JP7157048B2

JP7157048B2 - Ｐｏｌ６ポリメラーゼバリアント

Info

Publication number: JP7157048B2
Application number: JP2019515475A
Authority: JP
Inventors: ベーニッツ－デュラット，マラ; スコ，ショーン; エア，アルナ; ヴェルスデルファー，ビグナ; エッカート，バーバラ; サルヴァボウマン，プリーティ; シュワブ，チャールズ・ワヤン; ヴンダーリッヒ，ダーフィット; クレオマ，アーノルド; レダーマン，イリア; タイ，アイリーン; マクガー，コリン・アレクサンダー; アマート，エヴァン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2022-10-19
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: WO2018054970A3; US20210071152A1; CN110114458A; JP2019531073A; US20190225952A1; US10851353B2; US10829747B2; EP3516053A2; US20180094249A1; WO2018054970A2

Description

[001]本明細書においては、特に、組換えＤＮＡ技術における適用により適する酵素を選択するよう設計された定向進化実験において同定される変異に基づくアミノ酸変化を含有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。

[002]ＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して相補的なＤＮＡ鎖を合成する酵素のファミリーである。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’末端に遊離のヌクレオチドを添加し、その結果、新しい鎖を５’から３’への方向に伸長させることができる。ほとんどのＤＮＡポリメラーゼは、重合活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を有する多機能タンパク質である。例えば、多くのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これらのポリメラーゼは、誤って組み込まれたヌクレオチドを認識することができ、酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により、その間違ったヌクレオチドが除去される（この活性は、プルーフリーディングとして知られる）。ヌクレオチドの除去後、ポリメラーゼは正しいヌクレオチドを再挿入することができ、複製が継続できる。多くのＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性も有する。

[003]ポリメラーゼには、ナノポアシーケンシングを含めた組換えＤＮＡの応用例における用途が見出されている。しかしながら、ＤＮＡ鎖は、１塩基あたり１μｓ～５μｓの速度で急速にナノポアを通過する。これにより記録は困難になり、またバックグラウンドノイズを受けやすくなり、単一ヌクレオチドの分解能を得ることができなくなる。したがって、ＤＮＡ鎖またはその断片のシーケンシングでは、検出可能なタグをヌクレオチドに使用することがある。よって、シーケンシングするＤＮＡの速度を制御する必要性だけでなく、改変ヌクレオチド、例えばタグを有するか、または有しないヌクレオチドポリリン酸を組み込むことなどの、（野生型酵素と比較して）改良された特性を有するポリメラーゼを提供する必要性がある。

[004]本発明は、産業用途または研究用途で使用される条件下での有利な表現型、例えば高い塩濃度で例えばタグ付きヌクレオチドなどの改変ヌクレオチドポリリン酸の組み込みを触媒することなどを与える変異を選択するよう設計された定向進化実験に基づいた、改変ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、変異体）を提供する。

[005]本発明は、他の態様の中でも、高塩条件においてタグを有するかまたは有さないポリリン酸ヌクレオチドの延長速度および解離速度が改善された改変ＤＮＡポリメラーゼを対象とする。

[006]本発明の一態様は、野生型（ＷＴ）Ｐｏｌ６（配列番号１；Ｈｉｓタグを含まない野生型ｐｏｌ６）に対するいくつかの世代の突然変異誘発により、ポリリン酸ヌクレオチドの延長速度およびヌクレオチド解離速度について選択された高度なポリメラーゼ変異を提供する。

[007]本発明者らは、いくつかの変異体が、タグを有するかまたは有さないポリリン酸ヌクレオチドを使用する蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づく置換アッセイに示されるように、改善された延長速度を有することを見出した。図１を参照のこと。

[008]いくつかの実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも大きいｋ_ｃａｔを有する。いくつかの実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも小さいｋ_ｏｆｆを有する。いくつかの実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼより少なくとも１．５、２．０または２．５倍大きいｋ_ｃａｔ／ｋ_ｏｆｆ（すなわち、比）を有する。

[009]本発明の一実施形態においては、
Ｙ３０、Ｉ４２、Ｄ４４、Ｅ４６、Ｃ４８、Ｇ６２、Ｇ６４、Ｗ１２７、Ｇ１４６、Ｔ１６２、Ｖ１６４、Ｉ１７２、Ｉ１７８、Ｓ１９８、Ｌ２０６、Ｆ２０９、Ａ２１８、Ｑ２２１、Ｆ２２２、Ｎ２２４、Ｙ２２５、Ｖ２２６、Ｈ２２７、Ｆ２３３、Ｙ２３４、Ｋ２３５、Ｍ２３６、Ｇ２３７、Ｄ２４１、Ｙ２４２、Ｄ２４３、Ｄ２６３、Ｉ２６４、Ｙ２６５、Ｍ２６６、Ｒ２６８、Ｅ２６９、Ｖ２７０、Ｇ２７８、Ｅ２８３、Ｌ２８４、Ｐ２８５、Ｍ２８９、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｓ２９３、Ｓ２９４、Ｉ２９５、Ａ２９６、Ｆ２９７、Ｎ２９８、Ｖ２９９、Ｅ３１１、Ｅ３１２、Ｙ３１４、Ｙ３３８、Ｖ３５０、Ｃ３５９、Ｓ３６０、Ｌ３６１、Ｓ３６６、Ｓ３６９、Ｍ３７１、Ａ３７２、Ｙ３７３、Ｋ３７４、Ｆ３７６、Ｋ３８０、Ｖ３８２、Ｒ３８８、Ｐ３９０、Ｅ３９６、Ｙ３９８、Ｌ３９９、Ｉ４００、Ｅ４０１、Ｆ４０４、Ｆ４０６、Ｋ４１０、Ｈ４１１、Ｙ４１４、Ａ４１５、Ｌ４１６、Ｄ４１７、Ｉ４１８、Ｓ４３０、Ｐ４３１、Ｉ４３２、Ｇ４３８、Ｄ４４８、Ｋ４５６、Ｌ４５８、Ｋ４６２、Ｔ４６４、Ｎ４６８、Ｖ４６９、Ｖ４７０、Ｌ４７１、Ｖ４７４、Ｅ４７５、Ｙ４７６、Ｅ４７７、Ｆ４７８、Ｗ４７９、Ｋ４８１、Ｈ４８２、Ｆ４８３、Ｅ５０２、Ｇ５０５、Ｌ５０６、Ｉ５０８、Ｓ５１０、Ｙ５１４、Ｋ５１８、Ｆ５２１、Ｋ５２２、Ｐ５２３、Ｙ５２４、Ｖ５２５、Ｄ５２６、Ｈ５２７、Ｆ５２８、Ｔ５２９、Ｋ５３０、Ｍ５３１、Ｖ５３３、Ｅ５３４、Ｎ５３５、Ｋ５３７、Ｌ５３８、Ｇ５３９、Ｋ５４１、Ｐ５４２、Ｌ５４３、Ｔ５４４、Ｎ５４５、Ｑ５４６、Ａ５４７、Ｌ５４９、Ｌ５５１、Ｎ５５２、Ｇ５５３、Ａ５５４、Ｙ５５５、Ｇ５５６、Ｋ５５７、Ｆ５５８、Ｔ５６０、Ｋ５６１、Ｑ５６２、Ｅ５６６、Ｅ５８５、Ｅ５８７、Ｇ５８８、Ｅ５９０、Ｐ５９４、Ｇ６０３、Ｗ６０８、Ａ６１０、Ｖ６１５、Ｌ６２１、Ｃ６２３、Ｄ６２４、Ｉ６２８、Ｙ６２９、Ｃ６３０、Ｎ６３１、Ｒ６３２、Ｖ６３４、Ｎ６３５、Ｉ６３８、Ｅ６３９、Ｄ６４０、Ｍ６４１、Ｎ６４２、Ａ６４３、Ｉ６４４、Ｔ６４７、Ｋ６５０、Ｔ６５１、Ｉ６５２、Ｌ６５３、Ｋ６５５、Ｄ６５７、Ｖ６５８、Ｅ６５９、Ｋ６７２、Ｅ６８０、Ｋ６８２、Ｔ６８３、Ｄ６８４、Ｌ６８５、Ｋ６８６、Ｃ６８７、Ｃ６８８、Ｓ６９２、Ｄ６９３、Ａ６９４、Ｒ６９５、Ｋ６９６、Ｉ６９７、Ｉ６９８、Ｌ７０８、Ｖ７１２、Ｒ７１８、Ｉ７２２、Ｇ７２４、Ｆ７３２、Ｍ７３８の１つまたは複数に対応する位置に少なくとも１つの変化を含むバリアントＤＮＡポリメラーゼ、および配列番号２のそれらの組合せ（Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグ付き））がある。

[0010]一実施形態においては、配列番号１もしくは２と比較して酵素活性が変化したバリアントポリメラーゼ、または親ポリメラーゼは、Ｙ３０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ｉ４２Ｅ／Ｌ、Ｄ４４Ｔ、Ｅ４６Ｗ、Ｃ４８Ｇ、Ｇ６２Ａ／Ｅ／Ｔ、Ｇ６４Ａ、Ｗ１２７Ｌ／Ｓ／Ｒ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｐ／Ｑ／Ａ／Ｅ、Ｇ１４６Ｋ／Ｌ、Ｔ１６２Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｖ１６４Ｑ／Ｒ／Ｔ、Ｉ１７２Ａ、Ｉ１７８Ａ、Ｓ１９８Ｆ／Ｌ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、Ｌ２０６Ｓ、Ｆ２０９Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ａ２１８Ｒ、Ｑ２２１Ｆ／Ｍ／Ｒ／Ｗ／Ｇ／Ｌ／Ｅ／Ｙ／Ｋ、Ｆ２２２Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、Ｈ２２３Ｌ、Ｎ２２４Ｋ／Ｒ／Ｔ、Ｙ２２５Ｔ、Ｖ２２６Ｔ、Ｈ２２７Ｅ／Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３３Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｐ／Ｓ、Ｙ２３４Ｒ、Ｋ２３５Ｓ／Ｑ／Ｎ／Ｆ／Ｗ／Ｐ、Ｍ２３６Ｋ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２４１Ｗ／Ｈ、Ｄ２４３Ｐ、Ｄ２６３Ｑ／Ｗ／Ｌ、Ｉ２６４Ｙ、Ｙ２６５Ｅ、Ｍ２６６Ｖ／Ｗ、Ｒ２６８Ｅ、Ｅ２６９Ｉ、Ｖ２７０Ａ／Ｓ、Ｇ２７８Ｖ／Ｅ／Ｍ／Ｒ／Ｌ／Ｐ、Ｅ２８３Ｇ、Ｌ２８４Ｒ／Ｙ、Ｐ２８５Ｌ／Ｃ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｍ２８９Ｐ、Ｒ２９０Ｖ／Ｃ、Ａ２９２Ｓ／Ｌ／Ｔ、Ｓ２９３Ｇ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｍ／Ｗ／Ａ、Ｓ２９４Ｙ／Ｔ／Ｒ／Ｍ／Ｌ／Ｋ／Ｇ／Ｆ／Ｅ、Ｉ２９５Ａ／Ｌ、Ａ２９６Ｍ、Ｆ２９７Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｎ２９８Ｋ／Ｌ／Ｒ／Ｗ／Ｇ、Ｖ２９９Ｙ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｆ／Ｋ、Ｅ３１１Ｎ／Ｋ／Ｈ、Ｅ３１２Ｒ／Ｌ／Ｋ、Ｙ３１４Ｗ、Ｙ３３８Ｌ、Ｖ３５０Ｒ／Ｌ／Ｍ、Ｃ３５９Ｔ、Ｓ３６０Ａ／Ｆ、Ｌ３６１Ａ／Ｍ／Ｆ、Ｙ３６７Ｆ、Ｓ３６９Ｇ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ａ、Ｑ３７０Ａ、Ｍ３７１Ｌ、Ａ３７２Ｇ／Ｌ、Ｙ３７３Ｔ／Ｒ／Ａ、Ｋ３７４Ｈ／Ｐ／Ｎ／Ｆ／Ｇ／Ｗ、Ｆ３７６Ｌ／Ｖ、Ｋ３８０Ｒ、Ｖ３８２Ｌ／Ｉ、Ｒ３８８Ｐ／Ｓ、Ｐ３９０Ｌ／Ｖ、Ｅ３９６Ｎ／Ｆ、Ｙ３９８Ａ／Ｐ、Ｌ３９９Ｇ、Ｉ４００Ｐ／Ｍ／Ｌ、Ｅ４０１Ｉ、Ｆ４０４Ｌ、Ｆ４０６Ｋ／Ｙ、Ｋ４１０Ｖ、Ｈ４１１Ｐ、Ｙ４１４Ｐ／Ｒ／Ｉ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｇ、Ａ４１５Ｐ、Ｌ４１６Ｗ、Ｄ４１７Ｅ、Ｉ４１８Ｑ／Ｈ、Ｓ４３０Ｐ、Ｐ４３１Ｇ、Ｉ４３２Ｆ、Ｇ４３８Ｒ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｃ、Ｄ４４８Ｌ、Ｋ４５６Ｒ、Ｌ４５８Ｐ／Ｒ、Ｋ４６２Ｇ、Ｔ４６４Ｐ、Ｎ４６８Ｇ、Ｖ４６９Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｖ４７０Ｌ／Ｉ／Ｍ／Ｑ／Ｈ／Ａ／Ｆ、Ｌ４７１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｖ４７４Ｇ、Ｅ４７５Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｙ４７６Ｌ、Ｅ４７７Ｇ、Ｆ４７８Ｙ／Ｈ、Ｗ４７９Ｋ、Ｋ４８１Ｌ、Ｈ４８２Ｔ／Ｇ／Ｄ／Ｒ／Ｗ、Ｆ４８３Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｅ５０２Ｐ／Ａ、Ｇ５０５Ｃ／Ｒ、Ｌ５０６Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｉ５０８Ｍ／Ｐ、Ｓ５１０Ｐ／Ｆ／Ｌ、Ｙ５１４Ｗ、Ｋ５１８Ｗ、Ｆ５２１Ｍ／Ｌ、Ｋ５２２Ｒ／Ｑ、Ｐ５２３Ｙ／Ｔ／Ｋ／Ｇ／Ｅ／Ｒ／Ｍ／Ｌ／Ｑ／Ａ、Ｙ５２４Ａ／Ｆ／Ｗ、Ｖ５２５Ｍ、Ｄ５２６Ｑ／Ｅ、Ｈ５２７Ｆ／Ｍ／Ｌ／Ｒ、Ｆ５２８Ｑ／Ｌ／Ｙ、Ｋ５３０Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｗ／Ｙ／Ｒ／Ｑ、Ｍ５３１Ｒ／Ｌ／Ａ、Ｖ５３３Ａ、Ｅ５３４Ｒ、Ｎ５３５Ｙ、Ｋ５３７Ｌ／Ｅ、Ｌ５３８Ｒ／Ｑ／Ｋ／Ａ、Ｋ５４１Ｒ／Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｌ５４３Ａ／Ｋ／Ｔ／Ｒ、Ｔ５４４Ａ、Ｎ５４５Ｙ、Ｑ５４６Ａ、Ｌ５４９Ｔ／Ｒ／Ａ、Ｌ５５１Ｍ、Ｇ５５２Ｔ、Ｇ５５３Ｔ／Ｑ／Ｋ／Ａ／Ｙ／Ｒ／Ｍ、Ａ５５４Ｑ／Ｔ、Ｙ５５５Ａ、Ｇ５５６Ｒ、Ｋ５５７Ｗ／Ｒ／Ｅ／Ｑ、Ｆ５５８Ｍ、Ｔ５６０Ｙ／Ｒ／Ｍ／Ｇ／Ｆ／Ｋ／Ａ／Ｌ、Ｋ５６１Ａ／Ｑ／Ｍ／Ｇ／Ｙ、Ｑ５６２Ｋ／Ｒ／Ｇ、Ｅ５６６Ｑ／Ｙ／Ｇ／Ｆ、Ｅ５８７Ｋ／Ｔ、Ｇ５８８Ｅ／Ｖ／Ｑ、Ｅ５９０Ｒ／Ｗ、Ｐ５９４Ａ／Ｖ、Ｇ６０３Ｙ／Ｌ／Ａ、Ｗ６０８Ｒ、Ａ６１０Ｔ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｍ、Ｌ６２１Ｗ、Ｃ６２３Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｄ６２４Ｌ、Ｉ６２８Ｍ、Ｙ６２９Ｋ／Ｗ、Ｃ６３０Ａ／Ｑ、Ｎ６３１Ｌ／Ｔ／Ｗ／Ａ、Ｒ６３２Ｋ、Ｖ６３４Ｌ、Ｉ６３８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｙ／Ｆ／Ｋ、Ｅ６３９Ｆ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｄ６４０Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｍ６４１Ｌ、Ｎ６４２Ｅ／Ｆ／Ｋ／Ｑ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｍ、Ａ６４３Ｋ／Ｒ／Ｔ／Ｙ／Ｌ、Ｉ６４４Ａ、Ｔ６４７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｋ、Ｋ６５０Ｑ／Ｒ／Ｙ／Ａ、Ｔ６５１Ｍ、Ｉ６５２Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｗ／Ｌ、Ｌ６５３Ｍ／Ａ、Ｋ６５５Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、Ｄ６５７Ｅ／Ｒ、Ｖ６５８Ｆ／Ｍ／Ｙ／Ｔ、Ｅ６５９Ｋ／Ｔ、Ｋ６７２Ｒ／Ｔ、Ｅ６８０Ａ／Ｑ／Ｋ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｍ、Ｋ６８２Ｆ／Ｍ／Ｙ／Ｖ／Ｉ、Ｔ６８３Ｆ／Ｗ、Ｄ６８４Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｙ／Ｇ／Ｗ／Ｅ／Ｔ／Ｑ、Ｌ６８５Ａ、Ｋ６８６Ｒ／Ｍ／Ｔ、Ｃ６８７Ａ、Ｃ６８８Ａ／Ｓ、Ｓ６９２Ｆ／Ｋ／Ｒ／Ｙ／Ｄ／Ｌ、Ｄ６９３Ｐ／Ｒ／Ｍ／Ａ／Ｋ／Ｙ／Ｗ、Ａ６９４Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｙ／Ｆ、Ｒ６９５Ｋ、Ｋ６９６Ｑ、Ｉ６９７Ａ、Ｉ６９８Ｌ、Ｌ７０８Ｈ／Ｐ／Ｙ、Ｖ７１２Ｃ、Ｒ７１８Ｋ、Ｉ７２２Ｒ、Ｇ７２４Ｙ、Ｆ７３２Ｙ、Ｍ７３８Ｗ／Ｖ、およびそれらの組合せから選択される。

