mmol[α-33 P]-dATPを加えた200mMの各dNTPを含む。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７
Ｙとその置換体との耐塩性データの比較は以下の表１に示す。
【表１】
【００１６】
２)９５℃での熱安定性
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒの熱安定性を以下のよ
うにアッセイする。最初に、９５℃加熱ステップを、50mM Tris-HCl pH9.5、5mM
MgCl2、50μM 各dNTPおよび100ng Ｍ１３一本鎖ＤＮＡを含む緩衝液中で行った
。次いで、酵素１０ユニットを上記溶液に混合し、アリコート(それぞれ２０μ
ｌ)を採取し氷上に置くことにより、時間経過を見た。次に、希釈は、10mM Tris
-HCl pH8.0、1mM ２−メルカプトエタノール、0.5%Tween-20、0.5%Nonidet P-40
を含む緩衝液中で行った。３番目のステップでは、50mM KClを含むことを以外は
セクション(１)に記載の標準的ポリメラーゼアッセイ条件の下、過熱し希釈した
サンプルについて残存ポリメラーゼ活性をアッセイした。図５は、ＴａｑΔ２７
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲとAmplitaqを比較する熱安定性アッセ
イを示す。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲおよびAmplit
aqの９５℃の５０％阻害時間はそれぞれ２５分間および８分間である。
うにアッセイする。最初に、９５℃加熱ステップを、50mM Tris-HCl pH9.5、5mM
MgCl2、50μM 各dNTPおよび100ng Ｍ１３一本鎖ＤＮＡを含む緩衝液中で行った
。次いで、酵素１０ユニットを上記溶液に混合し、アリコート(それぞれ２０μ
ｌ)を採取し氷上に置くことにより、時間経過を見た。次に、希釈は、10mM Tris
-HCl pH8.0、1mM ２−メルカプトエタノール、0.5%Tween-20、0.5%Nonidet P-40
を含む緩衝液中で行った。３番目のステップでは、50mM KClを含むことを以外は
セクション(１)に記載の標準的ポリメラーゼアッセイ条件の下、過熱し希釈した
サンプルについて残存ポリメラーゼ活性をアッセイした。図５は、ＴａｑΔ２７
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲとAmplitaqを比較する熱安定性アッセ
イを示す。ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０ＲおよびAmplit
aqの９５℃の５０％阻害時間はそれぞれ２５分間および８分間である。
【００１７】
３)プロセシビティーアッセイ：
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒのプロセシビティーは
、ポリメラーゼ活性が単一の酵素結合イベントでアッセイされることを確認する
酵素希釈法で調べた。アッセイ緩衝液には、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９
．５)、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ各ｄＮＴＰおよび１μｇＰ３３標識
プライム化Ｍ１３を含む。当該プライマー伸張実験は、６５℃で９０秒間行った
。当該サンプルは８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素配列決定ゲルで分析した。
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒは、ポリメラーゼ結合イ
ベントあたり約３０ヌクレオチドの増加プロセシビティーを有する。これは、Ｔ
ａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙと比較して７〜８倍の増加である(４ｎ
ｔ／結合イベント)。
、ポリメラーゼ活性が単一の酵素結合イベントでアッセイされることを確認する
酵素希釈法で調べた。アッセイ緩衝液には、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９
．５)、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ各ｄＮＴＰおよび１μｇＰ３３標識
プライム化Ｍ１３を含む。当該プライマー伸張実験は、６５℃で９０秒間行った
。当該サンプルは８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素配列決定ゲルで分析した。
ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒは、ポリメラーゼ結合イ
ベントあたり約３０ヌクレオチドの増加プロセシビティーを有する。これは、Ｔ
ａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙと比較して７〜８倍の増加である(４ｎ
ｔ／結合イベント)。
【００１８】
４)均一な終結イベント：
発明である新しいＥからＲへのアミノ酸修飾からはまた、正味の陽性、陰性ま
たは中性の荷電ジデオキシヌクレオチドターミネーターを含む配列決定反応の間
に終結イベントの均一性の増加という結果を得ている。これは、電気泳動図バン
ドの強度の均一性を増加し、配列あたりにベースコール(basedcall)され得る塩
基の数を増加する。例えば、図６に示すように、Thermosequenase Version IIを
用いるバンド強度の平均偏差は約３０％偏差である。しかし、図７に示すように
、ＥからＲへ変化させたポリメラーゼを用いる典型的な結果は約２２％偏差であ
る。この改善は有意である。図６および７の一部をこの比較目的のために図８か
ら１０に拡大して表示する。
たは中性の荷電ジデオキシヌクレオチドターミネーターを含む配列決定反応の間
に終結イベントの均一性の増加という結果を得ている。これは、電気泳動図バン
ドの強度の均一性を増加し、配列あたりにベースコール(basedcall)され得る塩
基の数を増加する。例えば、図６に示すように、Thermosequenase Version IIを
用いるバンド強度の平均偏差は約３０％偏差である。しかし、図７に示すように
、ＥからＲへ変化させたポリメラーゼを用いる典型的な結果は約２２％偏差であ
る。この改善は有意である。図６および７の一部をこの比較目的のために図８か
ら１０に拡大して表示する。
【００１９】
５)困難な領域の配列決定能
発明である新しいＥからＲへのアミノ酸修飾からはまた、“配列決定が困難な
”領域を含むＤＮＡの配列決定をする能力の改善という結果を得ている。一定の
特異的ＤＮＡ配列は、配列決定するＤＮＡポリメラーゼ問題を生じる可能性が極
めて高く、得られた配列の質を低下する(図１１参照)。驚くべきことに、Ｅから
Ｒへの修飾を含む酵素は、領域の配列決定のこれらの困難性を含むＤＮＡからよ
り高い質の配列データを生ずる可能性が高い(図１２参照)。
”領域を含むＤＮＡの配列決定をする能力の改善という結果を得ている。一定の
特異的ＤＮＡ配列は、配列決定するＤＮＡポリメラーゼ問題を生じる可能性が極
めて高く、得られた配列の質を低下する(図１１参照)。驚くべきことに、Ｅから
Ｒへの修飾を含む酵素は、領域の配列決定のこれらの困難性を含むＤＮＡからよ
り高い質の配列データを生ずる可能性が高い(図１２参照)。
【００２０】
実施例２：ＴＡＱ Ｄ１８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙポリメラーゼ
我々はまた、上記標準的技術を用い、以下の置換：Ｄ１８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ
６６７Ｙを有するＴａｑ ポリメラーゼの全長型を構成した。この酵素では、Ｄ
１８Ａ置換体は、Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラー
ゼポリペプチドのようなアミノ酸の欠損よりも、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性が除かれている。Ｅ６８１Ｒ置換は、Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６
６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼのＥ４１０Ｒに同等の位置であり、Ｆ６６７Ｙは、
Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼのＦ３９６Ｙに
同等な位置である。この酵素はまた、色素ターミネーターを用いる配列決定に望
ましい性質を有する。Ｔａｑ Ｄ１８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸配列を図３に示す。
６６７Ｙを有するＴａｑ ポリメラーゼの全長型を構成した。この酵素では、Ｄ
１８Ａ置換体は、Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラー
ゼポリペプチドのようなアミノ酸の欠損よりも、５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性が除かれている。Ｅ６８１Ｒ置換は、Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６
６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼのＥ４１０Ｒに同等の位置であり、Ｆ６６７Ｙは、
Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼのＦ３９６Ｙに
同等な位置である。この酵素はまた、色素ターミネーターを用いる配列決定に望
ましい性質を有する。Ｔａｑ Ｄ１８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメ
ラーゼのアミノ酸配列を図３に示す。
【００２１】
陽性ターミネーター反応の均一性は、以下の表IIのデータにより示される通り
、Ｅ６８１での置換により相当改善される。
、Ｅ６８１での置換により相当改善される。
【表２】
表II
【００２２】
二乗平均(“r.m.s.”)は、４色配列反応の均一性の値である。この実験は、陽
性ターミネーター(リンカーの５リシン)および標準配列決定反応条件を用いた。
０．５２から０．４５未満への改善は、配列決定反応の均一性において有意な増
加を示す。
性ターミネーター(リンカーの５リシン)および標準配列決定反応条件を用いた。
０．５２から０．４５未満への改善は、配列決定反応の均一性において有意な増
加を示す。
【００２３】
図１３は、各電気泳動図の左側に記載したように種々のＥ６８１置換体を有す
るＤ１８Ａ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う４色配列決定反応か
ら得られた電気泳動図を並べて比較したものである。図１３に示すように、Ｄ１
８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙは、最も均一なピークの高さを示し、そのため、
均一性が最も改善されている。
るＤ１８Ａ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う４色配列決定反応か
ら得られた電気泳動図を並べて比較したものである。図１３に示すように、Ｄ１
８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙは、最も均一なピークの高さを示し、そのため、
均一性が最も改善されている。
【００２４】
図１４は、Ｄ１８Ａ／Ｆ６６７Ｙおよびその種々のＥ６８１置換体を種々の荷
電ターミネーターと共に用いる４色配列決定反応で証明される、非標識ｄｄＮＴ
Ｐと比較した相対的反応性を示す。
電ターミネーターと共に用いる４色配列決定反応で証明される、非標識ｄｄＮＴ
Ｐと比較した相対的反応性を示す。
【００２５】
核酸ターミネーター
１．直接負荷に適用するときの荷電修飾レポーターの例
１．１ ケミストリー
以下の概要を用い、荷電レポーター部分で標識ｄｄＮＴＰを合成した。当該リ
ンカーを、１９９８年８月３１日出願の米国仮特許出願番号６０／０９８，４６
９(それらの開示すべてを引用により本明細書に加える)に開示の方法に従い合成
した。
ンカーを、１９９８年８月３１日出願の米国仮特許出願番号６０／０９８，４６
９(それらの開示すべてを引用により本明細書に加える)に開示の方法に従い合成
した。
【化１】
【００２６】
１．２ 考察
４'，５'ビス−スルホノ−５−カルボキシフルオレセイン(ＢＳＦＡＭ)を、４
−プロパギルアミノ−Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニンに、Ｄ
ＭＦ／ジイソプロピルエチルアミン中のＴＳＴＵを用い相当するＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド活性化エステルの初期形成により、結合させた。活性時間は、典
型的にはｔｌｃの観察では１５分間であり、その後、アミノ成分を添加した。産
物１をＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣで単離し次いで正味のトリフルオロ酢酸で処理し、
カルバメート部分を取り除き、産物２をＥｔ２Ｏ沈殿で単離した。ローダミン部
分の結合は、ＤＭＳＯ／ジイソプロピルエチルアミン中の５−ローダミンヒドロ
キシスクシンイミド活性化エステルを用い行った。すべての二重色素カセットを
、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後、開示の方法(および１９９８年８月３１日出
願の米国仮出願番号６０／０９８，４６９に開示のような方法、その開示はすべ
て引用により本発明に加える)を用いアルキルアミノｄｄＮＴＰに結合させた。
標識ｄｄＮＴＰを、シリカゲルクロマトグラフィー、その後、イオン交換クロマ
トグラフィー、次いで逆相ＨＰＬＣで精製した。
−プロパギルアミノ−Ｎ−α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニンに、Ｄ
ＭＦ／ジイソプロピルエチルアミン中のＴＳＴＵを用い相当するＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド活性化エステルの初期形成により、結合させた。活性時間は、典
型的にはｔｌｃの観察では１５分間であり、その後、アミノ成分を添加した。産
物１をＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣで単離し次いで正味のトリフルオロ酢酸で処理し、
カルバメート部分を取り除き、産物２をＥｔ２Ｏ沈殿で単離した。ローダミン部
分の結合は、ＤＭＳＯ／ジイソプロピルエチルアミン中の５−ローダミンヒドロ
キシスクシンイミド活性化エステルを用い行った。すべての二重色素カセットを
、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後、開示の方法(および１９９８年８月３１日出
願の米国仮出願番号６０／０９８，４６９に開示のような方法、その開示はすべ
て引用により本発明に加える)を用いアルキルアミノｄｄＮＴＰに結合させた。
標識ｄｄＮＴＰを、シリカゲルクロマトグラフィー、その後、イオン交換クロマ
トグラフィー、次いで逆相ＨＰＬＣで精製した。
【００２７】
１．３ 実験
化学薬品はすべて、特記しなければSigma、Aldrich、FlukaまたはFisher Scie
ntificから購入した。ＵＶ／可視スペクトルをWinlab(登録商標)ソフトウェアと
組み合わせてPerkin Elmer Lambda ２０ＵＶ／可視スペクトロフォトメーターに
記録した。
ntificから購入した。ＵＶ／可視スペクトルをWinlab(登録商標)ソフトウェアと
組み合わせてPerkin Elmer Lambda ２０ＵＶ／可視スペクトロフォトメーターに
記録した。
【００２８】
４−(プロパギルアミド−４'，５'−ビススルフォネートフルオレセイン)−Ｎ−
α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン（１） ４'，５'ビス−スルホノ−５−カルボキシフルオレセイン(１００ｍｇ、０．
