ES2882646T3 - Polimerasas carentes de actividad exonucleasa - Google Patents

Abstract

Una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, en la que dicha polimerasa modificada comprende una sustitución seleccionada de un grupo que consiste en D128H, Y242G/A/L/S, Y259G/K/Q, y en la que dicha polimerasa modificada conserva una capacidad de desplazamiento de hebra.

Description

DESCRIPCIÓN

Polimerasas carentes de actividad exonucleasa

Campo técnico

En el presente documento, entre otras cosas, se proporcionan ADN polimerasas modificadas que son carentes de actividad exonucleasa, pero tienen la misma o mejorada capacidad de desplazamiento de hebra en comparación con la polimerasa natural, y que son ventajosas para su uso en aplicaciones industriales o de investigación.

Antecedentes

Las ADN polimerasas son una familia de enzimas que usan ADN monocatenario como molde para sintetizar la hebra de ADN complementaria. En particular, las ^a Dⁿ polimerasas pueden añadir nucleótidos libres al extremo 3' de una hebra recién formada, dando como resultado el alargamiento de la nueva hebra en sentido de 5' a 3'. La mayoría de las ADN polimerasas son proteínas multifuncionales que poseen actividades tanto polimerizantes como exonucleolíticas. Por ejemplo, muchas ADN polimerasas tienen actividad exonucleasa 3'^5'. Estas polimerasas pueden reconocer un nucleótido incorporado incorrectamente y la actividad exonucleasa 3 '^5 ' de la enzima permite que la escisión del nucleótido incorrecto (esta actividad es conocida como corrección de errores). Después de la escisión del nucleótido, la polimerasa puede reinsertar el nucleótido correcto y la replicación puede continuar. Muchas ADN polimerasas también tienen actividad exonucleasa 5'^3'.

La secuenciación por síntesis (SBS) determina la identidad de la secuencia de nucleótidos en una hebra de ADN. Las polimerasas usadas en SBS no solo añaden nucleótidos a la hebra en crecimiento, sino que también corrigen la hebra de nucleótidos en crecimiento. Un dominio exonucleasa de corrección de errores 3 '^ 5' es intrínseco a la mayoría de las ADN polimerasas. Como se indica anteriormente, la función de corrección de errores de exonucleasa puede corregir una base incorrecta. En SBS, esta actividad exonucleasa durante la secuenciación contribuirá a generar errores de deleción/inserción y, por lo tanto, no es deseable. Las mutaciones estándar en el dominio exonucleasa para anular la actividad exonucleasa en las polimerasas de la Familia B reducen típicamente la capacidad de desplazamiento de hebra de la polimerasa.

Por lo tanto, existe la necesidad de una polimerasa carente de actividad exonucleasa que tenga una característica de desplazamiento de hebra alterada en relación con las mutaciones estándar. Específicamente, se desea una polimerasa carente de actividad exonucleasa con el mismo o mejorado desplazamiento de hebra que una polimerasa original natural. La mejora del desplazamiento de hebra mejora el tiempo de espera entre incorporaciones de nucleótidos consecutivos (es decir, disminuye el tiempo de espera), así como la tasa de extensión/secuenciación de la polimerasa (es decir, incrementa la tasa de extensión/secuenciación).

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona ADN polimerasas modificadas (por ejemplo, mutantes) carentes de actividad exonucleasa. Las polimerasas modificadas tienen la misma o mejorada capacidad de desplazamiento de hebra en comparación con la polimerasa natural. Las mutaciones seleccionadas confieren fenotipos ventajosos en las condiciones usadas en aplicaciones industriales o de investigación, por ejemplo, catalizando la incorporación de nucleótidos polifosfato modificados, por ejemplo, nucleótidos marcados, con altas concentraciones de sal.

En algunos modos de realización, la polimerasa modificada comprende una sustitución correspondiente a una sustitución seleccionada entre D128H, Y242G/A/L/S e Y259G/K/Q.

En un modo de realización, la invención proporciona una polimerasa modificada que tiene una tasa de extensión que es mayor que la de la polimerasa original. En algunos modos de realización, la tasa de extensión de la polimerasa modificada es entre 1,5 y 5 veces mayor que la de la polimerasa original. En algunos modos de realización, la tasa de extensión es al menos 1,5, al menos 2, al menos 3 veces mayor que la de la polimerasa original.

En otro modo de realización, la polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera que es más corto en comparación con la polimerasa de acuerdo con las SEQ ID NO: 1 u 11. En un modo de realización, la polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera que es más corto en comparación con la polimerasa de acuerdo con la SEQ ID NO: 1. En un modo de realización, la polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera que es más corto en comparación con la polimerasa de acuerdo con la SEQ ID NO: 11. En un modo de realización, la polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera inferior a 3 segundos.

En todos los modos de realización, la variante de polimerasa tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, preferentemente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra un molde ejemplar usado en el ensayo de actividad exonucleasa o ensayo de desplazamiento (panel superior). Se hace referencia a los ejemplos 3 y 4 El panel inferior muestra un ensayo de círculo rodante. Se hace referencia al ejemplo 5.

La FIG. 2 muestra los resultados de un ensayo de actividad exonucleasa. Se muestra la evolución temporal de dos réplicas de las variantes indicadas. La polimerasa original sirvió como control. Todas las polimerasas mutadas muestran actividad exonucleasa reducida o nula. Se hace referencia al ejemplo 3.

La FIG. 3 muestra los resultados de un ensayo de desplazamiento. Se muestra la evolución temporal de dos réplicas de las variantes indicadas. Los controles son los mismos que en la FIG. 1. Todos los mutantes sometidos a prueba, excepto L125K, muestran actividad de extensión/desplazamiento en esta figura. Se hace referencia al ejemplo 4

La FIG. 4 muestra los resultados de un ensayo de círculo rodante. Se muestra una fotografía de un gel de agarosa. Las variantes, excepto L125K, muestran actividad. Los carriles derecho e izquierdo tienen la escalera molecular como referencia. La línea amarilla representa dónde se vería un producto de extensión esperado producido por la polimerasa SEQ ID NO: 8. Se hace referencia al ejemplo 5.

La FIG. 5 muestra los resultados de un ensayo de círculo rodante. Se muestra una fotografía de un gel de agarosa. Los carriles 1 y 20 tienen la escalera molecular como referencia. El carril 8 (F6) es Y212K. Las variantes se identifican usando los números de referencia alfanuméricos que se muestran en las FIGS. 1 y 2. La línea amarilla representa dónde se vería un producto de expresión esperado producido por la polimerasa SEQ ID NO: 8. Se hace referencia al ejemplo 5.

Descripción detallada

La invención se describirá ahora en detalle por medio de referencia usando solo las siguientes definiciones y ejemplos.

A menos que se defina de otro modo en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton et al., DⁱCTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.a ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos usados en la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puede usar en la práctica o pruebas de la presente invención, se describen los procedimientos y materiales preferentes. Los profesionales sanitarios se dirigen en particular a Sambrook et al., 1989, y Ausubel FM et al., 1993, para consultar definiciones y términos de la técnica. Se debe entender que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.

Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. El término aproximadamente se usa en el presente documento para referirse a más o menos un diez por ciento (10 %) de un valor. Por ejemplo, "aproximadamente 100" se refiere a cualquier número entre 90 y 110.

A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en una orientación de amino a carboxilo, respectivamente.

Los títulos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modos de realización de la invención que se pueden tener por referencia a la memoria descriptiva como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Definiciones

Aminoácido: Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se puede incorporar en una cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, un aminoácido tiene la estructura general H²N-C(H)(R)-COOH. En algunos modos de realización, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunos modos de realización, el aminoácido es un aminoácido sintético; en algunos modos de realización, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunos modos de realización, un aminoácido es un L-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar encontrados comúnmente en péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, "aminoácido sintético" engloba aminoácidos modificados químicamente, incluyendo pero sin limitarse a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos carboxi y/o aminoterminales en péptidos, se pueden modificar por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos sin afectar negativamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa de manera intercambiable con "residuo aminoacídico" y se puede referir a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoacídico de un péptido. Será evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido. Cabe destacar que todas las secuencias de residuos aminoacídicos se representan en el presente documento por fórmulas con una orientación izquierda y derecha que está en el sentido convencional del extremo amínico al extremo carboxílico.

Par de bases (bp): como se usa en el presente documento, par de bases se refiere a una asociación de adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en una molécula de ADN bicatenaria.

Complementario: como se usa en el presente documento, el término "complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de emparejamiento de bases. Es conocido que un nucleótido adenina puede formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un nucleótido que sea timina o uracilo. De forma similar, es conocido que un nucleótido citosina puede realizar emparejamiento de bases con un nucleótido guanina.

Afinidad de unión a ADN: como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión a ADN" típicamente se refiere a la actividad de una ADN polimerasa en la unión al ácido nucleico ADN. En algunos modos de realización, la actividad de unión a ADN se puede medir en un ensayo de desplazamiento de dos bandas. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9.63-9.75 (que describe el marcaje terminal de ácidos nucleicos). Se prepara una mezcla de reacción que contiene al menos aproximadamente 0,5 |jg del polipéptido en aproximadamente 10 j l de tampón de unión (tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), glicerol al 10 %, KCl 25 mM, MgCl²25 mM). Se calienta la mezcla de reacción a 37 °C durante 10 min. Se añade aproximadamente de 1*104 a 5*104 cpm (o aproximadamente 0,5-2 ng) de ácido nucleico bicatenario marcado a la mezcla de reacción y se incuba durante 10 min adicionales. Se carga la mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida natural en tampón Tris-borato 0,5*. Se somete la mezcla de reacción a electroforesis a temperatura ambiente. Se seca el gel y se somete a autorradiografía usando procedimientos estándar. Cualquier disminución detectable en la movilidad del ácido nucleico bicatenario marcado indica la formación de un complejo de unión entre el polipéptido y el ácido nucleico bicatenario. Dicha actividad de unión a ácido nucleico se puede cuantificar usando procedimientos densitométricos estándar para medir la cantidad de radioactividad en el complejo de unión en relación con la cantidad total de radioactividad en la mezcla de reacción inicial. Otros procedimientos de medición de afinidad de unión a ADN son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Kong et al. (1993) J. Biol. Chem.