[0011]一実施形態においては、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１または２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。

[0012]いくつかの実施形態においては、親ポリメラーゼは野生型Ｐｏｌ６（配列番号１）である。いくつかの実施形態においては、親ポリメラーゼは、Ｈｉｓタグを含むＰｏｌ６（配列番号２）である。様々な実施形態において、親ポリメラーゼは
１）Ａ５４７Ｆ；
２）Ａ５４７Ｆ＋Ｌ２０６Ｓ；
３）Ａ５４７Ｆ＋Ｆ２０９Ｉ；
４）Ａ５４７Ｆ＋Ｅ２８３Ｇ；
５）Ａ５４７Ｆ＋Ｐ２８５Ｌ；
６）Ａ５４７Ｆ＋Ｅ３１１Ｋ；
７）Ａ５４７Ｆ＋Ｌ３６１Ｆ；
８）Ａ５４７Ｆ＋Ｌ４７１Ｋ；
９）Ａ５４７Ｆ＋Ｖ４７４Ｇ；
１０）Ａ５４７Ｆ＋Ｈ４８２Ｇ；
１１）Ａ５４７Ｆ＋Ｔ１６２Ｃ／Ｒ／Ｖ；
１２）Ａ５４７Ｆ＋Ｖ１６４Ｑ／Ｒ／Ｔ；
１３）Ａ５４７Ｆ＋Ｅ３１１Ｈ；
１４）Ａ５４７Ｆ＋Ｅ３１２Ｒ／Ｌ／Ｋ；
１５）Ａ５４７Ｆ＋Ｙ３１４Ｗ；
１６）Ａ５４７Ｆ＋Ｖ３５０Ｒ／Ｌ／Ｍ；
１７）Ａ５４７Ｆ＋Ｑ５６２Ｋ／Ｒ／Ｇ；
１８）Ａ５４７Ｆ＋Ｅ５８７Ｋ／Ｔ；
１９）Ａ５４７Ｆ＋Ｐ５９４Ａ／Ｖ；
２０）Ａ５４７Ｆ＋Ｗ６０８Ｒ；
２１）Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｍ；
２２）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
２３）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
２４）Ｓ３６６Ａ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ｎ５３５Ｌ；
２５）ｐｏｌ６Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ；
２６）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ；
２７）Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｉ６５２Ｑ；
２８）Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ；
２９）Ｓ３６６Ａ＋Ｐ５４２Ｅ＋Ｔ６５１Ｙ；
３０）Ｐ５４２Ｅ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ；
３１）Ｐ５４２Ｅ＋Ｑ５４６Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
３２）Ｎ５３５Ｌ＋Ｔ６５１Ｙ；
３３）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ；
３４）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
３５）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
３６）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
３７）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｔ５２９Ｍ；
３８）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
３９）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ；
４０）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ；
４１）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｉ＋Ｉ６５２Ｑ；
４２）Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ；
４３）Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｎ６３５Ｄ；
４４）Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
４５）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ；
４６）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｉ６２８Ｙ；
４７）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ａ５４７Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｓ３６０Ｇ；
４８）Ｎ５３５Ｉ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｙ２２５Ｉ；
４９）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｋ６５５Ｇ；
５０）Ｎ５３５Ｌ＋Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６５１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ｌ５４９Ｑ；
５１）Ｓ３６６Ａ＋Ｎ５３５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ａ５４７Ｙ＋Ｋ６５５Ｇ；
５２）Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ２２５Ｔ；
５３）Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｓ３６６Ａ；
５４）Ａ５４７Ｆ＋Ａ６１０Ｔ＋Ｙ２２５Ｉ；
５５）Ｓ３６６Ａ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
５６）Ｔ６５１Ｙ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
５７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
５８）Ｔ６４７Ｅ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
５９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
６０）Ｎ５４５Ｋ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ；
６１）Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｔ５２９Ｍ；
６２）Ｎ５４５Ｋ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
６３）Ｔ５２９Ｍ＋Ａ６１０Ｔ＋Ａ５４７Ｆ；
６４）Ｍ６４１Ｙ＋Ｔ５２９Ｍ＋Ａ５４７Ｆ；
６５）Ｔ６４７Ｇ＋Ｃ６２３Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
６６）Ａ６１０Ｔ＋Ｉ２９５Ｗ＋Ｔ６５１Ｙ；
６７）Ｖ６１５Ａ＋Ｍ５３１Ｙ＋Ｔ６４７Ｇ；
６８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｋ；
６９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ；
７０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５５２Ｌ；
７１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｙ６２９Ｗ；
７２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ６２９Ｗ；
７３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ；
７４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｆ；
７５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｋ６５５Ｆ；
７６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
７７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｍ５３１Ａ；
７８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｇ５３９Ｙ；
７９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｒ＋Ｖ６５８Ｌ；
８０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ；
８１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ；
８２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｇ；
８３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｉ６５２Ｑ；
８４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｍ；
８５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｙ５２４Ｆ；
８６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｓ３６９Ｙ；
８７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｙ５２４Ｗ；
８８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｋ６５１Ａ；
８９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｔ５６０Ｍ；
９０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｎ５５２Ｌ＋Ｓ２９３Ｔ；
９１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｔ５６０Ｙ；
９２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｔ５６０Ｒ；
９３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ；
９４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｙ；
９５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｎ２２４Ｒ；
９６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
９７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ６５５Ａ；
９８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ２９３Ｑ；
９９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ６２９Ｗ；
１００）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｉ６２８Ｍ；
１０１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ；
１０２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｉ６３８Ｅ；
１０３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ６５５Ｍ；
１０４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ６５５Ｙ；
１０５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｖ６３４Ｌ；
１０６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｎ２２４Ｋ；
１０７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｓ２９３Ｑ；
１０８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｎ２９８Ｋ；
１０９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｓ２９４Ｔ；
１１０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｆ５２１Ｌ；
１１１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ；
１１２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｋ６８２Ｙ；
１１３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｄ６８４Ｇ；
１１４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ；
１１５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｉ６２８Ｍ；
１１６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｎ６４２Ｅ；
１１７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｓ６９２Ｆ；
１１８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｃ６３０Ａ；
１１９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｉ６３８Ｇ；
１２０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ２９４Ｌ；
１２１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ２９４Ｔ；
１２２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｉ６２８Ｍ；
１２３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｋ６５５Ａ；
１２４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｑ２２１Ｒ；
１２５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｇ５５３Ａ；
１２６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｔ６４７Ｆ；
１２７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｋ６８２Ｙ；
１２８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ；
１２９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｒ；
１３０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｓ２９３Ｇ；
１３１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｓ２９３Ｑ；
１３２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｋ６５５Ｇ；
１３３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｄ６８４Ｙ；
１３４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｄ６８４Ｍ；
１３５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ＋Ｔ５６０Ｍ；
１３６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｓ２９３Ｑ；
１３７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｌ３６１Ｍ；
１３８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｙ６２９Ｗ；
１３９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｔ６４７Ｑ；
１４０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
１４１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｌ６５３Ｍ；
１４２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｌ５４９Ｒ；
１４３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｇ５５３Ｋ；
１４４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｇ５５２Ｔ；
１４５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｇ；
１４６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｒ；
１４７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ；
１４８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｃ３５９Ｔ；
１４９）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｐ５２３Ｌ；
１５０）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｈ５２７Ｆ；
１５１）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｈ５２７Ｒ；
１５２）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｋ５３０Ｅ；
１５３）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｇ６０３Ａ；
１５４）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｎ６４２Ｍ；
１５５）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｋ６５５Ａ
１５６）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
１５７）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ；および
１５８）Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｄ６８４Ｍから選択されるｐｏｌ６である。