１８ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(４ｍｌ)に溶解し、次いでジイソプロピルエチルアミン(
０．４８ｍｍｏｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(６５ｍｇ、１．２当量)を加えた
。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いでプロパギルアミノ−Ｎ−α−ｔ−ブ
トキシカルボニルフェニルアラニン(６９ｍｇ、１．０当量)を加えた。攪拌を３
時間継続し、次いで反応混合物を真空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物を逆
相ＨＰＬＣ(Ｃ１８、DeltaPak １５μ、１００Ａ、５０×３００μｍ)で単離し
、０−１００％の溶出液Ｂで６０分間に渡り溶出させた(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ
、Ｂ＝５０％ ＭｅＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＢ ｖ／ｖ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)。当
該産物(保持時間３７分間)を真空で乾燥するまで蒸発させ、次いで、ＭｅＯＨ(
３×１０ｍｌ)で共蒸発(coevaporate)し、その後、凍結乾燥した(１００ｍｇ、
６５％)。ＵＶ／可視(１Ｍ トリエチルアンモニウムビカルボネート ｐＨ８．８
)４９５ｎｍ(２４６７０)、４６５ｎｍ(ショルダー、９６３４)、３１２ｎｍ(６
７０８)。
α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン（１） ４'，５'ビス−スルホノ−５−カルボキシフルオレセイン(１００ｍｇ、０．
１８ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(４ｍｌ)に溶解し、次いでジイソプロピルエチルアミン(
０．４８ｍｍｏｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(６５ｍｇ、１．２当量)を加えた
。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いでプロパギルアミノ−Ｎ−α−ｔ−ブ
トキシカルボニルフェニルアラニン(６９ｍｇ、１．０当量)を加えた。攪拌を３
時間継続し、次いで反応混合物を真空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物を逆
相ＨＰＬＣ(Ｃ１８、DeltaPak １５μ、１００Ａ、５０×３００μｍ)で単離し
、０−１００％の溶出液Ｂで６０分間に渡り溶出させた(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ
、Ｂ＝５０％ ＭｅＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＢ ｖ／ｖ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)。当
該産物(保持時間３７分間)を真空で乾燥するまで蒸発させ、次いで、ＭｅＯＨ(
３×１０ｍｌ)で共蒸発(coevaporate)し、その後、凍結乾燥した(１００ｍｇ、
６５％)。ＵＶ／可視(１Ｍ トリエチルアンモニウムビカルボネート ｐＨ８．８
)４９５ｎｍ(２４６７０)、４６５ｎｍ(ショルダー、９６３４)、３１２ｎｍ(６
７０８)。
【００２９】
４−(プロパギルアミド−４'，５'−ビススルフォネートフルオレセイン)−フェ
ニルアラニン−α−アンモニウムトリフルオロ酢酸(２) ４−(プロパギルアミド−４'，５'−ビススルフォネートフルオレセイン)−Ｎ
−α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン(１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏ
ｌ)をトリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)で１５分間処理し、次いで真空で乾燥するま
で蒸発させた。当該残渣をトルエン(３×１０ｍｌ)で共蒸発させ、次いで当該産
物をＥｔ２Ｏ(５０ｍｌ)を加えることにより沈殿させた。形成された固体を濾過
で回収し、冷Ｅｔ２Ｏ(３×５０ｍｌ)で洗浄し、次いで高真空のもと乾燥させた
(１００ｍｇ、９９％)。Ｒｆ(ｔｌｃ、ｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ(６：３
：１)＝０
ニルアラニン−α−アンモニウムトリフルオロ酢酸(２) ４−(プロパギルアミド−４'，５'−ビススルフォネートフルオレセイン)−Ｎ
−α−ｔ−ブトキシカルボニルフェニルアラニン(１００ｍｇ、０．１２ｍｍｏ
ｌ)をトリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)で１５分間処理し、次いで真空で乾燥するま
で蒸発させた。当該残渣をトルエン(３×１０ｍｌ)で共蒸発させ、次いで当該産
物をＥｔ２Ｏ(５０ｍｌ)を加えることにより沈殿させた。形成された固体を濾過
で回収し、冷Ｅｔ２Ｏ(３×５０ｍｌ)で洗浄し、次いで高真空のもと乾燥させた
(１００ｍｇ、９９％)。Ｒｆ(ｔｌｃ、ｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ(６：３
：１)＝０
【００３０】
ローダミン色素を２に結合する一般的方法(３)
４−(プロパギルアミド−４'，５'−ビススルフォネートフルオレセイン)−フ
ェニルアラニン−α−アンモニウムトリフルオロ酢酸２(０．１ｍｍｏｌ)をＤＭ
ＳＯ(１ｍｌ)中に溶解し、次いでジイソプロピルエチレンアミン(０．２６ｍｌ
、１５当量)およびローダミン−ＮＨＳ活性エステル(１．５当量)を加えた。反
応混合物を室温１６時間攪拌し、次いで真空で乾燥するまで蒸発させた。Ｒ１１
０類似体をトリエチルアンモニウムビカルボネート溶液(０．１Ｍ、５０ｍｌ)で
１６時間処理し、トリフルオロアセトイミド保護基を取り除き、次いで産物を特
記しない限り１と同一条件を用いＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。保持時間(ＢＳＦ
ＡＭ／Ｒ１１０＝３１分間、ＢＳＦＡＭ／Ｒ１１０＝５５分間 ９０分間に渡り
０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、ＢＳＦＡＭ／ＲＥＧ ５４分間 ９０分間
にわたり０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、ＢＳＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ＝５２
分間 ９０分間に渡り０−１００％Ｂ)。すべての吸収スペクトルから両色素の存
在が見られる。
ェニルアラニン−α−アンモニウムトリフルオロ酢酸２(０．１ｍｍｏｌ)をＤＭ
ＳＯ(１ｍｌ)中に溶解し、次いでジイソプロピルエチレンアミン(０．２６ｍｌ
、１５当量)およびローダミン−ＮＨＳ活性エステル(１．５当量)を加えた。反
応混合物を室温１６時間攪拌し、次いで真空で乾燥するまで蒸発させた。Ｒ１１
０類似体をトリエチルアンモニウムビカルボネート溶液(０．１Ｍ、５０ｍｌ)で
１６時間処理し、トリフルオロアセトイミド保護基を取り除き、次いで産物を特
記しない限り１と同一条件を用いＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。保持時間(ＢＳＦ
ＡＭ／Ｒ１１０＝３１分間、ＢＳＦＡＭ／Ｒ１１０＝５５分間 ９０分間に渡り
０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、ＢＳＦＡＭ／ＲＥＧ ５４分間 ９０分間
にわたり０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、ＢＳＦＡＭ／ＴＡＭＲＡ＝５２
分間 ９０分間に渡り０−１００％Ｂ)。すべての吸収スペクトルから両色素の存
在が見られる。
【００３１】