268(3):1965-1975).

Tasa de alargamiento: como se usa en el presente documento, el término "tasa de alargamiento" se refiere a la tasa promedio a la que una ADN polimerasa extiende una cadena de polímero. Como se usa en el presente documento, una alta tasa de alargamiento se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 2 nt/s (por ejemplo, mayor de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s). Como se usa en la presente solicitud, los términos "tasa de alargamiento", "tasa de extensión" y "tasa de incorporación" se usan de manera intercambiable.

Actividad enzimática: como se usa en el presente documento, el término "actividad enzimática" se refiere a la especificidad y eficacia de una ADN polimerasa. La actividad enzimática de una ADN polimerasa también se denomina "actividad polimerasa", lo que se refiere típicamente a la actividad de una ADN polimerasa al catalizar la síntesis dirigida a molde de un polinucleótido. Se puede medir la actividad enzimática de una polimerasa usando diversas técnicas y procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar diluciones en serie de polimerasa en tampón de dilución (por ejemplo, Tris.Cl 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, NP40 al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 %). Para cada dilución, se pueden retirar 5 |jl y añadirse a 45 |jl de una mezcla de reacción que contiene TAPS 25 mM (pH 9,25), KCl 50 mM, MgCh 2 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dCTP 0,1 mM, 12,5 jg de ^{A d N} activado, [a-32P]dCTP 100 jM (0,05 jCi/nmol) y agua desionizada estéril. Se pueden incubar las mezclas de reacción a 37 °C (o 74 °C para ADN polimerasas termoestables) durante 10 minutos y, a continuación, detenerse enfriando de inmediato la reacción a 4 °C y añadiendo 10 jl de EDTA 60 mM enfriado en hielo. Se puede retirar una alícuota de 25 jl de cada mezcla de reacción. Se puede retirar dCTP marcado radioactivamente no incorporado de cada alícuota por filtración en gel (Centri-Sep, Princeton Separations, Adelphia, N.J.). Se puede mezclar el eluido de columna con líquido de centelleo (1 ml). Se cuantifica la radioactividad en el eluido de columna con un contador de centelleo para determinar la cantidad de producto sintetizado por la polimerasa. Una unidad de actividad polimerasa se puede definir como la cantidad de polimerasa necesaria para sintetizar 10 nmol de producto en 30 minutos (Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem.

264:6427-647). Otros procedimientos de medición de la actividad polimerasa son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)).

Purificado: como se usa en el presente documento, "purificado" significa que una molécula está presente en una muestra a una concentración de al menos un 90 % en peso, o al menos un 95 % en peso, o al menos un 98 % en peso de la muestra en la que está contenida.

Aislado: una molécula "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se separa de al menos otra molécula con la que se asocia normalmente, por ejemplo, en su entorno natural. Una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan habitualmente la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromosómica o en una localización cromosómica que es diferente de su localización cromosómica natural.

% de homología: el término "% de homología" se usa de manera intercambiable en el presente documento con el término "% de identidad" en el presente documento y se refiere al nivel de identidad de secuencia de ácido nucleico o aminoácidos entre la secuencia de ácido nucleico que codifica uno cualquiera de los polipéptidos según la invención o la secuencia de aminoácidos del polipéptido según la invención, cuando se alinea usando un programa de alineación de secuencias.

Por ejemplo, como se usa en el presente documento, un 80 % de homología quiere decir lo mismo que un 80 % de identidad de secuencia determinada por un algoritmo definido y, en consecuencia, un homólogo de una secuencia dada tiene más de un 80 % de identidad de secuencia en una longitud de la secuencia dada. Los niveles ejemplares de identidad de secuencia incluyen, pero no se limitan a, 80, 85, 90, 95, 98 % o más de identidad de secuencia para una secuencia dada, por ejemplo, la secuencia codificante para uno cualquiera de los polipéptidos según la invención, como se describe en el presente documento.

Los programas informáticos ejemplares que se pueden usar para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX y TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, disponibles públicamente en Internet. Véanse también, Altschul, et al., 1990 y Altschul, et al., 1997.

Las búsquedas de secuencias se llevan a cabo típicamente usando el programa BLASTN cuando se evalúa una secuencia de ácido nucleico dada relativa a las secuencias de ácido nucleico en GenBank DNA Sequences y otras bases de datos públicas. El programa BLASTX es preferente para buscar secuencias de ácido nucleico que se han traducido en todos los marcos de lectura frente a secuencias de aminoácidos en GenBank Protein Sequences y otras bases de datos públicas. Tanto BLASTN como BLASTX se ejecutan usando parámetros predeterminados de una penalización por hueco abierto de 11,0 y una penalización por hueco extendido de 1,0, y utilizan la matriz BLOSUM-62. (Véase, por ejemplo, Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

Se realiza una alineación preferente de secuencias seleccionadas para determinar el "% de identidad" entre dos o más secuencias, usando por ejemplo, el programa CLUSTAL-W en MacVector versión 13.0.7, operado con parámetros predeterminados, incluyendo una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por hueco extendido de 0,1 y una matriz de similitud BLOSUM30.

ADN polimerasa modificada: como se usa en el presente documento, el término "ADN polimerasa modificada" se refiere a una ADN polimerasa originada a partir de otra ADN polimerasa (es decir, original) y contiene una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, deleción o inserción de aminoácidos) en comparación con la ADN polimerasa original. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa natural. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa recombinante o genomanipulada que incluye, pero sin limitarse a, ADN polimerasa quimérica, ADN polimerasa de fusión u otra ADN polimerasa modificada. Típicamente, una ADN polimerasa modificada tiene al menos un fenotipo cambiado en comparación con la polimerasa original.

Mutación: como se usa en el presente documento, el término "mutación" se refiere a un cambio introducido en una secuencia original incluyendo, pero sin limitarse a, sustituciones, inserciones, deleciones (incluyendo truncamientos). Las consecuencias de una mutación incluyen, pero no se limitan a, la creación de un nuevo o alterado carácter, propiedad, función, fenotipo o rasgo no encontrado en la proteína codificada por la secuencia original. Algunos mu

Mutante: como se usa en el presente documento, el término "mutante" se refiere a una proteína modificada que muestra características alteradas cuando se compara con la proteína original. Los términos "variante" y "mutante" se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Natural: como se usa en el presente documento, el término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural.

Fidelidad: como se usa en el presente documento, el término "fidelidad" se refiere a la exactitud de la polimerización de ADN por ADN polimerasa dependiente de molde o bien a la diferencia medida en la kdis de la unión del nucleótido correcto frente a la unión del nucleótido incorrecto al ADN molde. La fidelidad de una ADN polimerasa se mide típicamente mediante la tasa de error (la frecuencia de incorporar un nucleótido inexacto, es decir, un nucleótido que no se incorpora de una manera dependiente de molde). La exactitud o fidelidad de la polimerización de ADN se mantiene tanto para la actividad polimerasa como para la actividad 3'-5' exonucleasa de una ADN polimerasa. El término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45*10-6 (por ejemplo, menor de 4,0*10-6, 3,5*10-6, 3,0*10-6, 2,5*10-6, 2,0*10-6, 1,5*10-6, 1,0*10-6, 0,5*10-6) mutaciones/nt/duplicación. La fidelidad o tasa de error de una ADN polimerasa se puede medir usando ensayos conocidos para la técnica. Por ejemplo, se pueden someter a prueba las tasas de error de las ADN polimerasas como se describe en el presente documento o como se describe en Johnson et al., Biochim Biophys Acta, mayo 2010; 1804(5): 1041-1048.

Nanoporo: el término "nanoporo", como se usa en el presente documento, se refiere en general a un poro, canal o paso formado o proporcionado de otro modo en una membrana. Una membrana puede ser una membrana orgánica, tal como una bicapa lipídica, o una membrana sintética, tal como una membrana formada de un material polimérico. La membrana puede ser un material polimérico. El nanoporo se puede disponer contiguo o cerca de un circuito sensor o un electrodo acoplado a un circuito sensor, tal como, por ejemplo, un circuito con semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) o transistor de efecto de campo (FET). En algunos ejemplos, un nanoporo tiene una anchura o diámetro característico del orden de 0,1 nanómetros (nm) a aproximadamente 1000 nm. Algunos nanoporos son proteínas. La hemolisina alfa, la MspA son ejemplos de un nanoporo proteico.

Nucleótido: como se usa en el presente documento, una unidad monomérica de ADN o ARN que consiste en un resto glucídico (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base se une al resto glucídico por medio del carbono glucosídico (carbono 1' de la pentosa) y esa combinación de base y glúcido es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato enlazado a la posición 3' o 5' de la pentosa, se denomina nucleótido. Una secuencia de nucleótidos unidos de forma funcional se denomina típicamente en el presente documento "secuencia de bases" o "secuencia de nucleótidos," y se representa en el presente documento por una fórmula con una orientación de izquierda a derecha que está en el sentido convencional del extremo 5' al extremo 3'. Como se usa en el presente documento, un "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido polifosfato, por ejemplo, con 3, 4, 5, 6, 7 u 8 fosfatos.