[0013]いくつかの実施形態においては、上記の１～１５８の親ポリメラーゼは、Ｙ２４２Ａ、Ｅ５８５Ｋ、およびそれらの組合せから選択される変異をさらに含み得る。

[0014]一実施形態においては、バリアントポリメラーゼは、
１）
ａ．Ｙ３０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｖ；
ｂ．Ｉ４２Ｅ／Ｌ；
ｃ．Ｄ４４Ｔ；
ｄ．Ｅ４６Ｗ；
ｅ．Ｃ４８Ｇ；
ｆ．Ｇ６２Ａ／Ｅ／Ｔ；
ｇ．Ｇ６４Ａ；
ｈ．Ｗ１２７Ｌ／Ｓ／Ｒ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｐ／Ｑ／Ａ／Ｅ；
ｉ．Ｇ１４６Ｋ／Ｌ；
ｊ．Ｔ１６２Ｃ／Ｒ／Ｖ；
ｋ．Ｖ１６４Ｑ／Ｒ／Ｔ；
ｌ．Ｉ１７２Ａ；
ｍ．Ｉ１７８Ａ；
ｎ．Ｓ１９８Ｖ；
ｏ．Ｆ２０９Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｖ；
ｐ．Ａ２１８Ｒ；
ｑ．Ｑ２２１Ｗ／Ｒ／Ｇ／Ｌ／Ｅ／Ｆ；
ｒ．Ｆ２３３Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｐ／Ｓ；
ｓ．Ｙ２３４Ｒ；
ｔ．Ｋ２３５Ｓ／Ｑ／Ｎ／Ｆ／Ｗ／Ｐ；
ｕ．Ｍ２３６Ｋ；
ｖ．Ｇ２３７Ａ；
ｗ．Ｄ２４１Ｗ／Ｈ；
ｘ．Ｄ２４３Ｐ；
ｙ．Ｄ２６３Ｑ／Ｗ／Ｌ；
ｚ．Ｉ２６４Ｙ；
ａａ．Ｙ２６５Ｅ；
ｂｂ．Ｍ２６６Ｖ／Ｗ；
ｃｃ．Ｒ２６８Ｅ；
ｄｄ．Ｅ２６９Ｉ；
ｅｅ．Ｖ２７０Ａ／Ｓ；
ｆｆ．Ｇ２７８Ｖ／Ｅ／Ｍ／Ｒ／Ｌ／Ｐ；
ｇｇ．Ｌ２８４Ｒ／Ｙ；
ｈｈ．Ｐ２８５Ｌ／Ｃ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ；
ｉｉ．Ｍ２８９Ｐ；
ｊｊ．Ｒ２９０Ｖ／Ｃ；
ｋｋ．Ａ２９２Ｓ／Ｌ／Ｔ；
ｌｌ．Ｅ３１１Ｎ／Ｈ；
ｍｍ．Ｅ３１２Ｒ／Ｌ／Ｋ；
ｎｎ．Ｙ３１４Ｗ；
ｏｏ．Ｖ３５０Ｒ／Ｌ／Ｍ；
ｐｐ．Ｋ３７４Ｈ／Ｐ／Ｎ／Ｆ／Ｇ／Ｗ；
ｑｑ．Ｆ３７６Ｌ／Ｖ；
ｒｒ．Ｋ３８０Ｒ；
ｓｓ．Ｖ３８２Ｌ／Ｉ；
ｔｔ．Ｒ３８８Ｐ／Ｓ；
ｕｕ．Ｐ３９０Ｌ／Ｖ；
ｖｖ．Ｅ３９６Ｎ；
ｗｗ．Ｙ３９８Ａ／Ｐ；
ｘｘ．Ｌ３９９Ｇ；
ｙｙ．Ｉ４００Ｐ／Ｍ／Ｌ；
ｚｚ．Ｅ４０１Ｉ；
ａａａ．Ｆ４０４Ｌ；
ｂｂｂ．Ｋ４１０Ｖ；
ｃｃｃ．Ｈ４１１Ｐ；
ｄｄｄ．Ｙ４１４Ｐ／Ｒ／Ｉ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｇ；
ｅｅｅ．Ａ４１５Ｐ；
ｆｆｆ．Ｌ４１６Ｗ；
ｇｇｇ．Ｄ４１７Ｅ；
ｈｈｈ．Ｉ４１８Ｑ／Ｈ；
ｉｉｉ．Ｓ４３０Ｐ；
ｊｊｊ．Ｐ４３１Ｇ；
ｋｋｋ．Ｉ４３２Ｆ；
ｌｌｌ．Ｇ４３８Ｒ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｃ；
ｍｍｍ．Ｋ４５６Ｒ；
ｎｎｎ．Ｌ４５８Ｐ／Ｒ；
ｏｏｏ．Ｋ４６２Ｇ；
ｐｐｐ．Ｔ４６４Ｐ；
ｑｑｑ．Ｎ４６８Ｇ；
ｒｒｒ．Ｖ４６９Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｙ；
ｓｓｓ．Ｖ４７０Ｌ／Ｉ／Ｍ／Ｑ／Ｈ／Ａ／Ｆ；
ｔｔｔ．Ｌ４７１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｙ；
ｕｕｕ．Ｅ４７５Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；
ｖｖｖ．Ｙ４７６Ｌ；
ｗｗｗ．Ｅ４７７Ｇ；
ｘｘｘ．Ｆ４７８Ｙ／Ｈ；
ｙｙｙ．Ｗ４７９Ｋ；
ｚｚｚ．Ｋ４８１Ｌ；
ａａａａ．Ｈ４８２Ｔ／Ｄ／Ｒ／Ｗ；
ｂｂｂｂ．Ｆ４８３Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ；
ｃｃｃｃ．Ｅ５０２Ｐ／Ａ；
ｄｄｄｄ．Ｇ５０５Ｃ／Ｒ；
ｅｅｅｅ．Ｌ５０６Ｔ／Ｇ／Ｃ；
ｆｆｆｆ．Ｉ５０８Ｍ／Ｐ；
ｇｇｇｇ．Ｓ５１０Ｐ／Ｆ／Ｌ；
ｈｈｈｈ．Ｙ５１４Ｗ；
ｉｉｉｉ．Ｋ５１８Ｗ；
ｊｊｊｊ．Ｎ５４５Ｙ；
ｋｋｋｋ．Ｑ５６２Ｋ／Ｒ／Ｇ；
ｌｌｌｌ．Ｅ５８７Ｋ／Ｔ；
ｍｍｍｍ．Ｇ５８８Ｅ／Ｖ／Ｑ；
ｎｎｎｎ．Ｅ５９０Ｒ／Ｗ；
ｏｏｏｏ．Ｐ５９４Ａ／Ｖ；
ｐｐｐｐ．Ｗ６０８Ｒ；
ｑｑｑｑ．Ａ６１０Ｔ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｍ；
ｒｒｒｒ．Ｋ６７２Ｒ；
ｓｓｓｓ．Ｋ６８２Ｆ／Ｍ／Ｙ／Ｖ／Ｉ；
ｔｔｔｔ．Ｄ６８４Ｇ；
ｕｕｕｕ．Ｌ６８５Ａ；
ｖｖｖｖ．Ｃ６８８Ａ／Ｓ；
ｗｗｗｗ．Ｓ６９２Ｆ／Ｄ／Ｒ／Ｌ；
ｘｘｘｘ．Ｄ６９３Ｐ／Ｒ；
ｙｙｙｙ．Ｋ６９６Ｑ；
ｚｚｚｚ．Ｉ６９８Ｌ；
ａａａａａ．Ｌ７０８Ｈ／Ｐ／Ｙ；
ｂｂｂｂｂ．Ｖ７１２Ｃ；
ｃｃｃｃｃ．Ｒ７１８Ｋ；
ｄｄｄｄｄ．Ｉ７２２Ｒ；
ｅｅｅｅｅ．Ｇ７２４Ｙ；
ｆｆｆｆｆ．Ｆ７３２Ｙ；
ｇｇｇｇｇ．Ｍ７３８Ｗ／Ｖ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＡ５４７Ｆ；
２）ａ．Ｐ２８５Ｌをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｌ２０６Ｓ；
３）ａ．Ｄ４４８Ｌをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｆ２０９Ｉ；
４）ａ．Ｌ４７１Ｋをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｅ２８３Ｇ；
５）ａ．Ｌ２０６Ｓをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｐ２８５Ｌ；
６）ａ．Ｖ４７４Ｇをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｅ３１１Ｋ；
７）ａ．Ｈ４８２Ｇをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｌ３６１Ｆ；
８）ａ．Ｅ２８３Ｇをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｌ４７１Ｋ；
９）ａ．Ｅ３１１Ｋをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｖ４７４Ｇ；
１０）ａ．Ｌ３６１Ｆをさらに含むＡ５４７Ｆ＋Ｈ４８２Ｇ；
１１）
ａ．Ｑ２２１Ｗ；
ｂ．Ｙ２２５Ｔ；
ｃ．Ｙ２４２Ａ；
ｄ．Ｆ５２８Ｑ／Ｌ；
ｅ．Ｋ５３０Ｗ；
ｆ．Ｔ５６０Ｋ／Ｙ；
ｇ．Ｉ６３８Ａ；
ｈ．Ｌ６５３Ａ；
ｉ．Ｄ６５７Ｅ／Ｒ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＮ５４５Ｋ＋Ｔ６４７Ｇ＋Ａ５４７Ｆ；
１２）
ａ．Ｙ２４２Ａ；
ｂ．Ｓ２９４Ｙ／Ｋ；
ｃ．Ｉ２９５Ｌ；
ｄ．Ｎ２９８Ｌ；
ｅ．Ｃ３５９Ｔ；
ｆ．Ｌ３６１Ｍ／Ａ；
ｇ．Ｆ５２１Ｌ；
ｈ．Ｐ５２３Ｋ；
ｉ．Ｋ５３０Ｇ；
ｊ．Ｌ５３８Ｒ；
ｋ．Ｋ５４１Ｒ；
ｌ．Ｋ５５７Ｒ；
ｍ．Ｆ５５８Ｍ；
ｎ．Ｔ５６０Ｆ／Ｒ；
ｏ．Ｇ６０３Ｌ；
ｐ．Ｃ６２３Ａ；
ｑ．Ｄ６２４Ｌ；
ｒ．Ｉ６２８Ｍ；
ｓ．Ｖ６３４Ｌ；
ｔ．Ｉ６３８Ｅ；
ｕ．Ｍ６４１Ｌ；
ｖ．Ｔ６４７Ｇ／Ａ／Ｅ；
ｗ．Ｋ６５５Ｍ／Ａ／Ｙ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ；
１３）
ａ．Ｑ２２１Ｍ；
ｂ．Ｎ２２４Ｋ；
ｃ．Ｙ２４２Ａ；
ｄ．Ｓ２９３Ｑ；
ｅ．Ｓ２９４Ｔ；
ｆ．Ｎ２９８Ｋ；
ｇ．Ｌ３６１Ｍ；
ｈ．Ｙ３７３Ａ；
ｉ．Ｆ５２１Ｍ／Ｌ；
ｊ．Ｋ５２２Ｒ；
ｋ．Ｐ５２３Ｅ；
ｌ．Ｍ５３１Ｌ；
ｍ．Ｌ５４９Ａ；
ｎ．Ｔ５６０Ｒ；
ｏ．Ｉ６２８Ｍ；
ｐ．Ｃ６３０Ａ；
ｑ．Ｒ６３２Ｋ；
ｒ．Ｉ６３８Ｇ／Ａ／Ｑ；
ｓ．Ｎ６４２Ｅ；
ｔ．Ｔ６４７Ｅ；
ｕ．Ｋ６５０Ｑ；
ｖ．Ｉ６５２Ｇ；
ｗ．Ｋ６５５Ｆ；
ｘ．Ｖ６５８Ｆ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ；
１４）
ａ．Ｓ１９８Ｆ／Ｌ／Ｑ／Ｗ／Ｙ；
ｂ．Ｑ２２１Ｆ；
ｃ．Ｆ２２２Ｌ／Ｔ／Ｑ；
ｄ．Ｈ２２７Ｅ；
ｅ．Ｙ２４２Ａ；
ｆ．Ｓ２９３Ｇ／Ｑ／Ｒ／Ｔ；
ｇ．Ｆ２９７Ｍ；
ｈ．Ｓ２９４Ｇ／Ｙ；
ｉ．Ｖ２９９Ｙ／Ｒ／Ｅ／Ａ；
ｊ．Ｌ３６１Ｍ；
ｋ．Ｓ３６９Ｇ；
ｌ．Ｙ３７３Ａ／Ｒ；
ｍ．Ｆ４０６Ｋ；
ｎ．Ｆ５２１Ｍ／Ｌ；
ｏ．Ｋ５２２Ｑ；
ｐ．Ｐ５２３Ｇ／Ｙ；
ｑ．Ｄ５２６Ｑ；
ｒ．Ｋ５３０Ｔ；
ｓ．Ｍ５３１Ｒ／Ｌ／Ａ；
ｔ．Ｌ５３８Ｑ；
ｕ．Ｋ５４１Ｒ／Ｇ；
ｖ．Ｔ５４４Ａ；
ｗ．Ｑ５４６Ａ；
ｘ．Ｋ５５７Ｗ／Ｒ；
ｙ．Ｆ５５８Ｍ；
ｚ．Ｔ５６０Ｇ／Ｆ／Ｙ／Ｍ；
ａａ．Ｅ５６６Ｑ／Ｙ／Ｇ／Ｆ；
ｂｂ．Ｇ６０３Ｙ；
ｃｃ．Ｉ６２８Ｍ；
ｄｄ．Ｙ６２９Ｗ；
ｅｅ．Ｉ６３８Ｇ／Ａ／Ｌ／Ｅ／Ｙ／Ｍ；
ｆｆ．Ｅ６３９Ｆ／Ｔ／Ｗ／Ｙ；
ｇｇ．Ｄ６４０Ａ／Ｅ／Ｋ；
ｈｈ．Ｎ６４２Ｅ／Ｑ／Ｔ；
ｉｉ．Ａ６４３Ｙ／Ｔ；
ｊｊ．Ｉ６４４Ａ；
ｋｋ．Ｔ６４７Ｙ／Ｍ；
ｌｌ．Ｉ６５２Ｋ；
ｍｍ．Ｋ６５５Ｇ；
ｎｎ．Ｖ６５８Ｆ／Ｍ；
ｏｏ．Ｄ６８４Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｙ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｓ６９２Ｆ；
１５）
ａ．Ｑ２２１Ｍ／Ｒ；
ｂ．Ｆ２２２Ｍ；
ｃ．Ｎ２２４Ｒ；
ｄ．Ｙ２４２Ａ；
ｅ．Ｓ２９３Ｔ；
ｆ．Ｓ２９４Ｍ／Ｌ／Ｔ／Ｆ／Ｙ；
ｇ．Ｎ２９８Ｋ／Ｌ／Ｒ；
ｈ．Ｐ５２３Ｔ；
ｉ．Ｇ５５３Ａ／Ｑ；
ｊ．Ｋ５５７Ｒ；
ｋ．Ｅ５６６Ｇ；
ｌ．Ｉ６２８Ｍ；
ｍ．Ｙ６２９Ｋ；
ｎ．Ｃ６３０Ｑ；
ｏ．Ｖ６３４Ｌ；
ｐ．Ｉ６３８Ｇ；
ｑ．Ａ６４３Ｒ／Ｋ；
ｒ．Ｔ６４７Ｗ／Ｌ／Ｆ；
ｓ．Ｋ６５５Ａ；
ｔ．Ｋ６８２Ｙ；
ｕ．Ｓ６９２Ｆ／Ｋ／Ｒ／Ｙ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ；
１６）
ａ．Ｎ２２４Ｔ；
ｂ．Ｙ２４２Ａ；
ｃ．Ｓ２９３Ｑ；
ｄ．Ｓ２９４Ｒ／Ｔ；
ｅ．Ｉ２９５Ａ；
ｆ．Ｖ２９９Ａ／Ｒ；
ｇ．Ｌ３６１Ｍ；
ｈ．Ｓ３６９Ｆ；
ｉ．Ｙ３７３Ａ／Ｔ；
ｊ．Ｆ５２８Ｙ；
ｋ．Ｋ５３０Ｇ／Ｅ／Ｆ；
ｌ．Ｌ５４９Ｔ／Ｒ；
ｍ．Ｇ５５３Ａ／Ｋ／Ｔ；
ｎ．Ａ５５４Ｑ；
ｏ．Ｇ５５６Ｒ；
ｐ．Ｋ５５７Ｒ；
ｑ．Ｆ５５８Ｍ；
ｒ．Ｔ５６０Ｆ／Ｙ；
ｓ．Ｅ５８５Ｋ；
ｔ．Ｙ６２９Ｗ；
ｕ．Ｃ６３０Ａ；
ｖ．Ｉ６３８Ａ／Ｅ；
ｗ．Ｎ６４２Ｅ／Ｋ／Ｆ／Ｙ／Ｗ；
ｘ．Ｔ６４７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｍ；
ｙ．Ｋ６５０Ｑ；
ｚ．Ｔ６５１Ｍ；
ａａ．Ｉ６５２Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｍ；
ｂｂ．Ｌ６５３Ｍ；
ｃｃ．Ｋ６５５Ｇ／Ｗ；
ｄｄ．Ｖ６５８Ｙ；
ｅｅ．Ｄ６９３Ｒ／Ｍ／Ｐ；
ｆｆ．Ａ６９４Ｌ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ；
１７）
ａ．Ｑ２２１Ｌ；
ｂ．Ｆ２２２Ｌ；
ｃ．Ｙ２４２Ａ；
ｄ．Ｙ３３８Ｌ；
ｅ．Ｌ３６１Ｆ；
ｆ．Ｑ３７０Ａ；
ｇ．Ｋ５３７Ｅ；
ｈ．Ｌ５４３Ｋ／Ｒ；
ｉ．Ｇ５５３Ａ／Ｋ／Ｙ／Ｒ／Ｔ／Ｑ；
ｊ．Ａ５５４Ｔ；
ｋ．Ｅ５８５Ｋ；
ｌ．Ｉ６２８Ｍ；
ｍ．Ｙ６２９Ｋ；
ｎ．Ｎ６３１Ｔ；
ｏ．Ｒ６３２Ｋ；
ｐ．Ｎ６４２Ｑ／Ｆ／Ｙ；
ｑ．Ａ６４３Ｌ；
ｒ．Ｄ６８４Ｇ／Ｆ／Ｗ／Ｍ／Ｑ；
ｓ．Ｄ６９３Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｙ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ；
１８）
ａ．Ｎ２２４Ｋ；
ｂ．Ｈ２２７Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｔ；
ｃ．Ｙ２４２Ａ；
ｄ．Ｓ２９３Ａ／Ｑ／Ｔ；
ｅ．Ｖ２９９Ｆ；
ｆ．Ｃ３５９Ｔ；
ｇ．Ｌ３６１Ｍ；
ｈ．Ｆ４０６Ｙ；
ｉ．Ｆ５２１Ｍ；
ｊ．Ｐ５２３Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｔ／Ｍ／Ａ；
ｋ．Ｈ５２７Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｒ；
ｌ．Ｋ５３０Ｇ／Ｅ；
ｍ．Ｎ５３５Ｙ；
ｎ．Ｇ５５３Ａ；
ｏ．Ｙ５５５Ａ；
ｐ．Ｔ５６０Ｙ；
ｑ．Ｅ５８５Ｋ；
ｒ．Ｇ６０３Ａ；
ｓ．Ｃ６２３Ｇ；
ｔ．Ｙ６２９Ｋ；
ｕ．Ｎ６４２Ｍ；
ｖ．Ｔ６４７Ｋ／Ｆ／Ｙ；
ｗ．Ｉ６５２Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｍ；
ｘ．Ｋ６５５Ａ；
ｙ．Ｄ６８４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｍ；
ｚ．Ｋ６８６Ｒ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ；
１９）
ａ．Ｑ２２１Ｋ／Ｍ；
ｂ．Ｈ２２３Ｌ；
ｃ．Ｓ２９４Ｅ／Ｔ；
ｄ．Ｆ２９７Ｌ／Ｍ；
ｅ．Ｓ２９３Ｇ；
ｆ．Ｎ２９８Ｇ；
ｇ．Ｙ３３８Ｌ；
ｈ．Ｃ３５９Ｔ；
ｉ．Ｓ３６０Ａ；
ｊ．Ｌ３６１Ｆ；
ｋ．Ｙ３６７Ｆ；
ｌ．Ｓ３６９Ａ；
ｍ．Ｅ３９６Ｆ；
ｎ．Ｋ５２２Ｑ；
ｏ．Ｄ５２６Ｅ；
ｐ．Ｋ５３０Ｒ；
ｑ．Ｍ５３１Ａ；
ｒ．Ｌ５３８Ａ；
ｓ．Ｌ５４３Ｔ；
ｔ．Ｇ５５３Ｋ／Ｒ／Ｍ；
ｕ．Ｋ５５７Ｒ／Ｅ／Ｑ；
ｖ．Ｔ５６０Ｌ；
ｗ．Ｌ６２１Ｗ；
ｘ．Ｃ６２３Ｔ；
ｙ．Ｃ６３０Ｑ；
ｚ．Ｎ６３１Ａ；
ａａ．Ｉ６３８Ｋ／Ｆ／Ｅ；
ｂｂ．Ｄ６４０Ｅ／Ｑ／Ｔ；
ｃｃ．Ｖ６５８Ｔ／Ｍ；
ｄｄ．Ｅ６８０Ａ／Ｑ／Ｋ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｍ；
ｅｅ．Ｔ６８３Ｆ／Ｗ；
ｆｆ．Ｄ６８４Ｅ／Ｔ／Ｋ；
ｇｇ．Ｌ６８５Ａ；
ｈｈ．Ｋ６８６Ｍ；
ｉｉ．Ｃ６８７Ａ；
ｊｊ．Ａ６９４Ｍ／Ｔ／Ｙ；
ｋｋ．Ｒ６９５Ｋ；
ｌｌ．Ｉ６９７Ａ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｖ２９９Ｆ；
２０）
ａ．Ｑ２２１Ｒ；
ｂ．Ｎ２２４Ｋ；
ｃ．Ｙ２４２Ｋ；
ｄ．Ｓ２９３Ｑ／Ｇ；
ｅ．Ｎ２９８Ｌ／Ｋ／Ｗ；
ｆ．Ｖ２９９Ｒ；
ｇ．Ｓ３６０Ａ／Ｆ；
ｈ．Ｌ３６１Ｆ／Ｍ／Ａ；
ｉ．Ｋ５２２Ｒ；
ｊ．Ｈ５２７Ｍ；
ｋ．Ｋ５３０Ｆ；
ｌ．Ｋ５３７Ｅ；
ｍ．Ｌ５４３Ｋ；
ｎ．Ｇ５５３Ｙ／Ｒ／Ｔ／Ｍ；
ｏ．Ａ５５４Ｑ／Ｔ；
ｐ．Ｅ５８５Ｋ；
ｑ．Ｇ６０３Ａ；
ｒ．Ｙ６２９Ｗ／Ｋ；
ｓ．Ｎ６３１Ｗ；
ｔ．Ｉ６３８Ｆ；
ｕ．Ｎ６４２Ｍ；
ｖ．Ｋ６５０Ａ；
ｗ．Ｋ６５５Ｆ；
ｘ．Ｋ６７２Ｔ；
ｙ．Ｋ６８６Ｔ；
ｚ．Ｄ６９３Ｒ／Ｗ；
ａａ．Ａ６９４Ｆ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含むＴ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｄ６８４Ｍ；
から選択される。

