CN104350162A - 芯片设置和高精确度核酸测序 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于测序核酸分子的设备、系统和方法。可以使用包含以至少约500个位点/1mm的密度的独立可寻址的纳米孔传感器的阵列的芯片以高精确度(例如，在单次经过中大于97%)测序核酸分子。单个纳米孔传感器可以包括在邻近或接近于感测电极的膜中的纳米孔。

Description

芯片设置和高精确度核酸测序

交叉引用

本申请要求2013年2月28日提交的美国临时专利申请号61/771,031、2012年6月15日提交的美国临时专利申请号61/660,537和2012年6月15日提交的美国临时专利申请号61/660,543的权益，每个申请以其整体通过引用并入本文。

背景

生物芯片可用于各种类型的分子检测和感测，包括核酸分子的测序。核酸测序是用于测定核酸的核酸碱基的过程。此类序列信息可有助于诊断和/或治疗受试者。例如，受试者的核酸序列可用于鉴定、诊断遗传性疾病和潜在开发遗传性疾病的治疗方法。作为另一个实例，对病原体的研究可以导致传染性疾病的治疗。

存在可用于测序核酸的可用方法。然而，此类方法是昂贵的，并且无法在一定时间段内和以诊断和/或治疗受试者必要的精确度提供序列信息。

概述

本公开提供了用于种类检测和测序(诸如分子检测和/或核酸测序)的设备、系统和方法。还提供了用于形成高精确度纳米孔设备的方法。本公开提供了高性能设备，所述高性能设备可以经配置用于通过独立、平行地且以实质上高精确度(例如，至少约97％、98％或99％)，在一些情况下在实质上短时间段内(例如，小于约1天、12小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时或1小时)测序核酸分子(例如，作为较大核酸样品的部分)的高准确度核酸测序。此类高性能设备可以包括，例如，至少约500、600、700、800、900、1000、10000个单个纳米孔传感器/1 mm²。独立且平行测序可以实现高精确度测序，在一些情况下在冗余核酸序列信息的帮助下。

在一个方面，用于核酸测序的方法包括： (a) 提供包含大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的多个离散位点的芯片，其中所述多个离散位点的单个位点包含在邻近于电极设置的膜中形成的至少一个纳米孔，其中每个离散位点适配成帮助检测所述核酸分子或其部分；(b) 将多个核酸分子引导至所述多个离散位点；和(c) 借助于耦合至所述离散位点的计算机处理器，基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的每个的核酸序列。

在另一个方面，用于测序核酸分子的系统包含： (a) 包含大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的多个离散位点的芯片，其中所述多个离散位点的单个位点包含在邻近于电极设置的膜中形成的至少一个纳米孔，其中每个离散位点适配成帮助检测所述核酸分子或其部分；和(b) 耦合至所述芯片的处理器，其中将所述处理器编程以帮助基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的核酸序列。

在另一个方面，系统包含具有包含大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的离散位点的表面的衬底，其中所述多个离散位点的单个位点包含至少一个纳米孔和邻近于所述纳米孔的感测电路，其中所述感测电路与计算机处理器通信，将所述计算机处理器编程以帮助基于从所述感测电路接收的电信号表征核酸分子的核酸序列。

在另一个方面，将膜设置在感测接近于耦合至集成电路的电极的膜不相容表面上，其中所述膜，如通过所述集成电路测量，表现出大于约5 fF/μm²/平方微米的电容和小于约0.25纳西门子(nano Siemens)/摩尔电解质的电导率，如在至少约50 mV的施加电压下通过所述电极所测量。膜可以是用于种类检测和/或核酸测序的设备(例如，芯片)的部分。

在另一个方面，用于分子感测中使用的设备包含设置在感测接近于耦合至集成电路的电极的至少一个膜不相容表面上的膜中的一个或多个纳米孔，其中所述包含所述一个或多个纳米孔的膜表现出大于约5 fF/μm²的电容和小于约10纳西门子/摩尔电解质/纳米孔的电导率，如在至少约50 mV的施加电压下通过所述电极所测量。

在另一个方面，用于测序核酸分子的方法包括： (a) 提供包含传感器阵列的芯片，其中所述传感器阵列的单个传感器包含邻近于感测电极的膜，其中所述膜包含至少一个纳米孔，所述纳米孔经配置以帮助在通过或邻近于所述至少一个纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分的一个或多个核酸碱基；(b) 将所述核酸分子引导至所述单个传感器；(c) 将所述核酸分子引导至所述单个传感器之后将一系列电脉冲施加至所述膜；和(d) 在所述电脉冲系列之间检测所述核酸分子或其部分的一个或多个核酸碱基。

在另一个方面，用于测序核酸分子的方法包括： (a) 提供包含单个传感器的阵列的芯片， 其中所述阵列的单个传感器包含邻近于其中具有纳米孔的膜设置的电极，其中将所述电极耦合至电路，所述电路适配成生成电信号以帮助在通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分；(b) 引导所述核酸分子或其部分通过或接近于所述纳米孔；和(c) 以至少约97％的精确度鉴定所述核酸分子或其部分的核酸序列。

在另一个方面，用于测序核酸分子的系统包含： (a) 包含单个传感器的阵列的芯片，其中所述阵列的单个传感器包含邻近于其中具有纳米孔的膜设置的电极，其中将所述电极耦合至电路，所述电路适配成生成电信号以帮助在通过或邻近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分；和(b) 耦合至所述芯片的处理器，其中将所述处理器编程以帮助以至少约97％的精确度基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的核酸序列。

在另一个方面，用于测序核酸样品的方法包括在通过或接近于纳米孔的所述核酸样品流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位，并以至少约97％的精确度测序所述核酸样品。

在另一个方面，用于测序核酸样品的方法包括在通过或接近于纳米孔的所述核酸样品流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位，并以小于约3%的错误率测序所述核酸样品。

在另一个方面，用于测序核酸样品的方法包括(a) 在不使用分子马达的情况下促进通过嵌入在膜中的纳米孔的所述核酸样品流；(b) 在通过所述纳米孔的所述核酸样品流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位；和(c) 检测所述一个或多个核酸亚单位之后测序所述核酸样品。

在另一个方面，用于测序核酸样品的方法包括： (a) 借助于邻近于纳米孔的感测电路，在不借助于酶通过所述纳米孔的所述核酸样品或其部分的流上感测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位；和(b) 感测所述一个或多个核酸亚单位之后测序所述核酸样品。

在另一个方面，用于核酸测序的方法包括： (a) 将核酸分子锚定至其中具有纳米孔的膜； (b) 使所述核酸分子或其部分穿过或接近于纳米孔；和(c) 在步骤(b)过程中感测所述核酸分子的一个或多个单个碱基，其中将核酸分子锚定至所述膜防止核酸分子完全穿过纳米孔。

在另一个方面，用于感测来自受试者的生物样品的系统包含： (a) 壳体；(b) 壳体内的传感器，所述传感器具有邻近于其中具有纳米孔的膜的电路，其中所述电路适配成生成响应于流过或邻近于纳米孔的生物样品的电信号；和(c) 壳体上或壳体内的识别元件，所述识别元件具有与系统相关且适配成帮助将电信号或源自电信号的特征信息与受试者关联的独特标识符。

在另一个方面，用于在表面上操纵流体的方法包括： (a) 提供表面，接近于所述表面的电极阵列，和包含亲水相和疏水相的流体，其中所述疏水性邻近于所述表面；和(b) 以空间和/或时间模式为电极通电，从而减小所述疏水相相对于接近于所述电极的所述亲水相的体积。

在另一个方面，生物芯片包含设置在孔内、邻近于孔或接近于孔的膜中的纳米孔，其中所述孔包含电极，所述电极能够检测通过响应于经过、接近于或邻近于纳米孔的种类的所述纳米孔的离子流的变化，其中所述电极能够检测所述离子流的变化至少1小时，而无需重新调整膜的任一侧上的离子浓度。

在另一个方面，用于制备生物芯片的方法包括： (a) 提供半导体衬底；(b) 以至少500个孔/mm²的密度在所述半导体衬底中形成多个孔；(c) 在所述多个中的单个孔中形成电极，其中所述电极能够进行设置在所述半导体衬底上或邻近于所述半导体衬底的可检测种类的电测量，和其中所述电极在40 mV施加电势下具有至少15分钟的运行寿命；和(d)制备衬底用于形成膜，所述膜以至少约10千兆欧姆的电阻率(resistivity)密封所述单个孔。

在另一个方面，生物芯片包含(a) 至少500个孔/平方毫米的密度的多个电分离的孔；和(b) 设置在所述多个中的单个孔中或邻近于所述多个中的单个孔的膜，其中所述膜包含纳米孔，和其中所述单个孔包含电极，所述电极检测响应于通过所述纳米孔的离子流的信号。

在另一个方面，用于制备生物芯片的方法包括： (a) 将二氧化硅沉积在半导体衬底上；(b) 将孔蚀刻入二氧化硅，从而在所述半导体衬底中提供至少500个孔/mm²的密度的孔；(c) 所述孔中形成金属电极；(d) 从除了孔以外的衬底所有区域去除金属；和(e) 用适于粘附膜的层包覆衬底。

在一些实施方案中，金属电极通过以下在所述孔中形成：(a) 将保护层沉积在孔表面上，其中所述保护层(i) 为下面导体提供电连接性，(ii) 保护下面导体免于反应性溶液的攻击，(iii) 提供电子源和/或阱(sink)，从而使得电极材料不在氧化还原反应中消耗，或(iv)其任何组合；和(b) 将电极材料沉积邻近于所述保护层。

在另一个方面，用于制备生物芯片的方法包括： (a) 提供邻近于衬底的二氧化硅层，其中所述二氧化硅层具有在其中以至少500个孔/mm²的密度形成的多个孔；(b) 将保护层沉积邻近于所述多个中的单个孔的暴露表面；和(c) 将电极沉积邻近于所述保护层。

在另一个方面，用于形成生物芯片的方法包括形成邻近于硅烷化的半导体表面的膜，其中所述膜以至少10千兆欧姆的电阻(resistivity)将第一流体与第二流体流体分离。

在另一个方面，用于制备生物芯片的方法包括： (a) 提供具有包含二氧化硅和/或金属的表面的包装的生物芯片或生物芯片前体；和(b) 用有机官能烷氧基硅烷分子硅烷化表面。

在另一个方面，用于制备生物芯片的方法包括： (a) 将凝胶沉积入接近于电极的孔，其中将所述电极耦合至感测电路，所述感测电路用于感测邻近于所述电极的溶液中的种类；和(b) 在孔上形成膜，其中所述膜至少部分地由所述凝胶支持。

在另一个方面，生物芯片包含邻近于衬底设置的氧化硅层，其中所述氧化硅层包含其中形成的孔，其中所述孔包含抗腐蚀材料的第一层和邻近于所述第一层的电极，其中将所述电极暴露于流体空间。

在另一个方面，生物芯片包含多个孔和设置在所述多个孔的单个孔内或邻近于所述多个孔的单个孔的膜，其中所述膜包含纳米孔，且其中所述单个孔包含电极，所述电极检测通过响应于经过或邻近于所述纳米孔的种类的所述孔的离子流上的信号，而不会耗尽。

在另一个方面，生物芯片用于测序核酸样品。

生物芯片可以通过本文所述的任何方法制备。

在另一个方面，生物芯片包含与多个具有设置在孔上的膜(所述膜包含纳米孔)的孔接触的电解质和孔中的电极，其中所述电解质不包含钾离子。

在另一个方面，生物芯片包含与多个具有设置在孔上的膜(所述膜包含纳米孔)的孔接触的电解质和孔中的电极， 其中所述电解质包括氯化四甲铵、氯化三乙铵、氯化铵、氯化物、氯化钠或其任何组合。

从下列详述来看，本公开的其他方面与优点对于本领域技术人员将是显而易见的， 其中仅显示与描述本公开的例示说明性实施方案。如将意识到的，本公开能够包括其他和不同的具体实施方案，并且在均不偏离本公开的情况下，其几个细节能够在许多其他方面进行修改。因此，附图与描述被认为是说明性的而非限制的。

通过引用并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文至相同程度，如同每一单独的出版物、专利或专利申请明确地且单独地表示为通过引用并入。

附图说明

在随附的权利要求中具体描述了本发明的新型特征。通过参考记载说明性实施方案和附图的以下详述将获得本发明的特征和优点的更好理解，所述说明性实施方案中利用本发明的原理，附图为：

图1A、1B和1C显示纳米孔检测器的实例。在图1A中，纳米孔被设置在电极上；在图1B中，纳米孔被插入孔上的膜中；且在图1C中；纳米孔被设置在突起电极上；

图2显示超紧凑测量电路的一个实例；

图3显示超紧凑测量电路的一个实例；

图4显示测试芯片单元阵列配置的一个实例；

图5显示锚定至膜的核酸分子的实例；

图6显示与包含一个传感器的表面接触的包含离子相和疏水相的流体的一个实例；

图7显示与包含多个传感器的表面接触的包含离子相和疏水相的流体的一个实例；

图8显示通过以空间和/或时间模式为多个电极通电而使疏水相稀释(thinning)的一个实例；

图9显示电极阵列的顶视图的一个实例，其中以空间和/或时间模式为电极组通电以便将流体移动至表面的边缘；

图10显示电极阵列的顶视图的一个实例，其中如本文所述移动流体。　

图11显示本文所述的用来从表面边缘抽取流体并将它引导至表面上的位置的方法的一个实例；

图12说明使用纳米孔核酸测序的一个实例方法；

图13显示使用环状核酸分子模板核酸测序的一个实例方法；

图14显示使用环状核酸分子模板核酸测序的另一个实例方法；

图15说明用于解开(unzipping)双链核酸分子的一个实例方法；

图16说明用于使用纳米孔和锁定蛋白测序核酸分子的方法的一个实例步骤；

图17说明用于使用纳米孔和锁定蛋白测序核酸分子的方法的一种方法；

图18显示phi29聚合酶的带状图；

图19显示phi29聚合酶的空间填充图；

图20显示用于使用纳米孔测序核酸分子的一种实例方法，其中通过纳米孔的通过速率至少部分地通过结合伴侣之间的相互作用来测定；

图21显示经配置以控制测序仪的计算机系统；

图22显示基于孔的电传感器；

图23显示电极阵列，其中所述容器兼作对电极；

图24显示具有共同对电极的电极阵列；

图25显示电极阵列，其中传感器条共有共同的对电极；

图26显示电极阵列，其中每个电极具有一个独立的对电极；

图27显示数行共有共同的电解质池的传感器孔的一个实例；

图28显示半导体衬底的一个实例；

图29显示沉积在半导体衬底上的二氧化硅层；

图30显示沉积在二氧化硅层上的光致抗蚀剂；

图31显示被暴露于辐射以定义孔的区域的光致抗蚀剂的区域；

图32显示通过干蚀刻程序去除的二氧化硅的部分；

图33显示通过湿蚀刻程序去除额外的二氧化硅以生成孔；

图34显示钛粘附层的沉积；

图35显示铂保护层的沉积；

图36显示银电极材料的沉积；

图37显示光致抗蚀剂和设置在其上的材料的抬离(lift off)；

图38显示二氧化硅的硅烷化；

图39显示任选的用凝胶填充孔；

图40显示在孔上生成具有纳米孔的膜；和

图41显示其中银电极靠近(comes up)孔的侧壁上的生物芯片。

详述

尽管本文已经显示和描述了本发明的各个实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅仅通过实例的方式提供。许多变化、改变和替换对于本领域技术人员在不偏离本发明的情况下是可以想到的。应当理解的是，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。

如本文所使用，术语“纳米孔(nanopore)”通常是指在膜中形成或另外提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双层，或合成膜，诸如由聚合材料形成的膜。膜可以是聚合材料。可以将纳米孔设置在相邻或邻近于感测电路或耦合到感测电路的电极，诸如，例如，互补金属氧化物半导体(CMOS)或场效应晶体管(FET)电路。在一些实例中，纳米孔具有0.1纳米(nm)至约1000 nm的数量级的特征性宽度或直径。一些纳米孔是蛋白。α溶血素是蛋白纳米孔的一个实例。

如本文所使用，术语“聚合酶”通常是指能够催化聚合反应的任何酶。聚合酶的实例包括，但不限于，核酸聚合酶或连接酶。聚合酶可以是聚合作用酶。

如本文所使用，术语“核酸”通常是指包含一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可以包括选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体的一个或多个亚单位。核苷酸可以包括A、C、G、T 或U或其变体。核苷酸可以包括可以掺入正在生长的核酸链的任何亚单位。此类亚单位可以是A、C、G、T、或U，或对于一个或多个互补A、C、G、T 或U特异性的，或与嘌呤(即，A或G，或其变体)或嘧啶(即，C、T或U，或其变体)互补的任何其他亚单位。亚单位可以使得个体核酸碱基或碱基组(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA或其尿嘧啶对应物)得到分辨。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，或其衍生物。核酸可以是单链的或双链的。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”是包含如本文所定义的一个或多个核苷酸的聚合物或寡聚物。多核苷酸或寡核苷酸可以包含DNA多核苷酸或寡核苷酸，RNA多核苷酸或寡核苷酸，或DNA多核苷酸或寡核苷酸和/或RNA多核苷酸或寡核苷酸的一个或多个部分。

如本文所使用，“核苷酸”或“碱基”可以是主要核苷酸或核苷酸类似物。主要核苷酸是脱氧腺苷单磷酸 (dAMP)、脱氧胞苷单磷酸 (dCMP)、脱氧鸟苷单磷酸 (dGMP)、脱氧胸苷单磷酸 (dTMP)、腺苷单磷酸 (AMP)、胞苷单磷酸 (CMP)、鸟苷单磷酸 (GMP)或尿苷单磷酸 (UMP)。核苷酸类似物是主要核苷酸的类似物或模拟物，其在主要核碱基(A、C、G、T 和U)、脱氧核糖/核糖结构、主要核苷酸的磷酸基团、或其任何组合上具有修饰。例如，核苷酸类似物可以具有修饰的碱基，无论是天然存在的或人造的。修饰的碱基的实例包括，但不限于，甲基化的核碱基，修饰的嘌呤碱基(例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、isodG)，修饰的嘧啶碱基(例如，5,6-二氢尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶、isodC)，通用碱基(例如，3-硝基吡咯和5-硝基吲哚)，非结合碱基模拟物(例如，4-甲基苯并咪唑和2,4-二氟甲苯或苯)，和无碱基(脱碱基核苷酸(abasic nucleotide)，其中核苷酸类似物不具有碱基)。具有修饰的脱氧核糖(例如，二脱氧核苷诸如二脱氧鸟苷、二脱氧腺苷、二脱氧胸苷和二脱氧胞苷)和/或磷酸结构(统称为骨架结构)的核苷酸类似物的实例包括，但不限于，乙二醇核苷酸、吗啉代核苷酸和锁核苷酸(locked nucleotide)。