Oligonucleótido o polinucleótido: como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se define como una molécula que incluye dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o el uso definitivos del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar sintéticamente o por clonación. Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de polímero compuesta de monómeros nucleotídicos enlazados de forma covalente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos.

Polimerasa: como se usa en el presente documento, una "polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleótido (es decir, la actividad polimerasa). En general, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado a una secuencia molde de polinucleótido, y avanzará hacia el extremo 5' de la hebra molde. Una "ADN polimerasa" cataliza la polimerización de desoxinucleótidos.

Cebador: como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o producido sintéticamente, que puede actuar como un punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico cuando se dispone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico, por ejemplo, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfato diferentes y enzima termoestable en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc.) y a una temperatura adecuada. El cebador es preferentemente monocatenario para la eficacia máxima en la amplificación, pero, de forma alternativa, puede ser bicatenario. Si es bicatenario, en primer lugar se trata el cebador para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la enzima termoestable. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y uso del procedimiento. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente 15-25 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. En general, las moléculas cebadoras cortas requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Procesividad: como se usa en el presente documento, "procesividad" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantenerse unida al molde y realizar múltiples reacciones de modificación. Las "reacciones de modificación" incluyen pero no se limitan a polimerización y escisión exonucleolítica. En algunos modos de realización, "procesividad" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa para realizar una secuencia de etapas de polimerización sin disociación intermedia de la enzima de las cadenas de ADN crecientes. Típicamente, la "procesividad" de una ADN polimerasa se mide por la longitud de nucleótidos (por ejemplo 20 nt, 300 nt, 0,5-1 kb o más) que se polimerizan o se modifican sin disociación intermedia de la ADN polimerasa de la cadena de ADN creciente. La "procesividad" puede depender de la naturaleza de la polimerasa, la secuencia de un molde de ADN y de las condiciones de reacción, por ejemplo, concentración de sal, temperatura o presencia de proteínas específicas. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor de 20 nt (por ejemplo, mayor de 40 nt, 60 nt, 80 nt, 100 nt, 120 nt, 140 nt, 160 nt, 180 nt, 200 nt, 220 nt, 240 nt, 260 nt, 280 nt, 300 nt, 320 nt, 340 nt, 360 nt, 380 nt, 400 nt o mayor) por cada asociación/disociación con el molde. La procesividad se puede medir de acuerdo con los procedimientos definidos en el presente documento y en el documento WO 01/92501 A1 (MJ Bioworks, Inc., Improved Nucleic Acid Modifying Enzymes, publicado el 6 de diciembre de 2001).

Desplazamiento de hebra: como se usa en el presente documento, el término "desplazamiento de hebra" significa la capacidad de la polimerasa para desplazar el ADN en dirección 3' que se encuentra durante la síntesis de una hebra de ADN naciente, medida usando un ensayo de actividad de desplazamiento de hebra como se describe en el presente documento. Las ADN polimerasas pueden tener diversos grados de actividad de desplazamiento de hebra.

Síntesis: como se usa en el presente documento, el término "síntesis" se refiere a cualquier procedimiento in vitro para preparar una nueva hebra de polinucleótido o alargar el polinucleótido existente (es decir, ADN o ARN) de una manera dependiente de molde. La síntesis, de acuerdo con la invención, incluye amplificación, lo que incrementa el número de copias de una secuencia de molde de polinucleótido con el uso de una polimerasa. La síntesis de polinucleótidos (por ejemplo, amplificación) da como resultado la incorporación de nucleótidos en un polinucleótido (es decir, un cebador) formando de este modo una nueva molécula de polinucleótido complementaria al molde de polinucleótido. La molécula de polinucleótido formada y su molde se pueden usar como moldes para sintetizar moléculas de polinucleótidos adicionales. "Síntesis de ADN," como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, PCR, el marcaje de polinucleótido (es decir, para sondas y cebadores oligonucleotídicos), secuenciación de polinucleótidos.

Molécula de ADN molde: como se usa en el presente documento, el término "molécula de ADN molde" se refiere a una hebra de un ácido nucleico a partir de la cual se sintetiza una hebra de ácido nucleico complementaria por una ADN polimerasa, por ejemplo, en una reacción de extensión de cebador.

Manera dependiente de molde: como se usa en el presente documento, el término "manera dependiente de molde" se refiere a un procedimiento que implica la extensión dependiente de molde de una molécula cebadora (por ejemplo, síntesis de ADN por ADN polimerasa). El término "manera dependiente de molde" típicamente se refiere a la síntesis de polinucleótidos de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra de polinucleótido recién sintetizada viene dictada por las reglas bien conocidas de emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).

Marca: como se usa en el presente documento, el término "marca" se refiere a un resto detectable que puede ser átomos o moléculas, o una colección de átomos o moléculas. Una marca puede proporcionar una firma óptica, electroquímica, magnética o electrostática (por ejemplo, inductiva, capacitiva), firma que se puede detectar con la ayuda de un nanoporo.

Nucleótido marcado: como se usa en el presente documento, el término "nucleótido marcado" se refiere a un nucleótido o nucleótido modificado que tiene una marca unida. La marca se puede unir de forma covalente al glúcido, el fosfato (o polifosfato) o la base. La marca puede estar en el fosfato terminal.

Vector: como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ADN heterólogos en una célula exógena. Muchos vectores de expresión procariotas y eucariotas están disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica.

Las variantes de polimerasa proporcionadas en el presente documento son útiles en la secuenciación de polinucleótidos basada en chip como se describe en el documento WO2013/188841 (Genia Technologies, Inc., Chip Set-Up and High-Accuracy Nucleic Acid Sequencing, publicado el 19 de diciembre de 2013).

Las características deseadas de una polimerasa que encuentra uso en la secuenciación del ADN son:

a. kdis lenta (para nucleótido)

b. kaso rápida (para nucleótido)

c. Alta fidelidad

d. Baja actividad exonucleasa

e. Desplazamiento de la hebra de ADN

F. kquím

g. Estabilidad incrementada

h. Procesividad

i. Tolerancia a la sal

j. Compatible con unión a nanoporo

k. Capacidad para incorporar un polifosfato que tenga 4, 5, 6, 7 u 8 fosfatos, por ejemplo, nucleótido cuadrafosfato, pentafosfato, hexafosfato, heptafosfato u octofosfato

l. Exactitud de secuenciación

m. Longitudes de lectura largas, es decir, lecturas continuas largas.

Nomenclatura

En la presente descripción y reivindicaciones se usan los códigos de una letra y tres letras convencionales para los residuos aminoacídicos.

Para facilidad de referencia, las variantes de polimerasa de la solicitud se describen por el uso de la siguiente nomenclatura:

Aminoácido(s) original(es): posición/posiciones: aminoácido(s) sustituido(s). De acuerdo con esta nomenclatura, por ejemplo, la sustitución de serina por una alanina en la posición 242 se muestra como:

Ser242Ala o S242A

Las mutaciones múltiples se separan por signos más, es decir:

Ala30Asp+Glu34Ser o A30N+E34S

representando mutaciones en las posiciones 30 y 34 sustituyendo alanina y ácido glutámico por asparagina y serina, respectivamente.

Cuando uno o más residuos aminoacídicos alternativos se pueden insertar en una posición dada, se indica como: A30N/E o A30N o A30E.

La numeración de los residuos, a menos que se indique de otro modo, se hace con referencia a SEQ ID NO: 2 (Pol6 con marca His).

Mutagénesis de la polimerasa dirigida a sitio

En el presente documento se proporcionan las secuencias naturales de fago de Clostridium phiCPV4 (SEQ ID NO: 3, región codificante de ácido nucleico más una marca His; SEQ ID NO: 1, secuencia de aminoácidos) y están disponibles en otros lugares (National Center for Bioinformatics o GenBank con números de acceso AFH27113). La polimerasa original se puede seleccionar de las SEQ ID NO: 1 u 11, o cualquiera de las siguientes variantes pol6:

Tabla 1

Se pueden introducir mutaciones puntuales usando el kit QuikChange Lightning 2 (Stategene/Agilent) siguiendo las instrucciones del fabricante o el protocolo de mutagénesis NEB Q5.

En un modo de realización, la polimerasa variante que tiene actividad enzimática alterada en comparación con las SEQ ID NO: 1, 8 o una polimerasa original tiene una mutación seleccionada de

a. T45G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

b. H123G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

c. L125G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M)/F,

d. W127G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

e. D128G/A/U E/Q/K/H/S/Y/R/W/T /M/F,

f. Y212G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

g. E219G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M)/F,

h. E239G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

i. D241G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

j. Y242G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F,

k. Y259G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F o

l. Q260G/A/L/E/Q/K/H/S/Y/R/W/T/M/F.

Se pueden encargar los cebadores a empresas comerciales, por ejemplo, IDT DNA.

Ensamblaje e inserción de nanoporos

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usar un nanoporo que tiene una polimerasa unida al nanoporo. En algunos casos, es deseable tener una y solo una polimerasa por nanoporo (por ejemplo, de modo que solo se secuencie una molécula de ácido nucleico en cada nanoporo). Sin embargo, muchos nanoporos, incluyendo por ejemplo hemolisina alfa (aHL), pueden ser proteínas multiméricas que tienen una pluralidad de subunidades (por ejemplo, 7 subunidades para aHL). Las subunidades pueden ser copias idénticas del mismo polipéptido. En el presente documento se proporcionan proteínas multiméricas (por ejemplo, nanoporos) que tienen una proporción definida de subunidades modificadas (por ejemplo, variantes de a-HL) con respecto a subunidades no modificadas (por ejemplo, a-HL). En el presente documento también se proporcionan procedimientos para producir proteínas multiméricas (por ejemplo, nanoporos) que tienen una proporción definida de subunidades modificadas con respecto a subunidades no modificadas.