[0015]一実施形態においては、配列番号１または２と比較した場合に、酵素活性、忠実度、処理能力、伸長速度、安定性、または溶解性から選択される変化した特性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを提供する。一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特徴は改善された鎖置換である。

[0016]一実施形態においては、変化した特性は酵素活性である。一実施形態においては、変化した特性は忠実度である。一実施形態においては、変化した特性は処理能力である。一実施形態においては、変化した特性は伸長速度である。一実施形態においては、変化した特性は安定性である。一実施形態においては、変化した特性は溶解性である。一実施形態においては、変化した特性は、ヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力である。ヌクレオチドポリリン酸は、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸である。

[0017]一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも大きいｋ_ｃａｔを有する。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも小さいｋ_ｏｆｆを有する。一部の実施形態においては、改変ポリメラーゼは、親ポリメラーゼよりも少なくとも１．５倍、２．０倍、または２．５倍大きいｋ_ｃａｔ／ｋ_ｏｆｆ（すなわち、比）を有する。

[0018]一態様においては、本明細書に記載のバリアントポリメラーゼを用いて核酸鋳型を配列決定する方法が提供される。一実施形態においては、配列決定はナノポアを用いて行われる。

[0019]本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は本発明の好ましい実施形態を示すが、この詳細な説明から本発明の範囲および趣旨内の様々な変化および改変が当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は単に説明として提供するものであることを理解するべきである。

[0020]置換アッセイにおいて使用する例示的な鋳型を示す図である。 [0021]蛍光偏光に基づくｋ_ｏｆｆアッセイの図示、および例示的なデータトレースを示す図である。実施例３に関するものである。 [0022]蛍光偏光に基づくｋ_ｏｆｆアッセイからの代表的なデータのグラフである。実施例４に関するものである。親ポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ２４２Ａ）および１つのさらなる変異を有する親ポリメラーゼのバリアント（Ｓ２９３Ｍ）についてのトレースが示されている。 [0023]親ポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ２４２Ａ）および親ポリメラーゼの２つのバリアントのグラフである。親ポリメラーゼと比較して、バリアント１はさらにＴ５６０Ｍを含み、バリアント２はさらにＫ５６１Ｇを含む。実施例３に関するものである。 [0024]成長しているＤＮＡ鎖に組み込まれるにつれてタグ付きヌクレオチドの記録を与える電流変化を示す親ｐｏｌ６（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｙ２４２Ａ）について成長しているＤＮＡ鎖に組み込まれたときのタグ付きヌクレオチドの記録を与える電流変化を示すシーケンシングトレースを示す図である。鋳型ＤＮＡ配列、および、＞７０％の精度を示す新生鎖の召集配列も示されている。実施例５に関するものである。 [0025]図５のｐｏｌ６から由来したバリアントｐｏｌ６（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ）について成長しているＤＮＡ鎖に組み込まれたときのタグ付きヌクレオチドの記録を与える電流変化を示すシーケンシングトレースを示す図である。鋳型ＤＮＡ配列（配列番号６）、および、＞８０％の精度を示す新生鎖の召集配列（配列番号７）も示されている。実施例５に関するものである。

[0026]この特許のファイルは少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより、庁により提供されるであろう。

[0027]これより、以下の定義および例を使用して、単なる参照として本発明を詳細に説明する。本明細書において参照するあらゆる特許および刊行物は、このような特許および刊行物で開示されているあらゆる配列を含めて、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。

[0028]本明細書において別段の定めがない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥＨＡＲＰＥＲＣＯＬＬＩＮＳＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＢＩＯＬＯＧＹ、ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）により、本発明で使用する用語の多くの一般的な辞書が当業者に与えられる。本明細書において説明する方法および材料と類似または等価である任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。当技術分野の定義および用語について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、およびＡｕｓｕｂｅｌＦＭら、１９９３年が実施者らに特に向くものである。方法、プロトコールおよび試薬は様々であり得るので、本発明は、記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解するべきである。

[0029]数の範囲は、範囲を定める数を含める。約という用語は、本明細書においては、値のプラスまたはマイナス１０パーセント（１０％）を意味するよう使用する。例えば「約１００」は、９０～１１０の間の任意の数を指す。

[0030]別段に示されていない限り、核酸は５’～３’の方向でそれぞれ左から右に書き、アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向でそれぞれ左から右に書く。

[0031]本明細書において示している見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではなく、本発明は、明細書を全体として参照によって理解され得る。したがって、直下で定義する用語は、明細書を全体として参照によってより充分に定義される。

定義：
[0032]アミノ酸：本明細書において使用する場合、「アミノ酸」という用語は、広義には、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態においては、アミノ酸は、一般構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態においては、アミノ酸は、天然由来のアミノ酸である。一部の実施形態においては、アミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＤ－アミノ酸であり、一部の実施形態においては、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然由来のペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的なＬ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成により調製されるものであるか天然源から得られるものであるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を包含し、化学修飾アミノ酸としては、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換体が含まれるが、これらに限定されない。ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、それらの活性に悪影響を及ぼすことなく、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または、他の化学物質での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与することができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸、および／またはペプチドのアミノ酸残基を指すことができる。その用語が遊離アミノ酸、またはペプチドの残基のいずれを指すかは、その用語が使用される文脈から明らかになる。本明細書においては、全てのアミノ酸残基配列は、左右の方向が、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向になっている式によって示していることに留意するべきである。

[0033]塩基対（ｂｐ）：本明細書において使用する場合、塩基対は、２本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との結び付きを指す。

[0034]相補的：本明細書において使用する場合、「相補的」という用語は、塩基対形成による２本のポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の配列相補性の広範な概念を指す。アデニンヌクレオチドが、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることは公知である。同様に、シトシンヌクレオチドがグアニンヌクレオチドと塩基対形成することができることは公知である。

[0035]ＤＮＡ結合親和性：本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ結合親和性」という用語は、典型的には、ＤＮＡ核酸に結合することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。一部の実施形態においては、ＤＮＡ結合活性は、２バンドシフトアッセイにおいて測定することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮＹ）の９．６３～９．７５（核酸の末端標識について記載）を参照のこと。結合バッファー（リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、グリセロール１０％、ＫＣｌ２５ｍＭ、ＭｇＣｌ_２２５ｍＭ）約１０μｌ中に少なくとも約０．５μｇのポリペプチドを含有する反応混合物を調製する。反応混合物を１０分間、３７℃に加熱する。標識した２本鎖核酸約１×１０^４～５×１０^４ｃｐｍ（または約０．５～２ｎｇ）を反応混合物に加え、さらに１０分間インキュベートする。反応混合物を、０．５倍トリスホウ酸バッファー中の未変性ポリアクリルアミドゲルに載せる。反応混合物を室温で電気泳動に付す。ゲルを乾燥させ、標準的な方法を使用してオートラジオグラフィーに付す。標識した２本鎖核酸の移動度において検出可能な減少がある場合は、ポリペプチドと２本鎖核酸の間に結合複合体が形成していることを示す。このような核酸結合活性は、標準的な濃度測定法を使用して、最初の反応混合物における放射能の総量と比較した結合複合体における放射能の量を測定することにより、定量することができる。ＤＮＡ結合親和性を測定する他の方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｋｏｎｇら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３）：１９６５～１９７５を参照のこと）。

[0036]伸長速度：本明細書において使用する場合、「伸長速度」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼがポリマー鎖を伸ばす平均速度を指す。本明細書において使用する場合、高伸長速度は、２ｎｔ／ｓより大きい（例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０ｎｔ／ｓより大きい）伸長速度を指す。本出願において使用する場合、「伸長速度」、「延長速度」、および「組み込み速度」という用語は互換的に使用する。

[0037]酵素活性：本明細書において使用する場合、「酵素活性」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼの特異性および効率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は「ポリメラーゼ活性」とも呼ばれ、典型的には、ポリヌクレオチドの鋳型特異的合成を触媒することにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性を指す。ポリメラーゼの酵素活性は、当技術分野で公知の様々な技術および方法を用いて測定することができる。例えば、ポリメラーゼの段階希釈物を、希釈バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ｐＨ８．０２０ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＮＰ４００．５％、およびＴｗｅｅｎ－２００．５％）中で調製することができる。各希釈物について５μｌを取り出し、ＴＡＰＳ（ｐＨ９．２５）２５ｍＭ、ＫＣｌ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２２ｍＭ、ｄＡＴＰ０．２ｍＭ、ｄＧＴＰ０．２ｍＭ、ｄＴＴＰ０．２ｍＭ、ｄＣＴＰ０．１ｍＭ、活性化ＤＮＡ１２．５μｇ、［α－^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（０．０５μＣｉ／ｎｍｏｌ）１００μＭ、および滅菌脱イオン水を含有する反応混合物４５μｌに加えることができる。反応混合物を３７℃（または、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼでは７４℃）で１０分間インキュベートし、次いで反応物を４℃に急冷して、氷冷した６０ｍＭＥＤＴＡ１０μｌを加えることによって停止させることができる。各反応混合物からアリコート２５μｌを取り出すことができる。組み込まれなかった放射能標識ｄＣＴＰを、ゲルろ過（Ｃｅｎｔｒｉ－Ｓｅｐ、ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｎ．Ｊ．）によって各アリコートから取り出すことができる。カラム溶離液を、シンチレーション液（１ｍｌ）と混合することができる。シンチレーションカウンターを用いてカラム溶離液中の放射能を定量化して、ポリメラーゼによって合成された産物の量を決定する。ポリメラーゼ活性の１単位は、３０分間に１０ｎモルの産物を合成するために必要なポリメラーゼの量として定義することができる（Ｌａｗｙｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７～６４７）。ポリメラーゼ活性を測定する他の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第３版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照のこと）。

[0038]精製された：本明細書において使用する場合、「精製された」は、分子が、含有されている試料の少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％の濃度で試料中に存在することを意味する。

[0039]単離された：「単離された」分子は、通常、例えば分子の自然環境で会合している少なくとも１種の他の分子から分離されている核酸分子である。単離された核酸分子としては、その核酸分子を通常発現する細胞に含有された核酸分子が挙げられるが、その核酸分子は、染色体外、またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

[0040]相同性％：本明細書においては、「相同性％」という用語は、本明細書の「同一性％」という用語と互換的に使用し、本発明のポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸配列、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の間での、配列アライメントプログラムを使用して整列させた場合の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。

[0041]例えば、本明細書において使用する場合、相同性８０％は、定義済みのアルゴリズムによって決定される配列同一性８０％と同じことを意味し、したがって所与の配列の相同体は、所与の配列ある長さにわたって８０％超の配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、所与の配列、例えば本明細書に記載する本発明のポリペプチドのいずれか１つのコード配列との８０、８５、９０、９５、９８％以上の配列同一性が挙げられるが、これらに限定されない。

[0042]２つの配列間の同一性を決定するのに使用することができる例示的なコンピュータープログラムとしては、インターネット上で公開されている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年、も参照のこと。

[0043]配列検索は、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列および他の公開データベースの核酸配列と比較して所与の核酸配列を評価する場合には、典型的にはＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋのタンパク質配列および他の公開データベースのアミノ酸配列に対して、全ての読み枠で翻訳されている核酸配列を検索することに好ましい。ＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸの両方は、１１．０のオープンギャップペナルティー、および１．０のエクステンディッドギャップペナルティーのデフォルトパラメーターを使用し、ＢＬＯＳＵＭ－６２マトリックスを利用して走らせる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９～３４０２、１９９７年を参照のこと。）