アルキルアミノ−２'，３'−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェートへの３の
結合の一般的方法 二重色素カセット(１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)中に溶解し、次いでジスクシ
ンイミジルカルボネート(４当量)およびＤＭＡＰ(４当量)を−６０℃で加えた。
当該反応混合物を−３０℃で１５分間攪拌し、次いでアミノアルキル−ｄｄＮＴ
Ｐ(０．６７当量、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．５)溶液を加えた。当
該反応物を室温で１時間攪拌し、次いでＳｉＯ２ゲルカラムに直接適用した。当
該産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ(４：５：１ ｖ：ｖ：ｖ)で溶出し、
次いで真空で乾燥するまで蒸発させ、その後１のようにイオン交換クロマトグラ
フィー次いでＣ１８逆相ＨＰＬＣにより精製した。各化合物の吸収スペクトルは
両方の色素の存在を示した。
結合の一般的方法 二重色素カセット(１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)中に溶解し、次いでジスクシ
ンイミジルカルボネート(４当量)およびＤＭＡＰ(４当量)を−６０℃で加えた。
当該反応混合物を−３０℃で１５分間攪拌し、次いでアミノアルキル−ｄｄＮＴ
Ｐ(０．６７当量、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．５)溶液を加えた。当
該反応物を室温で１時間攪拌し、次いでＳｉＯ２ゲルカラムに直接適用した。当
該産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏ(４：５：１ ｖ：ｖ：ｖ)で溶出し、
次いで真空で乾燥するまで蒸発させ、その後１のようにイオン交換クロマトグラ
フィー次いでＣ１８逆相ＨＰＬＣにより精製した。各化合物の吸収スペクトルは
両方の色素の存在を示した。
【００３２】
１．４ 電気泳動図の比較
上記の形成されたターミネーターの１つ(構造４、ローダミン＝５−ＲＯＸお
よびＮ＝Ｃ)を配列決定反応に用い、スラブゲルに流す(run)。得られた電気泳動
図を図１６に示し、それは、通常のＥＴターミネーターの移動速度と比べた、非
組み込みビススルフォネート化フルオレセインエネルギー転移ターミネーター(
および熱分解したその産物)の配列産物に関連する移動速度の増加の例である。
よびＮ＝Ｃ)を配列決定反応に用い、スラブゲルに流す(run)。得られた電気泳動
図を図１６に示し、それは、通常のＥＴターミネーターの移動速度と比べた、非
組み込みビススルフォネート化フルオレセインエネルギー転移ターミネーター(
および熱分解したその産物)の配列産物に関連する移動速度の増加の例である。
【００３３】
２． 直接負荷を適用するときの陰性荷電リンカーアームの例
２．１ 背景
多数の荷電アミノ酸を蛍光レポーターに組み込むことにより、配列決定反応に
おいて観察される分解性副産物の移動を変化させる余剰陰性荷電を含む標識ｄｄ
ＮＴＰを合成することが可能である。
おいて観察される分解性副産物の移動を変化させる余剰陰性荷電を含む標識ｄｄ
ＮＴＰを合成することが可能である。
【００３４】
２．２ ケミストリー
色のついた副産物をシーケンスラダーから取り除くことが必要な陰性荷電量を
決定するため、フルオレセインをα−スルホ−β−アラニンに結合させ、５を形
成した。化合物５を１１−ｄｄＣＴＰに結合させ(１１＝リンカーアームの原子
の数)、７を形成した。５の一部を第二のα−スルホ−β−アラニン部分に結合
させ６を形成し、その後、１１−ｄｄＣＴＰに結合させ８を形成した。１１−ｄ
ｄＣＴＰに結合する通常のＦＡＭを含む対照ｄｄＮＴＰもまた合成された。構成
物は単一色配列決定反応に付され、移動易動性に対する荷電の効果が測定された
。
決定するため、フルオレセインをα−スルホ−β−アラニンに結合させ、５を形
成した。化合物５を１１−ｄｄＣＴＰに結合させ(１１＝リンカーアームの原子
の数)、７を形成した。５の一部を第二のα−スルホ−β−アラニン部分に結合
させ６を形成し、その後、１１−ｄｄＣＴＰに結合させ８を形成した。１１−ｄ
ｄＣＴＰに結合する通常のＦＡＭを含む対照ｄｄＮＴＰもまた合成された。構成
物は単一色配列決定反応に付され、移動易動性に対する荷電の効果が測定された
。
【００３５】
【化２】
フルオレセインは正味１−荷電(1-charge)を保有するため、化合物７は全体的
に２−リンカーアームとしてみなされ、化合物８は全体的に３−リンカーアーム
荷電(3-linker arm charge)を有する。
に２−リンカーアームとしてみなされ、化合物８は全体的に３−リンカーアーム
荷電(3-linker arm charge)を有する。
【００３６】
２．３ 実験
Ｎ−５−カルボキサミドフルオレセイン−α−スルホ−β−アラニン(５)
α−スルホ−β−アラニン(５９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(２ｍｌ)中
に溶解させ、次いでジイソプロピルエチルアミン(０．９ｍｏｌ、１５当量)を加
え、その後、５−ＦＡＭ−ＮＨＳ活性エステル(２００ｍｇ、１．２当量)を加え
た。当該反応混合物を室温で３時間攪拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残
渣をＭｅＯＨ(１０ｍｌ)で共蒸発(coevaporate)させ、次いで、９０分間渡り１
００ｍｌ／ｍｉｎで０−１００％Ｂで溶出するＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１
Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、５０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ)により産物が単
離される 1H nmr (300MHz, CD30D); 1.27 (t, 24H, J=8.4Hz, NCH2CH3), 3.05 (
q, 16H, J=8.4Hz, NCH2CH3), 3.95-4.05 (m, 3H, CH2+CHS03), 6.58 (m, 3H, Ar
-H), 6.85 (d, 2H, J=1l.OHz, Ar-H), 7.30 (d, 2H, J=1l.OHz, Ar-H), 8.02 (d
, 1H, J=7.6Hz, ArH), 8.45 (s, 1 H, Ar-H)。
に溶解させ、次いでジイソプロピルエチルアミン(０．９ｍｏｌ、１５当量)を加
え、その後、５−ＦＡＭ−ＮＨＳ活性エステル(２００ｍｇ、１．２当量)を加え
た。当該反応混合物を室温で３時間攪拌し、真空で乾燥するまで蒸発させた。残
渣をＭｅＯＨ(１０ｍｌ)で共蒸発(coevaporate)させ、次いで、９０分間渡り１
００ｍｌ／ｍｉｎで０−１００％Ｂで溶出するＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１
Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、５０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ)により産物が単
離される 1H nmr (300MHz, CD30D); 1.27 (t, 24H, J=8.4Hz, NCH2CH3), 3.05 (
q, 16H, J=8.4Hz, NCH2CH3), 3.95-4.05 (m, 3H, CH2+CHS03), 6.58 (m, 3H, Ar
-H), 6.85 (d, 2H, J=1l.OHz, Ar-H), 7.30 (d, 2H, J=1l.OHz, Ar-H), 8.02 (d
, 1H, J=7.6Hz, ArH), 8.45 (s, 1 H, Ar-H)。
【００３７】
Ｎ−(Ｎ−５−カルボキサミドフルオレセイン−α−スルホ−β−アラニン)アミ
ド−α−スルホ−β−アラニン(６) Ｎ−５−カルボキサミドフルオレセイン−α−スルホ−β−アラニン(５、５
０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(３ｍｌ)中に溶解し、次いでジイソプロ