本公开提供了用于种类(例如，原子、分子)检测和/或测序(例如，核酸测序)的设备、系统和方法。在一些实例中，本公开的设备包括纳米孔阵列，诸如密度为至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10000个位点/1 mm²。单个位点可以包括单个纳米孔传感器，所述纳米孔传感器可以包括邻近于感测电极设置的膜中的一个或多个纳米孔(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个纳米孔)。此类密度可以通过本文提供的制造方法来实现。单个纳米孔可以邻近于电极。电极可以是独立寻址的(例如，独立于另一个电极寻址)，其可以使每个纳米孔独立地感测不同的核酸分子。这可以实现平行测序(例如，核酸测序)，其可以提供高精确度测序，诸如至少约95%、约95.5%、约96%、约96.5%、约97%、约97.5%、约98%、约98.5%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、或约99.9999%的精确度。

例如，多个拷贝核酸分子可以在多个可独立寻址的纳米孔独立测序，以生成原始核酸序列数据。多个拷贝可以，例如，经由核酸扩增(例如，聚合酶链式反应)，从单一核酸样品生成。测序后，通过本公开系统的计算机处理器执行的软件可以校正在原始序列数据中的误差(例如，通过比较原始序列数据以检测异常)和比对原始序列数据以生成核酸样品的序列。在这此类方法下，核酸样品可以以至少约95%、约95.5%、约96%、约96.5%、约97%、约97.5%、约98%、约98.5%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、或约99.9999%的精确度进行测序。此类精确度可以在核酸分子通过或者邻近于纳米孔的单次经过来实现。在一些情况下，当鉴定约6、约5、约4、约3、约2或约1种核酸碱基时，可以实现此类精确度。例如，当使用纳米孔传感器测序核酸分子的单个碱基时，实现97％的精确度。

使用本公开的设备，当测序具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、或甚至100000或更多碱基的长度的核酸样品时，核酸样品可以以至少约95%、约95.5%、约96%、约96.5%、约97%、约97.5%、约98%、约98.5%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、或约99.9999%的精确度进行测序。在此类高精确度测定核酸序列，在一些情况下在冗余序列信息的帮助下，可以实现实质上快速测定核酸分子的核酸序列，诸如在小于或等于约1天、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时或更少的时间期间。

本公开的纳米孔设备可以生成冗余序列信息。在一些实例中，冗余序列信息可以通过独立且平行地，在一些情况下实质上同时测序多个拷贝的核酸分子来生成。测序给定拷贝的核酸分子之后，可以生成原始序列信息，所述信息可以被存储在用于生成核酸分子的核酸序列的系统的存储位置。可以将来自其他拷贝的核酸分子的原始序列储存在存储位置中。误差校正算法(如可以由软件实现)可以用来比较原始序列以测定重叠区域，并且从重叠区域和序列测定重叠区域中的误差。在一个实例中，误差是与生成序列相比的实际序列。例如，如果十个拷贝核酸分子中的九个拷贝中的给定区域具有生成的序列AAAAA，但一个拷贝具有AAAAT，则AAAAT序列可以被认为是错误的并弃去，并且对于给定区域，实际序列可以以高置信度被确定为AAAAA(例如，至少约80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、或99%的置信度)。此类冗余序列信息因此可用于降低与生成的核酸序列相关的误差。在一些情况下，冗余序列信息可以降低与生成的序列相关的误差，甚至当比对算法(例如，如由比对软件实施)用于从单个较小序列生成核酸分子的较长序列。

本文描述了用于测序核酸分子的方法、设备和系统。在各个方面，本公开包括膜和包含膜中的纳米孔的用于分子感测的设备。在一些情况下，有利的是提供包含多个离散位点(即，像素)的生物芯片。在一些情况下，将位点设置在阵列中。在一些情况中，生物芯片包含任选地嵌入或邻近于如本文所述的膜的纳米孔、传感器或其任何组合。

本文提供了用于在纳米孔的帮助下测序核酸分子的系统和方法。可以将纳米孔形成或另外嵌入邻近于感测电路诸如场效应晶体管或互补金属氧化物半导体(CMOS)配置的膜中。在一些情况下，当核酸或标签流过或邻近于纳米孔时，感测电路检测与核酸或标签相关的电信号。核酸可以是较大链的亚单位。标签可以是核酸掺入事件或标签核酸和纳米孔或邻近于纳米孔的种类(诸如从核酸切割标签的酶)之间的其他相互作用的副产物。

在一些实施方案中，可以将检测到的信号收集并储存在存储器位置中，并且后来用于构建核酸的序列。可以将收集的信号处理以解释检测到的信号中的任何异常，诸如误差。

用于测序核酸样品的方法

在一个方面，用于测序核酸样品的方法包括引导核酸样品或与核酸样品结合的标签通过或邻近于纳米孔，并以至少约97％的精确度测序核酸样品的核酸碱基。在一些实施方案中，纳米孔是膜。纳米孔可以是膜蛋白，诸如，例如，α-溶血素。在一些实施方案中，膜是合成的膜。在一些实施方案中，膜是脂质双层。纳米孔可以是单个(或独立)可寻址的。

在一些情况下，核酸(例如，DNA和RNA)的核酸序列的测定包括误差。实例误差包括，但不限于缺失(无法检测到核酸)、插入(在真实不存在的地方检测到核酸)和取代(检测到不正确的核酸)。在一些实施方案中，核酸测序的精确度通过以下确定：排列测量的核酸序列与真实的核酸序列(例如，根据生物信息学技术)，并测定是缺失、插入和/或取代的核酸位置的百分比。精确度范围为0％到100％，其中100％是完全正确测定核酸的序列。错误率可以是100％减去精确度，并且范围可为0％到100％，其中0%错误率是完全正确测定核酸的序列。

在各个实施方案中，误差为缺失、插入和取代的任何组合。在一些实施方案中，误差包含很少缺失。在一些实施方案中，误差的约70%、约60%、约50%、约40%、约30%、约20%、约10%、约5%、或约1%是缺失。在一些实施方案中，误差的不超过70%、不超过60%、不超过50%、不超过40%、不超过30%、不超过20%、不超过10%、不超过5%、或不超过1%是缺失。

在一些实施方案中，根据本文所述的方法和/或使用本文所述的设备进行的核酸测序的精确度高。精确度为任何高值。在一些情况下，精确度为约95%、约95.5%、约96%、约96.5%、约97%、约97.5%、约98%、约98.5%、约99%、约99.5%、约99.9%、约99.99%、约99.999%、约99.9999%等。在一些情况下，精确度为至少95%、至少95.5%、至少96%、至少96.5%、至少97%、至少97.5%、至少98%、至少98.5%、至少99%、至少99.5%、至少99.9%、至少99.99%、至少99.999%、至少99.9999%等。在一些情况下，精确度为约95%和99.9999%之间、约97%和99.9999%之间、约99%和99.9999%之间、约99.5%和99.9999%之间、约99.9%和99.9999%之间等。

在一些情况下，高精确度通过进行多次通过(即，测序核酸分子多次，例如，使核酸通过或接近于纳米孔和测序核酸分子的核酸碱基)来实现。在一些情况下，将来自多次通过的数据组合(例如，使用来自其他重复通过的数据校正首次通过中的缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，高精确度使用很少通过(也称为读出，测序覆盖的多重性)来实现。通过数是任何数，且不必是整数(例如，2.5次)。在一些实施方案中，将核酸分子测序至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、12次、14次、16次、18次、20次、25次、30次、35次、40次、45次、50次等。在一些实施方案中，将核酸分子测序至多1次、至多2次、至多3次、至多4次、至多5次、至多6次、至多7次、至多8次、至多9次、至多10次、至多12次、至多14次、至多16次、至多18次、至多20次、至多25次、至多30次、至多35次、至多40次、至多45次、至多50次等。在一些实施方案中，将核酸分子测序约1次至10次之间，约1次至5次之间，约1次至3次之间，等。在一些实施方案中，精确度水平通过组合从至多20次通过收集的数据来实现。在一些实施方案中，精确度水平通过组合从至多10次通过收集的数据来实现。在一些实施方案中，精确度水平通过组合从至多5次通过收集的数据来实现。在一些实施方案中，精确度水平在单次通过中实现。

在一些情况下，核酸组使用本文所述的方法和/或设备来鉴定。例如，三种核酸(例如，腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)的组合通过它们对纳米孔中电压的特征性效果来测定。在一些情况下，当鉴定约6、约5、约4、约3、约2或约1种核酸碱基(即，作为组)时，核酸测序的精确度高(例如，至少97％)。在一些情况下，当鉴定多达6、多达5、多达4、多达3、多达2或多达1种核酸碱基(即，作为组)时，核酸测序的精确度高。在一些实施方案中，当鉴定单一核酸碱基时，精确度为至少约97％。

在一个实例中，用于测序核酸样品的方法包括在通过或接近于纳米孔核酸样品流上以小于约3％的错误率检测一个或多个核酸亚单位。在一些情况下，低错误率以低数量通过实现(例如，单次通过中的3％错误率)。核酸亚单位包含任何合适数量的核酸，例如约三个核酸碱基或更少。在一些情况下，核酸亚单位包含单一核苷酸。

错误率是任何合适的低比率。在一些情况下，错误率为约10%、约5%、约4%、约3%、约2%、约1%、约0.5%、约0.1%、约0.01%、约0.001%、约0.0001%等。在一些情况下，错误率为至多10%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1%、至多0.5%、至多0.1%、至多0.01%、至多0.001%、至多0.0001%等。在一些情况下，错误率为10%和0.0001%之间、3%和0.0001%之间、1%和0.0001%之间、0.01%和0.0001%之间等。

在一些情况下，核酸分子通过检测来自电极的信号来测序。电极可以是纳米孔传感器的部分。在一些情况下，信号是电信号，其在核酸分子通过或接近于纳米孔之后生成。在一些情况下，与核酸分子结合的标签分子(例如，在核酸聚合事件之后释放的标签)流入和流出或通过纳米孔。在一些情况下，信号至少部分地被电噪声遮蔽。信噪比(例如，它们的幅度的比率)是任何合适的高值(即，合适地高，以达到特定精确度)。在一些实施方案中，一个或多个核酸亚单位以约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约100:1、约1,000:1、约10,000:1等的信噪比来检测。在一些实施方案中，一个或多个核酸亚单位以至少约10:1、至少约100:1、至少约1,000:1、至少约10,000:1的信噪比来检测。

核酸亚单位可以在任何合适量的时间内进行检测。在一些实施方案中，一个或多个核酸亚单位在约1秒、约1毫秒(ms)、约1微秒(μs)等的时间段内进行检测。在一些实施方案中，一个或多个核酸亚单位在至多1秒、至多1毫秒、至多1微秒等的时间段内进行检测。在一些实施方案中，一个或多个核酸亚单位在至少1秒、至少1毫秒、至少1微秒等的时间段内进行检测。

在一些情况下，核酸分子和/或与核酸分子结合的标签分子以特征性的停留时间通过纳米孔。在一些情况下，停留时间为核酸分子的部分(例如，单一碱基或多个碱基)或结合的标签分子在纳米孔中可检测的平均时间(例如，生成信号的时间段)。在另一个方面，本发明提供了用于测序核酸的方法，所述方法包括使核酸以停留时间通过纳米孔，并当核酸样品通过纳米孔时检测核酸样品的一个或多个核酸亚单位。

停留时间可以是任何合适量的时间 (例如，用于达到特定精确度)。在一些情况下，停留时间为约100毫秒(ms)、约80 ms、约60 ms、约40 ms、约20 ms、约10 ms、约1 ms、约100 µs、约80 µs、约60 µs、约40 µs、约20 µs、约10 µs、约1 µs等。在一些情况下，停留时间为至少100 ms、至少80 ms、至少60 ms、至少40 ms、至少20 ms、至少10 ms、至少1 ms、至少100微秒(µs)、至少80 µs、至少60 µs、至少40 µs、至少20 µs、至少10 µs、至少1 µs等。在一些情况下，停留时间为至多100 ms、至多80 ms、至多60 ms、至多40 ms、至多20 ms、至多10 ms、至多1 ms、至多100 µs、至多80 µs、至多60 µs、至多40 µs、至多20 µs、至多10 µs、至多1 µs等。在一些情况下，停留时间为约10 µs和20 ms之间。

在一些实施方案中，停留时间足以允许鉴定多达约5个碱基的亚单位。在一些实施方案中，停留时间足以允许鉴定多达约3个碱基的亚单位。在一些实施方案中，停留时间足以允许鉴定多达约1个碱基的亚单位。

本公开的另一个方面提供了获得核酸的序列信息的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使核酸流过纳米孔；(b)形成具有至少一个减速带(speed bump)-核酸双链体区段的减速带-核酸复合物；(c) 使所述减速带-核酸复合物流过纳米孔，直到所述减速带-核酸双链体区段在纳米孔的收缩区域前停止；(d)获得当所述减速带-核酸双链体区段停止时的电信号，并表征邻近于第一减速带-核酸双链体区段的核苷酸序列；和(e)解离所述减速带-核酸复合物，并继续使核酸流过纳米孔。

在该方法中，减速带-核酸复合物包含减速带寡核苷酸和核酸分子之间的DNA或RNA碱基配相互作用。双链体通过任何合适的方法(包括温度、电压或其任何组合)解离。在一些情况下，电压脉冲用于从核酸分子解离减速带分子。

在一些情况下，高精确度和/或低错误率通过减慢核酸分子通过或接近于纳米孔的速率来实现。在一些情况下，核酸分子通过纳米孔。在一些情况下，由核苷酸聚合事件释放的标签分子通过纳米孔。在一些情况下，核酸分子通过或接近于纳米孔的速率足够慢，足以实现特定停留时间(例如，停留时间足够长，足以实现高信噪比和/或高核酸测序的精确度)。

在一些情况下，减速带分子与核酸分子结合，以降低或减缓核酸分子通过或接近于纳米孔的速率。在一些情况下，减速带分子包含寡核苷酸。在一些实施方案中，减速带分子具有长达2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、或50个碱基的长度。在一些实施方案中，寡核苷酸与核酸序列碱基配对。此类碱基配对可以涉及寡核苷酸之间的共价相互作用。在一些实施方案中，当核酸通过纳米孔时，减速带分子从核酸解离。

在本发明的另一个方面提供了用于测序核酸的方法，所述方法包括通过使减速带分子与核酸非共价结合而减缓核酸通过纳米孔的速率，其中当核酸通过纳米孔时将核酸测序。非共价结合可以包括，但不限于，离子相互作用和至少部分由于伦敦色散力导致的相互作用。非共价结合的减速带分子减缓核酸分子通过或接近于纳米孔。

其他细节可以发现于PCT专利公开号WO/2012/088339和PCT专利公开号WO/2012/088341，其各自以其整体通过引用并入本文。

芯片设置

图1显示了具有温度控制的纳米孔检测器(或传感器)的一个实例，其可以根据美国专利申请公开号2011/0193570(其整体通过引用并入本文)中所述的方法来制备。参考图1A，纳米孔检测器包含与导电性溶液(例如，盐溶液)107接触的顶部电极101。底部导电电极102靠近、邻近或接近于插入膜105中的纳米孔106。在一些情况下，底部导电电极102被嵌入半导体103中，在所述半导体103中嵌入半导体衬底104中的电路。可以将半导体103的表面处理成疏水性的。被检测的样品经过纳米孔106中的孔。将半导体芯片传感器置于包装108中，且这，进而，处于温度控制元件109的附近。温度控制元件109可以是热电加热和/或冷却设备(例如，Peltier设备)。在一些情况下，双层跨过并覆盖电极102。

多个纳米孔检测器可以形成纳米孔阵列。纳米孔阵列可以包括一个或多个纳米孔检测器。在一些情况下，纳米孔阵列包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、1000、10000、或100,000个纳米孔检测器。单个纳米孔检测器可以包括一个或多个邻近于感测电极(例如，底部导电电极102)的纳米孔。在一些情况下，单个纳米孔检测器包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或100个邻近于感测电极的纳米孔。

参考图1B，其中相同数字表示相同的元件，可以将膜105设置在孔110上，其中传感器102形成孔的表面的部分。图1C显示一个实例，其中电极102从经处理的半导体表面103突出。

在一些实例中，膜105在底部导电电极102上形成，而不是在半导体103上形成。在此类情况下，膜105可以与底部导电电极102形成耦合相互作用。然而，在一些情况下，膜105在底部导电电极102和半导体103上形成。作为替代，膜105可以在半导体103上形成，而不是在底部导电电极102上形成，但可以在底部导电电极102上延伸。

在一些情况下，传感器和/或电极可以是单独或独立寻址的。单独和/或独立可寻址的传感器可以进行控制和/或从各传感器和/或电极读出数据。

给定的纳米孔传感器可以是独立可寻址的。这可以提供平行测序和生成冗余序列信息，其可用于以高精确度(例如，大于或等于约97％)生成核酸序列信息。作为替代，纳米孔传感器组可以是独立可寻址的。纳米孔传感器组可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、或500个单个纳米孔传感器。在此类情况下，给定的纳米孔传感器组可以与另一纳米孔传感器组独立地进行控制。

高像素密度 (pixel densities)

在一些情况下，有利的是提供包含高密度的离散位点的系统。例如，每单位面积的大量位点(即密度)允许构建更小设备，其是便携式的，低成本的，或具有其他有利的特征。在一些实施方案中，提供高密度的离散位点允许更多个位点，在其上进行反应，进行测量，等等。在一个实例中，大量包含纳米孔和感测电路的位点允许一次测序大量的核酸分子。此类系统可以增加通量和/或降低测序核酸样品的成本。

在一个方面，系统包含具有包含离散位点的表面的衬底，所述离散位点的单个位点具有纳米孔和邻近于纳米孔的感测电路。合适的纳米孔和感测电路的实例在本文中描述。在一些实施方案中，所述系统进一步包含与所述衬底流体连通的流通单元(flow cell)，所述流通单元适配成将一种或多种试剂递送至衬底。

所述表面包含任何合适密度的离散位点(例如，适合于在给定量时间或对于给定成本测序核酸样品的密度)。在一个实施方案中，所述表面具有大于或等于约500个位点/1 mm²的离散位点的密度。在一些实施方案中，所述表面具有约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、或约500000个位点/1 mm²的离散位点的密度。在一些实施方案中，所述表面具有至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少2000、至少3000、至少4000、至少5000、至少6000、至少7000、至少8000、至少9000、至少10000、至少20000、至少40000、至少60000、至少80000、至少100000、或至少500000个位点/1 mm²的离散位点的密度。此类像素密度可以使用如下面和本文其他地方所述的本公开的制造方法来实现。在一个实例中，至少约500个位点/1 mm²的像素密度通过以至少约500个位点/1 mm²的密度形成孔并在各孔中形成纳米孔传感器(例如，其中具有纳米孔的膜)来实现。较高密度(例如，至少600、700、800、900、1000、10000个位点/1 mm²)可以通过选择处理条件以形成以较高密度的孔来实现。