Con referencia a la figura 27 del documento WO2014/074727 (Genia Technologies, Inc.), un procedimiento para ensamblar una proteína que tiene una pluralidad de subunidades comprende proporcionar una pluralidad de primeras subunidades 2705 y proporcionar una pluralidad de segundas subunidades 2710, donde las segundas subunidades se modifican en comparación con las primeras subunidades. En algunos casos, las primeras subunidades son naturales (por ejemplo, purificadas de fuentes naturales o producidas de forma recombinante). Las segundas subunidades se pueden modificar de cualquier forma adecuada. En algunos casos, las segundas subunidades tienen una proteína (por ejemplo, una polimerasa) unida (por ejemplo, como una proteína de fusión).

Las subunidades modificadas pueden comprender un resto químicamente reactivo (por ejemplo, una acida o un grupo alquino adecuado para formar un enlace). En algunos casos, el procedimiento comprende además realizar una reacción (por ejemplo, una cicloadición de química Click) para unir una entidad (por ejemplo, una polimerasa) al resto químicamente reactivo.

El procedimiento puede comprender además poner en contacto las primeras subunidades con las segundas subunidades 2715 en una primera proporción para formar una pluralidad de proteínas 2720 que tienen las primeras subunidades y las segundas subunidades. Por ejemplo, una parte de las subunidades de aHL modificadas que tienen un grupo reactivo adecuado para unir una polimerasa se puede mezclar con seis partes de subunidades de aHL naturales (es decir, siendo la primera proporción 1:6). La pluralidad de proteínas puede tener una pluralidad de proporciones de las primeras subunidades con respecto a las segundas subunidades. Por ejemplo, las subunidades mixtas pueden formar varios nanoporos que tienen una distribución de estequiometrías de subunidades modificadas con respecto a no modificadas (por ejemplo, 1:6, 2:5, 3:4).

En algunos casos, las proteínas se forman simplemente mezclando las subunidades. En el caso de nanoporos de aHL, por ejemplo, un detergente (por ejemplo, ácido desoxicólico) puede provocar que el monómero de aHL adopte la conformación de poro. Los nanoporos también se pueden formar usando un lípido (por ejemplo, 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-di-O-fitanil-sn-glicero-3-fosfocolina (DoPhPC)) y temperatura moderada (por ejemplo, menor de aproximadamente 100 °C). En algunos casos, mezclar DPhPC con una solución tampón crea grandes vesículas multilaminares (LMV), y añadir subunidades de aHL a esta solución e incubar la mezcla a 40 °C durante 30 minutos da como resultado la formación de poro.

Si se usan dos tipos diferentes de subunidades (por ejemplo, la proteína natural y un segundo monómero de aHL que puede contener una única mutación puntual), las proteínas resultantes pueden tener una estequiometría mixta (por ejemplo, proteínas naturales y mutantes). La estequiometría de estas proteínas puede seguir una fórmula que es dependiente de la proporción de las concentraciones de las dos proteínas usadas en la reacción de formación de poros. Esta fórmula es como sigue:

100 Pm = 100[n!/m!(n-m)!] ■ fmutm ■ fwtñm,

donde

Pm = probabilidad de que un poro tenga un número m de subunidades mutantes

n = número total de subunidades (por ejemplo, 7 para aHL)

m = número de subunidades "mutantes"

fmut = fracción o proporción de subunidades mutantes mezcladas entre sí

fwt = fracción o proporción de subunidades naturales mezcladas entre sí

El procedimiento puede comprender además fraccionar la pluralidad de proteínas para enriquecer proteínas que tienen una segunda proporción de las primeras subunidades con respecto a las segundas subunidades 2725. Por ejemplo, se pueden aislar proteínas de nanoporo que tienen una y solo una subunidad modificada (por ejemplo, una segunda proporción de 1:6). Sin embargo, cualquier segunda proporción es adecuada. También se puede fraccionar una distribución de segundas proporciones, tal como enriquecer proteínas que tienen una o bien dos subunidades modificadas. El número total de subunidades que forman la proteína no siempre es 7 (por ejemplo, se puede usar un nanoporo diferente o se puede formar un nanoporo de hemolisina alfa que tiene seis subunidades) como se representa en la figura 27 del documento WO2014/074727. En algunos casos, se enriquecen las proteínas que tienen solo una subunidad modificada. En dichos casos, la segunda proporción es 1 segunda subunidad por (n-1) primeras subunidades, donde n es el número de subunidades que comprende la proteína.

La primera proporción puede ser la misma que la segunda proporción, sin embargo, esto no se requiere. En algunos casos, las proteínas que tienen monómeros mutados se pueden formar menos eficazmente que las que no tienen subunidades mutadas. Si este es el caso, la primera proporción puede ser mayor que la segunda proporción (por ejemplo, si se desea una segunda proporción de 1 subunidad mutada con respecto a 6 no mutadas en un nanoporo, formar un número adecuado de 1:6 proteínas puede requerir mezclar las subunidades en una proporción mayor que 1:6).

Las proteínas que tienen segundas proporciones de subunidades diferentes se pueden comportar de manera diferente (por ejemplo, tener diferentes tiempos de retención) en una separación. En algunos casos, las proteínas se fraccionan usando cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Puesto que las primeras y segundas subunidades pueden ser idénticas aparte de la modificación, el número de modificaciones en la proteína puede servir como base para la separación. En algunos casos, la primera o bien la segunda subunidad tienen una marca de purificación (por ejemplo, además de la modificación) para permitir o mejorar la eficacia del fraccionamiento. En algunos casos, se usa una marca polihistidina (marca His), una marca estreptavidina (marca Strep) u otra marca peptídica. En algunos casos, la primera y segunda subunidad comprenden cada una diferentes marcas y la etapa de fraccionamiento fracciona en base a cada marca. En el caso de una marca His, se crea una carga en la marca a pH bajo (los residuos de histidina se cargan positivamente por debajo del pKa de la cadena lateral). Con una diferencia significativa de carga en una de las moléculas de aHL en comparación con las otras, se puede usar cromatografía de intercambio iónico para separar los oligómeros que tienen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las subunidades de aHL "marcadas con carga". En principio, esta marca de carga puede ser una cadena de cualquier aminoácido que porte una carga uniforme. La figura 28 y figura 29 muestran ejemplos de fraccionamiento de nanoporos en base a una marca His. La figura 28 muestra una curva de absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros, absorbancia ultravioleta a 260 nanómetros y conductividad. Los picos corresponden a nanoporos con diversas proporciones de subunidades modificadas y no modificadas. La figura 29 del documento WO2014/074727 muestra el fraccionamiento de nanoporos de aHL y mutantes de los mismos usando tanto marca His como marcas Strep.

En algunos casos, una entidad (por ejemplo, una polimerasa) se une a la proteína después del fraccionamiento. La proteína puede ser un nanoporo y la entidad puede ser una polimerasa. En algunos casos, el procedimiento comprende además insertar las proteínas que tienen las segundas subunidades de proporción en una bicapa.

En algunas situaciones, un nanoporo puede comprender una pluralidad de subunidades. Se puede unir una polimerasa a una de las subunidades y al menos una y menos que todas las subunidades comprenden una primera marca de purificación. En algunos ejemplos, el nanoporo es hemolisina alfa o una variante de la misma. En algunos casos, todas las subunidades comprenden una primera marca de purificación o una segunda marca de purificación. La primera marca de purificación puede ser una marca polihistidina (por ejemplo, en la subunidad que tiene la polimerasa unida).

Polimerasa unida a nanoporo

En algunos casos, una polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa) se une y/o se localiza próxima al nanoporo. La polimerasa se puede unir al nanoporo antes o después de que el nanoporo se incorpore en la membrana. En algunos casos, el nanoporo y la polimerasa son una proteína de fusión (es decir, una única cadena polipeptídica).

La polimerasa se puede unir al nanoporo de cualquier forma adecuada. En algunos casos, la polimerasa se une al monómero proteico de nanoporo (por ejemplo, hemolisina) y, a continuación, se ensambla el heptámero de nanoporo completo (por ejemplo, en una proporción de un monómero con una polimerasa unida con respecto a 6 monómeros de nanoporo (por ejemplo, hemolisina) sin una polimerasa unida). El heptámero de nanoporo se puede insertar a continuación en la membrana.

Otro procedimiento para unir una polimerasa a un nanoporo implica unir una molécula conectora a un monómero de hemolisina o mutar un monómero de hemolisina para tener un sitio de unión y, a continuación, ensamblar el heptámero de nanoporo completo (por ejemplo, en una proporción de un monómero con conector y/o sitio de unión con respecto a 6 monómeros de hemolisina sin conector y/o sitio de unión). A continuación, se puede unir una polimerasa al sitio de unión o conector de unión (por ejemplo, en bloque, antes de insertarlo en la membrana). La polimerasa también se puede unir al sitio de unión o conector de unión después de que el nanoporo (por ejemplo, heptámero) se forme en la membrana. En algunos casos, se inserta una pluralidad de pares nanoporo-polimerasa en una pluralidad de membranas (por ejemplo, dispuestas sobre los pocillos y/o electrodos) del biochip. En algunos casos, la unión de la polimerasa al complejo de nanoporo se produce en el biochip encima de cada electrodo.

La polimerasa se puede unir al nanoporo con cualquier química adecuada (por ejemplo, enlace covalente y/o conector). En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo con grapas moleculares. En algunos casos, las grapas moleculares comprenden tres secuencias de aminoácidos (indicadas como conectores A, B y C). El conector A se puede extender desde un monómero de hemolisina, el conector B se puede extender desde la polimerasa, y el conector C puede unir a continuación los conectores A y B (por ejemplo, envolviendo ambos conectores A y B) y, por tanto, la polimerasa al nanoporo. El conector C también se puede construir para formar parte del conector A o conector B, reduciendo por tanto el número de moléculas conectoras.