ピルエチルアミン(０．２５ｍｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(４２ｍｇ、１．５
当量)を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いでα−スルホ−β−ア
ラニン(２４ｍｇ、１．５当量)を加えた。攪拌を３時間続け、次いで反応物を真
空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物をイオン交換クロマトグラフィー(mono-
Q カラム、Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、４０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ、Ｂ＝１．０Ｍ Ｔ
ＥＡＢ、４０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ、２２分間に渡り０−５０％Ｂ、２２−５０分
間に渡り５０−７５％Ｂ、５０−７０分間に渡り７５−１００％Ｂ、４ｍｌ／ｍ
ｉｎ、保持時間＝７５−８０分間)、次いでＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ
ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮ ５０％ｖ／ｖ、９０分間に渡り０
−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、保持時間＝３３時間)で単離した。Ｒｆｉ(
ＰｒＯＨ６：アンモニア３：水１ ｖ／ｖ／ｖ)０．３４。
ド−α−スルホ−β−アラニン(６) Ｎ−５−カルボキサミドフルオレセイン−α−スルホ−β−アラニン(５、５
０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(３ｍｌ)中に溶解し、次いでジイソプロ
ピルエチルアミン(０．２５ｍｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(４２ｍｇ、１．５
当量)を加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いでα−スルホ−β−ア
ラニン(２４ｍｇ、１．５当量)を加えた。攪拌を３時間続け、次いで反応物を真
空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物をイオン交換クロマトグラフィー(mono-
Q カラム、Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、４０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ、Ｂ＝１．０Ｍ Ｔ
ＥＡＢ、４０％ＭｅＣＮ ｖ／ｖ、２２分間に渡り０−５０％Ｂ、２２−５０分
間に渡り５０−７５％Ｂ、５０−７０分間に渡り７５−１００％Ｂ、４ｍｌ／ｍ
ｉｎ、保持時間＝７５−８０分間)、次いでＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ
ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮ ５０％ｖ／ｖ、９０分間に渡り０
−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ、保持時間＝３３時間)で単離した。Ｒｆｉ(
ＰｒＯＨ６：アンモニア３：水１ ｖ／ｖ／ｖ)０．３４。
【００３８】
修飾色素をアルキルアミノ−２'，３'−ジデオキシヌクレオチドトリホスフェー
トに結合させるための一般的方法(７、８) 修飾色素(１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)に溶解し、次いでジスクシンイミジル
カルボネート(４当量)およびＤＭＡＰ(４当量)を−６０℃で添加した。反応混合
物を−３０℃で１５分間攪拌し、次いでアミノアルキル−ｄｄＮＴＰ(０．６７
当量、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．５)溶液を加えた。反応物を室温で
１時間攪拌し、直接ＳｉＯ２ゲルカラムに適用した。産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ ＯＨ：Ｈ２Ｏ(４：５：１ ｖ：ｖ：ｖ)で溶出し、真空で乾燥するまで蒸発させ
、その後、１の場合ようにイオン交換クロマトグラフィー次いでＣ１８逆相ＨＰ
ＬＣにより精製した。
トに結合させるための一般的方法(７、８) 修飾色素(１ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)に溶解し、次いでジスクシンイミジル
カルボネート(４当量)およびＤＭＡＰ(４当量)を−６０℃で添加した。反応混合
物を−３０℃で１５分間攪拌し、次いでアミノアルキル−ｄｄＮＴＰ(０．６７
当量、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．５)溶液を加えた。反応物を室温で
１時間攪拌し、直接ＳｉＯ２ゲルカラムに適用した。産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ ＯＨ：Ｈ２Ｏ(４：５：１ ｖ：ｖ：ｖ)で溶出し、真空で乾燥するまで蒸発させ
、その後、１の場合ようにイオン交換クロマトグラフィー次いでＣ１８逆相ＨＰ
ＬＣにより精製した。
【００３９】
２．４ 結果
各標識ｄｄＮＴＰを配列決定緩衝液中に溶解し、数ラウンドのサーモサイクリ
ングを行った。産物をシーケンシングゲル上で分離し、電気泳動を図１７に示す
。電気泳動図の解釈は、全体的な３−荷電(すなわち構造８)により、実質的なシ
ーケンシングデータが得られる電気泳動図の領域から色のついた副産物が取り除
かれるという結論を提供した。
ングを行った。産物をシーケンシングゲル上で分離し、電気泳動を図１７に示す
。電気泳動図の解釈は、全体的な３−荷電(すなわち構造８)により、実質的なシ
ーケンシングデータが得られる電気泳動図の領域から色のついた副産物が取り除
かれるという結論を提供した。
【００４０】
図１７は、正味の陰性荷電の色素標識ジデオキシヌクレオチドがどのくらいそ
の移動速度(およびその産物の熱分解)に影響を与えるかを示すものである。正味
の陰性荷電のターミネーターが増加するにつれて、見られる種々のピーク(見ら
れるピーク各々は、色素標識ジデオキシヌクレオチドまたはその熱分解性産物で
ある)の移動速度が増加する(図１７)。全体的３−荷電(リンカーから２−(2-fro
m linker)、フルオレセインから１−(1-from fluorescein))において、ピークは
、実質的な配列データが通常得られる電気泳動図の領域からは見られない。
の移動速度(およびその産物の熱分解)に影響を与えるかを示すものである。正味
の陰性荷電のターミネーターが増加するにつれて、見られる種々のピーク(見ら
れるピーク各々は、色素標識ジデオキシヌクレオチドまたはその熱分解性産物で
ある)の移動速度が増加する(図１７)。全体的３−荷電(リンカーから２−(2-fro
m linker)、フルオレセインから１−(1-from fluorescein))において、ピークは
、実質的な配列データが通常得られる電気泳動図の領域からは見られない。
【００４１】
３．直接負荷に適用するための陰性荷電伸張リンカーアーム
３．１ 背景
修飾ターミネーターの組み込み効率を改善するため、リンカーアーム上におい
て３−荷電の標識ターミネーターを合成した。このとき、１８および２４原子の
伸張リンカーアームを含んでいる。
て３−荷電の標識ターミネーターを合成した。このとき、１８および２４原子の
伸張リンカーアームを含んでいる。
【００４２】
３．２ ケミストリー
【化３】
３．３ 実験
化合物６を、セクション２．３で概略したようなｄｄＮＴＰに標識を結合させ
る標準的プロトコールを用い１８−ｄｄＣＴＰおよび２４−ｄｄＣＴＰを結合さ
せた。精製の方法は９および１０と同じであった。 ９の保持時間 ：Ｍｏｎｏ−Ｑ(登録商標)イオン交換(４７分間) １０の保持時間：Ｍｏｎｏ−Ｑ(登録商標)イオン交換(４２分間) Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ(１５分間)