在一些实施方案中，纳米孔是蛋白。纳米孔的一个实例是α-溶血素。在一些实施方案中，纳米孔具有约100 Å或更小的直径。在一些实施方案中，纳米孔具有约50 Å或更小的直径。因此，在一些情况下，实现大量离散位点/单位面积的能力通过感测电路的尺寸来确定。

在一些实施方案中，感测电路包含较少晶体管。传感器电路可以包含任何合适数量的晶体管(例如，少至检测信号所需)。在一些实施方案中，感测电路包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个晶体管。在一些实施方案中，感测电路包含至多1、至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、或至多20个晶体管。一个用于提供包含具有包含高密度离散位点(其中所述位点包含感测电路)的表面的衬底的系统的合适的实施方案如下。

紧凑型感测电路

单元电路的一个实例显示于图2中。将施加电压Va施加至在金属-氧化物-半导体场效应晶体管(MOSFET)电流传输器门201之前的运算放大器1200。此处还显示电极202和设备203检测的核酸和/或标签的电阻。

施加电压Va可以驱动电流传输器门201。所得电极上的电压然后是Va-Vt，其中Vt是MOSFET的阈值电压。在一些情况下，当MOSFET阈值电压可以随着芯片内过程、电压、温度、和甚至设备之间变化相当大时，这导致施加至电极的实际电压的有限控制。这种Vt变化在亚阈值泄漏效应可以发挥作用的低电流水平可以更大。因此，为了提供施加电压的更好控制，运算放大器可以用于具有电流传输器设备的跟随反馈配置中。这确保了施加至电极的电压是Va，这独立于MOSFET阈值电压的变化。

单元电路的另一个实例显示于图3中，并且包括积分器、比较器和数字逻辑，以便在控制位中移位，并同时移出比较器输出的状态。单元电路可以适配用于与本文提供的系统和方法使用。B0至B1线路可以由移位寄存器产生。模拟信号由组(bank)内的所有单元共享，而数字线路可以从单元到单元成菊状链(daisy-chained)。

单元数字逻辑包含5位数据移位寄存器(DSR)、5位平行加载寄存器(PLR)、对照逻辑和模拟积分器电路。使用LIN信号，将移入DSR的对照数据平行加载至PLR中。这5位控制数字“先断后通(break-before-make)”定时逻辑，其控制单元中的转换。此外，数字逻辑具有置位复位(SR)锁存器来记录比较器输出的转换。

该结构递送可变的样品速率，其与单个单元电流成比例。较高电流可以导致比较低电流的每秒更多样品。电流测量的分辨率与测量的电流相关。小电流可以用比大电流更细的分辨率测量，这可以是相比于固定分辨率测量系统的益处。存在模拟输入，其允许使用者通过改变积分器的电压摆幅来调整样品速率。可能增加样品速率，以分析生物学快速过程或减缓样品速率(且从而获得精密度)，以分析生物学缓慢过程。

将积分器的输出针对电压低电压偏压(LVB)初始化，并整合至电压化学机械平坦化(CMP)。样品每次在这两个水平之间生成积分器的输出摆幅。因此，电流越大，积分器输出摆幅越快，且因此样品速率越快。类似地，如果CMP电压降低，则生成新样品所需的积分器的输出摆幅降低，因此样品速率增加。因此，简单降低LVB和CMP之间的电压差异提供了增加样品速率的机制。

基于纳米孔的测序芯片可以并入配置为阵列的大量自主操作或单个可寻址单元。例如一百万个单元的阵列可以由1000行单元×1000列单元构成。当核苷酸掺入事件之后释放的标签通过例如纳米孔检测时，该阵列通过测量电导率差异实现核酸分子的平行测序。此外，这种电路实施允许测定孔-分子复合物的电导率特征，这在标签之间进行区分中是有价值的。

整合的纳米孔/双层电子单元结构可以应用适当电压以便进行电流测量。例如，(a)控制电极电压电势和(b)同时监测电极电流是必要的以便正确地进行。

此外，彼此独立地控制单元可以是必要的。可以需要单元的独立控制，以便管理可以为不同物理状态的大量单元。施加至电极的分段线性电压波形刺激的精确控制也可以用于在单元的物理状态之间进行转换。

为了减小电路大小和复杂性，提供逻辑以应用两个分开的电压可以是足够的。这允许应用单元的两个独立分组和相应的状态转换刺激。状态转换本质上是随机的，具有相对低的发生概率。因此，能够断言适当的控制电压并随后进行测量以确定期望的状态转换是否已经发生是非常有用的。例如，可以将适当电压施加至单元，然后测量电流以确定双层是否已经形成。将单元分成两组： (a) 已经具有双层形式且不再需要施加电压的那些。这些单元可施加0V偏压，以便实现空操作(NOP) - 即停留在相同状态，和(b) 未形成双层的那些。这些单元将再次施加双层形成电压。

实质上简化和电路大小降低可以通过将可允许施加电压限制到二，且在物理状态之间分批迭代转换单元来实现。例如，降低至少1.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、或100的倍数可以通过限制可允许施加电压来实现。

在一些实例中，测试芯片包括各排列在66个传感器单元的四个分开组(即组(bank))中的264个传感器的阵列。将各组依次分为三“列”，各列中具有22个传感器“单元”。考虑到理想地由双脂层和插入的纳米孔组成的虚拟单元在阵列中的各264个传感器上形成，“单元(cell)”名称是适当的(尽管该设备可以用如此组装的传感器单元的仅小部分成功地操作)。

存在单一的模拟I/O垫，其将电压电势施加至安装至管芯(die)表面的导电圆筒内含有的液体。这种“液体”电势被施加至孔的顶侧且对于检测器阵列中的所有单元是通用的。孔的底侧具有暴露的电极，且各传感器单元可以将独特的底侧电势施加至其电极。然后测量顶部液体连接和孔的底侧上各单元的电极连接之间的电流。传感器单元测量如通过孔内的标签分子调节的经过孔的电流。

在一些情况下，五个比特控制各传感器单元的模式。继续参考图4，阵列中的各264个单元可以进行单个控制。将值分别应用于一组66个单元。组中各66个单元的模式由系列移入330(66*5个比特/单元)数字值系列转换成数据移位寄存器(DSR)来控制。将这些值使用KIN (计时器(clock))和DIN （数据输入器(dat in)）引脚(pin)与各组的66个单元的分开的引脚对移位至阵列。

因此，330计时器用于将330位移位至DSR移位寄存器。当相应的LIN<i> (加载输入)设置高时，第二330位平行加载寄存器(PLR)平行加载自该移位寄存器。在平行加载PLR的同时，将单元的状态值加载至DSR。

完整操作可以由将330数据位移位至DSR 的330个计时器、具有设置高的LIN信号的单一计时器、随后读出移出DSR的捕获的状态数据的330个计时器循环组成。将操作流水线化，从而使得可以将新的330位同时移入DSR，而330位正在从阵列读出。因此，在50MHz计时器频率，读取的循环时间为331/50MHz = 6.62us。

组合的 AC 和 DC 刺激

如本文所述，电刺激可以是各种电刺激，诸如施加的电流和施加的电压。电流可以是直流电流(DC)和/或交流电流(AC)。电刺激可以构成一系列电脉冲。电刺激可以经由电极(诸如纳米孔的电极)施加。

在一些情况下，所述刺激是变化的电刺激(例如，电刺激随时间变化)。在一些情况下，所述刺激包含脉冲(例如，距基线快速且瞬时的变化)。在一些情况下，所述刺激是波形(例如，正弦波，方波，三角波，或锯齿波)。

在一些实施方案中，所述电刺激是AC脉冲和DC偏压的组合。在一些情况下，将AC脉冲施加在DC刺激的顶部。在一些情况下，DC刺激不变(即，是恒定的)。

非消耗电极

在一些实施方案中，本文所述的电极是消耗电极。消耗电极当使用它们时可以被耗尽(例如，当它们检测信号时)。氯化银(AgCl)是消耗电极的一个实例。在一些情况下，可以使用电极的时间量受电极材料的消耗性质的限制。在一些实施方案中，电极在使用期之后补充。补充可以包括反转导致电极耗尽的电化学反应的流向，例如通过反转施加至电极的电压。

在一些实施方案中，本文所述的电极不是消耗(或非消耗)电极。在一些情况下，当使用电极时(例如，当它们检测信号时)，电极没有耗尽或基本上耗尽。包含铂的电极是非消耗电极的一个实例。非消耗电极在纳米孔检测器的运行寿命过程中可不必补充，所述运行寿命可以是至少约5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、或1天。

在一些情况下，电极具有低信噪比。例如，一些非消耗电极具有低信噪比。在一些实施方案中，本文所述的电极用于检测核酸测序的信号。核酸测序的信噪比可以通过使用亚铁氰化物标签来增加(例如，当使用非消耗电极时)。亚铁氰化物([Fe(CN)₆]^4-)及其氧化产物铁氰化物([Fe(CN)₆]^3-)大部分对膜是不可透过的(例如，脂质双层)。在一些实施方案中，核苷酸用包含亚铁氰化物的分子标签化，且核酸分子得到复制(例如，通过DNA聚合酶)，由此亚铁氰化物标签从核苷酸释放且通过纳米孔，在那里它们由如本文所述的传感器(例如，非消耗电极)检测到。

离子和非离子化学

用于操作芯片的操作电压可以至少部分地由盐浓度测定。通常，对于相同的施加电压，较高盐浓度导致较高电流。在一些实施方案中，+/- 320 mV范围用于约1 M的盐浓度(例如，KCl)。如果盐浓度为约0.3M，则工作电压可以是约+/- 500 mV。本文所述的特定电压和盐浓度是说明性的而非限制性的。

电极可以是银电极。例如，KCl经过通过银电极的离子电流，其在正电极使其从银转为AgCl，在负电极将AgCl转为银。在银电极的情况下，电极本身受纳米孔系统操作的影响。

在一些情况下，系统和/或芯片不使用导电盐溶液。一些氧化还原分子可以取代盐。例如，氧化还原分子可以是二茂铁羧酸盐(ferrocene carboxylate)。在这种情况下，氧化还原分子在第一电极改变为氧化态(例如，Fe⁺³)，并在第二电极释放电子，在这里所述氧化还原分子得到还原(例如，还原为Fe⁺²)。氧化还原分子的浓度是任何合适的浓度。在一个实施方案中，二茂铁羧酸盐以约100mM和1M之间的浓度使用。在一些实施方案中，氧化还原分子的浓度为至少约10 mM、至少约20 mM、至少约40 mM、至少约60 mM、至少约80 mM、至少约100 mM、至少约200 mM、至少约500 mM、至少约1 M、或至少约10 M。

在氧化还原分子系统中，电极可以是铂感测电极和银或铂参考电极。在氧化还原设置中，电极可以不受纳米孔设置的操作和/或电流的通过的影响(例如，电极不是消耗的)。在一些实施方案中，氧化还原分子系统可以导致更长的电极寿命。

在一些情况下，使用氧化还原分子而非离子的缺点可以是比银电极系统更低的电流读数。在一些实施方案中，电流读数对于纳米孔足够高，足以检测通过孔的切割的标签(例如，来自用标签化核苷酸合成反义链)。

功能性膜

在一个方面，本文描述了“功能性膜”。功能性膜可以具有特定电阻、电容和/或电导率/摩尔电解质。在一些情况下，功能性膜包含纳米孔。在一些情况下，功能性膜不包含纳米孔(例如，无纳米孔)。在一些实施方案中，功能性膜被设置在膜-不相容表面上。在一些情况下，膜和表面之间没有共价键。膜或膜材料(例如，脂质)可以结合至表面。在一些实施方案中，膜可以拴系在表面(即，通过连接部分共价地)，然而通常应当构建拴系膜，以便防止膜和表面之间电解质的泄漏。在一些实施方案中，功能性膜被设置感测接近于集成电路，如下所述。在一些情况下，膜不相容表面和集成电路基本上是平的(包含共有平面)。在一些实施方案中，集成电路传感器是亲水性的，且脂双层在感测电路上形成，而脂质单层在膜不相容表面上形成，脂质尾部朝向膜不相容表面。

功能性膜具有任何合适的电容。在一些实施方案中，所述膜具有约0.1、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约20、或约50 fF/μm²的电容。在一些实施方案中，所述膜具有大于约0.1、大于约0.5、大于约1、大于约2、大于约3、大于约4、大于约5、大于约6、大于约7、大于约8、大于约9、大于约10、大于约20、或大于约50 fF/μm²的电容。在一些实施方案中，所述膜具有小于约0.1、小于约0.5、小于约1、小于约2、小于约3、小于约4、小于约5、小于约6、小于约7、小于约8、小于约9、小于约10、小于约20、或小于约50 fF/μm²的电容。功能性膜可以不具有纳米孔(即，功能性膜是无纳米孔的)，或者具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个纳米孔。电容可以通过至少约50 mV的施加电压下的电极来测量。

功能性膜具有任何合适的电阻。在一些实施方案中，所述膜具有约100兆欧姆(MΩ)、约200 MΩ、约300 MΩ、约400 MΩ、约500 MΩ、约1千兆欧姆(GΩ)、约5 GΩ、约10 GΩ、约50 GΩ、约100 GΩ、或约500 GΩ的电阻。在一些情况下，所述膜具有至少约100至少兆欧姆(MΩ)、至少约200 MΩ、至少约300 MΩ、至少约400 MΩ、至少约500 MΩ、至少约1千兆欧姆(GΩ)、至少约5 GΩ、至少约10 GΩ、至少约50 GΩ、至少约100 GΩ、或至少约500 GΩ的电阻。在一些情况下，所述膜具有至少约100至少兆欧姆(MΩ)、至少约200 MΩ、至少约300 MΩ、至少约400 MΩ、至少约500 MΩ、至少约1千兆欧姆(GΩ)、至少约5 GΩ、至少约10 GΩ、至少约50 GΩ、至少约100 GΩ、或至少约500 GΩ的电阻。在一些情况下，不具有纳米孔的膜具有至少10 GΩ的的电阻，具有一个纳米孔的膜具有1 GΩ至10 GΩ的电阻，且具有两个或更多个纳米孔的膜具有500MΩ至1 GΩ(包括端值)的电阻。电阻可以通过至少约50 mV的施加电压下的电极来测量。

功能性膜具有任何合适的电导率。在一些情况下，测量每摩尔电解质电导率。在一些实施方案中，所述膜具有约0.02、约0.05、约0.1、约0.25、约0.5、约1、约2、或约5纳西门子/摩尔电解质的电导率。在一些实施方案中，所述膜具有大于约0.02、大于约0.05、大于约0.1、大于约0.25、大于约0.5、大于约1、大于约2、或大于约5纳西门子/摩尔电解质的电导率。在一些实施方案中，所述膜具有小于约0.02、小于约0.05、小于约0.1、小于约0.25、小于约0.5、小于约1、小于约2、或小于约5纳西门子/摩尔电解质的电导率。电导率可以通过至少约50 mV的施加电压下的电极来测量。

在一些实施方案中，所述膜具有选自上述列表的任何电容，或选自上述列表的任何电导率。在一些实施方案中，所述膜具有选自上述列表的任何电容，和选自上述列表的任何电导率。

在一个实例中，纳米孔设备包含设置在感测接近于集成电路的膜不相容表面上的膜。所述膜，如通过集成电路所测量，可以表现出(i)大于约5 fF/μm²的电容或小于约0.25纳西门子/摩尔电解质的电导率，或(ii) 大于约5 fF/μm²/平方微米的电容和小于约0.25纳西门子/摩尔电解质的电导率。

在一些实例中，用于分子感测的设备包含设置在感测接近于集成电路的至少一个膜不相容表面上的膜中的一个或多个纳米孔。膜、膜不相容表面、任选的拴系(tether)、集成电路和纳米孔的实例在本文中描述。在一些情况下，所述设备包含感测接近于集成电路的功能性膜(例如，如本文所述)。如本文所使用，“感测接近(sensing proximity)”意指所述膜足够接近于传感器，从而使得传感器能够检测源自膜的信号。核酸测序是分子感测的一个实例。

在一些实施方案中，集成电路是单个可寻址的集成电路。即，数据可以收集自多个集成电路中的各集成电路和/或信号可以发送至多个集成电路中的各集成电路。上述超紧凑集成电路是可接受的集成电路的一个实例。在一些实施方案中，集成电路包含逻辑控制器。逻辑控制器的实例描述于美国专利公开号2011/0192723，其整体通过引用并入本文，并且例如可以包括适合于核酸测序的任何控制器。

在一些实例中，用于在分子感测中使用的纳米孔设备包含设置在感测接近于集成电路的至少一个膜不相容表面上的膜中的一个或多个纳米孔，具有一个或多个纳米孔的膜表现出(i)大于约5 fF/μm²/平方微米的电容或小于约10纳西门子/摩尔电解质/孔的电导率，如通过感测集成电路测量，或(ii) 大于约5 fF/μm²的电容和小于约10纳西门子/摩尔电解质/孔的电导率，如通过感测集成电路测量。单个纳米孔可以是独立可寻址的。

交联的和其他膜

本公开的设备可以包含膜。膜可以是有机或无机膜。在一些实例中，膜是脂质双层。在一些实施方案中，所述膜是适合于插入蛋白(例如，α溶血素)的任何膜。设备的设置或使用过程中，膜可以与离子溶液接触(例如，用于如本文所述插入蛋白)。在一些情况下，膜是柔性的(即，不易碎和/或可以变形而不破坏)。在一些情况下，膜包含多个分子和/或模块，所述分子和/或模块可以扩大、变形、相对于彼此重新排列，等(例如，以容纳将蛋白插入膜)。在一些情况下，膜低于其玻璃转变温度。

在一些情况下，膜是疏水性的。膜可以包含疏水性部分(例如，磷脂的尾部面向脂质双层的内侧)和亲水性部分(例如，磷脂头部面向脂质双层的外侧)。

在一些情况下，膜是薄的(例如，两个脂质分子的宽度)。膜具有任何合适的厚度(例如，适合于插入蛋白和/或进行核酸测序的厚度)。在一些实施方案中，膜的厚度为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约50、约100、约200、约300、约400、约500、或约1000纳米(nm)。在一些实施方案中，膜的厚度为至多2、至多3、至多4、至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多15、至多20、至多25、至多30、至多50、至多100、至多200、至多300、至多400、至多500、或至多1000 nm。在一些情况下，膜具有约1 nm和50 nm之间，或2.5 nm和约10 nm之间的厚度。

在一些实施方案中，膜包含聚合物。在一些情况下，聚合物是次要组分(例如，以任何合适的比例(包括至多1％、至多5％、至多10％)掺入脂质双层)。在一些实施方案中，膜的大部分(例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少99％)以质量计包含聚合物。在一些情况下，膜包含聚合物和膜蛋白。

聚合物可以是天然来源的、人造的、或其组合。人造聚合物的实例包括氯丁橡胶、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、聚硅氧烷等等。在一些情况下，聚合物是嵌段共聚物。在一些情况下，聚合物是支化的。