En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo usando la química Solulink™. Solulink™ puede ser una reacción entre HyNic (ácido 6-hidracino-nicotínico, una hidracina aromática) y 4FB (4-formilbenzoato, un aldehído aromático). En algunos casos, la polimerasa se une al nanoporo usando la química Click (disponible de LifeTechnologies, por ejemplo). En algunos casos, se introducen mutaciones de dedos de cinc en la molécula de hemolisina y, a continuación, se usa una molécula (por ejemplo, una molécula intermedia de ADN) para unir la polimerasa a los sitios de dedos de cinc en la hemolisina.

Otros conectores que pueden ser útiles en la unión de la polimerasa a un nanoporo son el enlace genético directo (por ejemplo, el conector de aminoácidos (GGGGS)1-3 (SEQ ID NO: 12)), el enlace mediado por transglutaminasa (por ejemplo, RSKLG (SEQ ID NO: 13)), el enlace mediado por sortasa y enlace químico a través de modificaciones de cisteína. Los conectores específicos contemplados como útiles en el presente documento son (GGGGS)i -3 (SEQ ID NO: 12), marca K (RSKLG (SEQ ID NO: 13)) en el extremo N, sitio ATEV (12-25), sitio ATEv+extremo N de SpyCatcher (12-49).

Configuración del aparato

El nanoporo se puede formar o incluirse de otro modo en una membrana dispuesta contigua a un electrodo sensor de un circuito sensor, tal como un circuito integrado. El circuito integrado puede ser un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC). En algunos ejemplos, el circuito integrado es un transistor de efecto de campo o un semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS). El circuito sensor se puede situar en un chip u otro dispositivo que tenga el nanoporo, o fuera del chip o dispositivo, tal como en una configuración fuera de chip. El semiconductor puede ser cualquier semiconductor, incluyendo, sin limitación, los semiconductores del grupo IV (por ejemplo, silicio) y del grupo III-V (por ejemplo, arseniuro de galio). Véase, por ejemplo, el documento WO 2013/123450, para la configuración del aparato y dispositivo para detectar un nucleótido o marca.

Se pueden usar sensores basados en poros (por ejemplo, biochips) para consulta electrónica de moléculas individuales. Un sensor basado en poros puede incluir un nanoporo de la presente divulgación formado en una membrana que se dispone contigua o próxima a un electrodo sensor. El sensor puede incluir un contraelectrodo. La membrana incluye un lado trans (es decir, un lado orientado hacia el electrodo sensor) y un lado cis (es decir, un lado orientado hacia el contraelectrodo).

En la divulgación experimental que sigue se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); |jM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); jmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); kg (kilogramos); jg (microgramos); l (litros); ml (mililitros); j l (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); jm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados centígrados); h (horas); min (minutos); s (segundos); ms (milisegundos); dN6P (desoxinucleótidos hexafosfato).

Ejemplos

La polimerasa original para los ejemplos 3-5 fue la SEQ ID NO: 1 que comprende las mutaciones T529M+S366A+A547F (SEQ ID NO: 8).

Ejemplo 1

Mutagénesis dirigida

Este ejemplo ilustra la introducción de una mutación en una polimerasa pol6 en una posición deseada.

El ADN que codifica la pol6 natural marcada con His se adquirió de una fuente comercial (DNA 2.0, Menlo Park, California). Se verificó la secuencia por secuenciación.

Para el cribado de mutantes, se expresó la polimerasa tal cual (N-ter His-Pol6). Para someter a prueba los resultados positivos de pol en el chip, se genomanipuló en un dominio de SpyCatcher en el extremo N o extremo C de Pol6.

Las posiciones racionales para afectar a la actividad exonucleasa de Pol6 se identificaron en base a modelos de homología de estructuras cristalinas conocidas.

Para el cribado principal, cada una de las posiciones racionales se mutaron en Gly, Ala, Leu, Glu, Gln, Lys, His, Tyr, Pro, Trp, Thr, Ser, Arg, Phe o Met usando el protocolo de mutagénesis Q5.

Los cebadores para cada reacción de mutagénesis se diseñaron usando el protocolo de NEBaseChanger y se encargaron en formato de placa de 96 pocillos de IDT.

Los cebadores directo e inverso se fosforilaron en 5' en formato de alto rendimiento (HTP) usando la polinucleotidocinasa (PNK) T4 adquirida en NEB. Una reacción típica de 25 |jl contenía 15 |jl de cebador a 10 jM, 5 j l de tampón de reacción 5X (de NEB), 1,25 j l de enzima PNK, 3,75 j l de agua. Se realizó la reacción a 37 °C durante 30 min y se termoinactivó la enzima a 65 °C durante 20 min.

Se realizó la mutagénesis por PCR usando ADN polimerasa Q5 de NEB. Una reacción típica de 25 j l contenía 5 j l de tampón Q5, 5 j l de potenciador de GC, 0,5 j l de dNTP 10 mM, 1,25 j l de cebadores directo e inverso de mutagénesis fosforilada 10 jM, 0,25 j l de polimerasa Q5 y 1 j l de 5 ng/ml de molde de Pol6 natural, es decir, His-Pol6, y 10,75 j l de H²O.

Una vez que se completa la PCR, se añadieron 0,5 j l de Dpn1 a 25 j l de la mezcla de PCR y se incubó a 37 °C durante 1 h.

Añadir 2,5 j l de producto de PCR tratado con Dpn1 con 2,5 j l de Blunt/TA Ligase Master Mix. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h.

Añadir 1 j l de mezcla de fijación a 20 j l de células BL21DE3 en 96 pocillos (EMD Millipore) e incubar en hielo durante 5 min.

Choque térmico a 42 °C durante exactamente 30 s usando el dispositivo de PCR y poner en hielo durante 2 min. Añadir 80 j l de SOC e incubar en una estufa de incubación a 37 °C durante 1 h sin agitar.

Añadir 100 j l de SOC o agua ultrapura y sembrarlas en placas con LB-agar de 48 pocillos con 50-100 jg/ml de kanamicina.

Ejemplo 2

Expresión y purificación

El siguiente ejemplo detalla cómo se expresaron y purificaron las variantes de pol6 usando un procedimiento de alto rendimiento.

El ADN que codifica las variantes en el vector pD441 (plásmido de expresión) se transformó en E. coli competente y se prepararon caldos de glicerol. Comenzando a partir de una pequeña selección del caldo de glicerol, cultivar 1 ml de cultivo iniciador en LB con glucosa al 0,2 % y 100 jg/ml de kanamicina durante aproximadamente 8 h. Transferir 25 j l de cultivo iniciador en fase logarítmica a 1 ml de medio de expresión (medio de autoinducción Terrific Broth (TB) complementado con glucosa al 0,2 %, fosfato de potasio 50 mM, MgCl2 5 mM y 100 jg/ml de kanamicina) en placas de 96 pocillos profundos. Se incubaron las placas con agitación a 250-300 rpm durante 36-40 h a 28 °C.

A continuación, se recogieron las células por medio de centrifugación a 3200*g durante 30 minutos a 4 °C. Se decantó el medio y se resuspendió el sedimento celular en 200 j l de tampón de lisis preenfriado (fosfato de potasio 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween20 al 0,5 %, TCEP 5 mM, imidazol 10 mM, PMSF1 mM, BugBuster 1X, 100 jg/ml de inhibidores de lisozima y proteasa) e incubar a temperatura ambiente durante 20 min con agitación suave. A continuación, añadir 20 j l de un caldo 10x a una concentración final de 100 jg/ml de DNasa, MgCl25 mM, 100 jg/ml de RNasa I e incubar en hielo durante 5-10 min para producir un lisado. Complementar el lisado con 200 j l de fosfato de potasio 1 M, pH 7,5 (la concentración final será de aproximadamente 0,5 M de fosfato de potasio en 400 j l de lisado) y filtrar a través de placas de filtro Pall (pieza n.° 5053, filtros de 3 micrómetros) por medio de centrifugación a aproximadamente 1500 rpm a 4 °C durante 10 minutos. A continuación, se aplicaron los lisados clarificados a placas de cobalto His-Pur de 96 pocillos equilibradas (Pierce, pieza n.° 90095) y se permitió la unión durante 15-30 min.

Se recogió el flujo pasante (FT) por centrifugación a 500xG durante 3 min. A continuación, se lavó 3 veces el FT con 400 pl de tampón de lavado 1 (fosfato de potasio 0,5 M pH 7,5, NaCl 1 M TCEP 5 mM, imidazol 20 mM+Tween20 al 0,5 %). A continuación, se lavó el FT dos veces en 400 pl de tampón de lavado 2 (Tris 50 mM pH 7,4, KCl 200 mM, TCEP 5 mM, Tween20 al 0,5 %, imidazol 20 mM).

Se eluyó la Pol6 usando 200 pl de tampón de elución (Tris 50 mM pH 7,4, KCl 200 mM, TCEP 5 mM, Tween20 al 0,5 %, imidazol 300 mM, glicerol al 25 %) y se recogió después de una incubación de 1-2 min. Volver a aplicar eluido a la misma placa con His-Pur 2-3 veces para obtener Pol6 concentrada en el eluido. La polimerasa purificada es >95 % pura como se evalúa por SDS-PAGE. La concentración de proteína es de ~3 pM (0,35 mg/ml) con una proporción 260/280 de 0,6 como se evalúa por Nanodrop.