る標準的プロトコールを用い１８−ｄｄＣＴＰおよび２４−ｄｄＣＴＰを結合さ
せた。精製の方法は９および１０と同じであった。 ９の保持時間 ：Ｍｏｎｏ−Ｑ(登録商標)イオン交換(４７分間) １０の保持時間：Ｍｏｎｏ−Ｑ(登録商標)イオン交換(４２分間) Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ(１５分間)
【００４３】
３．４ 配列決定の結果
配列決定実験から、リンカーアームが長くなるとターミネーターの組み込みが
改善されることが明らかとなった。色素リンカー構造中の３−荷電の存在と組み
合わせた、この情報から、３−荷電リンカーでローダミン色素を調査した。これ
により、４色配列決定が可能となる。
改善されることが明らかとなった。色素リンカー構造中の３−荷電の存在と組み
合わせた、この情報から、３−荷電リンカーでローダミン色素を調査した。これ
により、４色配列決定が可能となる。
【００４４】
図１８に示すように、浄化手順なしに直接配列決定反応に負荷することができ
る。図１８では、配列中の非組み込み色素標識ターミネーターから生ずるピーク
は全く見られない。そのため、直接負荷配列決定に関する陰性荷電ターミネータ
ーの有用性について説明できる。
る。図１８では、配列中の非組み込み色素標識ターミネーターから生ずるピーク
は全く見られない。そのため、直接負荷配列決定に関する陰性荷電ターミネータ
ーの有用性について説明できる。
【００４５】
３．５ ３−リンカーアームを含むローダミン標識ターミネーター
以下のケミストリーを試み、一群の４種の標識ターミネーターを合成した：
【化４】
【表３】
Ｒｈｏｄ＝ローダミン標識、Ｘ＝リンカーアームの長さ、Ｎ＝塩基
【００４６】
３．６ 実験
化合物１１、１５、１９を５で概略した方法に従い合成した。
化合物１２、１３、１６、１７、１７、２１は、６で概略した方法に従った。
化合物１４、１８、２２−２５は、修飾色素をアルキルアミノ−２'，３'−ジ
デオキシヌクレオチドトリホスフェートに結合させる一般的方法（７，８）に従
った。
デオキシヌクレオチドトリホスフェートに結合させる一般的方法（７，８）に従
った。
【００４７】
３．７ 結果および考察
標識トリホスフェート１４、１８、２２を直接負荷配列決定実験に用いた。直
接負荷実験の化合物１４では産物分解がまったく見られず、ＴＳＩＩおよびＴａ
ｑＥＲＤＡＦＹを用いる場合であっても産物分解がまったく見られなかった。化
合物１８および２２は非常に暗い配列決定バンドを生じ、予測できない集合体を
形成することが観察された(放出スペクトルで観察されるように)。当該化合物は
また、配列の解釈を妨げる大きな色のついた小塊をシーケンシングゲル上に生ず
る。
接負荷実験の化合物１４では産物分解がまったく見られず、ＴＳＩＩおよびＴａ
ｑＥＲＤＡＦＹを用いる場合であっても産物分解がまったく見られなかった。化
合物１８および２２は非常に暗い配列決定バンドを生じ、予測できない集合体を
形成することが観察された(放出スペクトルで観察されるように)。当該化合物は
また、配列の解釈を妨げる大きな色のついた小塊をシーケンシングゲル上に生ず
る。
【００４８】
集合体の効果を克服すため、構造２３−２５を合成し、より短いリンカーアー
ムの効果を調査した。化合物２３は、きれいな配列を生じ、２４および２５は、
未試験である。構造物２３−２５は全て、予測可能なローダミン放射スペクトル
を有し、このため、集合体問題が克服されていることが明らかである。
ムの効果を調査した。化合物２３は、きれいな配列を生じ、２４および２５は、
未試験である。構造物２３−２５は全て、予測可能なローダミン放射スペクトル
を有し、このため、集合体問題が克服されていることが明らかである。
【００４９】
４ 陰性荷電リンカーアームの他の例
他の陰性荷電リンカーアームを合成し、以下に示すホスホジエステル構造の例
を研究した。当該生成物は、ホスホラミダイトケミストリーを用い合成したが、
Ｈ−ホスホネート、ホスホロイミダゾリド、またはホスホトリエステルケミスト
リーでも合成できた。
を研究した。当該生成物は、ホスホラミダイトケミストリーを用い合成したが、
Ｈ−ホスホネート、ホスホロイミダゾリド、またはホスホトリエステルケミスト
リーでも合成できた。
【化５】
【００５０】
５．陽性荷電レポーターを有するターミネーターの例
５．１ 背景
陽性荷電構造を研究するため、以下の標識ターミネーターを合成した。
【化６】
５．２ 実験
化合物２６(１０ｍｇ、０．０１３４ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(１ｍｌ)に溶解し、次
いでジイソプロピルエチルアミン(２３μｌ、１０当量)を加え、その後、ＰｙＢ
ＯＰ(１４ｍｇ、２．０当量)を加えた。当該反応混合物を室温で１５分間攪拌し
、次いで１１−ｄｄＧＴＰ(０．００８３ｍｍｏｌ、Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ
３ ｐＨ８．５)溶液の一度に加えた。当該反応混合物を室温で３時間攪拌し、次
いでシリカゲルカラムに直接適用した。当該産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ ２ Ｏ(６：３：１ ｖ／ｖ／ｖ)で溶出し、次いでイオン交換クロマトグラフィー(
６のように)で精製し、その後、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ(１．７５μｍｍｏｌ、
収率２１％)で精製した。
いでジイソプロピルエチルアミン(２３μｌ、１０当量)を加え、その後、ＰｙＢ
ＯＰ(１４ｍｇ、２．０当量)を加えた。当該反応混合物を室温で１５分間攪拌し
、次いで１１−ｄｄＧＴＰ(０．００８３ｍｍｏｌ、Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ
３ ｐＨ８．５)溶液の一度に加えた。当該反応混合物を室温で３時間攪拌し、次
いでシリカゲルカラムに直接適用した。当該産物をｉＰｒＯＨ：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ ２ Ｏ(６：３：１ ｖ／ｖ／ｖ)で溶出し、次いでイオン交換クロマトグラフィー(
６のように)で精製し、その後、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣ(１．７５μｍｍｏｌ、
収率２１％)で精製した。
【００５１】
５．３ 配列決定結果
図１９に示す電気泳動図は、２７を配列決定反応に用いるときに、得られた。
＋２荷電ターミネーターを配列決定反応に用い、スラブゲルに直接負荷した。同
じ実験を繰り返したが、反応混合物をホスファターゼで処理した後ゲルに負荷し
、反応混合物中に残存する非組み込み色素標識ジデオキシヌクレオチドからホス
フェートを取り除いた。これは、電気泳動の間に配列産物の逆方向に移動する原
因となる全体的な陽性荷電を全ターミネーター誘導産物に維持する。電気泳動図
から色のついた副産物が、ホスファターゼを用いターミネーター産物を分解する
とき、配列に欠けていていることは明らかである。
＋２荷電ターミネーターを配列決定反応に用い、スラブゲルに直接負荷した。同
じ実験を繰り返したが、反応混合物をホスファターゼで処理した後ゲルに負荷し
、反応混合物中に残存する非組み込み色素標識ジデオキシヌクレオチドからホス
フェートを取り除いた。これは、電気泳動の間に配列産物の逆方向に移動する原
因となる全体的な陽性荷電を全ターミネーター誘導産物に維持する。電気泳動図
から色のついた副産物が、ホスファターゼを用いターミネーター産物を分解する
とき、配列に欠けていていることは明らかである。
【００５２】
６．直接負荷するときの陽性荷電伸張リンカーアーム
６．１ ケミストリー
陽性荷電リンカーアームに結合する色素の他の例を以下に示す：
【化７】
この例では、ε第四級アミンからの形式化陽性荷電を含むローダミン色素Ｒ６Ｇ
をε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシンに結合させる。産物(２８)は、荷電アミノ
酸の更なる分子の反応により更に修飾され、２＋リンカーアーム(２９)を生じ得