在一些情况下，膜是脂质双层。在一些情况下，膜不是脂质双层。在一些实施方案中，膜包含脂质。在一些情况下，膜包含脂质类似物、化学修饰的脂质、或衍生化的脂质。

在一些情况下，膜包含长碳链。碳链的长度是任何合适数量的碳，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、或50个碳。在一些情况下，碳链包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、或至少50个碳。在一些情况下，碳链是支化的。在一些情况下，碳链不是支化的。

在一些实施方案中，膜包含交联的脂质。脂质可以是可聚合的。在交联脂质的实例中，磷脂酰胆碱脂质对经设计在形成脂质双层时在它们的2位酰基链的末端交联。在一些情况下，交联的脂质跨过脂质双层，类似于针对高温稳定古细菌膜的天然存在的Bola型两亲分子。交联反应的三个实例包括硫醇(thiol)和溴基团、硫醇和丙烯酰基和环戊二烯和丙烯酰基之间的酰基链交联。交联脂质的实例描述于Halter, 等人 Langmiur, March 16, 2004 20(6), 第2416-2423页，其在此以其整体通过引用并入。

锚定核酸

在一些实施方案中，本文所述方法包括将核酸分子捕获在纳米孔中，而无需使用发夹结构。在一些实施方案中，将核酸分子锚定至膜，以便将核酸分子捕获在纳米孔中(例如，以防止核酸完全通过纳米孔)。

本公开提供了用于核酸测序的方法，包括： (a) 将核酸分子锚定至其中具有纳米孔的膜；(b) 使核酸分子或其部分穿过或接近于纳米孔；(c) 在步骤(b)过程中感测核酸分子的一个或多个单个碱基；和(d)任选地反转穿过的方向，其中将核酸分子锚定至膜防止核酸分子完全穿过纳米孔。

参考图5，将核酸分子501、502和503锚定至膜504。在一些实施方案中，膜包含在一个或多个纳米孔505。α溶血素是纳米孔的一个实例。在一些情况下，膜是脂质双层。

在一些实施方案中，膜进一步包括核酸结合蛋白506，且将核酸分子501锚定至核酸结合蛋白。在一些实施方案中，核酸结合蛋白包含与膜(例如，脂质双层)相互作用(例如，嵌入其中)的跨膜。在一些情况下，跨膜结构域包含疏水性氨基酸。核酸结合蛋白是本领域已知的，并且包括对于单链或双链核酸分子具有特异性(即，仅结合一些核酸序列)或通用(即，结合许多或所有核酸序列)亲和力的蛋白。实例包括转录因子、聚合酶、核酸酶、亮氨酸拉链、等等。在一些情况下，核酸结合蛋白是包含跨膜结构域的融合蛋白。

在一些实施方案中，将核酸分子502直接锚定至膜(如，无核酸结合蛋白)。可以将膜修饰或衍生化，以形成与核酸分子的共价或非共价键。在一些情况下，将核酸分子502修饰或衍生化，以形成与膜的共价或非共价键。可以将核酸分子503锚定至纳米孔。核酸分子和纳米孔之间的连接可以是共价或非共价的。在一些情况下，纳米孔是纳米孔蛋白(例如，α-溶血素)和核酸结合蛋白之间的融合体。

用于操纵表面上的脂质的方法

本公开提供了用于操纵表面上的膜亚单位诸如脂质的方法。此类操纵可以有助于形成膜作为纳米孔检测器的部分。

参考图6，疏水相601(例如，癸烷中的二植烷酰磷脂酰胆碱(DPhPC)，15 mg/mL)沉积到表面602上(例如，平面疏水性表面)。在一些情况下，当添加亲水相时603，所有或大部分疏水相在表面上形成池。亲水相可以包含电解质(例如，盐诸如KCl)和/或氧化还原活性分子(例如，二茂铁羧酸盐，其中所述分子能够在Fe⁺²和Fe⁺³氧化还原状态之间循环)。在一些情况下，表面604上的电极被密封在这些疏水相池下，并且不与亲水相直接接触。密封电极通常不与和亲水相接触的参考电极605完成电路。在一些情况下，电极保持密封，并且甚至当将电势施加到电极时也不导电。在一些情况下，将电压施加至电极使电极上的疏水相稀释，且将疏水相推向电极606侧。在一些情况下，亲水相替代电极附近的部分疏水相，从而相对于电极附近的离子相稀释疏水相。

图7描述包含离子相和疏水相的流体的体积，其中疏水相在多个电极上的区域内稀释。如图8中所示，在一些实施方案中，以空间和/或时间(例如，时间系列)模式为多个电极通电以便将疏水相移动跨过表面。

在另一个方面，本文提供了用于在表面上操纵流体的方法，所述方法包括： (a) 提供表面，接近于所述表面的电极阵列，和包含离子相和疏水相的流体，其中所述疏水性邻近于所述表面；和(b) 以空间和/或时间模式为电极通电，从而减小所述疏水相相对于接近于所述电极的所述离子相的体积。在一些实施方案中，(b)中为电极通电影响与表面接触的疏水相的稀释。

例如，如图8中所示，依次为一系列电极通电，从而使得疏水相波移动跨过表面。在图8A中第一带正电的电极上方生成疏水相A的稀释抑制。在一些实施方案中，然后将第一电极上的电荷设定至中性，且第二电极是带正电的(图8B)。在一些情况下，这以远离所述第一电极的方向推动疏水相的前导波(图8中向右)，且以朝向所述第一电极的方向稀释疏水相(图8中向左)。图8C和8D显示了可以将所述波进一步移动跨过随后的电极，进一步推动前导波，并以尾随方向进一步稀释疏水相。

在一些实施方案中，电极紧密间隔的。电极之间的空间是任何合适的距离(例如，适合于形成波的距离)。在一些情况下，电极之间的距离小于所述电极的宽度。在一些情况下，电极之间的距离约与所述电极的宽度相同。在一些情况下，电极之间的距离是电极的宽度的约两倍、约三倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍、或约10倍。

在一些情况下，电极是单个可控的和/或单个可寻址的。如本文所使用，例如，能够确定可控电极的状态，且能够从可寻址电极获得测量信号。对于单个可控电极的阵列中的每个电极，能够设定电压和/或在电压状态(即，中性或带电)之间选择。在一些情况下，包含电极阵列的电极组是与其他电极组分开可控的。在一些实施方案中，电极进一步能够感测(例如，感测与核酸分子通过纳米孔相关的电流变化)。

在一些实施方案中，可以使疏水相跨过表面重新分布。参考图9，在一个实例中，使电极901的第一组初始带正电。 随后，使邻近于第一组电极的第二组中的电极带正电，随后使第三组带正电，以此类推902，直到将疏水相的体积移动至表面的边缘903。可以以任何方向移动脂质相(例如，图10)。

在一些实施方案中，所述方法牵引疏水相远离表面的边缘。例如，如图11中所示，所述方法能够从表面的边缘1101拉回疏水相，并将其引导至表面上的适当位置1102。在一些情况下，核酸分子在表面上测序。在一些情况下，表面包含适合用于核酸测序的纳米孔。在一些情况下，所述方法进一步包括在表面上的纳米孔的帮助下测序核酸分子。在一些情况下，所述方法引导表面上的疏水相，从而使得核酸分子能够在表面上的位置进行测序(例如，通过重整脂质双层)。

在一些实施方案中，疏水相包含脂质。在一些实例中，脂质是DPhPC。在一些情况下，将脂质溶解于有机溶剂(例如，癸烷)中。溶剂中脂质的浓度可以是任何合适的值，包括约1 mg/mL、约5 mg/mL、约10 mg/mL、约15 mg/mL、约20 mg/mL、约25 mg/mL、约50 mg/mL、约100 mg/mL等。在一些实施方案中，疏水相包含经稀释以形成表面上的双层的脂质。

在一些实施方案中，方法沿表面重新分布脂质。在各种情况下，表面是疏水的，基本上(或实质上)平的(例如，完全平的平面，或与理想化平面具有一定量变化的表面)，或疏水且基本上平的。

刺激辅助的流过纳米孔

本公开提供了用于使用纳米孔测序核酸样品的刺激辅助方法。在一些实例中，核酸样品可以在没有分子马达(例如，酶)的帮助或使用下进行测序。在一些实施方案中，核酸样品流过纳米孔由一系列电脉冲促进。

分子马达是生物分子机器，其是活生物体中运动的试剂。在通常术语中，马达可以被定义为消耗一种形式的能量，并将其转化为运动或机械功的设备；例如，许多基于蛋白的分子马达利用由ATP的水解释放的化学自由能，以进行机械功。在一些实施方案中，所述方法不使用核酸马达。核酸马达的实例包括RNA聚合酶、DNA聚合酶、解旋酶、拓扑异构酶、重塑染色质的蛋白、凝聚染色体的蛋白、病毒核酸包装马达，等。

在一个方面，本文描述了用于测序核酸样品的方法，包括： (1) 在不使用分子马达的情况下促进通过嵌入在膜中的纳米孔的核酸样品流；和(b)在通过纳米孔的所述核酸样品流上检测核酸样品的一个或多个核酸亚单位。

核酸样品以任何合适的精确度进行测序。在一些实施方案中，核酸以至少90％的精确度进行测序。在一些实施方案中，核酸以至少95％的精确度进行测序。在一些实施方案中，核酸以至少99％的精确度进行测序。

在一些实施方案中，核酸样品流过纳米孔由一系列电脉冲促进。在一些实施方案中，电脉冲系列具有约10 mV和1000 mV、或100 mV和500 mV、或200 mV和400 mV之间的电压。在一些实施方案中，电脉冲系列包含非对称的反向“V”时间概况进展(asymmetric reverse “V” time profile progression)。下文描述了合适的电脉冲。

用于操作芯片的操作电压(例如，电脉冲)可以至少部分地由盐浓度测定。通常，对于相同的施加电压，较高盐浓度导致较高电流。在一些实施方案中，+/- 320 mV范围用于约1 M的盐浓度(例如，KCl)。如果盐浓度为约0.3M，则工作电压可以是约+/- 500 mV。本文所述的特定电压和盐浓度是说明性的而非限制性的。

用纳米孔的无酶测序

本文描述了用于在没有酶的帮助下使用纳米孔测序核酸样品的方法。此类方法可用于在不使用边合成边测序(SBS)方法的情况下测序核酸。在一些实施方案中，用于测序核酸分子的方法不使用核酸聚合酶(例如，RNA聚合酶和/或DNA聚合酶)。

本文描述了用于测序核酸样品的方法，其包括在核酸样品或其部分在没有酶的帮助下流过纳米孔之后在邻近于纳米孔的感测电路的帮助下感测核酸样品的单个核酸碱基。

核酸样品以任何合适的精确度进行测序。在一些实施方案中，当鉴定多达5、4、3、2、或1种核酸碱基时，核酸以至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、或99.9%的精确度进行测序。

描述了方法、设备和系统的实例，所述方法、设备和系统适合于(a)提供如此处所述的功能性膜，(b)提供如此处所述的用于分子感测中使用的设备，(c)进行如此处所述的用于通过刺激辅助的通过纳米孔的流而测序核酸分子的方法，和/或(d) 进行如此处所述的用于无酶测序的方法。

核酸结合蛋白的用途

在一些情况下，核酸结合蛋白是自由漂浮的，而不是锚定于膜，如图5中所示。核酸分子可以缠绕核酸结合蛋白周围。在一些情况下，当将核酸分子拉过纳米孔时，核酸分子从核酸结合蛋白解开。核酸和核酸结合蛋白之间的相互作用可以减缓核酸通过纳米孔的速率且增加核酸测序的精确度。在一些实施方案中，电刺激(例如，在一些情况下高频脉冲)用于以逐步的方式(即，以适合于测序核酸分子的速率)从结合蛋白解开核酸。

滚环纳米 孔测序

本文描述了用于核酸测序的方法，其中使单链核酸通过纳米孔，而使核酸序列的重复单元延伸至核酸链上(例如，通过使用环状核酸作为模板)。在一些情况下，所述方法是高度准确的(例如，至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、或99%的精确度)。在滚环测序中，核酸分子可以进行测序和重新测序多次以产生冗余核酸序列信息。在一些实施方案中，将核酸分子进行测序，直到整个重复单元得到精确测定(例如，通过测序重复单元多次)。在一些情况下，延伸率至少部分确定测序核酸的速率。

在本发明的另一个方面提供了用于测序核酸的方法，所述方法包括(a) 使单链核酸分子从所述单链核酸分子的第一末端通过纳米孔，和(b) 使用环状核酸分子作为模板从所述单链核酸分子的第二末端延伸所述单链核酸分子。

在一些实施方案中，单链核酸分子在纳米孔中进行测序。在一些实施方案中，将核苷酸掺入事件的副产物(例如，在通过聚合酶将核苷酸掺入正在生长的链之后从标签化的核苷酸释放标签)感测(例如，通过纳米孔)来测定序列。

继续参考图12，在一些实施方案中，将核酸分子1200使用酶1201和作为模板的环状核酸分子1202进行延伸。在一些实施方案中，酶(例如，核酸聚合酶)的速度至少部分确定单链核酸分子穿过纳米孔的速度。

所述方法以多种方式中的任一种进行，其实例在此处描述。在一些实施方案中，第一单链核酸分子是环化的1202。一些情况下，核酸通过连接环化。在一些情况下，当其环化时，引物退火序列被插入第一单链核酸分子中。在一些情况下，引物退火序列与待测序的所有分子相同或几乎相同。在一些情况下，引物退火序列是不同的，并且任选地用于鉴定特定核酸分子源自哪个样品。在一些情况下，环状核酸分子由双链样品DNA或RNA构建。在一个实施方案中，将双链样品的有义和反义链的末端连接一起(例如，用接头)，从而使得所得环状核酸包含有义和反义链，任选地包含接头和/或引物结合位点。在一些实施方案中，将发夹连接至单链核酸分子的末端(例如，3'末端)，且合成与单链模板互补的反义链。合成反义链之后，环化通过连接(例如，平端连接)核酸(例如，DNA)的环来完成。在一些实施方案中，有义链包含核酸类似物。

在一些情况下，包含有义和反义链两者的环状单链模板分子1202是有利的，因为(a)在基因组位置测序有义和反义链两者增加了碱基读出(base calling)的精确度，(b)允许鉴定错配碱基，和(c)允许读取的位置双重检查。

在一些情况下，环化之后，将引物退火至环化分子。在一些实施方案中，引物包含纳米孔捕获区1203和杂交区1204，其中杂交区退火至环化分子。从引物延伸的捕获区可以由任何分子(包括无碱基核酸、PEG分子，或任何其他经优化被捕获至纳米孔中的各种人造聚合物)构建。例如，根据待处理的特定纳米孔设置或样品类型，捕获区可以是高度带负电或带正电的。捕获区的电荷状态也可影响通过电势施加的电泳拉力。在一些实施方案中，该电荷的优化可以改善阻断剂分子 (例如，阻断聚合酶的前进) 的去除。可以选择引物的捕获区的组成，以给出可以指定样品源自的样品合并物的独特信号。多个样品，每个都具有它们自己的标识符或者捕获区条形码，可以包括在相同的纳米孔测序运行中。在一些实施方案中，减速带的使用用于解码捕获线流(capture thread)。

在一些情况下，引物包含寡核苷酸的合并物，所有寡核苷酸都具有共同的纳米孔捕获区。在一些情况下，将纳米孔捕获区连接至寡核苷酸。在一些实施方案中，纳米孔捕获区的序列表明第一核酸分子源自的样品。

在一些情况下，引物退火之后，引物使用第一核酸分子作为模板是从杂交区的末端进行延伸，以生成第二核酸分子1205(例如，与第一核酸分子碱基配对)。在一些情况下，延伸通过酶(例如，DNA聚合酶，phi29聚合酶)进行。在一些实施方案中，延伸进行，直到酶被引物1206阻断。在这点上，在一些情况下，形成包含酶、纳米孔捕获区和环状双链核酸分子的停滞复合物(stalled complex)1207。

在一些实施方案中，停滞复合物1207的形成具有某些优点。在一些实施方案中，与不形成停滞复合物的情况相比，包含停滞复合物的核酸不太可能形成3D结构或结合本身或其他核酸分子。在一些实施方案中，停滞复合物的形成使得更可能所有或实质上所有核酸分子将被测序。在一些实施方案中，停滞复合物的形成改善了纳米孔捕获纳米孔捕获区的效率。

在一些情况下，形成停滞复合物之后，停滞复合物1208被插入纳米孔1209。在一些实施方案中，第二核酸分子的纳米孔捕获区被插入纳米孔中。插入可以以任何合适的方式来进行。在一些情况下，电场用于将第二核酸分子的纳米孔捕获区插入纳米孔中。

在一些情况下，插入停滞复合物之后，使第二核酸分子通过纳米孔1210。在一些实施方案中，第二核酸分子通过纳米孔，同时进一步使用第一核酸分子作为模板延伸第二核酸分子。在一些实施方案中，当第二核酸分子通过纳米孔时，其进行测序。

在一些实施方案中，第一核酸分子的核酸序列通过使第二核酸分子通过纳米孔来测定，直到重复单元的序列得到精确测定。精确度是任何合适的水平，包括本文所述的任何精确度水平，例如99.99％。在一些实施方案中，第二核酸分子包含与第一核酸分子的序列互补的重复单元。任何合适数量拷贝的重复单元进行测序。在一些实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、约12、约14、约16、约18、约20、约25、约30、约40、或约50个拷贝的重复单元进行测序。

在一些情况下，引物发挥几种作用。参考图12，在一些实施方案中，引物(i) 引发合成1204；(ii) 阻断核酸聚合酶1206的前进；和(iii)被插入纳米孔1209。在一些实施方案中，引物发挥几种作用简化了化学，且使得方法更稳健和/或廉价。

在一些实施方案中，引物的组成与引物结合位点匹配，从而使得引物将仅优先结合引物结合位点。在一些实施方案中，合成的核酸类似物被用作引物/引物结合位点序列的部分(例如，isodG和isodC)。

在一些实施方案中，聚合酶由其获取核苷酸的核苷酸混合物含有任何天然的或任何合成的核酸类似物。在一些实施方案中，选择这些类似物以给出纳米孔中较大或特定水平的信号。在一些实施方案中，这些类似物减缓核酸链转运通过纳米孔(例如，以使碱基读取更容易)。在一些实施方案中，所述类似物允许更容易、更一致地穿入孔。

滚环纳米孔测序的另一个实施方案显示于图13。此处，核酸聚合酶1301(例如，DNA聚合酶)结合至纳米孔1302。在一些情况下，所述结合是二硫键或包含纳米孔和聚合酶的融合蛋白。所述方法还提供了环状核酸分子1304和至少部分退火至环状核酸分子1303的引物。