La actividad polimerasa se verifica por ensayo de desplazamiento de fluorescencia (véase el ejemplo 4).

Ejemplo 3

Ensayo de actividad exonucleasa

Este ejemplo muestra un procedimiento para determinar la actividad exonucleasa de variantes.

El ensayo es un ensayo basado en fluorescencia. En ausencia de nucleótidos y en presencia de Mg+2, se inicia la actividad exonucleasa de la polimerasa. La polimerasa comienza retirando los residuos de uno en uno del molde de ADN; y, a medida que continúa cortando, libera el fluoróforo del extintor, lo que hace que la señal se incremente. Véase la FIG. 1.

Las secuencias usadas fueron como sigue:

Oligonucleótido de desplazamiento de horquilla (es decir, molde de desplazamiento ATTO-488)

5’- /5ATT0488N/AGA GTG ATA GTA TGA TTA TGT AGA TGT AGG ATT TGA

TAT GTG AGT AGC CGA ATG AAA CCT TTG GTT TCA TTC GG-3’ (SEQ ID NO:

6)

Oligonucleótido corto complementario

5’- TTT TCA TAT CAA ATC CTA CAT CTA CAT AAT CAT ACT ATC ACT

CT/3IABkFQ/-3’ (SEQ ID NO: 7)

El fluoróforo usado fue Atto-488. El extintor usado fue lowa Black® FQ 3'. El cebador hibrida con el molde en una proporción 1:1 usando el siguiente protocolo de PCR:

i. 95 °C durante 5 min

ii. 93 °C durante 50 s; disminuir 2 grados/ciclo hasta que la temperatura alcance 61 °C

iii. 59 °C durante 25 s; disminuir 2 grados/ciclo hasta que la temperatura alcance 35 °C

a continuación, se almacena a 4 °C hasta su uso.

Se preparó una mezcla de reacción final de 40 pl mezclando 20 pl de tampón A (glutamato de potasio 75 mM, HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BSA y molde de desplazamiento ATTO-488 50 nM (previamente hibridado al cebador) (concentración final), 5 pl de polimerasa (concentración final 100 nM) y 15 pl de tampón B (HEPES 25 mM pH 7,5, glutamato de potasio 75 mM, Triton X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BSA y MgCl²5 mM; concentración final).

Se mezclaron 20 pl de tampón A con 5 pl de polimerasa y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se usó un lector de placas BMG LABTECH y se programó de modo que iniciara la reacción añadiendo 15 pl de tampón B y se midió el incremento de fluorescencia cada 8 segundos (longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de emisión de 520 nm) durante un período de más de 2 horas. Los mutantes se seleccionaron para un estudio adicional si se observaba una disminución de la señal de fluorescencia durante un período de 2 horas en comparación con los controles.

Los resultados para variantes seleccionadas se muestran en la FIG. 2.

Ejemplo 4

Ensayo de desplazamiento

Este ejemplo muestra la actividad de desplazamiento de hebra de variantes carentes de actividad exonucleasa (exo-).

El ensayo de desplazamiento de hebra de una polimerasa mide la capacidad de la enzima para moverse a través del ADN bicatenario durante la síntesis. Este ensayo se basa en la fluorescencia, donde los moldes de ADN que no se han extendido tienen baja fluorescencia y los moldes que se han extendido desplazan una parte de ADN que a continuación les permite emitir más fluorescencia que el molde de ADN no extendido. Véase la FIG. 1. En presencia de Mg2+ y nucleótidos, la polimerasa se extiende a lo largo del molde en horquilla y desplaza el oligonucleótido extintor, lo que da como resultado un incremento de la fluorescencia.

El fluoróforo usado fue Cy5 y el extintor fue 3BHQ-2.

Las secuencias usadas fueron como sigue:

Oligonucleótido de desplazamiento de horquilla (es decir, molde de desplazamiento Cv5) (SEQ ID NO: 4 y 14)

5- /5Cy5/AGA GTG ATA GTA TGA TTA TGT AGA TGT AGG ATT TGA TAT GTG

AGT AGC CGA ATG AAA CCT T/¡SpC3/TT GGT TTC ATT CGG-3

Oligonucleótido corto complementario (SEQ ID NO: 5)

5'- TTT TCA TAA TCA TAC TAT CAC TCT /3BHQ_2/-3'

Se preparó una mezcla de reacción final de 45 pl mezclando 23 pl de tampón A (glutamato de potasio 75 mM, HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BSA, molde corto Cy5 y dN6P 20 pM (concentración final), 4 pl de polimerasa (concentración final de 100 nM), 10 pl de tampón B (HEPES 25 mM pH 7,5, glutamato de potasio 300 mM, Triton X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BSA y MgCl²5 mM; concentración final) y 8 pl de glutamato de potasio 1 M.

Se mezclaron 23 pl de tampón A con 4 pl de Pol y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se usó y programó un lector de placas BMG LABTECH de modo que añade 8 pl de K-Glu 1 M, agita durante 5 s, espera 5 s e inicia la reacción mediante la adición de 10 pl de tampón B y mide la fluorescencia (excitación a 648 nm y emisión a 668 nm) cada 0,1 s durante 100 s.

A continuación, se realizó el cálculo del tiempo hasta la imposición y, por tanto, el kcat.

Los resultados ejemplares de desplazamiento se muestran en la FIG. 3.

Ejemplo 5

Ensayo de círculo rodante

Este ejemplo muestra otro procedimiento para determinar el desplazamiento de hebra, así como la capacidad de la polimerasa para sintetizar una nueva hebra basada en el ADN molde.

El ensayo de círculo rodante (RCA) es uno en el que se usa un molde de ADN circular y se somete a prueba la ADN polimerasa para determinar su capacidad para dar la vuelta al círculo muchas veces. Este ensayo es otro tipo de ensayo de desplazamiento de hebra y somete a prueba específicamente la actividad de desplazamiento de hebra de la enzima. Se monitoriza usando geles para medir su patrón de migración. Típicamente, cuantas más veces se desplaza la enzima alrededor del círculo, más grande es la parte de ADN que sintetiza y más lento migra el fragmento resultante por el gel.

Se preparó una mezcla de reacción final de 50 pl mezclando 20 pl de tampón A (glutamato de potasio 75 mM, HEPES 25 mM pH 7,5, EDTA 0,2 mM, Triton X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BSA, HFCirc10 100 nM (molde circular interno; SEQ ID NO: 9) complejado con cebador (SEQ ID NO: 10) y dN6P 40 pM; concentración final), 10 pl de polimerasa y 20 pl de tampón B (HEPES 25 mM pH 7,5, glutamato de potasio 300 mM, Tritón X-100 al 0,05 %, TCEP 5 mM, 25 pg/ml de BsA y MgCl²5 mM; concentración final).

Se mezclaron 20 pl de tampón A con 10 pl de polimerasa y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se inició mediante la adición de 20 pl de tampón B. Se retiraron 15 pl de la mezcla anterior en el tiempo T = 0, T = 20 min y T = 40 min y se añadieron a 15 pl de terminador de reacción (formamida, EDTA 50 mM, tinte Orange-G) para terminar la reacción. Las muestras de los puntos temporales se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos. Se añadieron 3 pl de SYBRGold a los 30 pl de mezcla terminada. A continuación, las muestras se procesaron en un gel de agarosa al 1,2 % a 130 V durante aproximadamente 65-75 min. Se analizó el gel y se seleccionaron los mutantes que tienen un producto más grande y más nítido que los controles para su posterior estudio.

Los resultados ejemplares se muestran en la FIG. 4 y la FIG. 5.

Ejemplo 6

Actividad en chip

Este ejemplo muestra que las polimerasas variantes tienen propiedades mejoradas de desplazamiento de hebra. La polimerasa original (SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 11) y la polimerasa variante (Y212K en una estructura de base de SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 11) se analizaron en un biochip para determinar el efecto de una mutación en una o más posiciones de la polimerasa. Se diseñó el ensayo para medir el tiempo entre capturas de una molécula nucleotídica marcada por una ADN polimerasa unida al nanoporo usando voltajes alternos, es decir, ondas cuadradas.

En este ejemplo se usó el molde de secuenciación HP7, un molde de mancuernas interno.

La polimerasa Pol6 variante se pone en contacto con el molde de ADN para formar el complejo Pol6-ADN variante, que posteriormente se une a un nanoporo incluido en una bicapa lipídica sobre un pocillo en un chip sensor semiconductor, también llamado biochip. Se forma la bicapa lipídica y se inserta el nanoporo con el complejo polimerasa variante Pol6-ADN unido, es decir, el complejo de secuenciación de nanoporo Pol6 variante como se describe en el documento PCT/US2014/061853 (titulado "Methods for Forming Lipid Bilayers on Biochips" y presentado 23 de octubre de 2014).

De forma alternativa, el nanoporo se incluye en la bicapa lipídica y el complejo variante Pol6-ADN se une in situ. Se usó una mezcla de nucleótidos marcados con cada nucleótido que tenía una marca diferente, es decir, los cuatro nucleótidos (A, T, G y C) tenían marcas diferentes, en un tampón (KGlu 300 mM, MgCh 3 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0), y los nucleótidos marcados fluyeron sobre los nanoporos a una velocidad de 0,834 |jl/segundo. Se aplica una corriente alterna de 210 mV pico a pico a 25 Hz, y se evaluó la captura de marcas de nucleótidos a medida que la polimerasa unida a nanoporo incorporaba bases de nucleótidos a la hebra de ADN copiada. El tiempo entre capturas consecutivas de marcas se denomina en el presente documento tiempo de espera. El tiempo de espera incluye kaso, tasa de asociación para el nucleótido entrante y kdesplaz, la tasa de desplazamiento de la hebra en el molde en dirección 3'. Por tanto, se puede analizar la capacidad de la polimerasa para avanzar a un nuevo nucleótido, que depende de que la polimerasa desplace la hebra complementaria.