る。更なる反応は望ましい荷電構造を生じ得る。
をε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシンに結合させる。産物(２８)は、荷電アミノ
酸の更なる分子の反応により更に修飾され、２＋リンカーアーム(２９)を生じ得
る。更なる反応は望ましい荷電構造を生じ得る。
【００５３】
６．２ 実験
α−Ｎ−(５−カルボキサミドローダミン６Ｇ)−ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリ
シン(２８) ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン(６８ｍｇ、３０．０ｍｇ)をＤＭＦ(６ｍ
ｌ)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(０．５ｍｌ、１０当量)を加え、そ
の後、Ｒ６Ｇ−ＮＨＳ活性エステル(２００ｍｇ、１．２当量)を加えた。当該反
応混合物を室温で１６時間攪拌し、次いで真空で乾燥するまで蒸発させた。当該
産物をＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／
５０％ＭｅＣＮ、５０分間に渡り０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)で単離
した。保持時間＝４４分間。
シン(２８) ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン(６８ｍｇ、３０．０ｍｇ)をＤＭＦ(６ｍ
ｌ)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン(０．５ｍｌ、１０当量)を加え、そ
の後、Ｒ６Ｇ−ＮＨＳ活性エステル(２００ｍｇ、１．２当量)を加えた。当該反
応混合物を室温で１６時間攪拌し、次いで真空で乾燥するまで蒸発させた。当該
産物をＣ１８ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／
５０％ＭｅＣＮ、５０分間に渡り０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)で単離
した。保持時間＝４４分間。
【００５４】
α−(α'−Ｎ−(５−カルボキサミドローダミン６Ｇ)−ε'−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルリシン)−ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン(２９) α−Ｎ−(５−カルボキサミドローダミン６Ｇ)−ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル
リシン(１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)中に溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン(０．３ｍｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(６７ｍｇ、１．５
当量)を加えた。当該反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いで、ε−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルリシン(５０ｍｇ、１．５当量)を加えた。当該溶液を更に３時間
攪拌し、次いで反応混合物を真空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物はＣ１８
ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／５０％ＭｅＣ
Ｎ、９０分間に渡り０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)によって単離した。
保持時間＝６０分間。
メチルリシン)−ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン(２９) α−Ｎ−(５−カルボキサミドローダミン６Ｇ)−ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル
リシン(１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ)をＤＭＦ(５ｍｌ)中に溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン(０．３ｍｌ、１５当量)およびＴＳＴＵ(６７ｍｇ、１．５
当量)を加えた。当該反応混合物を室温で１時間攪拌し、次いで、ε−Ｎ，Ｎ，
Ｎ−トリメチルリシン(５０ｍｇ、１．５当量)を加えた。当該溶液を更に３時間
攪拌し、次いで反応混合物を真空で乾燥するまで蒸発させた。当該産物はＣ１８
ＲＰ ＨＰＬＣ(Ａ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ、Ｂ＝０．１Ｍ ＴＥＡＢ／５０％ＭｅＣ
Ｎ、９０分間に渡り０−１００％Ｂ、１００ｍｌ／ｍｉｎ)によって単離した。
保持時間＝６０分間。
【００５５】
表ＩＶ
略語
【表４】
【表５】
【００５６】
本発明の種々の態様が上記で詳細に述べられているが、本発明はその特定の例
に限定するものではない。当業者とって種々の修飾が容易に明らかとなるが、そ
れらは添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる。
に限定するものではない。当業者とって種々の修飾が容易に明らかとなるが、そ
れらは添付の請求の範囲の精神および範囲内に含まれる。
【図１】 図１は、好熱性細菌Thermus aquaticusから単離のＴａｑ ＤＮＡ
ポリメラーゼのアミノ酸配列を示している。
ポリメラーゼのアミノ酸配列を示している。
【図２】 図２は、Ｔａｑ Δ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０
Ｒ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
Ｒ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３】 図３は、Ｔａｑ Ｄ１８Ａ／Ｅ６８１Ｒ／Ｆ６６７Ｙ ＤＮＡポリ
メラーゼのアミノ酸配列を示す。
メラーゼのアミノ酸配列を示す。
【図４】 図４は、基質として活性化サケ精子ＤＮＡを用いるＴａｑΔ２７
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７ＹおよびＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／
Ｅ４１０ＲのＫＣｌ滴定からのデータをプロットしたものである。
１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７ＹおよびＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／
Ｅ４１０ＲのＫＣｌ滴定からのデータをプロットしたものである。
【図５】 図５は、ＴａｑΔ２７１／Ｆ２７２Ｍ／Ｆ６６７Ｙ／Ｅ４１０Ｒ
とAmplitaqを比較する熱安定性アッセイを示す。
とAmplitaqを比較する熱安定性アッセイを示す。
【図６】 図６は、均一な終結イベントを示したものである。
【図７】 図７は、均一な終結イベントを示したものである。
【図８】 図８は、図６および図７の一部を比較したものである。
【図９】 図９は、図６および図７の一部を比較したものである。
【図１０】 図１０は、図６および図７の一部を比較したものである。
【図１１】 図１１は、困難な領域の配列決定能を示したものである。
【図１２】 図１２は、困難な領域の配列決定能を示したものである。
【図１３】 図１３は、４色配列決定反応から得られた電気泳動図を並べて
比較したものである。
比較したものである。
【図１４】 図１４は、Ｄ１８Ａ／Ｆ６６７Ｙおよびその種々のＥ６８１置
換体を種々の荷電ターミネーターと共に用いる４色配列決定反応で証明される、
非標識ｄｄＮＴＰと比較した相対的反応性を示す。