所述方法包括使用核酸聚合酶和环状核酸分子作为模板，从第一末端1305延伸引物。延伸的引物可以从第二末端通过纳米孔1306，同时进一步从第一末端延伸引物。当延伸的引物通过纳米孔时，其可以进行测序。在一些实施方案中，将引物延伸且通过纳米孔，直到测定环状核酸分子的序列。

在一些情况下，引物的第二末端(虚线)不退火至环状核酸分子，但这是不需要的。引物序列的至少部分可以指示环状核酸源自的样品。

可以将任何合适的延伸的引物的部分退火至环状核酸分子。图13显示了环状核酸分子大部分退火至延伸的引物的实例。图14显示了环状核酸分子大部分不退火至延伸的引物的实例。

锁定酶解开

本文描述了用于解开双链核酸的方法和用于核酸测序的方法。参考图15，在一些情况下，所述方法包括：(a) 在由双链核酸1502的区段和解离的有义链1503和反义链1504(包含双链核酸)形成的连接周围锁定蛋白1501，和(b) 在有义和反义链的至少之一上提供拉力1505。

在另一个方面，本文提供了用于核酸测序的方法，所述方法包括： 参考图16，(a) 将双链体核酸1600连接至双链核酸1601的末端， 其中所述双链体核酸包含有义链1602和反义链1603，其中所述有义链和反义链在双链体核酸1604的第一末端处碱基配对，且将所述第一末端连接至双链核酸1605，且其中所述有义链和反义链不在双链体核酸1606的第二末端处碱基配对。所述方法进一步包括，参考图17，(b)在其中有义链和反义链碱基配对且其中它们不碱基配对的连接周围锁定蛋白1701；(c) 使1702有义链或反义链穿过纳米孔1703，其中链1704在纳米孔的帮助下测序。

蛋白可以是任何合适的蛋白。在一些实施方案中，蛋白是phi29聚合酶。图18和19描绘了phi29聚合酶。在一些实施方案中，将聚合酶突变，以提供用于形成适合于锁定连接周围的聚合酶的交联的位置。在一些实施方案中，突变包含用氨基酸取代半胱氨酸，其中二硫键交联在半胱氨酸氨基酸之间形成。

在一些实施方案中，蛋白通过交联蛋白锁定。交叉在任何合适的实体之间，任选地包含氨基酸的蛋白之间形成。用于锁定蛋白的另一种合适的方法是将非天然氨基酸掺入蛋白，并从非天然氨基酸形成交联。非天然氨基酸可以具有任何合适的可交联的化学基团或接头。用于将非天然氨基酸掺入蛋白的方法是已知的，且包括使用可抑制的终止密码子。在一些情况下，交联是二硫键。在一些情况下，交联的形成通过光(例如，紫外光)引发。在一些情况下，交联的形成通过光或化学剂引发。甲醛是一种合适的化学剂。甲醛通过CH₂-键交联蛋白中的伯氨基与其他附近的氮原子。

在一些实施方案中，锁定的蛋白解开双链核酸。在一些实施方案中，锁定的蛋白至少部分决定链穿过纳米孔的速率。在一些情况下，速率合适地慢，以获得高度精确的核酸序列。在一些实施方案中，速率合适地慢，使得每个核酸位置在单次通过中以合适的精确度(例如，约90％、约95％、约97％、约99％、或约99.5％)进行测序。

用生物素化的核酸的控制的链通过

本文描述了用于至少部分降低核酸分子通过或通过接近于纳米孔的速率的方法。在一些情况下，所述方法用于使用纳米孔来增加核酸测序的精确度和/或通过将其测序几次(例如，单次)来测定核酸分子的序列。

参考图20，在另一个方面，本文提供了用于核酸测序的方法，所述方法包括使第一单链核酸分子2001通过或接近于纳米孔2002，其中第一分子与第二单链核酸分子2003(包含第一结合分子2004)碱基配对，并且其中所述第一结合分子与纳米孔或结合至纳米孔的第二结合分子2005相互作用。

在一些实施方案中，第一核酸分子在纳米孔的帮助下进行测序。在一些情况下，第一单链核酸分子通过纳米孔生成如本文所述可检测的核苷酸特异性电流阻断。

在一些实施方案中，第一核酸分子通过或接近于纳米孔的速率至少部分由第一和第二结合分子之间的相互作用确定。在一些实施方案中，所述相互作用包含第一和第二结合分子之间形成非共价键。

结合分子是能够相互作用(例如，形成非共价键)的任何两个分子。在一些实施方案中，第一结合分子是生物素，且第二结合分子是链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白。

具有条形码的系统

本文所述的设备和系统可以经配置用于从受试者(例如，单个人)感测生物样品(例如，血液、唾液、组织)。感测的实例是测序受试者的基因组信息和/或基因组。在一些实施方案中，每个受试者使用专用于受试者的单元(unit)(例如，本文所述的设备或系统)。在一些实施方案中，每个受试者的生物样品在与其他受试者不同的单元上感测。在一些实施方案中，识别元件(identification member)(例如，条形码)用于将受试者匹配至单元。

在一些实例中，用于感测来自受试者的生物样品的系统包含：(a) 壳体(housing)；(b) 壳体内的传感器，所述传感器具有邻近于其中具有纳米孔的膜的电路，其中所述电路适配成生成响应于通过或邻近于纳米孔的生物样品的电信号；和(c) 壳体上或壳体内的识别元件，所述识别元件具有与系统相关且适配成帮助将电信号或源自电信号的特征信息与受试者关联的独特标识符。

识别元件是能够被识别的任何设备或部件。在一些实施方案中，识别元件选自电可擦除可编程只读存储器、射频识别标签、闪存、条形码和序列号。在一些实施方案中，识别元件通过目视识别。在一些实施方案中，识别元件通过扫描仪、机器等准备。

在一些情况下，壳体是小的。在一些情况下，系统是便携式的。在一些实施方案中，壳体具有至多27,000 cm³的体积。在一些实施方案中，壳体具有至多10,000 cm³的体积。在一些实施方案中，壳体具有至多5,000 cm³的体积。在一些实施方案中，壳体具有至多500 cm³的体积。在一些情况下，系统是手持式和/或能够用手携带。

识别元件可以外壳中或外壳上提供。识别元件可以允许受试者匿名，这在匿名性得到关注的情况下可以是优选的。识别元件可以将系统或设备(例如，纳米孔检测器)连接至受试者。

系统能够感测生物样品的任何合适的特征。在一些实施方案中，系统能够在至多10小时内测序个体的基因组。在一些实施方案中，系统能够在至多1小时内测序个体的基因组。在一些实施方案中，系统能够在至多10分钟内测序个体的基因组。

膜蛋白测定法和其他用途

本公开的设备可以用于任何合适的目的。在一些情况下，设备不用于核酸测序。没有限制，设备可用于检测单核苷酸多态性(SNP)、基因插入、缺失或其他遗传突变或标志物、蛋白测序、其他任何聚合物的测序等。

本公开的方法可用于构建模拟生物膜的膜。在一些实施方案中，膜和/或包含膜蛋白的膜的组成实质上类似于生物体的细胞膜的组成。在一些情况下，如果膜和/或包含膜蛋白的膜包含类似的膜蛋白和/或脂质的类型、身份和/或比例，则它们是实质上类似的。在一些实施方案中，蛋白占膜的比例是生物膜中蛋白的比例的约50％内，约40％内，约30％内，约20％内，约10％内，或约5％内。

生物细胞可具有各种膜，包括包覆细胞的细胞膜和包覆细胞器(例如内质网、细胞核、高尔基体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体、液泡)的各种细胞膜。在一些情况下，膜包含脂质双层。双层中脂质的组成取决于物种、膜的类型或者甚至生物体的发育状态或生物体周围的环境条件而变化。脂质双层经常包含两层磷脂，其中两层的疏水性尾部彼此面对。任何脂质或脂质的组合适合于形成如本文所述的生物膜模拟物，包括例如磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，根据此处所述的方法生成的膜包含固醇类(例如，胆固醇)。

生物膜还通常包含膜蛋白，但是这不是必需的。在一些情况下，膜蛋白占生物膜质量的大部分(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、或至少60％)。在一个方面，本文所述的方法用于将膜蛋白插入膜。

存在许多膜蛋白的实例。膜蛋白包括转运蛋白、接头、通道、受体、酶、结构蛋白、参与能量的积累和传递的蛋白、负责细胞粘附的蛋白等。一些实例包括α-溶血素、胰岛素受体、整合素、钙粘素、血型糖蛋白、视紫红质等等。一些膜蛋白是单体(包含单一多肽链)，且一些膜蛋白包含多种(一种或多种类型的)多肽链。

本公开的另一个方面提供了用于进行膜蛋白测定的方法，所述方法包括： (a) 将电刺激施加至在电极上形成的至少一个膜，从而使得膜蛋白被吸引且插入膜中；和(b) 测定膜和/或膜蛋白的特性。

本文提供了用于在电极上形成膜的方法。用于施加适合于将膜蛋白(例如，α-溶血素)吸引并插入膜的电刺激的方法也在上面提供。在一些实施方案中，膜蛋白包含跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域包含疏水性氨基酸(例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)。在一些情况下，疏水性氨基酸是连续的。在一些情况下，跨膜结构域至少部分插入脂质双层。在一些情况下，跨膜结构域完全跨过脂质双层。膜蛋白可以具有任何数量的跨膜结构域(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多跨膜结构域)。

在一些实施方案中，将多个不同的膜蛋白插入膜。在一些实施方案中，多个不同的膜蛋白包含蛋白文库的突变体。在一些实施方案中，多个不同的膜蛋白包含不同类型的膜蛋白(例如，孔蛋白、粘附素、受体等)。在一些实施方案中，膜在多个导电电极上形成，将突变体膜蛋白的文库分布地插入多个电极上的膜中，且测定膜蛋白的文库。

在各个实施方案中，测定法可以不同。在一些实施方案中，测定法是功能测试(例如，孔蛋白的转运速率或受体的特异性)。测定法使用任何合适的试剂、时间、温度、检测机制(例如，电子检测、荧光检测)等。在一些实施方案中，测定法包括测定药物化合物对膜和/或膜蛋白的效果。在一些实施方案中，测定法包括测定化学化合物对膜和/或膜蛋白的效果。

在一些实施方案中，可以将膜结合蛋白和孔电吸引并插入人工脂质双层膜，或代表所有已知活的和非活物种的可能其他形式的膜。在一些情况下，模拟活生物体的膜的脂质双层或其他膜首先在导电电极上生成。然后可以将电势施加至电极，从而使得将人工膜上溶液中自由漂浮的膜蛋白吸引并插入膜中。这些蛋白的插入可以通过如电极测量的电特性的变化来检测。

在一个方面，检测完整膜相比于破裂膜。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过测量电极的电特性来检测膜蛋白的插入。具有插入蛋白的正常膜的总电导率和电容可以进行检测。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用电极测量总电导率和/或电容，以测定膜中的一个或多个缺陷。

在一些实施方案中，膜蛋白将一个或多个跨膜结构域插入膜。在一些情况下，当将膜蛋白插入膜时，其不形成孔(例如，其这样插入可能无法通过膜的电容或电导率的变化来检测)。可以将报道分子部分和/或标记结合至膜蛋白，以确定该蛋白是否已经插入。报道分子部分和/或标记可以是化学或生物反应性的(例如，可以是膜蛋白和报道酶的融合蛋白，生物素化的膜蛋白等)。插入蛋白之后，试剂可以与膜蛋白接触，以生成信号(即，任选地通过试剂和报道分子部分和/或标记之间的相互作用生成)。合适的信号包括pH变化、电变化和/或电容变化(例如，通过传感器检测)。在一些情况下，发射光(例如，荧光)，且对膜蛋白的存在进行成像。

在一些实例中，纳米孔检测器可用于测试药物化合物对膜的影响。也可以确定化学化合物对膜的影响。在一些情况下，当平行测试多种包含蛋白的膜时，或当一次测试多种膜/蛋白组合时，该技术是有力的。在一些情况下，用电极/检测器的基于纳米孔的大规模平行组，可以多次测试代表一种生物体的相同的膜/蛋白设置，和/或用一个传感器芯片上的分开的孔，可以一次测试代表许多不同类型的生物体的许多不同类型的膜/蛋白组合。

在一些实施方案中，至少一个膜包含在多个导电电极上形成的多个膜，其中将电极选择性通电，以便将来自包含多种膜蛋白的混合物的膜蛋白的子集插入电极位置的膜中，并且其中所述膜和/或膜蛋白在电极位置进行测定。

在一些实施方案中(例如，因为当被诱导这样做时膜蛋白才插入)，不同蛋白可以流动跨过在时间上分离的电极传感器的大规模平行阵列，并且通过用存在特定蛋白协调电脉冲的施加，每个电极检测器可以生成其自己的特定蛋白群体。因此，已知驻留在斑马鱼膜中的蛋白可以在电极膜1-10上生成，而具有其适当蛋白的人肺细胞膜壁的模拟物可以在电极膜11-20上生成，大豆膜和适当蛋白在电极30-40上，等等。在一些实施方案中，这种人工细胞膜的可编程生成允许前所未有看到生物体的特征。

本公开的系统可用于选择膜结合的蛋白或目标孔蛋白。例如，通过用未知孔填充单个控制的电极/膜传感器的大规模平行组，然后测试它们所有对试剂或刺激电压和/或电流的优选应答，可以确定独特的优选的蛋白的存在。在一些情况下，用有限比例的初始测试混合物进一步筛选允许使用者确定哪个确切孔蛋白是他的目标分子。在一些实施方案中，该系统允许快速选择，或筛选，膜相关蛋白中的大量突变。

计算机系统

本公开的设备、系统和方法可以在计算机系统的帮助下进行调节。图21显示了系统2100，其包含与纳米孔检测和/或核酸测序系统2102耦合的计算机系统2101。计算机系统2101可以是一个服务器或多个服务器。计算机系统2101可以进行编程以调节样品制备和处理，和通过测序系统2102的核酸测序。测序系统可以是包含多个可独立寻址的纳米孔传感器的纳米孔设备，如本文中其他地方所述。测序系统2102可以是芯片(或生物芯片)。计算机系统2101可以包括机器可执行的代码(例如，软件)，其可以用于执行由测序系统2102生成的核酸序列信息中的误差检测，并执行核酸序列数据的比对(在本文中也称为“读出”) 。纳米孔检测和/或测序系统2102可以是基于纳米孔的测序仪(或检测器)，如本文所述。

计算机系统2101可以进行编程以实施本公开的方法。计算机系统2101包括中央处理单元(CPU，在本文中也称为“处理器”)2105，其可以是单核或多核处理器，或用于平行处理的多个处理器。处理器2105可以是电路(诸如集成电路)的部分。在一些实例中，可以将处理器2105集成在应用特异性集成电路(ASIC)中。计算机系统2101还包括存储器2110(例如，随机存取存储器，只读存储器，闪存)，电子存储单元2115(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口2120(例如，网络适配器)，和外围设备2125，诸如高速缓存，其他存储器，数据存储和/或电子显示适配器。存储器2110，存储单元2115，接口2120和外围设备2125与CPU 2105通过通信总线(实线)诸如主板来通信。存储单元2115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统2101可以在通信接口2120的帮助下可操作地耦合至计算机网络(“网络”)。网络可以是因特网、互联网和/或外联网，或与因特网通信的内联网和/或外联网。网络可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算。

在一些实例中，计算机系统2101包括场可编程门阵列(field-programmable gate array, FPGA)。在此类情况下，可以排除处理器2105。

本公开的方法可以经由储存在计算机系统2101的电子存储位置上，诸如，例如，存储器2110或电子存储单元2115上的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)来实施。在使用过程中，所述代码可以由处理器2105来执行。在一些情况下，所述代码可以从存储单元2115检索并存储在存储器2110上，用于准备由处理器2105访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元2115，并且将机器可执行指令存储在存储器2110上。

所述代码可以用具有适于执行所述代码的处理器的机器预编译和配置用于使用，或者可以在运行过程中进行编译。所述代码可以以编程语言提供，可以选择所述编程语言以使所述代码以预编译或编译(as-compiled)的方式来执行。

计算机系统2101可适配成存储使用者概况信息，诸如，例如，名称、物理地址、电子邮件地址、电话号码、即时消息(IM)处理、教育信息、工作信息、社会喜好/或厌恶、和与使用者或其他使用者潜在相关的其他信息。可以将此类概况信息存储在计算机系统2101的存储单元2115上。纳米孔检测和/或核酸测序系统2102可以直接耦合至计算机系统2101或经过云(例如，互联网)2130。

本文中提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统2101，可以在编程中实施。该技术的各个方面可以被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据形式的“产品”或“制品”，其在一种类型的机器可读介质中实现或实施。可以将机器可执行编码存储在电子存储单元，诸如存储器(例如，ROM、RAM)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有的有形存储器或其相关模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以随时为软件编程提供非临时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或其他各种通信网络进行通信。此类通信，例如，可以实现将软件从一个计算机或处理器装载到另一个，例如，从管理服务器或主计算机装载到应用服务器的计算机平台。因此，可以具有软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，诸如在本地设备之间的物理接口间使用，其通过有线和光纤地面网络和经各种空中链接。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链接，光学链接等，也可以被认为是具有软件的介质。如本文所使用，除非限于非临时性的有形“存储”介质，术语计算机或机器“可读介质”是指参与为处理器提供用于执行的指令的任何介质。

因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于，有形存储介质，载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，诸如在任何计算机等中的任何存储设备，诸如可用于实施数据库等，在附图中显示。易失性存储介质包括动态存储器，诸如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜导线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采用以下形式：电或电磁信号，或声波或光波，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的那些。计算机可读介质的常见形式，因此包括，例如： 软盘，柔性盘，硬盘，磁带，任何其他磁介质，CD-ROM，DVD或DVD-ROM，任何其他光学介质，穿孔卡片纸带，具有孔模式的任何其他物理存储介质，RAM，ROM，PROM和EPROM，FLASH-EPROM，任何其他存储器芯片或编码磁带(cartridge)，载波传输数据或指令，传输此类载波的电缆或链接，或计算机可以由其读取程序代码和/或数据的任何其他介质。计算机可读介质的许多这些形式可以参与携带用于处理器执行的一个或多个指令的一个或多个序列。

生物芯片和用于形成生物芯片的方法

纳米孔可以用于检测各种分子，包括但不限于测序聚合物，诸如核酸分子。本文中认识到需要改进的生物芯片和用于制备生物芯片(例如，包括纳米孔)的方法。在一些情况下，常规半导体加工技术在生产用作生物芯片的硅设备中是缺乏的。本公开提供了可以生产抵抗高腐蚀环境诸如水溶液(任选地包含离子) (例如，在与其接触过程中或接触后是可操作的)的生物芯片的方法。此类方法可用于以高密度(例如，至少约500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、或10000个位点/mm²)形成生物芯片。每个位点可以是独立(或单独)可寻址的位点。在另一个方面，本文所述的方法生成有利于有机膜(例如，脂质双层)的形成的生物芯片表面。在另一个方面，该方法提供了进行生物芯片中离子电流流动的电测量所需的电化学电极。