La capacidad de dos polimerasas para desplazar la hebra complementaria en un ADN molde se muestra por el tiempo de espera. D44^a es una mutación de aspartato catalítico en el dominio exonucleasa y es la mutación de eliminación de actividad exonucleasa más comúnmente usada. Esto afecta el desplazamiento de hebra y provoca largos tiempos de espera durante la secuenciación. Y212K (una mutación de eliminación de actividad exonucleasa proporcionada en el presente documento) ha mejorado el desplazamiento de hebra, lo que da como resultado una tasa de progresión más rápida y un tiempo de espera disminuido. Se observó una duplicación eficaz de la tasa de progresión, es decir, tasa de extensión o secuenciación, con Y212K en comparación con la mutación D44A de pol6 (datos no mostrados).

Texto libre del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 - Pol6 natural (ADN polimerasa [fago de Clostridium phiCPV41]: GenBank: AFH27113.1)

1 mdkhtqyvke hsfnydeykk anfdkiecli fdtesctnye ndntgarvyg

wglgvtrnhn 061 miygqnlnqf wevcqnifnd

wyhdnkhtik itktkkgfpk rkyikfpiav hnlgwdvefl 121

kyslvengfn ydkgllktvf skgapyqtvt dveepktfhi vqnnnivygc

nvymdkffev 181 enkdgsttei glcldffdsy kiitcaesqf

hnyvhdvdpm fykmgeeydy dtwrspthkq 241 ttlelryqyn

diymlrevie qfyidglcgg elpltgmrta ssiafnvlkk mtfgeektee

301 gyinyfeldk ktkfeflrkr iemesytggy thanhkavgk tinkigcsld

inssypsqma 361 ykvfpygkpv rktwgrkpkt eknevyliev

gfdfvepkhe eyaldifkig avnskalspi 421 tgavsgqeyf

ctnikdgkai pvykelkdtk lttnynvvlt sveyefwikh fnfgvfkkde

481 ydcfevdnle ftglkigsil yykaekgkfk pyvdhftkmk venkklgnkp

ltnqakliln 541 gaygkfgtkq nkeekdlimd knglltftgs

vteyegkefy rpyasfvtay grlqlwnaii 601 yavgvenfly

cdtdsiycnr evnsliedmn aigetidkti lgkwdvehvf dkfkvlgqkk

661 ymyhdckedk tdlkccglps darkiiigqg fdefylgknv egkkqrkkvi

ggcllldtlf 721 tikkimf

SEQ ID NO: 2 - Pol6 (con marca His)

MHHHHHHHHS GGSDKHTQYV KEHSFNYDEY KKANFDKIEC LIFDTESCTN 50

YENDNTGARV YGWGLGVTRN HNMIYGQNLN QFWEVCQNIF NDWYHDNKHT

100

IKITKTKKGF PKRKYIKFPI AVHNLGWDVE FLKYSLVENG FNYDKGLLKT

150

VFSKGAPYQT VTDVEEPKTF HIVQNNNIVY GCNVYMDKFF EVENKDGSTT

200

EIGLCLDFFD SYKIITCAES QFHNYVHDVD PMFYKMGEEY DYDTWRSPTH

250

KQTTLELRYQ YNDIYMLREV IEQFYIDGLC GGELPLTGMR TASSIAFNVL

300

KKMTFGEEKT EEGYINYFEL DKKTKFEFLR KRIEMESYTG GYTHANHKAV

350

GKTINKIGCS LDINSSYPSQ MAYKVFPYGK PVRKTWGRKP KTEKNEVYLI

400

EVGFDFVEPK HEEYALDIFK IGAVNSKALS PITGAVSGQE YFCTNIKDGK

450

AIPVYKELKD TKLTTNYNW LTSVEYEFWI KHFNFGVFKK DEYDCFEVDN

500

LEFTGLKIGS ILYYKAEKGK FKPYVDHFTK MKVENKKLGN KPLTNQAKLI

550

LNGAYGKFGT KQNKEEKDLI MDKNGLLTFT GSVTEYEGKE FYRPYASFVT

600

AYGRLQLWNA IIYAVGVENF LYCDTDSIYC NREVNSLIED MNAIGETIDK

650

TILGKWDVEH VFDKFKVLGQ KKYMYHDCKE DKTDLKCCGL PSDARKIIIG

700

QGFDEFYLGK NVEGKKQRKK VIGGCLLLDT LFTIKKIMF*

739

SEQ ID NO: 3 - Pol6 con marca His (secuencia de ADN) ATGCATCACC ATCATCATCA CCACCACAGC GGCGGTTCCG ACAAACACAC 50

GCAGTACGTC AAAGAGCATA GCTTCAATTA TGACGAGTAT AAGAAAGCGA 100

ATTTCGACAA GATCGAGTGC CTGATCTTTG ACACCGAGAG CTGCACGAAT 150

TATGAGAACG ATAATACCGG TGCACGTGTT TACGGTTGGG GTCTTGGCGT 200

CACCCGCAAC CACAATATGA TCTACGGCCA AAATCTGAAT CAGTTTTGGG 250

AAGTATGCCA GAACATTTTC AATGATTGGT ATCACGACAA CAAACATACC 300

ATTAAGATTA CCAAGACCAA GAAAGGCTTC CCGAAACGTA AGTACATTAA 350

GTTTCCGATT GCAGTTCACA ATTTGGGCTG GGATGTTGAA TTCCTGAAGT 400

ATAGCCTGGT GGAGAATGGT TTCAATTACG ACAAGGGTCT GCTGAAAACT 450

GTTTTTAGCA AGGGTGCGCC GTACCAAACC GTGACCGATG TTGAGGAACC 500

GAAAACGTTC CATATCGTCC AGAATAACAA CATCGTTTAT GGTTGTAACG 550

TGTATATGGA CAAATTCTTT GAGGTCGAGA ACAAAGACGG CTCTACCACC 600

GAGATTGGCC TGTGCTTGGA TTTCTTCGAT AGCTATAAGA TCATCACGTG 650

TGCTGAGAGC CAGTTCCACA ATTACGTTCA TGATGTGGAT CCAATGTTCT 700

ACAAAATGGG TGAAGAGTAT GATTACGATA CTTGGCGTAG CCCGACGCAC 750

AAGCAGACCA CCCTGGAGCT GCGCTACCAA TACAATGATA TCTATATGCT 800

GCGTGAAGTC ATCGAACAGT TTTACATTGA CGGTTTATGT GGCGGCGAGC 850

TGCCGCTGAC CGGCATGCGC ACCGCTTCCA GCATTGCGTT CAACGTGCTG 900

AAAAAGATGA CCTTTGGTGA GGAAAAGACG GAAGAGGGCT ACATCAACTA 950

TTTTGAATTG GACAAGAAAA CCAAATTCGA GTTTCTGCGT AAGCGCATTG 1000

AAATGGAATC GTACACCGGT GGCTATACGC ACGCAAATCA CAAAGCCGTT 1050

GGTAAGACTA TTAACAAGAT CGGTTGCTCT TTGGACATTA ACAGCTCATA 1100

CCCTTCGCAG ATGGCGTACA AGGTCTTTCC GTATGGCAAA CCGGTTCGTA 1150

AGACCTGGGG TCGTAAACCA AAGACCGAGA AGAACGAAGT TTATCTGATT 1200

GAAGTTGGCT TTGACTTCGT GGAGCCGAAA CACGAAGAAT ACGCGCTGGA 1250

TATCTTTAAG ATTGGTGCGG TGAACTCTAA AGCGCTGAGC CCGATCACCG 1300

GCGCTGTCAG CGGTCAAGAG TATTTCTGTA CGAACATTAA AGACGGCAAA 1350

GCAATCCCGG TTTACAAAGA ACTGAAGGAC ACCAAATTGA CCACTAACTA 1400

CAATGTCGTG CTGACCAGCG TGGAGTACGA GTTCTGGATC AAACACTTCA 1450

ATTTTGGTGT GTTTAAGAAA GACGAGTACG ACTGTTTCGA AGTTGACAAT 1500

CTGGAGTTTA CGGGTCTGAA GATTGGTTCC ATTCTGTACT ACAAGGCAGA 1550

GAAAGGCAAG TTTAAACCTT ACGTGGATCA CTTCACGAAA ATGAAAGTGG 1600

AGAACAAGAA ACTGGGTAAT AAGCCGCTGA CGAATCAGGC AAAGCTGATT 1650

CTGAACGGTG CGTACGGCAA ATTCGGCACC AAACAAAACA AAGAAGAGAA 1700

AGATTTGATC ATGGATAAGA ACGGTTTGCT GACCTTCACG GGTAGCGTCA 1750

CGGAATACGA GGGTAAAGAA TTCTATCGTC CGTATGCGAG CTTCGTTACT 1800

GCCTATGGTC GCCTGCAACT GTGGAACGCG ATTATCTACG CGGTTGGTGT 1850

GGAGAATTTT CTGTACTGCG ACACCGACAG CATCTATTGT AACCGTGAAG 1900

TTAACAGCCT CATTGAGGAT ATGAACGCCA TTGGTGAAAC CATCGATAAA 1950

ACGATTCTGG GTAAATGGGA CGTGGAGCAT GTCTTTGATA AGTTTAAGGT 2000

CCTGGGCCAG AAGAAGTACA TGTATCATGA TTGCAAAGAA GATAAAACGG 2050

ACCTGAAGTG TTGCGGTCTG CCGAGCGATG CCCGTAAGAT TATCATTGGT 2100

CAAGGTTTCG ACGAGTTTTA TCTGGGCAAA AATGTCGAAG GTAAGAAGCA 2150

ACGCAAAAAA GTGATCGGCG GTTGCCTGCT GCTGGACACC CTGTTTACGA 2200

TCAAGAAAAT CATGTTCTAA 2220

SEQ ID NO: 4 y 14 - Oligonucleótido de horquilla del ensayo de desplazamiento con iSpC3, un espaciador de 3 carbonos