換体を種々の荷電ターミネーターと共に用いる４色配列決定反応で証明される、
非標識ｄｄＮＴＰと比較した相対的反応性を示す。
【図１５】 図１５は、荷電部位がターミネーターに結合し得る可能性のあ
る部位の構造を示す。
る部位の構造を示す。
【図１６】 図１６は、通常のＥＴターミネーターとビススルフォネート化
フルオレセインエネルギー転移ターミネーターとの比較を示す。
フルオレセインエネルギー転移ターミネーターとの比較を示す。
【図１７】 図１７は、電気泳動の結果を示す。
【図１８】 図１８は、電気泳動の結果を示す。
【図１９】 図１９は、電気泳動の結果を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，
ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(71)出願人 800 Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ
ｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ 1327，Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ
08855−1327，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(72)発明者 マリア・デイビス
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
(72)発明者 ジョン・ネルソン
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
(72)発明者 シブ・クマー
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
(72)発明者 パトリック・ジェイ・フィン
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
(72)発明者 サティアーム・ナムパリ
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
(72)発明者 パーク・フリック
アメリカ合衆国ニュージャージー州08855
−1327，ピスカタウェイ，センテニアル・
アベニュー 800，ピー・オー・ボックス
1327
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA10 CA06 DA06 HA01
4B050 CC04 FF03 FF05 FF11 FF12
4B063 QA13 QQ28 QQ44 QR08 QR32
QR42 QR62 QS25 QX02
4B064 AF27 CB30 CC24
4B065 AA26X AB01 CA29
Claims (28)
- 【請求項１】 図２に示すアミノ酸配列を含む精製組換え熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ。 - 【請求項２】 図２のアミノ酸配列表中の置換Ｅ６８１Ｒに相当するアミノ
酸置換を含む精製組換え熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項３】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離核酸であって
、図２に開示のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配列からなる当該核酸。 - 【請求項４】 請求項３の核酸を含む組換えＤＮＡベクター。
- 【請求項５】 請求項４のベクターで形質転換された組換え宿主細胞。
- 【請求項６】 E. coliである、請求項５の組換え宿主細胞。
- 【請求項７】 少なくとも１つの鎖終結試薬および１以上のヌクレオチドト
リホスフェートの存在下、請求項１のＤＮＡポリメラーゼで配列決定するＤＮＡ
鋳型から鎖終結フラグメントを生ずるステップ、および当該フラグメントの大き
さから当該ＤＮＡの配列を決定するステップを含むＤＮＡを配列決定する方法。 - 【請求項８】 鎖終結試薬が、正味の陽性荷電または正味の陰性荷電を有す
る標識核酸ターミネーターを含む、請求項７の方法。 - 【請求項９】 蛍光性標識ポリヌクレオチドを合成する方法であって、請求
項１のＤＮＡポリメラーゼをプライム化(primed)鋳型と混合するステップを含む
当該方法。 - 【請求項１０】 プライム化鋳型が鎖終結配列決定反応物中にあるプライム
化鋳型である、請求項９の方法。 - 【請求項１１】 プライム化鋳型がポリメラーゼ連鎖反応物中にあるプライ
ム化鋳型である、請求項９の方法。 - 【請求項１２】 蛍光性標識ポリヌクレオチドのキットであって、請求項１
のＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光性標識ヌクレオチドを含むキット。 - 【請求項１３】 蛍光性標識ヌクレオチドが、正味の陰性荷電または正味の
陽性荷電を有する核酸ターミネーターを含む、請求項１２のキット。 - 【請求項１４】 請求項１のＤＮＡポリメラーゼを含む、ＤＮＡを配列決定
するためのキット。 - 【請求項１５】 図３に開示のアミノ酸配列を含む精製組換え熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ。 - 【請求項１６】 図３のアミノ酸配列表の置換Ｅ６８１Ｒに相当するアミノ
酸置換を含むＤＮＡポリメラーゼ。 - 【請求項１７】 核酸が、図３に開示のアミノ酸配列に相当するヌクレオチ
ド配列からなる、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする単離核酸。 - 【請求項１８】 請求項１７の核酸を含む組換えＤＮＡベクター。
- 【請求項１９】 請求項１８のベクターで形質転換された組換え宿主細胞。
- 【請求項２０】 E. coliである、請求項１８の組換え宿主細胞。
- 【請求項２１】 少なくとも１つの鎖終結試薬および１以上のヌクレオチド
トリホスフェートの存在下、請求項１６のＤＮＡポリメラーゼで配列決定するＤ
ＮＡ鋳型から鎖終結フラグメントを生ずるステップ、および当該フラグメントの
大きさから当該ＤＮＡの配列を決定するステップを含むＤＮＡを配列決定する方
法。 - 【請求項２２】 鎖終結試薬が、正味の陽性荷電または正味の陰性荷電を有
する標識核酸ターミネーターを含む、請求項２１の方法。 - 【請求項２３】 蛍光性標識ポリヌクレオチドを合成する方法であって、請
求項１６のＤＮＡポリメラーゼをプライム化鋳型と混合するステップを含む当該
方法。 - 【請求項２４】 プライム化鋳型が鎖終結配列決定反応物中にあるプライム
化鋳型である、請求項２３の方法。 - 【請求項２５】 プライム化鋳型がポリメラーゼ連鎖反応物中にあるプライ
ム化鋳型である、請求項２３の方法。 - 【請求項２６】 蛍光性標識ポリヌクレオチドのキットであって、請求項１
６のＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光性標識ヌクレオチドを含むキット。 - 【請求項２７】 蛍光性標識ヌクレオチドが、正味の陰性荷電または正味の
陽性荷電を有する核酸ターミネーターを含む、請求項２６のキット。 - 【請求項２８】 請求項１６のＤＮＡポリメラーゼを含む、ＤＮＡを配列決
定するためのキット。
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|---|---|---|---|
| US15016799P | 1999-08-21 | 1999-08-21 | |
| US60/150,167 | 1999-08-21 | ||
| US15473999P | 1999-09-17 | 1999-09-17 | |
| US60/154,739 | 1999-09-17 | ||
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|---|---|---|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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