此外，根据本文所述的方法生产的生物芯片可用于核酸分子鉴定和聚合物(例如，核酸)测序。在一些情况下，使聚合物通过纳米孔，且聚合物的各个亚单位(例如，核酸的腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和/或尿嘧啶(U)碱基)影响流过纳米孔的电流。如本文所述，各个亚单位可以通过测量在跨过纳米孔和/或膜施加的多个电压下的电流来鉴定。在一些情况下，标签化的核苷酸的聚合将标签分子释放和/或呈现至纳米孔，其可以通过测量在跨过纳米孔和/或膜施加的多个电压下的电流来鉴定。

基于孔的传感器(例如，生物芯片)可用于电询查(electro-interrogation)单分子。本公开的基于孔(pore)的传感器可以包括邻近或接近于感测电极设置的膜中形成的纳米孔。传感器可以包括对电极。所述膜包括反式(trans)侧(即，面向感测电极的侧)，和顺式(cis)侧(即，面向对电极的侧)。

现在将参考附图，其中相同编号始终是指相同部分。将理解的是，本文中的附图和特征不必按比例绘制。

关于图22，典型的电测量可以在测试下在与孔密切相关的分子上操作(例如，结合可以是化学的、机械的、电的或电化学的)。所述系统可以跨过分子/孔复合物施加刺激(电压或电流)并测量响应。为了分离孔/分子复合物的测量，孔的两侧通常由高绝缘材料(例如，脂质双层)分隔。

包覆在绝缘阻挡层的对侧上的体积被称为顺式孔和反式孔，其中通常定义是目标种类(例如，核酸分子或标签分子)在检测过程中从顺式孔移动至反式孔。反式孔通常是接近于和电连接至芯片电极的绝缘膜的侧面。

在一些实施方案中，生物芯片包含能够在孔中与电极形成电路的对电极。在一些情况下，多个孔中的多个电极共有共同的对电极。图23显示了具有共同的对电极的电极阵列，其中所述液体容器周界(例如，容器)充当对电极(例如是导电的，并且形成电路)。对电极的另一个实施方案显示于图24，其中对电极是纳米孔的顶部上的板(例如，由导电金属制成)。如图25和图26中显示，可以将多个孔中的多个电极组织成共有共同的对电极的组。在一些情况下，(例如，图26)，多个孔中的多个电极各自具有专用的对电极。在一些情况下，具有多个对电极可以允许感测电极可单独寻址(或在电极组共有共同的对电极的情况下的组中)。

在一些情况下，多个孔(包括孔的总数的任何子集)包含共同的电解质合并物。如图27中显示，孔2701可以由壁2702分成数行，从而使得孔的行共有孔上面的共同有的电解质合并物。如此处所述将生物芯片分成部分可以允许在单一生物芯片上分析多个样品(例如，通过将不同样品放入芯片的不同部分)。

纳米孔传感器可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、或1000个邻近于电极的纳米孔(例如，图1B的底部导电电极202)。纳米孔传感器可以包括顶部电极(例如，图1B的顶部电极201)，其用于通过纳米孔传感器(且不是其他传感器)单独使用，或者作为替代，可以提供顶部电极用于由多个纳米孔传感器使用。

生物芯片处理

可以如本文所述进行控制表面特征、孔腔体积以及电极组成和体积，以产生微孔的可伸缩的基于半导体的平面阵列(例如，用于纳米孔检测的目的)。在一些情况下，基于纳米孔的半导体阵列感测平台实现以下目标： (1)支持平面绝缘膜的芯片表面特征，(2)导致良好定义和良好控制的平面膜表面的差异表面特征，(3)大穿孔(trans-well)电解质体积，(4)大电极体积，(5) 阵列上邻近传感器电极之间的低电串扰，(6)高单元密度，以实现非常大的阵列尺寸，和(7)非常长持续时间的稳定测量，在此过程中关键参数(电压，电阻等)保持几乎恒定。

例如，符合目标(1)和(2)可能难以确保用良好控制的膜区域和穿孔体积形成高度绝缘(电阻性)屏障。

在形成脂质双层膜的情况下，芯片的设计和加工可负责磷脂分子的亲水性头部和疏水性尾部。仔细控制芯片表面允许界定良好界定的亲水性和疏水性区域。进而，这可以控制形成的脂质双层膜的结构和特征。

目标(3)可以确保穿孔电解质离子丰度足够，以便在典型测量的持续时间过程中不影响影响结果。这可以通过完全耗尽一种离子或其他离子或将各种离子的相对浓度改变至它们实质上改变测量结果的程度(即，通过浓度梯度和/或所得的能斯特电势的改变)而发生。

实现目标(4)在消耗电极被消耗或转化为支持测量的电化学反应的部分(例如，银被转化为银氯化氧化反应)的情况下可以具有一定的重要性。具有高电极体积对于以下两者可以具有一定的重要性： (i) 增加可以连续进行测量而不干预“再充电”测量(其可以完全破坏实验或导致测量的数据的缺口)的时间，和 (ii) 减少由氧化和还原电极组分的相对浓度的变化引起的电化学电势变化。在一些情况下，电极材料(银)的完全耗尽在实际连续测量持续时间上设置了理论上限。

在一些情况下，这些目标中的几个可以导致其中满足一个目标以损失另一个的冲突。例如，在硅表面蚀刻深腔并用银完全填充可以在金属/硅表面实现平面膜，由此实现目标(1)、(2)和(4)，然而可以留下较少穿孔电解质可用的剩余体积。类似地，尽可能降低电串扰(目标5)可以通过使邻近单元远远隔开而实现；然而，这可能会以损失实现目标(6)而达到。

在各个方面，本文所述的生物芯片和用于制备生物芯片的方法可以以能够测序核酸分子的方式实现目标(1)至(6)。例如，开发深孔垂直腔结构以支持电解质和电极材料两者可以满足目标(3)和(4)；混合湿/干蚀刻可以增加侧向维度，因此穿孔体积可以满足目标(1)、(2)、(3)和(4)；氧化物表面的选择性硅烷化可以实现目标(1)和(2)；利用凝胶可用于平衡目标(3)和(4)，而同时实现目标(1)和(2)；实施分布式对电极可以同时实现目标(5)和(6)；使用电极补充(再充电)可以实现目标(7)；使用非消耗电极可以实现目标(7)；电镀可以增强电极材料以满足目标(4)；或其任何组合。

生物芯片特征

在一个方面，生物芯片包含半导体衬底和设置在衬底上的二氧化硅层。孔可以在二氧化硅内形成。耐腐蚀材料可以包覆孔的内侧。电极材料可以在孔中。有机官能烷氧基硅烷层可以包覆二氧化硅。在一些情况下，生物芯片进一步包含隔离孔中的第一流体和孔外侧的第二流体的膜。本公开还涵盖通过本文所述的任何方法制备的生物芯片和本文所述的任何生物芯片或通过本文所述的方法生产的生物芯片测序聚合物(包括但不限于核酸分子)的用途。

在一些情况下，电极材料在生物芯片的操作过程中没有耗尽。在一个方面，生物芯片包含多个具有设置在孔上的膜的孔和孔中能够检测到响应于通过孔的实体的通过膜中的孔的离子流的变化的电极。在一些情况下，电极在检测过程中没有耗尽。

电极(例如，银或铂材料)可以具有任何合适的质量或体积。在一些情况下，电极的体积为约0.1毫微微升(fL)、约0.5 fL、约1 fL、约5 fL、或约10 fL。在一些情况下，电极的体积为至少约0.1毫微微升(fL)、至少约0.5 fL、至少约1 fL、至少约5 fL、或至少约10 fL。在一些实施方案中，电极的体积为至多约0.1毫微微升(fL)、至多约0.5 fL、至多约1 fL、至多约5 fL、或至多约10 fL。

电极可以由任何合适的材料(包括材料的混合物和合金)制成。一些实例包括铂、二茂铁、铁氰化物、或其任何组合。在一些情况下，电极材料在电极的操作过程中没有消耗。电极可以包含具有至少两种氧化态的材料和/或能够既接受又供给电子的材料。

具有深、紧密堆积的孔的芯片

在生物芯片上具有高密度的纳米孔传感器对于具有小设备和/或用小生物芯片设备感测或测序大量分子可以是期望的。所述表面包含任何合适密度的离散位点(例如，适合于在给定量时间或对于给定成本测序核酸样品的密度)。在一个实施方案中，所述表面具有大于或等于约500个位点/1 mm²的离散位点的密度。在一些实施方案中，所述表面具有约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约2000、约3000、约4000、约5000、约6000、约7000、约8000、约9000、约10000、约20000、约40000、约60000、约80000、约100000、或约500000个位点/1 mm²的离散位点的密度。在一些实施方案中，所述表面具有至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约2000、至少约3000、至少约4000、至少约5000、至少约6000、至少约7000、至少约8000、至少约9000、至少约10000、至少约20000、至少约40000、至少约60000、至少约80000、至少约100000、或至少约500000个位点/1 mm²的离散位点的密度。

具有高密度离散位点的生物芯片通常导致具有小面积的孔。在一些情况下，孔合适地深(例如，使得所述孔具有合适大的体积)。在一个方面，孔的体积合适地大，从而使得在使电极充电之前孔中的离子没有完全耗尽。在一个方面，电极可以是消耗电极(例如，在检测过程中减少和/或增加体积的电极，诸如银)且孔的体积合适地大，从而使得在使电极再充电之前电极没有完全耗尽。在一些实施方案中，所述孔含有足够大体积的电极材料诸如银。在这些方面，除其他外，孔的体积可以限制电极能够检测电流(即，耗尽离子和/或耗尽电极材料之前)的时间。

在一些情况下，所述孔具有合适大的体积，从而使得所述电极可以检测离子流(例如，电流)约1毫秒(ms)、约5 ms、约10 ms、约50 ms、约100 ms、约500 ms、约1 s、约5 s、约10 s、约50 s、约100 s、约500 s、约1000s、或约5000 s。在一些实施方案中，所述孔具有合适大的体积，从而使得所述电极可以检测离子流(例如，电流)至少约1 ms、至少约5 ms、至少约10 ms、至少约50 ms、至少约100 ms、至少约500 ms、至少约1 s、至少约5 s、至少约10 s、至少约50 s、至少约100 s、至少约500 s、至少约1000 s、或至少约5000 s。

检测的时间可以至少部分取决于跨过纳米孔和/或膜施加的电压幅值(例如，较高的电压幅值导致更高的离子电流、电极更快耗尽，因此，相对较短的检测时间)。在一些实施方案中，跨过膜的电压差为约40毫伏(mV)、约60 mV、约80 mV、约100 mV、约120 mV、约140 mV、约160 mV、约180 mV、约200 mV、约300 mV、约400 mV、或约500 mV。在一些实施方案中，跨过膜的电压差为至多约40 mV、至多约60 mV、至多约80 mV、至多约100 mV、至多约120 mV、至多约140 mV、至多约160 mV、至多约180 mV、至多约200 mV、至多约300 mV、至多约400 mV、或至多约500 mV。在一些实施方案中，跨过膜的电压差为至少约40 mV、至少约60 mV、至少约80 mV、至少约100 mV、至少约120 mV、至少约140 mV、至少约160 mV、至少约180 mV、至少约200 mV、至少约300 mV、至少约400 mV、或至少约500 mV。电压可以是恒定的或可变的(例如，经任何周期波形变化)。

在一些情况下，电极在至少约40 mV、约60 mV、约80 mV、约100 mV、约120 mV、约140 mV、约160 mV、约180 mV、约200 mV、约300 mV、约400 mV、或约500 mV的施加电势下具有至少约1 分钟(“min”)、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min、15 min、20 min、30 min、40 min、50 min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、或12小时的运行寿命。在一些实例中，电极在约80 mV的施加电势下具有至少约15 min的运行寿命。

电极的运行寿命可以基于电极在使用过程中的耗尽(例如，耗尽的速度)来评价。在一些情况下，电极材料在电极的使用过程中在小于或等于约60分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、或1分钟的时间期间内耗尽至多约50%、40%、30%、20%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、或0.01%。

所述孔可以具有任何合适的深度。在一些情况下，孔的深度从生物芯片的表面和/或膜的底部到电极的顶部和/或电极的底部来测量。在一些情况下，孔的深度约等于氧化物层(例如，在图1B中103)的厚度。在一些实施方案中，孔的深度为约0.5微米(µm)、约1 µm、约1.5 µm、约2 µm、约2.5 µm、约3 µm、约3.5 µm、约4 µm、约4.5 µm、约5 µm、约6 µm、约7 µm、约8 µm、约9 µm、约10 µm、或约20 µm。在一些实施方案中，孔的深度为至少约0.5微米(µm)、至少约1 µm、至少约1.5 µm、至少约2 µm、至少约2.5 µm、至少约3 µm、至少约3.5 µm、至少约4 µm、至少约4.5 µm、至少约5 µm、至少约6 µm、至少约7 µm、至少约8 µm、至少约9 µm、至少约10 µm、或至少约20 µm。

在一个方面，生物芯片包含多个具有设置在孔上的膜的孔和孔中能够检测到响应于通过孔的实体的通过膜中的孔的离子流的变化的电极。生物芯片可以包含每平方毫米至少500个孔，并且所述孔可以具有合适大的体积，从而使得电极可以检测至少100个实体，而无需为电极再充电。

在一些实施方案中，所述实体是核苷酸掺入事件后释放的标签分子。在一些情况下，聚合物穿过孔且所述实体是聚合物的亚单位。在一些情况下，所述聚合物是核酸，且聚合物的亚单位是核碱基。

生物芯片可以检测任何合适数量的实体，而无需为电极再充电。在一些情况下，检测约10、约50、约100、约500、约1000、约5000、约10000、约50000、约100000、约500000、约1000000、约5000000、或约10000000个实体。在一些情况下，检测至少约10、至少约50、至少约100、至少约500、至少约1000、至少约5000、至少约10000、至少约50000、至少约100000、至少约500000、至少约1000000、至少约5000000、或至少约10000000个实体。

具有紧密堆积的孔和最小串扰的芯片

在一个方面，孔被紧密堆积且具有低量的串扰 (例如，电极将所有或大部分它们的信号从纳米孔和/或最接近于电极的膜导出)。在一个方面，生物芯片包含多个具有设置在孔上的膜的孔和孔中检测到响应于离子流的信号的电极。生物芯片可以包含每平方毫米至少500个孔，且所述电极彼此电隔离。生物芯片可以包含单位面积任何合适数量的孔，如本文所述。

在一些情况下，电极检测来自通过膜中的纳米孔的离子流的信号的约80%、约90%、约95%、约99%、约99.5%、或约99.9%。在一些情况下，电极检测来自通过膜中的纳米孔的离子流的信号的至少约80%、至少约90%、至少约95%、至少约99%、至少约99.5%、或至少约99.9%。在一些情况下，电极检测来自通过邻近孔中的纳米孔的离子流的信号的不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过1％、不超过0.5％、或不超过0.1％。

用于制备生物芯片的方法

所述方法可用于制备高质量生物芯片，其能够抵抗腐蚀性溶液和在生物芯片上形成具有高电阻的膜。在一个方面，用于制备生物芯片的方法包括提供半导体衬底和在衬底上或邻近于衬底形成多个含有能够进行电测量的电极的孔。在一些情况下，所述方法进一步包括处理衬底以抵抗腐蚀性溶液和制备衬底用于形成具有高电阻的密封孔的膜。

膜可以具有任何合适的高电阻(resistivity)。在一些情况下，电阻为约10兆欧姆(MΩ)、约50 MΩ、约100 MΩ、约500 MΩ、约1千兆欧姆(GΩ)、约5 GΩ、或约10 GΩ。在一些情况下，电阻为至少约10兆欧姆(MΩ)、至少约50 MΩ、至少约100 MΩ、至少约500 MΩ、至少约1千兆欧姆(GΩ)、至少约5 GΩ、或至少约10 GΩ。

在一些实施方案中，半导体衬底包含硅。在一些情况下，膜是脂质双层。电极可以能够测量通过嵌入膜中的纳米孔的离子电流。

设备可以抵抗任何合适的腐蚀性溶液。在一些情况下，腐蚀性溶液是含水的(包括水)和包含离子(例如，Na⁺、Cl^-)。在一些情况下，生物芯片在与1 M NaCl接触10小时后是可操作的。

在一些实例中，用于制备生物芯片的方法包括在半导体衬底上沉积具有反应性氧化物基团的材料，将孔蚀刻成二氧化硅，在孔中形成金属电极，从衬底的除了孔以外的所有区域去除金属，和用合适用于粘附膜的层包覆衬底。在一些情况，半导体衬底包含硅。所述方法可以制备用于使用纳米孔核酸测序中使用的生物芯片。

在一些情况下，具有反应性氧化物基团的材料是二氧化硅。所述材料可以呈现硬的、平的表面，其对于与其表面接触的溶液表现出反应性氧化物(–OH)基团的均匀覆盖。这些氧化物基团可以是用于随后硅烷化处理的连接点。或者，可以沉积亲脂性和疏水性表面材料，其模拟二氧化硅的腐蚀特征。

在一些实施方案中，将钝化层沉积在半导体衬底上，其可以具有或可以不具有反应性氧化物基团。钝化层可以包含氮化硅(Si₃N₄)或聚酰胺。在一些情况下，光刻步骤用来限定其中在钝化层上形成膜的区域。光刻步骤可以用来限定使用光致抗蚀剂和通过掩模(mask)暴露光致抗蚀剂的部分的区域。生物芯片中的位点密度(例如，500个位点/mm²)可以通过选择掩模(mask)和光致抗蚀剂的暴露部分中的特征(例如，代表孔横截面的洞)的密度来定义。

图28至图41显示可以导致产生生物芯片的步骤的实例。所有附图不必按比例绘制。

参考图28，用于制备生物芯片的方法可以用半导体衬底开始。半导体(例如，硅)可以具有设置在其上的任何数量的层，包括但不限于导电层，诸如金属。一些情况下，导电层是铝。在一些情况下，衬底具有保护层(例如，氮化钛)。所述层可以在各种沉积技术的帮助下沉积，诸如，例如，化学蒸汽沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD)、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热线CVD(HWCVD)、 初始CVD(iCVD)、改良式CVD(MCVD)、蒸汽轴沉积(VAD)、外部蒸汽沉积(OVD)以及物理蒸汽沉积(例如溅射沉积、蒸发沉积)。

在一些情况下，将氧化物层沉积在半导体衬底上，如图29中所示。在一些情况下，氧化物层包含二氧化硅。二氧化硅可以使用原硅酸四乙酯(TEOS)、高密度等离子体(HDP)、或其任何组合来沉积。