[0044]２つ以上の配列間での「同一性％」を決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗプログラムを使用し、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１のエクステンディッドギャップペナルティーを含むデフォルトパラメーター、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似度マトリックスを用いて動作させて行う。

[0045]改変ＤＮＡポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「改変ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、別の（すなわち、親）ＤＮＡポリメラーゼから生じ、親ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つまたは複数のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入）を含有するＤＮＡポリメラーゼを指す。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来のＤＮＡポリメラーゼ、または野生型ＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。一部の実施形態においては、本発明の改変ＤＮＡポリメラーゼは、組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼから生じるか、またはそれから改変されている。組換えＤＮＡポリメラーゼまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼとしては、キメラＤＮＡポリメラーゼ、融合ＤＮＡポリメラーゼ、または別の改変ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、改変ＤＮＡポリメラーゼは、親ポリメラーゼと比較して変更された表現型を少なくとも１つ有する。

[0046]変異：本明細書において使用する場合、「変異」という用語は、親配列に導入された変更を指し、その変更としては、置換、挿入、欠失（切り詰めを含める）が挙げられるが、これらに限定されない。変異の結果としては、親配列によってコードされるタンパク質では見出されない新しい特性、特質、機能、表現型、または形質の創造が挙げられるが、これらに限定されない。

[0047]変異体：本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、親タンパク質と比較した場合に変化した特性を示す改変タンパク質を指す。「バリアント」および「変異体」という用語は、本明細書において互換的に使用する。

[0048]野生型：本明細書において使用する場合、「野生型」という用語は、天然由来の供給源から単離された際に、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。

[0049]忠実度：本明細書において使用する場合、「忠実度」という用語は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の精度、または、鋳型ＤＮＡに結合している誤ったヌクレオチドに対する正しいヌクレオチドのｋ_ｏｆｆの測定差異のいずれかを指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、典型的には、エラー率（不正確なヌクレオチド、すなわち、鋳型依存的な方式で組み込まれていないヌクレオチドを組み込む頻度）によって測定する。ＤＮＡ重合の精度または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性と３’－５’エキソヌクレアーゼ活性の両方によって維持される。「高忠実度」という用語は、４．４５×１０^－６変異／ｎｔ／倍加未満（例えば、４．０×１０^－６、３．５×１０^－６、３．０×１０^－６、２．５×１０^－６、２．０×１０^－６、１．５×１０^－６、１．０×１０^－６、０．５×１０^－６変異／ｎｔ／倍加未満）のエラー率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度またはエラー率は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、本明細書に記載するように試験するか、またはＪｏｈｎｓｏｎら、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．２０１０年５月；１８０４（５）：１０４１～１０４８において記載されているように試験することができる。

[0050]ナノポア：本明細書において使用する場合、「ナノポア」という用語は概して、膜に形成された、または他の方法で膜に与えられた細孔、チャネル、または通路を指す。膜は、脂質二重層などの有機膜であっても、ポリマー材料で形成された膜などの合成膜であってもよい。膜はポリマー材料としてもよい。ナノポアは、例えば相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）回路または電界効果トランジスター（ＦＥＴ）回路などの検出回路、または検出回路に連結された電極に隣接して、またはその近傍に配置してもよい。一部の例においては、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）～約１０００ｎｍの桁の特徴的な幅または直径を有する。一部のナノポアはタンパク質である。アルファ溶血素、ＭｓｐＡは、タンパク質ナノポアの例である。

[0051]ヌクレオチド：本明細書において使用する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニットは、糖部分（ペントース）、リン酸、および窒素含有複素環塩基からなる。塩基はグリコシドの炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖部分に連結され、その塩基と糖の組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドが、ペントースの３’位または５’位に結合したリン酸基を含有する場合、それはヌクレオチドと呼ばれる。作用的に連結されたヌクレオチドの配列は、本明細書においては典型的に「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」と呼び、本明細書においては、左から右への方向が、５’末端から３’末端への従来の方向になっている式によって表す。本明細書において使用する場合、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオチドポリリン酸、例えば、ヌクレオチド３、４、５、６、７、または８リン酸を指す。

[0052]オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つ超のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存し、その因子はさらにはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存することになる。オリゴヌクレオチドは、合成によって、またはクローニングによって得ることができる。本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、鎖内で共有結合したヌクレオチド単量体で構成されたポリマー分子を指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。

[0053]ポリメラーゼ：本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する（すなわち、ポリメラーゼ活性）酵素を指す。通常、その酵素は、ポリヌクレオチドの鋳型配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型鎖の５’末端へ進行することになる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。

[0054]プライマー：本明細書において使用する場合、「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合、例えば、好適な温度における適切なバッファー（「バッファー」は、ｐＨ、イオン強度、補助因子などを含む）中の４種の異なるヌクレオチド三リン酸および熱安定性酵素の存在下で、核酸合成の開始点の役割を果たすことができる、天然に存在しているものであっても合成によって生成されたものであってもよいオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするために１本鎖であることが好ましいが、代替的に２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは、まず、その鎖が分離するよう処理し、その後、延長産物の調製に使用する。プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーは、熱安定性酵素の存在下での延長産物の合成の出発物質となるのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の用途を含めた多くの因子に依存することになる。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５～２５ヌクレオチドを含有するが、それよりも多いか、または少ないヌクレオチドを含有することができる。短いプライマー分子は概して、鋳型と充分に安定なハイブリッド複合体を形成するにはより低い温度を必要とする。

[0055]処理能力：本明細書において使用する場合、「処理能力」は、鋳型に付いてとどまり、複数の改変反応を行うポリメラーゼの能力を指す。「改変反応」としては、重合、およびエキソヌクレアーゼ的切断が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態においては、「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖から酵素が途中で解離することなく一連の重合工程を行うＤＮＡポリメラーゼの能力を指す。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼの「処理能力」は、成長しているＤＮＡ鎖からＤＮＡポリメラーゼが途中で解離することなく重合または改変されるヌクレオチドの長さ（例えば、２０ｎｔ、３００ｎｔ、０．５～１ｋｂ以上）によって測定する。「処理能力」は、ポリメラーゼの性質、ＤＮＡ鋳型の配列、および反応条件、例えば、塩濃度、温度、または特定のタンパク質の存在に依存し得る。本明細書において使用する場合、「高処理能力」という用語は、鋳型との１会合／解離当たり２０ｎｔ超（例えば、４０ｎｔ超、６０ｎｔ超、８０ｎｔ超、１００ｎｔ超、１２０ｎｔ超、１４０ｎｔ超、１６０ｎｔ超、１８０ｎｔ超、２００ｎｔ超、２２０ｎｔ超、２４０ｎｔ、２６０ｎｔ超、２８０ｎｔ超、３００ｎｔ超、３２０ｎｔ超、３４０ｎｔ超、３６０ｎｔ超、３８０ｎｔ超、４００ｎｔ超、またはそれ以上）の処理能力を指す。処理能力は、本明細書およびＷＯ０１／９２５０１Ａ１（ＭＪＢｉｏｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．、ＩｍｐｒｏｖｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＭｏｄｉｆｙｉｎｇＥｎｚｙｍｅｓ、２００１年１２月０６日公開）において定義された方法に従って測定することができる。

[0056]合成：本明細書において使用する場合、「合成」という用語は、鋳型依存的な方式で、新しいポリヌクレオチド鎖を作製するか、または現存するポリヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伸長する任意のインビトロ方法を指す。本発明による合成には、ポリメラーゼを使用してポリヌクレオチド鋳型配列の複製物の数を増加させる増幅が含まれる。ポリヌクレオチドの合成（例えば、増幅）の結果、ヌクレオチドがポリヌクレオチド（すなわちプライマー）に組み込まれ、それによってポリヌクレオチド鋳型に相補的な新しいポリヌクレオチド分子が形成される。形成されたポリヌクレオチド分子およびその鋳型は、さらなるポリヌクレオチド分子を合成するための鋳型として使用することができる。本明細書において使用する場合、「ＤＮＡ合成」には、ＰＣＲ、ポリヌクレオチドの標識（すなわち、プローブおよびオリゴヌクレオチドプライマーに対して）、ポリヌクレオチドシーケンシングが含まれるが、これらに限定されない。

[0057]鋳型ＤＮＡ分子：本明細書において使用する場合、「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えばプライマー延長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的な核酸鎖が合成される核酸鎖を指す。

[0058]鋳型依存的な方式：本明細書において使用する場合、「鋳型依存的な方式」という用語は、鋳型依存的なプライマー分子の延長（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）を含むプロセスを指す。「鋳型依存的な方式」という用語は、典型的には、新たに合成されるポリヌクレオチド鎖の配列が、相補的な塩基対形成の周知の規則によって規定される、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチドの合成を指す（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、第４版、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．（１９８７）を参照のこと）。

[0059]タグ：本明細書において使用する場合、「タグ」という用語は、原子もしくは分子、または、原子もしくは分子の集団としてもよい検出可能な部分を指す。タグは、光学的、電気化学的、磁気的、または静電的（例えば、誘導的、容量的）性状を示すことができ、その性質は、ナノポアを利用して検出することができる。

[0060]タグ付きヌクレオチド：本明細書において使用する場合、「タグ付きヌクレオチド」という用語は、タグが付けられたヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを指す。タグは、糖、リン酸（もしくはポリリン酸）、または塩基に共有結合で付けてもよい。タグは、末端リン酸上にあってもよい。

[0061]ベクター：本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、異なる宿主細胞間の移動用に設計された核酸構造物を指す。「発現ベクター」は、外来性細胞において異種ＤＮＡ断片を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。多くの原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターが市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者に知られている。

[0062]本明細書において示すポリメラーゼバリアントは、ＷＯ２０１３／１８８８４１（ＧｅｎｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＣｈｉｐＳｅｔ－ＵｐａｎｄＨｉｇｈ－ＡｃｃｕｒａｃｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、２０１３年１２月１９日公開）において記載されている、チップを用いたポリヌクレオチドシーケンシングに有用である。

[0063]ＤＮＡのシーケンシングに用いられるポリメラーゼの望ましい特性は、以下の通りである。
ａ．遅いｋ_ｏｆｆ（改変ヌクレオチドに対して）
ｂ．速いｋ_ｏｎ（改変ヌクレオチドに対して）
ｃ．高忠実度
ｄ．低エキソヌクレアーゼ活性
ｅ．ＤＮＡ鎖置換
ｆ．より速いｋ_ｃａｔ（改変ヌクレオチド基質に対して）
ｇ．向上した安定性
ｈ．処理能力
ｉ．塩耐性
ｊ．ナノポアへの取付けの適合性
ｋ．４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸、例えばヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸を組み込む能力
ｌ．シーケンシング精度
ｍ．長いリード長、すなわち長時間連続性解読。

命名法
[0064]本明細書および特許請求の範囲において、アミノ酸残基の従来の１文字表記および３文字表記を使用する。

[0065]参照を容易にするため、本出願のポリメラーゼバリアントは、以下の命名法を使用して記載する。

[0066]元のアミノ酸（１つまたは複数）：位置（１つまたは複数）：置換したアミノ酸（１つまたは複数）。この命名法によれば、例えば、位置２４２におけるセリンのアラニンによる置換は、
Ｓｅｒ２４２ＡｌａまたはＳ２４２Ａ
として示す。

[0067]複数の変異はプラス記号によって分ける。すなわち、
Ａｌａ３０Ａｓｐ＋Ｇｌｕ３４ＳｅｒまたはＡ３０Ｎ＋Ｅ３４Ｓ
は、位置３０および３４における、アラニンとグルタミン酸をそれぞれアスパラギンとセリンに置換する変異を表す。

[0068]１つまたは複数の代替アミノ酸残基を所与の位置に挿入することができる場合は、Ａ３０Ｎ／Ｅ、またはＡ３０ＮもしくはＡ３０Ｅとして示す。

[0069]別段に述べられていない限り、残基の番号は、配列番号２の残基の番号付けに一致する。

ポリメラーゼの部位特異的突然変異誘発
[0070]クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４野生型配列は、本明細書において示しており（配列番号３、核酸コード領域およびＨｉｓタグ；配列番号１、タンパク質コード領域）、他の場所で入手可能である（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓまたはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＨ２７１１３）。

[0071]点変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＬｉｇｈｔｎｉｎｇ２キット（Ｓｔａｔｅｇｅｎｅ／Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、製造業者の指示書に従って導入することができる。

[0072]プライマーは、営利会社、例えばＩＤＴＤＮＡに注文することができる。

ナノポア構築および挿入
[0073]本明細書において記載する方法は、ポリメラーゼがナノポアに付いたナノポアを使用することができる。一部の場合においては、（例えば、各ナノポアで１つのみの核酸分子がシーケンシングされるように）ナノポア１つ当たりただ１つのポリメラーゼを有することが望ましい。しかしながら、例えばアルファ溶血素（ａＨＬ）を含めた多くのナノポアは、複数のサブユニット（例えば、ａＨＬでは７サブユニット）を有する多量体タンパク質であり得る。サブユニットは、同じポリペプチドの同一複製物であり得る。本明細書においては、無改変サブユニット（例えば、ａ－ＨＬ）に対する改変サブユニット（例えば、ａ－ＨＬバリアント）の規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を提供する。本明細書においては、無改変サブユニットに対する改変サブユニットの規定された比を有する多量体タンパク質（例えば、ナノポア）を作製する方法も提供する。

[0074]ＷＯ２０１４／０７４７２７（ＧｅｎｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の図２７を参照すると、複数のサブユニットを有するタンパク質を構築する方法は、複数の第１のサブユニット２７０５を用意すること、および複数の第２のサブユニット２７１０を用意することを含み、第２のサブユニットは第１のサブユニットと比較すると改変されている。一部の場合においては、第１のサブユニットは野生型（例えば、天然源から精製したもの、または組換えで作製したもの）である。第２のサブユニットは、任意の好適な方法で改変することができる。一部の場合においては、第２のサブユニットは、（例えば、融合タンパク質として）付けられたタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を有する。

[0075]改変サブユニットは、化学反応性部分（例えば、連結の形成に好適なアジド基またはアルキン基）を含むことができる。一部の場合においては、当該方法は、反応（例えば、Ｃｌｉｃｋ化学付加環化）を行って、実在物（例えば、ポリメラーゼ）を化学反応性部分に付けることをさらに含む。

[0076]当該方法は、第１のサブユニットを第２のサブユニット２７１５と第１の比で接触させて、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを有する複数のタンパク質２７２０を形成させることをさらに含むことができる。例えば、ポリメラーゼを付けるのに好適な反応基を有する改変ａＨＬサブユニット１部を、野生型ａＨＬサブユニット６部と混合することができる（すなわち、第１の比は１：６である）。複数のタンパク質は、第２のサブユニットに対する第１のサブユニットの複数の比を有することができる。例えば、混合したサブユニットは、改変サブユニット：無改変サブユニットの化学量論比（例えば、１：６、２：５、３：４）の分布を有するいくつかのナノポアを形成させることができる。

[0077]一部の場合においては、タンパク質は、サブユニットを単純に混合することによって形成させる。例えばａＨＬナノポアの場合においては、界面活性剤（例えば、デオキシコール酸）は、ａＨＬ単量体が細孔構造をとることを引き起こすことができる。ナノポアは、脂質（例えば、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）または１，２－ジ－Ｏ－フィタニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤｏＰｈＰＣ））、および中温（例えば、約１００℃未満）を用いて形成させることもできる。一部の場合においては、ＤＰｈＰＣを緩衝溶液と混合すると、大きな多重膜ベシクル（ＬＭＶ）が生じ、この溶液にａＨＬサブユニットを加えて、混合物を４０℃で３０分間インキュベートすると、細孔が形成する。