AGA GTG ATA GTA TGA TTA TGT AGA TGT AGG ATT TGA TAT GTG AGT

AGC CGA ATG AAA CCT T/iSpC3/TT GGT TTC ATT CGG

SEQ ID NO: 5 - Oligonucleótido corto del ensayo de desplazamiento

TTT TCA TAA TCA TAC TAT CAC TCT

SEQ ID NO: 6 - Oligonucleótido de horquilla de ensayo de exonucleasa

AGA GTG ATA GTA TGA TTA TGT AGA TGT AGG ATT TGA TAT GTG AGT

AGC CGA ATG AAA CCT TTG GTT TCA TTC GG

SEQ ID NO: 7 - Oligonucleótido corto de ensayo de exonucleasa

TTT TCA TAT CAA ATC CTA CAT CTA CAT AAT CAT ACT ATC ACT CT SEQ ID NO: 8 - Variante de pol6 (T529M+S366A+A547F; sin marca His)

1 MDKHTQYVKE HSFNYDEYKK ANFDKIECLI FDTESCTNYE NDNTGARVYG WGLGVTRNHN 061 MIYGQNLNQF WEVCQNIFND WYHDNKHTIK ITKTKKGFPK RKYIKFPIAV HNLGWDVEFL 121 KYSLVENGFN YDKGLLKTVF SKGAPYQTVT DVEEPKTFHI VQNNNIVYGC NVYMDKFFEV 181 ENKDGSTTEI GLCLDFFDSY KIITCAESQF HNYVHDVDPM FYKMGEEYDY DTWRSPTHKQ 241 TTLELRYQYN DIYMLREVIE QFYIDGLCGG ELPLTGMRTA SSIAFNVLKK MTFGEEKTEE

301 GYINYFELDK KTKFEFLRKR IEMESYTGGY THANHKAVGK TINKIGCSLD INSAYPSQMA 361 YKVFPYGKPV RKTWGRKPKT EKNEVYLIEV GFDFVEPKHE EYALDIFKIG AVNSKALSPI 421 TGAVSGQEYF CTNIKDGKAI PVYKELKDTK LTTNYNWLT SVEYEFWIKH FNFGVFKKDE

481 YDCFEVDNLE FTGLKIGSIL YYKAEKGKFK PYVDHFMKMK VENKKLGNKP LTNQFKLILN 541 GAYGKFGTKQ NKEEKDLIMD KNGLLTFTGS VTEYEGKEFY RPYASFVTAY GRLQLWNAII 601 YAVGVENFLY CDTDSIYCNR EVNSLIEDMN AIGETIDKTI LGKWDVEHVF DKFKVLGQKK

661 YMYHDCKEDK TDLKCCGLPS DARKIIIGQG FDEFYLGKNV EGKKQRKKVI GGCLLLDTLF 721 TIKKIMF

SEQ ID NO: 9 - HFCirc10

CGC TCA CAC TCG CTC TCT CTA CGT CAC TCA TCT CAC TAC TGC ACT CTA CTC GAC ACT CTA CTA CAG CTA GCT CTC TCT ACG ACG CAC ATC ACG CTA CTA CAC TCT GCT CTA CAC TAC ACT CTC TCT ACA TCG CTC TAC TAC GCT CAT CTA SEQ ID NO: 10 - Cebador para HFCirc10

GTG TGA GCG TAG ATG AGC SEQ ID NO: 11 - Variante de pol6 (D44A+T529M+S366A+A547F; sin marca His) 1 MDKHTQYVKE HSFNYDEYKK ANFDKIECLI FATESCTNYE NDNTGARVYG WGLGVTRNHN 061 MIYGQNLNQF WEVCQNIFND WYHDNKHTIK ITKTKKGFPK RKYIKFPIAV HNLGWDVEFL 121 KYSLVENGFN YDKGLLKTVF SKGAPYQTVT DVEEPKTFHI VQNNNIVYGC NVYMDKFFEV 181 ENKDGSTTEI GLCLDFFDSY KIITCAESQF HNYVHDVDPM FYKMGEEYDY DTWRSPTHKQ 241 TTLELRYQYN DIYMLREVIE QFYIDGLCGG ELPLTGMRTA SSIAFNVLKK MTFGEEKTEE

301 GYINYFELDK KTKFEFLRKR IEMESYTGGY THANHKAVGK TINKIGCSLD INSAYPSQMA 361 YKVFPYGKPV RKTWGRKPKT EKNEVYLIEV GFDFVEPKHE EYALDIFKIG AVNSKALSPI 421 TGAVSGQEYF CTNIKDGKAI PVYKELKDTK LTTNYNWLT SVEYEFWIKH FNFGVFKKDE

481 YDCFEVDNLE FTGLKIGSIL YYKAEKGKFK PYVDHFMKMK VENKKLGNKP LTNQFKLILN 541 GAYGKFGTKQ NKEEKDLIMD KNGLLTFTGS VTEYEGKEFY RPYASFVTAY GRLQLWNAII 601 YAVGVENFLY CDTDSIYCNR EVNSLIEDMN AIGETIDKTI LGKWDVEHVF DKFKVLGQKK

661 YMYHDCKEDK TDLKCCGLPS DARKIIIGQG FDEFYLGKNV EGKKQRKKVI GGCLLLDTLF 721 TIKKIMF

Lista de citas

Literatura de patente

[1]Documento PCT/US2005/009702 (publicado como WO2006/028508 el 16 de marzo de 2006; Presidente y miembros de la Universidad de Harvard; titulado METHODS AND APPARATUS FOR CHARACTERIZING POLYNUCLEOTIDES).

[2] Documento PCT/US2011/065640 (publicado como WO2012/083249 el 21 de junio de 2012; Universidad de Columbia; titulado DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS USING MODIFIED NUCLEOTIDES AND NANOPORE DETECTION).

[3] Documento PCT/US2013/068967 (publicado como WO2014/074727 el 15 de mayo de 2014; Genia Technologies; titulado NUCLEIC ACID SEQUENCING USING TAGS).

[4] Documento PCT/US2013/046012 (Genia Technologies, Inc., titulado CHIP SET-UP AND HIGH-ACCURACY NUCLEIC ACID SEQUENCING, publicado el 19 de diciembre de 2013 como WO2013/188841).

[5] Documento US 2013/0053544 (Isis Innovation Limited) titulado Peptide Tag Systems That Spontaneously Form an Irreversible Link to Protein Partners via Isopeptide Bonds.

Literatura distinta de patente

[6] Altschul, S. F. et al., 1990

[7] Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997

[8] Ausubel, Frederick et al., (1992) Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Molecular Biology, 2.a ed., Greene Publishing Associates & John Wiley & Sons. Nueva York, N.Y.

[9] Gardner et al., Nucleic Acids Res. (2012) páginas 1-12 (doi: 10.1093/nar/gks330; Publicado en primer lugar en línea: 8 de mayo de 2012)

[10] Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)

[11] Johnson et al., Biochim Biophys Acta. mayo 2010; 1804(5): 1041-1048

[12] Kong et al., (1993) J. Biol. Chem. 268(3):1965-1975

[13]Lawyer et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:6427-647

[14] Li et al., J Mol Biol. 23 de enero de 2014;426(2):309-17

[15] Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)

[16] Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9.63-9.75 (que describe el marcaje terminal de ácidos nucleicos).

[17]Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.a ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994)

[18]Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987))

[19]Zakari y Howarth, (2010) Spontaneous Intermolecular Amide Bond Formation between Side Chains for Irreversible Peptide Targeting, J. Am. Chem. Soc., 132(13):4526-4527

[20]Zakari, B. et al., (2012) Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion, PNAS 109 (12):E690-E697.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1,

en la que dicha polimerasa modificada comprende una sustitución seleccionada de un grupo que consiste en D128H, Y242G/A/L/S, Y259G/K/Q, y

en la que dicha polimerasa modificada conserva una capacidad de desplazamiento de hebra.

2. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que dicha polimerasa modificada tiene al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

3. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que dicha polimerasa modificada se selecciona de uno de los siguientes:

a. T529M+S366A+A547F+Y242G/A/L/S

b. T529M+S366A+A547F+Y259G/K/Q

c. T529M+S366A+A547F+D128H

4. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que dicha polimerasa modificada tiene una tasa de extensión que es mayor que la de la polimerasa original.

5. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 4,

en la que la tasa de extensión es entre 1,5 y 5 veces mayor que la de la polimerasa original.

6. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 4,

en la que la tasa de extensión es al menos 1,5 veces mayor que la de la polimerasa original.

7. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 4,

en la que la tasa de extensión es al menos 2 veces mayor que la de la polimerasa original.

8. La ADN polimerasa modificada de la reivindicación 4,

en la que la tasa de extensión es al menos 3 veces mayor que la de la polimerasa original.

9. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 1,

en la que dicha polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera que es inferior a la de la polimerasa natural u original.

10. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 9,

en la que dicha polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera que es inferior al tiempo de espera de la polimerasa de acuerdo con SEQ ID NO: 11.

11. La ADN polimerasa modificada de acuerdo con la reivindicación 9,

en la que dicha polimerasa modificada tiene una mediana de tiempo de espera inferior a 3 segundos.