在一些情况下，二氧化硅使用低温技术沉积。在一些情况下，所述方法是二氧化硅的低温化学蒸汽沉积。所述温度通常足够低，从而使得芯片上预先存在的金属不被损坏。沉积温度可以为约50℃、约100℃，、约150℃、约200℃、约250℃、约300℃、约350℃等。在一些实施方案中，沉积温度为低于约50℃、低于约100℃、低于约150℃、低于约200℃、低于约250℃、低于约300℃、低于约350℃等。沉积可以在任何合适的压力下进行。在一些情况下，沉积过程使用RF等离子体能量。

在一些情况下，氧化物不通过热生长的氧化过程来沉积(例如，其可以使用接近或超过1,000℃的温度)。

可以将二氧化硅沉积至适于形成以下孔的厚度，所述孔包含电极和一定体积的电解质，其能够测序核酸分子的至少100、至少1000、至少10000、至少100000、或至少1000000个核碱基而无需为电极再充电。

可以将二氧化硅沉积到任何合适的厚度。在一些实施方案中，二氧化硅的厚度为约0.5微米(µm)、约1 µm、约1.5 µm、约2 µm、约2.5 µm、约3 µm、约3.5 µm、约4 µm、约4.5 µm、约5 µm、约6 µm、约7 µm、约8 µm、约9 µm、约10 µm、或约20 µm。在一些实施方案中，二氧化硅的厚度为至少约0.5微米(µm)、至少约1 µm、至少约1.5 µm、至少约2 µm、至少约2.5 µm、至少约3 µm、至少约3.5 µm、至少约4 µm、至少约4.5 µm、至少约5 µm、至少约6 µm、至少约7 µm、至少约8 µm、至少约9 µm、至少约10 µm、或至少约20 µm。

孔蚀刻

生物芯片可以包含孔。单个孔可以包括孔中或孔上膜中的纳米孔。孔可以是独立可寻址的纳米孔传感器的部分。

可以使用各种制造技术在二氧化硅衬底中生成孔。此类技术可以包括半导体制造技术。在一些情况下，使用光刻技术诸如半导体工业中使用的那些生成孔。例如，可以将光致抗蚀剂(例如，当暴露于电磁辐射时改变特性的材料)包覆在二氧化硅(例如，通过旋涂晶片)至任何合适的厚度，如图30中所示。然后可以将包括光致抗蚀剂的衬底暴露于电磁辐射源。掩模可用于遮蔽来自光致抗蚀剂的部分的辐射以限定孔的区域。光致抗蚀剂可以是负性抗蚀剂或正性抗蚀剂(例如，可以将孔的区域暴露于电磁辐射或可以将除了孔以外的区域暴露于电磁辐射如通过掩模所限定)。在图31中，将覆盖其中待生成孔的位置的区域暴露于电磁辐射，以限定对应于二氧化硅层中孔的位置和分布的模式。生物芯片中的位点密度(例如，500个位点/mm²)可以通过选择掩模(mask)的特征(例如，代表孔横截面的洞)的密度来定义。可以将光致抗蚀剂通过限定对应于孔的模式的掩模暴露于电磁辐射。接下来，可以去除光致抗蚀剂的暴露部分，诸如，例如，在洗涤操作(例如，去离子水)的帮助下。然后可以将掩模的去除部分暴露于化学蚀刻剂以蚀刻衬底并将孔的模式转为二氧化硅层。蚀刻剂可以包括酸，诸如，例如，硫酸(H₂SO₄)。二氧化硅层可以各向异性的方式来蚀刻，尽管在一些情况下，蚀刻可以是各向同性的。例如，参考图33，可以蚀刻不完全对应于最终孔的区域的区域 (例如，可以在光致抗蚀剂下蚀刻孔)。

各种蚀刻程序可用于蚀刻待形成孔的区域中的二氧化硅。如图32和图33中所示，蚀刻可以是各向同性蚀刻(即，沿一个方向的蚀刻速率等于沿正交方向的蚀刻速率)，或各向异性蚀刻(即，沿一个方向的蚀刻速率小于沿正交方向的蚀刻速率)，或其变体。

在一些情况下，各向异性蚀刻去除大部分的孔体积。可以去除任何合适的孔体积的百分比，包括约60%、约70%、约80%、约90%、或约95%。在一些情况下，至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、或至少约95%的材料以各向异性蚀刻去除。在一些情况下，至多约60%、至多约70%、至多约80%、至多约90%、或至多约95%的材料以各向异性蚀刻去除。在一些实施方案中，各向异性蚀刻不会去除向下至半导体衬底的所有通路的二氧化硅材料。在一些情况下，各向同性蚀刻去除向下至半导体衬底的所有通路的二氧化硅材料。

在一些情况下，将孔使用光刻步骤蚀刻以限定孔，随后为混合干-湿蚀刻。光刻步骤可以包括用光致抗蚀剂包覆二氧化硅和将光致抗蚀剂通过具有限定孔的模式的掩模(或标线)暴露于电磁辐射。在一些情况下，混合干-湿蚀刻包括干蚀刻以去除通过光刻步骤限定的光致抗蚀剂中的孔区域中的大部分的二氧化硅，清洗生物芯片，和湿蚀刻以便从孔区域中的衬底去除剩余的二氧化硅。

生物芯片可以在等离子蚀刻化学的帮助下，或暴露于氧化剂(诸如，例如，过氧化氢(H₂O₂)、氧化物阴离子(O₂ ^-)或臭氧(O₃))来清洗。清洗可以包括去除残留聚合物，去除可以阻止湿蚀刻的材料，或其组合。在一些情况下，清洗是等离子清洗。清洗步骤可以进行任何合适的时间段(例如，15到20秒)。在一个实例中，清洗可以用以100 mT, 200 W, 20 G, 20 O₂设置的eMAx-CT机器(Applied Materials, Sunnyvale California)进行20秒。

干蚀刻可以是各向异性蚀刻，其垂直蚀刻 (例如，向半导体衬底)，但不侧向蚀刻(例如，平行于半导体衬底)。在一些情况下，干蚀刻包括用基于氟的蚀刻剂(诸如CF₄、CHF₃、C₂F₆、C₃ F₆或其任何组合)来蚀刻。在一种情况下，蚀刻用具有100 mT, 1000 W, 20 G和50 CF₄的设置的eMax-CT机器(Applied Materials, Sunnyvale California)进行400秒。

湿蚀刻可以是各向同性蚀刻，其以所有方向去除材料。在一些情况下，湿蚀刻底切(undercuts)光致抗蚀剂。底切光致抗蚀剂可以使光致抗蚀剂更容易在后续步骤中去除(例如，光致抗蚀剂“抬离(lift off)”)。在一个实施方案中，湿蚀刻是缓冲的氧化物蚀刻(BOE)。在一些情况下，湿氧化物蚀刻在室温用可以进行缓冲的氢氟酸的碱(base)(例如，用氟化铵)进行，以减慢蚀刻速率。蚀刻速率可以取决于被蚀刻的薄膜和HF和/或NH₄F的特定浓度。完全去除氧化物层所需的蚀刻时间通常根据经验确定。在一个实例中，蚀刻在22℃用15:1 BOE(缓冲氧化物蚀刻)进行。

可以将二氧化硅层蚀刻至下面的材料层。例如，参考图33，蚀刻二氧化硅层，直到氮化钛层。

在一个方面，用于制备生物芯片的方法包括使用光刻步骤将孔蚀刻入包覆在半导体衬底上的二氧化硅层以限定孔，干蚀刻以去除通过光刻步骤限定的孔区域中的大部分二氧化硅，且湿蚀刻以便从孔区域中的衬底去除剩余的二氧化硅。在一些情况下，所述方法进一步包括去除残留聚合物，去除可以阻止湿蚀刻的材料，或其组合。所述方法可以包括等离子清洗步骤。

如图33中所示，在一些情况下，在光刻步骤或混合湿干蚀刻之后，没有从二氧化硅去除光致抗蚀剂。离开光致抗蚀剂可用于在后续步骤中仅将金属引入孔而不是引至二氧化硅的上表面上。在一些情况下，半导体衬底用金属(例如，图33中的铝)包覆，且湿蚀刻不会去除保护金属免受腐蚀的组分(例如，图33中的氮化钛(TiN))。然而，在一些情况下，可以去除光致抗蚀剂层，诸如在化学机械平面化(CMP)的帮助下。

电极金属化

本文所述的生物芯片可用于在纳米孔和电检测的帮助下检测分子和/或测序核酸分子。电检测可以在孔中的电极和位于孔外侧的对电极的帮助下进行。本文提供的是用于生成电极(诸如金属电极)的方法。电极可以在检测过程中被可逆地消耗，在检测过程中不消耗，或者在检测过程中不会明显地消耗。

可以在分子检测过程中被可逆地消耗的电极的一个实例是银。可以在检测过程中不会明显地消耗的电极的一个实例是铂。

电极可以在各种沉积技术的帮助下邻近于衬底形成。例如，电极可以在电镀的帮助下形成。作为另一个实例，电极可以在各种蒸汽沉积技术的帮助下形成，诸如，例如，化学蒸汽沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD)、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热线CVD(HWCVD)、 初始CVD(iCVD)、改良式CVD(MCVD)、蒸汽轴沉积(VAD)、外部蒸汽沉积(OVD)以及物理蒸汽沉积(例如溅射沉积、蒸发沉积)。

在一个方面，用于制备生物芯片的方法包括提供用二氧化硅层包覆的半导体衬底，其中将孔蚀刻入二氧化硅(例如，图33中所示)。所述方法可以包括将保护层沉积在孔表面上(例如，如图35中所示的铂)和将电极材料沉积在孔表面上(例如，如图36中所示的银)。所述方法可以进一步包括将粘附材料的薄膜沉积到孔表面上，以提供金属层与金属层下方层的粘附性和导电性。粘附材料可以包括钛、钽、氮化钛(TiN)、铬或其任何组合。参考图34，可以将包含钛的粘附材料邻近于氮化钛层沉积，诸如，例如，通过电镀或蒸汽沉积(例如，化学蒸汽沉积)。在一些情况下，金属的单层替代两层或更多层(例如，单一金属层为粘附层和保护层两者)。

在一些情况下，保护层包含抗腐蚀金属(例如，铂、金)。非限制地，保护层可以为下面导体提供电连接性(例如，图34中的铝，或氮化钛)，保护下面导体免于反应性溶液的攻击(例如，腐蚀性溶液诸如氯化钠的水溶液)，提供电子源和/或阱(sink)，从而使得电极材料不在氧化还原反应中消耗(例如，当电极包含银时，铂可以充当源和/或阱(sink))，或其任何组合。

金属的各层(例如，粘附层、保护层、电极材料等)可以通过任何合适的技术(例如溅射、沉积、电镀或其组合) 来沉积。在一些情况下，电极材料通过溅射(诸如，例如，磁控溅射)来沉积。

电极能够根据需要进行任何合适的测量用于生物芯片的操作。在一些情况下，电极材料进行孔中的分析物的电测量。分析物可以包含核酸、氨基酸、蛋白、标签分子或其任何组合。电测量可以是可逆的氧化还原反应。在一些实施方案中，将足够体积的电极材料沉积到孔中，以提供涉及孔中的分析物的氧化还原反应的检测。

抬离程序

可以存在一个或多个在电极金属化之后沉积到光致抗蚀剂上的金属层，如图36中所示。在一些情况下，将沉积到光致抗蚀剂上的金属从生物芯片去除，而沉积在孔中的金属留在孔中。生成孔之后留下光致抗蚀剂(例如，如图33中所示)对于实现仅从生物芯片的表面而不是孔中去除金属可以是有利的。

在一些情况下，在形成孔和电极之后，光致抗蚀剂和光致抗蚀剂上的任何材料层可以在化学或机械蚀刻操作的帮助下去除。在一个实例中，化学机械平面化(CMP)用于去除光致抗蚀剂和光致抗蚀剂上的任何材料层。在另一实例中，使用丙酮去除光致抗蚀剂和任何覆盖层。

生物芯片表面的硅烷化

在形成孔和孔内的电极之后，可以处理二氧化硅层以使二氧化硅层适用于在孔中或邻近于孔形成膜。在一些情况下，疏水膜，诸如，例如，双层(例如，脂质双层)，在孔上形成。该膜可以诸如，例如，以至少约10千兆欧姆的电阻从上覆液隔离蚀刻的孔。如本文所述，二氧化硅表面的硅烷化(例如，使表面疏水)使表面适于形成膜。

用于使膜稳定至半导体接口的方法包括硅烷化半导体表面，从而使得膜能够粘附至硅烷化的表面，且以例如至少约10千兆欧姆的电阻从第二流体(例如，在膜的反式侧面上)隔离第一流体(例如，在膜的顺式侧面上)。

用于制备生物芯片的方法可以包括提供具有包含二氧化硅和/或金属的表面的包装的生物芯片或生物芯片前体(例如，如图37中所示)和使用，例如，有机官能烷氧基硅烷分子硅烷化表面(例如，如图38中所示)。在一些情况下，所述有机官能烷氧基硅烷分子是二甲基氯-十八烷基-硅烷、甲基二氯-十八烷基-硅烷、三氯-十八烷基-硅烷、三甲基-十八烷基-硅烷、三乙基-十八烷基-硅烷或其任何组合。

有机官能烷氧基硅烷分子可以覆盖二氧化硅表面(如图38中所示)和任选的金属表面(未显示)。硅烷层的厚度可以是一个分子(图38)。

硅烷化之后，所述方法可以进一步包括用冲洗方案从衬底去除残留的硅烷。冲洗方案的一个实例是用癸烷、丙酮、乙醇、水和乙醇冲洗5秒，随后空气干燥，且在97℃加热30分钟。冲洗方案也可以用于在应用硅烷层之前清洗芯片。

图41显示了银和下方保护金属可以溅射到孔的侧壁上，因此，硅烷化不能下降入孔。在一些情况下，孔的侧壁的四分之三或以上用银和下方保护层覆盖。

凝胶的插入和膜的形成

在一个方面，方法包括用适用于粘附膜的层(例如，包含纳米孔的脂质双层)包覆衬底，其中所述方法包括用有机官能烷氧基硅烷分子硅烷化衬底。图38显示了其中膜可以设置在硅烷化的表面上的生物芯片。

在一些情况下，至少部分由于膜在硅烷化的二氧化硅上得到支持，但没有在孔上得到支持，所以膜难以形成和/或是不稳定的。本文中认识且描述，用凝胶填充孔可以支持孔区域上的膜，由此使得更容易形成膜和/或稳定膜。在一些实施方案中，孔的空部分用凝胶填充，如图39中所示。凝胶可以为设置在孔上的膜提供机械支持。

在一个方面，用于制备生物芯片的方法包括将凝胶沉积入接近于电极和感测电路的孔和在孔上形成膜，其中所述膜至少部分地由凝胶支持。

在一些情况下，凝胶是不反应的，交联的，包含液体电解质，或者其任何组合。凝胶可以包括但不限于标准的试剂凝胶，诸如琼脂糖和市售专有凝胶基质(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白(Lamanin)、水凝胶、QGel和HydroMax凝胶)。

纳米孔的插入

在一些情况下，将纳米孔插入膜中(例如，通过电穿孔)。可以通过刺激信号插入纳米孔，所述刺激信号诸如电刺激、压力刺激、液流刺激、气泡刺激、超声处理、声、振动、或其任何组合。纳米孔可以是蛋白纳米孔诸如α-溶血素或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)(MspA)纳米孔。

在一些情况下，使聚合酶(例如，DNA聚合酶)连接和/或位于接近于纳米孔。可以在将纳米孔并入膜之前或之后将聚合酶可以连接至纳米孔。在一些情况下，纳米孔和聚合酶是融合蛋白(即，单一的多肽链)。

可以任何合适的方式将聚合酶连接至纳米孔。在一些情况下，将聚合酶连接至溶血素蛋白单体，然后组装完整的纳米孔七聚体(例如，以一个具有连接的聚合酶的单体与6个没有连接的聚合酶的溶血素单体的比率)。然后可以将纳米孔七聚体插入膜中。

另一种用于将聚合酶连接至纳米孔的方法涉及将接头分子连接至溶血素单体或突变溶血素单体以具有连接位点，然后组装完整的纳米孔七聚体(例如，以一个具有接头和/或连接位点的单体与6个没有接头和/或连接位点的溶血素单体的比率)。然后可以将聚合酶连接至连接位点或连接接头(例如，整批，插入到膜中之前)。也可以在膜中形成(例如，七聚体)纳米孔之后将聚合酶连接至连接位点或连接接头。在一些情况下，将多个纳米孔-聚合酶对插入生物芯片的多个膜(例如，设置在孔和/或电极上)。在一些情况下，聚合酶与纳米孔复合物的连接发生在每个电极上的生物芯片上。

可以用任何合适的化学作用(如共价键和/或接头)将聚合酶连接至纳米孔。在一些情况下，用分子钉(molecular staples)将聚合酶连接至纳米孔。在一些情况下，分子钉包含三种氨基酸序列(表示接头A、B和C)。接头A可以从溶血素单体延伸，接头B可以从聚合酶延伸，且接头C然后可以结合接头A和B(例如，通过在接头A和B周围缠绕)，因此使聚合酶结合纳米孔。也可以将接头C构建成接头A或接头B的部分，因此降低了接头分子的数目。

在一些情况下，使用Solulink^TM化学法将聚合酶连接至纳米孔。Solulink^TM可以是HyNic (6‐肼基-烟酸，芳香族肼)和4FB(4-甲酰基苯甲酸，芳香醛)之间的反应。在一些情况下，使用Click化学法(例如购自LifeTechnologies)将聚合酶连接至纳米孔。在一些情况下，将锌指突变引入溶血素分子，然后使用分子(例如，DNA中间体分子)，以便将聚合酶连接至溶血素上的锌指位点。

用于形成孔的系统

本公开的另一个方面提供了用于形成孔的系统。所述系统可以包括沉积系统，与沉积系统流体连通的泵送系统，和具有用于实施执行用于形成孔的方法的机器可读代码的计算机处理器(本文中也称为“处理器”)的计算机系统(或控制器)。所述代码可以执行本文提供的任何方法。泵送系统可以被配置为吹洗或疏离沉积系统。

所述沉积系统可以包括一个或多个用于形成孔的材料层的反应空间。在一些情况下，沉积系统是具有一个或多个互连的反应室的滚动式(roll-to-roll)沉积系统，所述反应室可以彼此流体分离(例如，在处于室中间的位置吹洗或泵送的帮助下) 。

一个或多个沉积系统可用于形成孔。沉积系统可以用各种类型的沉积技术来配制，所述沉积技术诸如，例如，化学蒸汽沉积(CVD)、原子层沉积(ALD)、等离子体增强CVD(PECVD)、等离子体增强ALD(PEALD)、金属有机CVD(MOCVD)、热线CVD(HWCVD)、 初始CVD(iCVD)、改良式CVD(MCVD)、蒸汽轴沉积(VAD)、外部蒸汽沉积(OVD)以及物理蒸汽沉积(例如溅射沉积、蒸发沉积)。可以配置沉积系统以实现使用各种半导体制造技术(诸如光刻法)的逐层形成。