[0078]異なる２種類のサブユニット（例えば、天然野生型タンパク質と、単一点変異を含有することができる第２のａＨＬ単量体）を使用する場合、得られるタンパク質は、（例えば野生型と変異体タンパク質の）混合化学量論比を有することができる。これらのタンパク質の化学量論比は、細孔形成反応において使用する２種のタンパク質の濃度比に依存した式に従うことができる。この式は以下の通りである。
１００Ｐ_ｍ＝１００［ｎ！／ｍ！（ｎ－ｍ）！］・ｆ_ｍｕｔ ^ｍ・ｆ_ｗｔ ^ｎ～ｍ、式中
Ｐ_ｍ＝ｍ個の変異体サブユニットを有する細孔の確率
ｎ＝サブユニットの総数（例えば、ａＨＬでは７個）
ｍ＝「変異体」サブユニットの数
ｆ_ｍｕｔ＝一緒に混合した変異体サブユニットの割合または比
ｆ_ｗｔ＝一緒に混合した野生型サブユニットの割合または比

[0079]当該方法は、複数のタンパク質を分画して、第２のサブユニット２７２５に対する第１のサブユニットの第２の比を有するタンパク質の割合を増やすことをさらに含むことができる。例えば、ただ１つの改変サブユニットを有するナノポアタンパク質を単離することができる（例えば、第２の比は１：６）。しかしながら、いずれの第２の比も好適である。第２の比の分布も分画することができ、例えば、１つまたは２つのいずれかの改変サブユニット有するタンパク質の割合を増やすことができる。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２７に示されているように、タンパク質を形成するサブユニットの総数は７個であるとは限らない（例えば、異なるナノポアを使用することができ、または６個のサブユニットを有するアルファ溶血素ナノポアが形成し得る）。一部の場合においては、１つのみの改変サブユニットを有するタンパク質の割合を増やす。このような場合においては、第２の比は、第１のサブユニット（ｎ－１）個当たり、第２のサブユニット１個であり、ｎはタンパク質を構成するサブユニットの数である。

[0080]第１の比は、第２の比と同じものとすることができるが、必要とされるものではない。一部の場合においては、変異単量体を有するタンパク質は、変異サブユニットを有しないタンパク質よりも低い効率で形成し得る。この場合は、第１の比は、第２の比よりも大きいものとすることができる（例えば、変異サブユニット１：無変異サブユニット６の第２の比がナノポアで所望される場合、好適な数の１：６タンパク質を形成させるには、１：６よりも大きい比でサブユニットを混合することが必要とされてもよい）。

[0081]異なる第２のサブユニット比を有するタンパク質は、分離において、異なる挙動を示す（例えば、異なる保持時間を有する）ことができる。一部の場合においては、タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを使用して分画する。第１および第２のサブユニットは、改変を除いては同一とすることができるので、タンパク質における改変の数は、分離の根拠として役割を果たすことができる。一部の場合においては、第１または第２のサブユニットのいずれかは、分画を可能にするか、または分画の効率を改良するよう、（例えば、改変に加えて）精製タグを有する。一部の場合においては、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ストレプトアビジンタグ（Ｓｔｒｅｐタグ）、または他のペプチドタグを使用する。一部の例においては、第１および第２のサブユニットはそれぞれ異なるタグを含み、分画工程では、各タグに基づき分画される。Ｈｉｓタグの場合には、低いｐＨでタグに電荷を生じさせる（ヒスチジン残基は、側鎖のｐＫａ未満で正に荷電する）。他のものと比較してａＨＬ分子の１つにおいて電荷が有意に異なることにより、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、０、１、２、３、４、５、６、または７個の「電荷タグ付き」ａＨＬサブユニットを有するオリゴマーを分離することができる。原則的に、この電荷タグは、一定の電荷を運ぶ任意のアミノ酸が糸状に連なるものとすることができる。図２８および図２９では、Ｈｉｓタグに基づくナノポアの分画の例が示されている。図２８では、２８０ナノメートルにおける紫外吸光度、２６０ナノメートルにおける紫外吸光度、および伝導率のプロットが示されている。ピークは、改変サブユニットと無改変サブユニットの様々な比を有するナノポアに一致する。ＷＯ２０１４／０７４７２７の図２９では、ＨｉｓタグとＳｔｒｅｐタグの両方を使用した、ａＨＬナノポアおよびその変異体の分画が示されている。

[0082]一部の場合においては、分画後に、実在物（例えば、ポリメラーゼ）をタンパク質に付ける。タンパク質はナノポアとすることができ、実在物はポリメラーゼとすることができる。一部の例においては、当該方法は、第２の比のサブユニットを有するタンパク質を二重層に挿入することをさらに含む。

[0083]一部の状況においては、ナノポアは、複数のサブユニットを含むことができる。ポリメラーゼは、サブユニットの１つに付けることができ、サブユニットの少なくとも１つかつ全部未満が、第１の精製タグを含む。一部の例においては、ナノポアはアルファ溶血素またはそのバリアントである。一部の例においては、サブユニットの全てが第１の精製タグまたは第２の精製タグを含む。第１の精製タグは、（例えば、ポリメラーゼが付いたサブユニットにおける）ポリヒスチジンタグとすることができる。

ナノポアに付けられたポリメラーゼ
[0084]一部の場合においては、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノポアに付けられ、かつ／または、ナノポアの近傍に配置される。ポリメラーゼは、ナノポアが膜に組み込まれる前または後に、ナノポアに付けることができる。一部の例においては、ナノポアおよびポリメラーゼは融合タンパク質（すなわち、単一のポリペプチド鎖）である。

[0085]ポリメラーゼは、任意の好適な方法でナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、ナノポア（例えば、溶血素）タンパク質単量体に付け、その後、（例えば、ポリメラーゼが付いていないナノポア（例えば、溶血素）単量体６つに対し、ポリメラーゼが付いた単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築する。次いでナノポア七量体を膜に挿入することができる。

[0086]ポリメラーゼをナノポアに付ける別の方法は、溶血素単量体にリンカー分子を付けるか、または溶血素単量体を、取付け部位を有するよう変異させること、ならびに、その後、（例えば、リンカーおよび／または取付け部位を有しない溶血素単量体６つに対し、リンカーおよび／または取付け部位を有する単量体１つの比で）全体のナノポア七量体を構築することを含む。次いでポリメラーゼを、（例えば、膜への挿入前に、大量で）取付け部位または取付けリンカーに付けることができる。ポリメラーゼは、（例えば、七量体の）ナノポアを膜に形成させた後で、取付け部位または取付けリンカーに付けることもできる。一部の場合においては、複数のナノポア－ポリメラーゼペアを、バイオチップの（例えば、ウェルおよび／または電極に配置した）複数の膜に挿入する。一部の例においては、ポリメラーゼのナノポア複合体への取付けは、各電極上のバイオチップにおいて行う。

[0087]ポリメラーゼは、任意の好適な化学作用（例えば、共有結合および／またはリンカー）を用いてナノポアに付けることができる。一部の場合においては、ポリメラーゼは、分子ステープル（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔａｐｌｅ）を用いてナノポアに付ける。一部の例においては、分子ステープルは、３種のアミノ酸配列（リンカーＡ、Ｂ、およびＣで示す）を含む。リンカーＡは溶血素単量体から延びることができ、リンカーＢはポリメラーゼから延びることができ、その場合にリンカーＣは、リンカーＡとリンカーＢを（例えば、リンカーＡとリンカーＢの両方に巻き付くことによって）つなぐことができ、したがってポリメラーゼをナノポアとつなぐことができる。リンカーＣは、リンカーＡまたはリンカーＢの一部分となるよう構築することもでき、したがってリンカー分子の数は減る。

[0088]一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）化学を用いてナノポアに連結する。Ｓｏｌｕｌｉｎｋ（商標）は、ＨｙＮｉｃ（６－ヒドラジノ－ニコチン酸、芳香族ヒドラジン）と４ＦＢ（４－ホルミル安息香酸エステル、芳香族アルデヒド）の間の反応とすることができる。一部の例においては、ポリメラーゼは、Ｃｌｉｃｋ化学（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を用いてナノポアに連結する。一部の場合においては、溶血素分子にジンクフィンガー変異を導入し、次に分子（例えば、ＤＮＡ中間体分子）を使用してポリメラーゼを溶血素のジンクフィンガー部位に連結する。

[0089]ポリメラーゼをナノポアに付けることにおいて使用することができる他のリンカーは、直接の遺伝子連結（例えば、（ＧＧＧＧＳ）_１－３（配列番号４）アミノ酸リンカー）、トランスグルタミナーゼ媒介連結（例えば、ＲＳＫＬＧ（配列番号５））、ソルターゼ媒介連結、およびシステイン修飾による化学連結である。本明細書において有用であると考えられる具体的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_１－３（配列番号４）、Ｎ末端のＫタグ（ＲＳＫＬＧ（配列番号５））、ΔＴＥＶ部位（１２～２５）、ΔＴＥＶ部位＋ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒのＮ末端（１２～４９）である。

装置のセットアップ
[0090]ナノポアは、集積回路などの検出回路の検出電極に隣接して配置された膜に形成するか、または他の方法で埋め込んでもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）としてもよい。一部の例においては、集積回路は電界効果トランジスターまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検出回路は、ナノポアを有するチップもしくは他のデバイスに位置するか、または、チップもしくはデバイスの外部に、例えばオフチップ配置などで位置することができる。半導体は任意の半導体とすることができ、ＩＶ族半導体（例えば、ケイ素）、およびＩＩＩ－Ｖ族半導体（例えば、ヒ化ガリウム）が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドまたはタグを検出するための装置およびデバイスのセットアップについては、例えば、ＷＯ２０１３／１２３４５０を参照のこと。

[0091]細孔を用いたセンサー（例えば、バイオチップ）は、単一分子の電子照合に使用することができる。細孔を用いたセンサーは、検出電極に隣接して、またはその近傍に配置された膜に形成された本開示のナノポアを含むことができる。センサーは対電極を含むことができる。膜は、トランス側（すなわち、検出電極に面する側）およびシス側（すなわち、対電極に面する側）を含む。

[0092]この後の実験に関する開示においては、以下の略記が適用される：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）。

[0093]本発明を以下の実施例においてさらに説明する。実施例は、いかなる方法でも、特許請求する本発明の範囲を限定することを意図するものではない。添付の図は、本発明の明細書および説明の一部をなす部分としてみなされることを意図している。全ての参考文献は、そこに記載されている全てが参照によって本明細書に明確に組み込まれる。以下の実施例は、説明するために提供するものであり、特許請求する本発明を限定するために提供するものではない。

定方向突然変異誘発
[0094]この実施例では、ｐｏｌ６ポリメラーゼへの所望の位置での変異導入を説明している。

[0095]Ｈｉｓタグ付き野生型ｐｏｌ６をコードするＤＮＡを、商業的供給源（ＤＮＡ２．０、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から購入した。配列は、シーケンシングによって確かめた。

[0096]変異体スクリーニング用に、ポリメラーゼをそのまま発現させた（Ｎ末端Ｈｉｓ－Ｐｏｌ６）。ｐｏｌがチップに付くことを試験するため、ｐｏｌ６のＮ末端またはＣ末端にＳｐｙＣａｔｃｈｅｒドメインを操作して入れた。

[0097]Ｐｏｌ６－ヌクレオチド結合に影響を与える合理的位置は、公知の結晶構造のホモロジーモデリングに基づいて同定した。

[0098]最初のスクリーニング用に、合理的位置の各々を、Ｑ５突然変異誘発プロトコールを用いて、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＭｅｔに変異させた。その後のスクリーニングは、他の全ての１９アミノ酸可能性について位置を変異させた。

[0099]各突然変異誘発反応用のプライマーは、ＮＥＢ塩基チェンジャープロトコールを用いて設計し、ＩＤＴに９６ウェルプレートフォーマットで注文した。

[00100]順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、ＮＥＢから購入したＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）を使用して、ハイスループット（ＨＴＰ）フォーマットで５’リン酸化した。典型的な２５μｌ反応物は、１０μＭのプライマー１５μｌ、５倍反応バッファー（ＮＥＢより）５μｌ、ＰＮＫ酵素１．２５μｌ、水３．７５μｌを含有した。反応は３７℃で３０分間行い、酵素は６５℃で２０分間熱失活させた。

[00101]ＰＣＲ突然変異誘発は、ＮＥＢからのＱ５ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。典型的な２５μｌ反応物は、Ｑ５バッファー５μｌ、ＧＣエンハンサー５μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ０．５μｌ、１０μＭリン酸化突然変異誘発順方向プライマーおよび逆方向プライマー１．２５μｌ、Ｑ５ポリメラーゼ０．２５μｌ、および５ｎｇ／ｍｌ野生型Ｐｏｌ６鋳型、すなわちＨｉｓ－Ｐｏｌ６１μｌ、およびＨ_２Ｏ１０．７５μｌを含有した。

[00102]ＰＣＲが完了したら、Ｄｐｎ１０．５μｌをＰＣＲミックス２５μｌに加え、３７℃で１時間インキュベートした。

[00103]Ｄｐｎ１で処理したＰＣＲ産物２．５μｌをＢｌｕｎｔ／ＴＡリガーゼマスターミックス２．５μｌに加える。室温で１時間インキュベートした。

[00104]ライゲーションミックス１μｌを、９６ウェルＢＬ２１ＤＥ３細胞（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）２０μｌに加え、氷上で５分間インキュベートする。

[00105]ＰＣＲデバイスを使用して、正確に３０秒間、４２℃で熱ショックを与え、氷上に２分間置く。

[00106]ＳＯＣ８０μｌを加え、３７℃のインキュベーターで１時間、振盪せずにインキュベートする。

[00107]ＳＯＣまたは超純水１００μｌを加え、カナマイシン５０～１００μｇ／ｍｌを含む４８ウェルＬＢ寒天プレートに蒔く。

発現および精製
[00108]以下の実施例では、ｐｏｌ６バリアントをハイスループット法を用いてどのように発現させて精製したかを詳しく述べる。

[00109]ｐＤ４４１ベクター（発現プラスミド）中のバリアントをコードするＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞に形質転換し、グリセロールストックを作製した。グリセロールストックから取った微量から開始し、グルコース０．２％およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢでスターター培養物１ｍｌを約８時間増殖させた。対数期のスターター培養物２５μｌを、９６ディープウェルプレートの発現培地１ｍｌ（グルコース０．２％、リン酸カリウム５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２５ｍＭ、およびカナマイシン１００μｇ／ｍｌを追加したＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ）自己誘導培地）に移す。プレートを、２５０～３００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で３６～４０時間インキュベートした。

[00110]次に細胞を、４℃で３０分間、３２００×ｇにて遠心分離して収集した。デカントして培地を除き、細胞ペレットをあらかじめ冷却した溶解バッファー２００μｌ（リン酸カリウム２０ｍＭｐＨ７．５、ＮａＣｌ１００ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２００．５％、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール１０ｍＭ、ＰＭＳＦ１ｍＭ、１×ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、リゾチーム１００μｇ／ｍｌ、およびプロテアーゼ阻害剤）中で再懸濁させ、穏やかに撹拌しながら室温で２０分間インキュベートした。次いで１０倍ストックからの２０μｌを、最終濃度１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＩに加え、氷上で５～１０分間インキュベートして溶解液を生成させる。溶解液に、１Ｍリン酸カリウム２００μｌ、ｐＨ７．５（最終濃度は、溶解液４００μｌ中の約０．５Ｍリン酸カリウムとなる）を追加し、４℃で１０分間、約１５００ｒｐｍにて遠心分離することによりＰａｌｌフィルタープレート（部品番号５０５３、３ミクロンフィルター）でろ過する。次いで、澄んだ溶解液を、平衡化した９６ウェルＨｉｓ－Ｐｕｒコバルトプレート（Ｐｉｅｒｃｅ部品番号９００９５）に入れ、１５～３０分間結合させた。

[00111]流出液（ＦＴ）を、５００×Ｇにて３分間遠心分離することによって収集した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー１（リン酸カリウム０．５ＭｐＨ７．５、ＮａＣｌ１Ｍ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、イミダゾール２０ｍＭ、およびＴｗｅｅｎ２００．５％）で３回洗浄した。次いでＦＴを４００μｌの洗浄バッファー２（トリス５０ｍＭｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２００．５％、イミダゾール２０ｍＭ）で２回洗浄した。

[00112]Ｐｏｌを、溶出バッファー２００μｌ（トリス５０ｍＭｐＨ７．４、ＫＣｌ２００ｍＭ、ＴＣＥＰ５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ２００．５％、イミダゾール３００ｍＭ、グリセロール２５％）を使用して溶出させ、１～２分のインキュベーション後に収集した。溶離液を２～３回、同じＨｉｓ－Ｐｕｒプレートに再び入れて、溶離液中に濃縮したＰｏｌ６を得る。精製したポリメラーゼは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価した場合に９５％超の純度である。タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐによって評価した場合に約３ｕＭ（０．３５ｍｇ／ｍｌ）であり、２６０／２８０比は０．６である。

[00113]ポリメラーゼ活性は、ＦＲＥＴに基づく延長アッセイによって確認する（実施例３を参照のこと）。

蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）に基づく延長アッセイ
[00114]高塩濃度条件下でポリリン酸ヌクレオチドヌクレオチドを取り込むそれらの能力に対するバリアントポリメラーゼのアミノ酸の変異の影響を、ＦＲＥＴに基づく延長アッセイで試験した。

[00115]このアッセイにおいて、フルオロフォアはＡｌｅｘａ／Ａｔｔｏ４８８であり、消光剤はＩｏｗａブラックであった。

[00116]使用された配列は以下の通りであった：
５－／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／ＡＧＡＧＴＧＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧ－３（配列番号６）
５－ＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３（配列番号７）

[00117]ポリメラーゼを低７５ｍＭＫＧｌｕ中でヘアピン鋳型にあらかじめ結合させ、時間＝０で、Ｍｇ２＋を注入して鋳型の伸長を開始させ、これによりプロセス中の消光剤鎖が置換され、その結果蛍光が増加した。ＢＭＧｌａｂｔｅｃｈ蛍光プレートリーダーを用いて蛍光をモニターした。

[00118]アッセイに使用した最終緩衝液組成は表１に記載した通りであった。

[00119]例示的な親ポリメラーゼ、およびそのバリアントについての延長曲線をそれぞれ図４に示す。

[00120]データは、変異を含むバリアントポリメラーゼＰｏｌ６がＤＮＡ鋳型からの解離速度の減少、したがってプロセッシビリティの増加を示すことを示している。したがって、これらのバリアントポリメラーゼはまた、配列決定寿命を増大させ、そして配列決定イベントの読取りの長さを増加させると期待される。

ｋ_ｏｆｆの測定
[00121]この実施例では、蛍光偏光を用いる、ｋ_ｏｆｆを測定する代替方法を示す。

[00122]トリス２５ｍＭｐＨ７．０、ＫＣｌ７５ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１０００．０１％、１×ＢＳＡ（１００ｕｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ０．５ｍＭ、ＣａＣｌ２２ｍＭ、ＤＴＴ２ｍＭを含むアッセイバッファーを使用して、ヘアピンフルオレセイン標識ＤＮＡ鋳型およびｄＣ６Ｐ－Ｃ６－Ｃｙ３タグ付きヌクレオチド２５０ｎＭを含有するアッセイマスターミックスを調製した。マスターミックス５５μｌを黒色９６ウェルＣｏｓｔａｒプレートのウェルの各々に加え、培養物１ｍｌから精製したポリメラーゼ変異体２０μｌをハイスループット（ＨＴＰ）フォーマットで加えた。プレートは、プレート振盪機で１分間振盪し、ポリメラーゼ－ＤＮＡ鋳型－ヌクレオチドの均一な三元複合体を形成させた。プレートをＢＭＧＰｏｌａｒｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧＬＡＢＴＥＣＨＩｎｃ．、ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ）に置き、２０００周辺でのゲインを有するよう標的ミリ偏光を２００ｍＰおよび１０％に調節した。励起フィルターは４８５ｎＭに設定し、発光フィルターは５９０～２０ｎＭに設定した。注射器に、１ｍＭｄＣＴＰ追跡ヌクレオチド溶液１ｍｌを詰めた。データは、１インターバルにつき１ウェル当たり最低３０フラッシュで、開始の合計読取り時間６０秒で収集した。遅い解離を示したヒット変異体では、フラッシュを５０以上に増加させ、より長い読取り時間を取った。データ収集は、１ｍＭｄＣＴＰ２５μｌの注入で開始した。

[00123]バリアント親ポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ２４２Ａ）およびバリアントポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｓ２９３Ｍ）の蛍光偏光に基づくｋ_ｏｆｆアッセイからの代表的なデータについては図３を参照のこと。ｍＰはミリ偏光である。あらかじめ形成させた、ポリメラーゼ－ＤＮＡ鋳型－ｄＣｎＰ－Ａｌｅｘａ５５５の三元複合体を、未変性ｄＣＴＰを用いて追跡し、偏光ｄＣｎＰ－Ａｌｅｘａ５５５をある時間にわたってモニターした。

ナノポアへの取付け
[00124]この実施例では、バリアントポリメラーゼをナノポア、例えばα－溶血素に付ける方法を示す。

[00125]ポリメラーゼは、任意の好適な手段によってナノポアに連結してもよい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８９６７（ＷＯ２０１４／０７４７２７として公開；ＧｅｎｉａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００９７０２（ＷＯ２００６／０２８５０８として公開；ＰｒｅｓｉｄｅｎｔａｎｄＦｅｌｌｏｗｓｏｆＨａｒｖａｒｄＣｏｌｌｅｇｅ）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６５６４０（ＷＯ２０１２／０８３２４９として公開；ＣｏｌｕｍｂｉａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を参照のこと。

[00126]ポリメラーゼ、例えばバリアントｐｏｌ６ＤＮＡポリメラーゼを、リンカー分子を介してタンパク質ナノポア（例えば、アルファ溶血素）に連結させた。詳細には、生理的条件下で共有結合性イソペプチド連結を自発的に形成するＳｐｙＴａｇおよびＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを使用した。例えば、Ｌｉら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２０１４年１月２３；４２６（２）：３０９～１７を参照のこと。

[00127]ｐｏｌ６バリアントＳｐｙＣａｔｃｈｅｒＨｉｓタグを実施例２に従って発現させ、コバルトアフィニティーカラムを使用して精製した。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒポリメラーゼおよびＳｐｙＴａｇオリゴマー化ナノポアタンパク質を、３ｍＭＳｒＣｌ_２中で、４℃にて終夜インキュベートした。次に１：６－ポリメラーゼ－鋳型複合体を、分子ふるいクロマトグラフィーを使用して精製した。

[00128]ｐｏｌ６バリアントのＮ末端またはＣ末端のいずれかに、リンカーを付けた。Ｎ末端で付けられたバリアントはより頑強、例えばより安定であることが見出された。したがって、Ｎ末端に付けられたリンカーを使用した。

タグ付きヌクレオチドを使用した鋳型ＤＮＡのシーケンシング
[00129]この実施例では、バリアントポリメラーゼが、バイオチップでの合成法によるシーケンシングにおいて機能的であることを示す。

[00130]親Ｐｏｌ６ポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｙ２４２Ａ）およびバリアントＰｏｌ６ポリメラーゼ（Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ）、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ８、５００ｍＭグルタミン酸カリウムおよび５ｍＭＭｇＣｌ２、室温を用いた鋳型のＡＣ配列決定。ポリメラーゼが付いたナノポアを、本明細書において記載したように脂質二重層に埋め込んだ。プライマーが付いたＤＮＡを加え、ポリメラーゼと複合化させた。４種の異なるタグ付きヌクレオチドを２０μＭの濃度で加えた。合成によるシーケンシングは、「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＵｓｉｎｇＴａｇｓ」という題名のＷＯ２０１４／０７４７２７において記載されているように進めてもよい。親ポリメラーゼのトレースを図５に示し、配列決定精度７１％を示す。図６のトレースは、ヘテロポリマー鋳型について８１％の配列決定精度、およびバリアントポリメラーゼについて９６ｂｐのリード長を示す。

温度アッセイ
[00131]高温でポリリン酸ヌクレオチドヌクレオチドを取り込むそれらの能力に対するバリアントポリメラーゼのアミノ酸の変異の影響を、ＦＲＥＴに基づく延長アッセイで試験した。高温は、野生型酵素の融点より高い温度、または野生型酵素が変性した温度として定義された。

[00132]このアッセイにおいては、フルオロフォアはＡｌｅｘａ／Ａｔｔｏ４８８であり、消光剤はＩｏｗａブラックであった。

[00133]使用された配列は以下の通りであった：
５－／５ＡＴＴＯ４８８Ｎ／ＡＧＡＧＴＧＡＴＡＧＴＡＴＧＡＴＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＴＧＡＧＴＡＧＣＣＧＡＡＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＧ－３（配列番号６）
５－ＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＴＡＣＴＡＴＣＡＣＴＣＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／－３（配列番号７）

[00134]ポリメラーゼを低７５ｍＭＫＧｌｕ中でヘアピン鋳型にあらかじめ結合させ、４５℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＦＲＥＴに基づく伸長アッセイを通常通りに行った：時間＝０で、Ｍｇ２＋を注入して鋳型の伸長を開始させ、これによりプロセス中の消光剤鎖が置換され、その結果蛍光が増加した。蛍光はＢＭＧｌａｂｔｅｃｈ蛍光プレートリーダーを用いてモニターした。

[00135]アッセイに使用した最終緩衝液組成は表２に記載の通りであった。

[00136]対照と比較した種々の変異の折れたたみの改善を表３に示す。

[00137]本明細書において記載される実施例および実施形態は、単なる例示目的のものであり、またその実施例および実施形態を考慮した様々な改変または変化が当業者に提案されることになり、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることになることが理解されよう。本明細書において引用されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる。

配列番号１－野生型Ｐｏｌ６（ＤＮＡポリメラーゼ［クロストリジウムファージｐｈｉＣＰＶ４］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＨ２７１１３．１）

配列番号２－Ｐｏｌ６（Ｈｉｓタグ付き；番号付けのために使用）

配列番号３－Ｈｉｓタグ付きＰｏｌ６（ＤＮＡ配列）

配列番号４－アミノ酸リンカー

配列番号５－トランスグルタミナーゼ媒介連結

配列番号６

配列番号７

先行技術文献
特許文献
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非特許文献
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Claims

ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼであって、
配列番号１または２に記載するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
前記改変ＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ３０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｖ、Ｉ４２Ｅ／Ｌ、Ｄ４４Ｔ、Ｅ４６Ｗ、Ｃ４８Ｇ、Ｇ６２Ａ／Ｅ／Ｔ、Ｇ６４Ａ、Ｗ１２７Ｌ／Ｓ／Ｒ／Ｖ／Ｇ／Ｃ／Ｐ／Ｑ／Ａ／Ｅ、Ｇ１４６Ｋ／Ｌ、Ｔ１６２Ｃ／Ｒ／Ｖ、Ｖ１６４Ｑ／Ｒ／Ｔ、Ｉ１７２Ａ、Ｉ１７８Ａ、Ｓ１９８Ｆ／Ｌ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｖ、Ｌ２０６Ｓ、Ｆ２０９Ｉ／Ｒ／Ｔ／Ｖ、Ａ２１８Ｒ、Ｑ２２１Ｆ／Ｍ／Ｒ／Ｗ／Ｇ／Ｌ／Ｅ／Ｙ／Ｋ、Ｆ２２２Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｔ、Ｈ２２３Ｌ、Ｎ２２４Ｋ／Ｒ／Ｔ、Ｙ２２５Ｔ、Ｖ２２６Ｔ、Ｈ２２７Ｅ／Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｔ、Ｆ２３３Ｅ／Ｔ／Ｗ／Ｐ／Ｓ、Ｙ２３４Ｒ、Ｋ２３５Ｓ／Ｑ／Ｎ／Ｆ／Ｗ／Ｐ、Ｍ２３６Ｋ、Ｇ２３７Ａ、Ｄ２４１Ｗ／Ｈ、Ｄ２４３Ｐ、Ｄ２６３Ｑ／Ｗ／Ｌ、Ｉ２６４Ｙ、Ｙ２６５Ｅ、Ｍ２６６Ｖ／Ｗ、Ｒ２６８Ｅ、Ｅ２６９Ｉ、Ｖ２７０Ａ／Ｓ、Ｇ２７８Ｖ／Ｅ／Ｍ／Ｒ／Ｌ／Ｐ、Ｅ２８３Ｇ、Ｌ２８４Ｒ／Ｙ、Ｐ２８５Ｌ／Ｃ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｍ２８９Ｐ、Ｒ２９０Ｖ／Ｃ、Ａ２９２Ｓ／Ｌ／Ｔ、Ｓ２９３Ｇ／Ｑ／Ｒ／Ｔ／Ｍ／Ｗ／Ａ、Ｓ２９４Ｙ／Ｔ／Ｒ／Ｍ／Ｌ／Ｋ／Ｇ／Ｆ／Ｅ、Ｉ２９５Ａ／Ｌ、Ａ２９６Ｍ、Ｆ２９７Ｍ／Ｔ／Ｌ、Ｎ２９８Ｋ／Ｌ／Ｒ／Ｗ／Ｇ、Ｖ２９９Ｙ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｆ／Ｋ、Ｅ３１１Ｎ／Ｋ／Ｈ、Ｅ３１２Ｒ／Ｌ／Ｋ、Ｙ３１４Ｗ、Ｙ３３８Ｌ、Ｖ３５０Ｒ／Ｌ／Ｍ、Ｃ３５９Ｔ、Ｓ３６０Ａ／Ｆ、Ｌ３６１Ａ／Ｍ／Ｆ、Ｙ３６７Ｆ、Ｓ３６９Ｇ／Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ａ、Ｑ３７０Ａ、Ｍ３７１Ｌ、Ａ３７２Ｇ／Ｌ、Ｙ３７３Ｔ／Ｒ／Ａ、Ｋ３７４Ｈ／Ｐ／Ｎ／Ｆ／Ｇ／Ｗ、Ｆ３７６Ｌ／Ｖ、Ｋ３８０Ｒ、Ｖ３８２Ｌ／Ｉ、Ｒ３８８Ｐ／Ｓ、Ｐ３９０Ｌ／Ｖ、Ｅ３９６Ｎ／Ｆ、Ｙ３９８Ａ／Ｐ、Ｌ３９９Ｇ、Ｉ４００Ｐ／Ｍ／Ｌ、Ｅ４０１Ｉ、Ｆ４０４Ｌ、Ｆ４０６Ｋ／Ｙ、Ｋ４１０Ｖ、Ｈ４１１Ｐ、Ｙ４１４Ｐ／Ｒ／Ｉ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｋ／Ｇ、Ａ４１５Ｐ、Ｌ４１６Ｗ、Ｄ４１７Ｅ、Ｉ４１８Ｑ／Ｈ、Ｓ４３０Ｐ、Ｐ４３１Ｇ、Ｉ４３２Ｆ、Ｇ４３８Ｒ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｃ、Ｄ４４８Ｌ、Ｋ４５６Ｒ、Ｌ４５８Ｐ／Ｒ、Ｋ４６２Ｇ、Ｔ４６４Ｐ、Ｎ４６８Ｇ、Ｖ４６９Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｙ、Ｖ４７０Ｌ／Ｉ／Ｍ／Ｑ／Ｈ／Ａ／Ｆ、Ｌ４７１Ｃ／Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｖ４７４Ｇ、Ｅ４７５Ｄ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｙ４７６Ｌ、Ｅ４７７Ｇ、Ｆ４７８Ｙ／Ｈ、Ｗ４７９Ｋ、Ｋ４８１Ｌ、Ｈ４８２Ｔ／Ｇ／Ｄ／Ｒ／Ｗ、Ｆ４８３Ｇ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｅ５０２Ｐ／Ａ、Ｇ５０５Ｃ／Ｒ、Ｌ５０６Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｉ５０８Ｍ／Ｐ、Ｓ５１０Ｐ／Ｆ／Ｌ、Ｙ５１４Ｗ、Ｋ５１８Ｗ、Ｆ５２１Ｍ／Ｌ、Ｋ５２２Ｒ／Ｑ、Ｐ５２３Ｙ／Ｔ／Ｋ／Ｇ／Ｅ／Ｒ／Ｍ／Ｌ／Ｑ／Ａ、Ｙ５２４Ａ／Ｆ／Ｗ、Ｖ５２５Ｍ、Ｄ５２６Ｑ／Ｅ、Ｈ５２７Ｆ／Ｍ／Ｌ／Ｒ、Ｆ５２８Ｑ／Ｌ／Ｙ、Ｋ５３０Ｔ／Ｇ／Ｆ／Ｅ／Ｗ／Ｙ／Ｒ／Ｑ、Ｍ５３１Ｒ／Ｌ／Ａ、Ｖ５３３Ａ、Ｅ５３４Ｒ、Ｎ５３５Ｙ、Ｋ５３７Ｌ／Ｅ、Ｌ５３８Ｒ／Ｑ／Ｋ／Ａ、Ｋ５４１Ｒ／Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｌ５４３Ａ／Ｋ／Ｔ／Ｒ、Ｔ５４４Ａ、Ｎ５４５Ｙ、Ｑ５４６Ａ、Ｌ５４９Ｔ／Ｒ／Ａ、Ｌ５５１Ｍ、Ｇ５５２Ｔ、Ｇ５５３Ｔ／Ｑ／Ｋ／Ａ／Ｙ／Ｒ／Ｍ、Ａ５５４Ｑ／Ｔ、Ｙ５５５Ａ、Ｇ５５６Ｒ、Ｋ５５７Ｗ／Ｒ／Ｅ／Ｑ、Ｆ５５８Ｍ、Ｔ５６０Ｙ／Ｒ／Ｍ／Ｇ／Ｆ／Ｋ／Ａ／Ｌ、Ｋ５６１Ａ／Ｑ／Ｍ／Ｇ／Ｙ、Ｑ５６２Ｋ／Ｒ／Ｇ、Ｅ５６６Ｑ／Ｙ／Ｇ／Ｆ、Ｅ５８７Ｋ／Ｔ、Ｇ５８８Ｅ／Ｖ／Ｑ、Ｅ５９０Ｒ／Ｗ、Ｐ５９４Ａ／Ｖ、Ｇ６０３Ｙ／Ｌ／Ａ、Ｗ６０８Ｒ、Ａ６１０Ｔ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｍ、Ｌ６２１Ｗ、Ｃ６２３Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｄ６２４Ｌ、Ｉ６２８Ｍ、Ｙ６２９Ｋ／Ｗ、Ｃ６３０Ａ／Ｑ、Ｎ６３１Ｌ／Ｔ／Ｗ／Ａ、Ｒ６３２Ｋ、Ｖ６３４Ｌ、Ｉ６３８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｙ／Ｆ／Ｋ、Ｅ６３９Ｆ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｄ６４０Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｑ／Ｔ、Ｍ６４１Ｌ、Ｎ６４２Ｅ／Ｆ／Ｋ／Ｑ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｍ、Ａ６４３Ｋ／Ｒ／Ｔ／Ｙ／Ｌ、Ｉ６４４Ａ、Ｔ６４７Ａ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｗ／Ｙ／Ｋ、Ｋ６５０Ｑ／Ｒ／Ｙ／Ａ、Ｔ６５１Ｍ、Ｉ６５２Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｗ／Ｌ、Ｌ６５３Ｍ／Ａ、Ｋ６５５Ａ／Ｆ／Ｇ／Ｍ／Ｗ／Ｙ、Ｄ６５７Ｅ／Ｒ、Ｖ６５８Ｆ／Ｍ／Ｙ／Ｔ、Ｅ６５９Ｋ／Ｔ、Ｋ６７２Ｒ／Ｔ、Ｅ６８０Ａ／Ｑ／Ｋ／Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｍ、Ｋ６８２Ｆ／Ｍ／Ｙ／Ｖ／Ｉ、Ｔ６８３Ｆ／Ｗ、Ｄ６８４Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｙ／Ｇ／Ｗ／Ｅ／Ｔ／Ｑ、Ｌ６８５Ａ、Ｋ６８６Ｒ／Ｍ／Ｔ、Ｃ６８７Ａ、Ｃ６８８Ａ／Ｓ、Ｓ６９２Ｆ／Ｋ／Ｒ／Ｙ／Ｄ／Ｌ、Ｄ６９３Ｐ／Ｒ／Ｍ／Ａ／Ｋ／Ｙ／Ｗ、Ａ６９４Ｌ／Ｍ／Ｔ／Ｙ／Ｆ、Ｒ６９５Ｋ、Ｋ６９６Ｑ、Ｉ６９７Ａ、Ｉ６９８Ｌ、Ｌ７０８Ｈ／Ｐ／Ｙ、Ｖ７１２Ｃ、Ｒ７１８Ｋ、Ｉ７２２Ｒ、Ｇ７２４Ｙ、Ｆ７３２Ｙ、Ｍ７３８Ｗ／Ｖおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有し、
さらに、前記改変ＤＮＡポリメラーゼが、Ｙ２４２ＡおよびＥ５８５Ｋのアミノ酸置換を有し、
ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２の番号付けに対応するものであり、
前記改変ポリメラーゼが、親ポリメラーゼと比較して向上した配列決定精度を有する、
前記改変ＤＮＡポリメラーゼ。
前記改変ポリメラーゼが、親ポリメラーゼと比較して変化した追加特性を有する、請求項１に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
変化した追加特性が、忠実度、処理能力、伸長速度、安定性、溶解性、ならびに、ヌクレオチド四リン酸、ヌクレオチド五リン酸、ヌクレオチド六リン酸、ヌクレオチド七リン酸、またはヌクレオチド八リン酸のようなヌクレオチドポリリン酸に結合する能力、および／またはヌクレオチドポリリン酸を組み込む能力から選択される、請求項２に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
変化した特性が、４、５、６、７、または８個のリン酸を有するヌクレオチドポリリン酸を、成長しているＤＮＡ鎖に組み込む能力である、請求項２に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
ヌクレオチドポリリン酸がタグ付きのものである、請求項４に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
Ａ．
ａ．Ｎ２２４Ｔ；
ｂ．Ｓ２９３Ｑ；
ｃ．Ｓ２９４Ｒ／Ｔ；
ｄ．Ｉ２９５Ａ；
ｅ．Ｖ２９９Ａ／Ｒ；
ｆ．Ｌ３６１Ｍ；
ｇ．Ｓ３６９Ｆ；
ｈ．Ｙ３７３Ａ／Ｔ；
ｉ．Ｆ５２８Ｙ；
ｊ．Ｋ５３０Ｇ／Ｅ／Ｆ；
ｋ．Ｌ５４９Ｔ／Ｒ；
ｌ．Ｇ５５３Ａ／Ｋ／Ｔ；
ｍ．Ａ５５４Ｑ；
ｎ．Ｇ５５６Ｒ；
о．Ｋ５５７Ｒ；
ｐ．Ｆ５５８Ｍ；
ｑ．Ｔ５６０Ｆ／Ｙ；
ｒ．Ｙ６２９Ｗ；
ｓ．Ｃ６３０Ａ；
ｔ．Ｉ６３８Ａ／Ｅ；
ｕ．Ｎ６４２Ｅ／Ｋ／Ｆ／Ｙ／Ｗ；
ｖ．Ｔ６４７Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｍ；
ｗ．Ｋ６５０Ｑ；
ｘ．Ｔ６５１Ｍ；
ｙ．Ｉ６５２Ｇ／Ａ／Ｅ／Ｑ／Ｍ；
ｚ．Ｌ６５３Ｍ；
ａａ．Ｋ６５５Ｇ／Ｗ；
ｂｂ．Ｖ６５８Ｙ；
ｃｃ．Ｄ６９３Ｒ／Ｍ／Ｐ；および
ｄｄ．Ａ６９４Ｌ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含む、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ；
Ｂ．
ａ．Ｑ２２１Ｌ；
ｂ．Ｆ２２２Ｌ；
ｃ．Ｙ３３８Ｌ；
ｄ．Ｌ３６１Ｆ；
ｅ．Ｑ３７０Ａ；
ｆ．Ｋ５３７Ｅ；
ｇ．Ｌ５４３Ｋ／Ｒ
ｈ．Ｇ５５３Ａ／Ｋ／Ｙ／Ｒ／Ｔ／Ｑ；
ｉ．Ａ５５４Ｔ；
ｊ．Ｉ６２８Ｍ；
ｋ．Ｙ６２９Ｋ；
ｌ．Ｎ６３１Ｔ；
ｍ．Ｒ６３２Ｋ；
ｎ．Ｎ６４２Ｑ／Ｆ／Ｙ；
о．Ａ６４３Ｌ；
ｐ．Ｄ６８４Ｇ／Ｆ／Ｗ／Ｍ／Ｑ；および
ｑ．Ｄ６９３Ａ／Ｋ／Ｍ／Ｙ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含む、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ；
Ｃ．
ａ．Ｎ２２４Ｋ；
ｂ．Ｈ２２７Ｇ／Ａ／Ｑ／Ｔ；
ｃ．Ｓ２９３Ａ／Ｑ／Ｔ；
ｄ．Ｖ２９９Ｆ；
ｅ．Ｃ３５９Ｔ；
ｆ．Ｌ３６１Ｍ；
ｇ．Ｆ４０６Ｙ；
ｈ．Ｆ５２１Ｍ；
ｉ．Ｐ５２３Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｔ／Ｍ／Ａ；
ｊ．Ｈ５２７Ｆ／Ｌ／Ｍ／Ｒ；
ｋ．Ｋ５３０Ｇ／Ｅ；
ｌ．Ｎ５３５Ｙ；
ｍ．Ｇ５５３Ａ；
ｎ．Ｙ５５５Ａ；
о．Ｔ５６０Ｙ；
ｐ．Ｇ６０３Ａ；
ｑ．Ｃ６２３Ｇ；
ｒ．Ｙ６２９Ｋ；
ｓ．Ｎ６４２Ｍ；
ｔ．Ｔ６４７Ｋ／Ｆ／Ｙ；
ｕ．Ｉ６５２Ｇ／Ｌ／Ｑ／Ｋ／Ｒ／Ｗ／Ｍ；
ｖ．Ｋ６５５Ａ；
ｗ．Ｄ６８４Ｆ／Ｙ／Ｗ／Ｍ；および
ｘ．Ｋ６８６Ｒ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含む、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｄ６９３Ｐ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ；
Ｄ．
ａ．Ｑ２２１Ｒ；
ｂ．Ｎ２２４Ｋ；
ｃ．Ｓ２９３Ｑ／Ｇ；
ｄ．Ｎ２９８Ｌ／Ｋ／Ｗ；
ｅ．Ｖ２９９Ｒ；
ｆ．Ｓ３６０Ａ／Ｆ；
ｇ．Ｌ３６１Ｆ／Ｍ／Ａ；
ｈ．Ｋ５２２Ｒ；
ｉ．Ｈ５２７Ｍ；
ｊ．Ｋ５３０Ｆ；
ｋ．Ｋ５３７Ｅ；
ｌ．Ｌ５４３Ｋ；
ｍ．Ｇ５５３Ｙ／Ｒ／Ｔ／Ｍ；
ｎ．Ａ５５４Ｑ／Ｔ；
о．Ｇ６０３Ａ；
ｐ．Ｙ６２９Ｗ／Ｋ；
ｑ．Ｎ６３１Ｗ；
ｒ．Ｉ６３８Ｆ；
ｓ．Ｎ６４２Ｍ；
ｔ．Ｋ６５０Ａ；
ｕ．Ｋ６５５Ｆ；
ｖ．Ｋ６７２Ｔ；
ｗ．Ｋ６８６Ｔ；
ｘ．Ｄ６９３Ｒ／Ｗ；および
ｙ．Ａ６９４Ｆ
から選択される１つまたは複数の変異をさらに含む、Ｔ５２９Ｍ＋Ｓ３６６Ａ＋Ａ５４７Ｆ＋Ｎ５４５Ｌ＋Ｙ２２５Ｌ＋Ｄ６５７Ｒ＋Ｋ５６１Ｇ＋Ｋ５４１Ｒ＋Ｔ５４４Ａ＋Ｓ６９２Ｙ＋Ｉ６５２Ｑ＋Ｄ６８４Ｍ＋Ｙ２４２Ａ＋Ｅ５８５Ｋ、
から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼ。
検出電極に隣接する膜中のα溶血素ナノポアを用いて核酸試料を配列決定する方法であって、
ａ．前記ナノポアを含む反応チャンバ内にタグ付きヌクレオチドを提供するステップであって、前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドがヌクレオチドに結合したタグを含み、そのタグが前記ナノポアを用いて検出可能であるステップ；
ｂ．請求項１～６のいずれか１項に記載の改変ＤＮＡポリメラーゼを用いて重合反応を行うステップであって、前記ポリメラーゼがナノポアに結合し、それによって前記タグ付きヌクレオチドの個々のタグ付きヌクレオチドを前記核酸試料からの一本鎖核酸分子に相補的な成長鎖に組み込むステップ；および
ｃ．前記ナノポアを用いて、前記個々のタグ付きヌクレオチドの組み込み中に前記個々のタグ付きヌクレオチドに関連付けられたタグを検出し、前記タグは前記ナノポアを用いて検出され、前記ヌクレオチドは前記バリアントポリメラーゼに関連付けられるステップを含む、前記方法。