泵送系统可以包括一个或多个真空泵，诸如一个或多个涡轮分子(“涡轮(turbo)”)泵、扩散泵、离子泵、低温(“低温(cryo)”)泵和机械泵。泵可包括一个或多个备用泵。例如，涡轮泵可用机械泵备用。

在一些情况下，包含一个或多个孔的阵列在沉积系统的帮助下在衬底中形成。沉积可以在控制器的帮助下进行调节。在一些实施方案中，控制器配置为调节一个或多个处理参数，诸如衬底温度、前驱物流率、生长率、载气流速以及沉积室压力。控制器包括处理器，处理器配置为协助执行配置以实施本文提供的方法的机器可执行代码。机器可执行代码储存于物理存储介质，诸如闪存、硬盘或其他配置以存储计算机可执行代码的其他物理存储介质。

可以使控制器耦合至系统的各种部件。例如，控制器可以与一个或多个沉积系统通信。作为另一个实例，控制器可以与泵送系统通信，所述泵送系统可以使得控制器能够调节外壳的压力。

可以将控制器编程或另外配置以调节一个或多个处理参数，诸如衬底温度、前体流速、生长率、载气流速、前体流速和沉积室压力。在一些情况下，控制器与沉积室的一个阀或多个阀连通，这有助于终止(或调节)沉积室中的前体流。控制器包括经配置以帮助执行机器可执行代码的处理器，所述机器可执行代码经配置以执行本文提供的方法。将所述机器可执行代码存储在物理存储介质上，诸如闪存、硬盘、或经配置以存储计算机可执行代码的其他物理存储介质。

用于形成脂质双层、在脂质双层中插入纳米孔和测序核酸分子的方法可见PCT专利公开号WO2011/097028，其以其整体通过引用并入本文。在一些情况下，膜在气泡的帮助下形成，且纳米孔在电刺激的帮助下插入膜中。

本公开提供了生物芯片的多种使用者。本公开的生物芯片可用于原子或分子感测，诸如感测分析物，或测序，诸如核酸测序。本公开的设备可用于确定核酸碱基序列中甲基化核酸碱基的存在。

本文所述的生物芯片可用于确定药物或任何人造或天然存在的分子对跨膜蛋白或膜结合蛋白的稳定性或性能的影响。检测器可以通过生成单独可寻址和电可检测的人造电极或单元膜的阵列(例如，大于2个)来设置，所述人造电极或单元膜含有电极上的任何数量的预先选择或未知的跨膜蛋白，所述电极各自用膜样双层密封。其存在可以离子化或电学检测的任何跨膜蛋白可以被插入脂质双层，且化学品、药物和任何生物或人造分子对这些跨膜蛋白的稳定性或性能的影响可以进行感测和检测。

本文所述的生物芯片可用于确定药物或任何人造或天然分子对阵列传感器的不同部分上放置的不同膜的稳定性或性能的影响。通过使用本申请的附图中定义的通路，可以将不同脂质双层材料引导至阵列芯片的不同区域，并且可以将多个不同的脂质膜呈现给测试溶液，每个膜类型存在于已知的位置。可以检测药物影响膜类型的能力或任何人造或天然存在的分子影响不同膜的能力。

本文所述的生物芯片可用于检测未知溶液中特定蛋白或特定生物分子的存在，将其捕获、排序和分级。

生物芯片和制备和使用本文所述的生物芯片的方法可以使用电解质溶液。在一些情况下，电解质溶液中的离子流过纳米孔且通过电极检测。在电极是消耗电极(即在检测过程中耗尽，例如，银)的情况下，电极可以在电解质包含一些盐不是其他时持续更长。在一些实施方案中，电解质不包含钾离子(例如，因为钾离子导致相对较短的电极寿命)。在一些实施方案中，电解质包含氯化锂、氯化四甲铵、氯化三乙铵、氯化铵或其任何组合(例如，因为列举的盐导致相对较短的电极寿命)。

本公开的生物芯片可以在电阻、电感或电容感测的帮助下进行感测测量。在一些情况下，生物芯片包含电极，所述电极可以在膜或膜中的纳米孔与邻近于或接近于膜或纳米孔的种类的相互作用之后感测邻近于电极的膜的电容。此类测量可以在施加的交流电(AC)波形或直流电(DC)波形的帮助下进行。

实施例

实施例1 - 用具有500个位点/1 mm²的芯片的核酸测序

提供芯片，所述芯片具有以大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的多个离散位点。多个离散位点的单个位点具有在邻近于电极设置的膜中形成的至少一个纳米孔。每个离散位点适配成帮助检测核酸分子。每个离散位点是独立可寻址的。

将多个核酸分子引导至多个离散位点且在耦合至离散位点的计算机处理器的帮助下表征。每个核酸分子的核酸序列基于从多个离散位点接收的电信号来确定。

实施例 2 –以至少 97 ％的精确度测序核酸

提供具有单个传感器的阵列的芯片。所述阵列的单个传感器具有邻近于具有纳米孔的膜设置的电极。将电极耦合至电路，所述电路适配成生成电信号以帮助在通过或接近于纳米孔的核酸分子或其部分的流上检测核酸分子。电极和，因此，单个传感器是独立可寻址的。

可以将核酸分子引导通过或接近于纳米孔。核酸序列信息(原始读取)获得自单个传感器，且存储在计算机存储器中。原始读取同时获得自其他单个传感器，且存储在计算机存储器中。原始读取从数个拷贝的核酸分子生成。因此，该过程生成可用于误差分析的冗余序列信息。与芯片通信的计算机系统具有对原始读取进行误差分析且消除错误原始读取的软件。然后，计算机系统以至少约97％的精确度生成核酸分子的核酸序列。在一些实例中，计算机系统将核酸序列与作为较大核酸样品的部分的其他核酸分子的核酸序列进行比对，且以至少约97％的精确度生成核酸样品的序列。

从上述中应理解，虽然已经例示并描述特定实施，但多种修改可对其进行并在本文中考虑。还旨在本发明也不受限于说明书内提供的特定实例。虽然已经参考上述说明书来描述本发明，但是本文优选的实施方案的描述与例示不应理解为限制之意。更进一步，应理解，本发明的所有方面并不限于本文中根据许多条件与变量所描述的特定说明、设置或相对比例。本发明的实施方案的形式和细节中的多种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，考虑本发明也应涵盖任何此类修改、变化与等同方案。旨在下面的权利要求定义本发明的范围，且这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案因此被涵盖。

Claims (125)

1.用于核酸测序的方法，其包括：

(a) 提供包含以大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的多个离散位点的芯片，其中所述多个离散位点的单个位点包含在邻近于电极设置的膜中形成的至少一个纳米孔，其中每个离散位点适配成帮助检测所述核酸分子或其部分；

(b) 将多个核酸分子引导至所述多个离散位点；和

(c) 借助于耦合至所述离散位点的计算机处理器，基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的每个的核酸序列。

2.权利要求1的方法，其中所述多个核酸分子源自核酸样品。

3.权利要求2的方法，其中所述多个核酸分子的每个具有比所述核酸样品更短的核酸序列。

4.权利要求3的方法，其进一步包括，在(b)之前，将所述核酸样品片段化以提供所述多个核酸分子。

5.权利要求2的方法，其进一步包括基于所述核酸分子的每个的核酸序列的表征来表征所述核酸样品的核酸序列。

6.权利要求1的方法，其中所述电极适配成提供跨过所述膜的电刺激，所述刺激能够在所述核酸分子或其部分的分子流上生成可检测的信号。

7.权利要求1的方法，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于约5 fF/μm²的电容。

8.权利要求1的方法，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于或等于约500 MΩ的电阻。

9.权利要求1的方法，其中所述膜具有跨过所述膜的小于或等于约1 GΩ的电阻。

10.权利要求9或10的方法，其中所述电阻借助于邻近于所述膜设置的相对电极进行测量。

11.权利要求1的方法，其中每个单独可寻址的纳米孔适配成调节分子流。

12.权利要求11的方法，其中每个离散位点适配成借助于施加至所述纳米孔的电刺激调节分子流。

13.权利要求12的方法，其中所述电刺激包含一个或多个电压脉冲。

14.权利要求1的方法，其中每个离散位点适配成调节通过或邻近于所述至少一个纳米孔的分子流。

15.权利要求1的方法，其中每个离散位点适配成在通过或邻近于所述至少一个纳米孔的所述核酸分子或其部分的分子流上检测所述核酸分子或其部分。

16.权利要求1的方法，其中对所述多个核酸分子或其部分的每个的移动表征所述核酸序列。

17.权利要求1的方法，其中将所述电极耦合至集成电路，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。

18.权利要求1的方法，其中所述计算机处理器在所述芯片外部。

19.权利要求1的方法，其中每个离散位点是独立可寻址的。

20.用于测序核酸分子的系统，其包含：

(a) 包含以大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的多个离散位点的芯片，其中所述多个离散位点的单个位点包含在邻近于电极设置的膜中形成的至少一个纳米孔，其中每个离散位点适配成帮助检测所述核酸分子或其部分；和

(b) 耦合至所述芯片的处理器，其中将所述处理器编程以帮助基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的核酸序列。

21.权利要求20的系统，其中所述密度为至少约1000个位点/1 mm²。

22.权利要求20的系统，其中所述膜具有跨过所述膜的小于或等于约1 GΩ的电阻。

23.权利要求20的系统，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于或等于约500 MΩ的电阻。

24.权利要求23的系统，其中所述电阻借助于邻近于所述膜设置的相对电极进行测量。

25.权利要求20的系统，其中每个离散位点适配成调节分子流。

26.权利要求25的系统，其中每个离散位点适配成借助于施加至所述离散位点的电刺激调节分子流。

27.权利要求26的系统，其中所述电刺激包含一个或多个电压脉冲。

28.权利要求20的系统，其中所述电极适配成提供跨过所述膜的电刺激，所述刺激使得在所述核酸分子或其部分的分子流上生成可检测的信号。

29.权利要求20的系统，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于约5 fF/μm²的电容。

30.权利要求20的系统，其中每个离散位点适配成在通过或邻近于所述至少一个纳米孔的所述核酸分子或其部分的分子流上检测所述核酸分子或其部分。

31.权利要求20的系统，其中所述计算机处理器在接近于所述芯片的工作站中。

32.权利要求20的系统，其中将所述电极耦合至集成电路，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。

33.权利要求20的系统，其中每个离散位点适配成调节邻近于所述至少一个纳米孔的分子流。

34.权利要求20的系统，其中每个离散位点适配成调节通过所述至少一个纳米孔的分子流。

35.权利要求20的系统，其中每个离散位点是独立可寻址的。

36.系统，其包含：

具有包含以大于或等于约500个位点/1 mm²的密度的离散位点的表面的衬底，其中所述多个离散位点的单个位点包含至少一个纳米孔和邻近于所述纳米孔的感测电路，其中所述感测电路与计算机处理器通信，所述计算机处理器编程以帮助基于从所述感测电路接收的电信号表征核酸分子的核酸序列。

37.权利要求36的系统，其中所述密度为至少约1000个位点/1 mm²。

38.权利要求36的系统，其中所述纳米孔具有约250 Å或更小的直径。

39.权利要求36的系统，其进一步包含与所述衬底流体连通的流通单元，其中所述流通单元适配成将一种或多种试剂递送至所述衬底。

40.权利要求36的系统，其中所述感测电路包含至多4个晶体管。

41.权利要求36的系统，其中所述至少一个纳米孔是独立可寻址的。

42.膜，其被设置在感测接近于耦合至集成电路的电极的膜不相容表面上，其中所述膜，如通过所述集成电路测量，表现出大于约5 fF/μm²/平方微米的电容和小于约0.25纳西门子/摩尔电解质的电导率，如在至少约50 mV的施加电压下通过所述电极所测量。

43.权利要求42的膜，其中所述集成电路是单独可寻址的集成电路。

44.权利要求42的膜，其中所述集成电路包含逻辑控制器。

45.权利要求42的膜，其中所述膜无纳米孔。

46.用于分子感测中使用的设备，所述设备包含设置在感测接近于耦合至集成电路的电极的至少一个膜不相容表面上的膜中的一个或多个纳米孔，其中所述包含所述一个或多个纳米孔的膜表现出大于约5 fF/μm²的电容和小于约10纳西门子/摩尔电解质/纳米孔的电导率，如在至少约50 mV的施加电压下通过所述电极所测量。

47.权利要求46的设备，其中所述集成电路是单独可寻址的集成电路。

48.权利要求46的设备，其中所述集成电路包含逻辑控制器。

49.用于测序核酸分子的方法，其包括：

(a) 提供包含传感器阵列的芯片，其中所述传感器阵列的单个传感器包含邻近于感测电极的膜，其中所述膜包含至少一个纳米孔，所述纳米孔经配置以帮助在通过或邻近于所述至少一个纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分的一个或多个核酸碱基；

(b) 将所述核酸分子引导至所述单个传感器；

(c) 将所述核酸分子引导至所述单个传感器时将电脉冲系列施加至所述膜；和

(d) 在所述电脉冲系列之间检测所述核酸分子或其部分的一个或多个核酸碱基。

50.权利要求49的方法，其中所述电脉冲系列的单个脉冲解开通过所述纳米孔的所述核酸分子的部分。

51.权利要求49的方法，其中所述核酸分子是双链的，且其中所述电脉冲系列的单个脉冲解离所述核酸分子的单个链。

52.权利要求49的方法，其中所述电脉冲系列具有约100 mV和500 mV之间的电压。

53.权利要求49的方法，其中所述电脉冲系列包含非对称的反向“V”时间概况进展电刺激。

54.权利要求49的方法，其中所述传感器阵列包含以大于或等于约500个单个传感器/1 mm²的密度的单个传感器。

55.权利要求49的方法，其中所述单个传感器是独立可寻址的。

56.权利要求49的方法，其中所述电脉冲系列借助于所述感测电极施加至所述膜。

57.权利要求49的方法，其进一步包括借助于计算机处理器生成所述核酸分子或其部分的序列。

58.用于测序核酸分子的方法，其包括：

(a) 提供包含单个传感器的阵列的芯片，其中所述阵列的单个传感器包含邻近于其中具有纳米孔的膜设置的电极，其中将所述电极耦合至电路，所述电路适配成生成电信号以帮助在通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分；

(b) 引导所述核酸分子或其部分通过或接近于所述纳米孔；和

(c) 以至少约97％的精确度鉴定所述核酸分子或其部分的核酸序列。

59.权利要求58的方法，其中借助于耦合至所述电路的计算机处理器生成所述核酸序列。

60.权利要求58的方法，其中所述传感器是芯片的部分。

61.权利要求58的方法，其中所述传感器阵列包含以大于或等于约500个单个传感器/1 mm²的密度的单个传感器。

62.权利要求58的方法，其中所述单个传感器是独立可寻址的。

63.权利要求58的方法，其中所述核酸分子包含标签，所述标签在互补核酸碱基掺入所述核酸分子时被所述纳米孔检测。

64.权利要求58的方法，其中所述膜是合成膜。

65.权利要求64的方法，其中所述膜是脂质双层。

66.权利要求58的方法，其中所述精确度为至少约99.5%。

67.权利要求58的方法，其中当鉴定所述核酸分子或其部分的多达5个核酸碱基时，所述精确度为至少约97％。

68.权利要求67的方法，其中当鉴定所述核酸分子或其部分的多达3个核酸碱基时，所述精确度为至少约97％。

69.权利要求68的方法，其中当鉴定所述核酸分子或其部分的单个核酸碱基时，所述精确度为至少约97％。

70.权利要求58的方法，其中通过组合从通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的至多20次经过收集的数据实现所述至少约97％的精确度。

71.权利要求70的方法，其中通过组合从通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的至多5次经过收集的数据实现所述至少约97％的精确度。

72.权利要求71的方法，其中通过组合来自通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的单次经过的数据实现所述至少约97％的精确度。

73.权利要求58的方法，其中通过组合从通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的至少10次经过收集的数据鉴定所述核酸分子或其部分的所述核酸序列。

74.权利要求73的方法，其中通过组合从通过或接近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的至少20次经过收集的数据鉴定所述核酸分子或其部分的所述核酸序列。

75.用于测序核酸分子的系统，其包含：

(a) 包含单个传感器的阵列的芯片，其中所述阵列的单个传感器包含邻近于其中具有纳米孔的膜设置的电极，其中将所述电极耦合至电路，所述电路适配成生成电信号以帮助在通过或邻近于所述纳米孔的所述核酸分子或其部分的流上检测所述核酸分子或其部分；和

(b) 耦合至所述芯片的处理器，其中所述处理器编程以帮助以至少约97％的精确度基于从所述多个离散位点接收的电信号表征所述核酸分子的核酸序列。

76.权利要求75的系统，其中所述单个传感器的阵列的密度为至少约500个单个传感器/1 mm²。

77.权利要求75的系统，其中所述膜具有跨过所述膜的小于或等于约1 GΩ的电阻。

78.权利要求77的系统，其中所述电阻借助于邻近于所述膜设置的相对电极进行测量。

79.权利要求75的系统，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于或等于约500 MΩ的电阻。

80.权利要求79的系统，其中所述电阻借助于邻近于所述膜设置的相对电极进行测量。

81.权利要求75的系统，其中所述电极适配成提供跨过所述膜的电刺激，所述刺激使得在所述核酸分子或其部分的分子流上生成可检测的信号。

82.权利要求75的系统，其中所述膜具有如跨过所述膜测量的大于约5 fF/μm²的电容。

83.权利要求75的系统，其中所述计算机处理器在接近于所述芯片的工作站中。

84.权利要求75的系统，其中将所述电极耦合至集成电路，所述集成电路处理借助于所述电极检测的信号。

85.权利要求75的系统，其中所述单个传感器是独立可寻址的。

86.用于测序核酸样品的方法，其包括在通过或接近于纳米孔的所述核酸样品的流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位，并以至少约97％的精确度测序所述核酸样品。

87.用于测序核酸样品的方法，其包括在通过或接近于纳米孔的所述核酸样品的流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位，并以小于约3%的错误率测序所述核酸样品。

88.用于测序核酸样品的方法，其包括：

a) 在不使用分子马达的情况下促进通过嵌入在膜中的纳米孔的所述核酸样品的流；

b) 在通过所述纳米孔的所述核酸样品的流上检测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位；

c) 在检测所述一个或多个核酸亚单位时测序所述核酸样品。

89.用于测序核酸样品的方法，其包括：

(a) 借助于邻近于纳米孔的感测电路，在不借助于酶通过所述纳米孔的所述核酸样品或其部分的流上感测所述核酸样品的一个或多个核酸亚单位；和

(b) 在感测所述一个或多个核酸亚单位时测序所述核酸样品。

90.权利要求86-89中任一项的方法，其中以至少90%、95%、99%或99.5%的精确度测序所述核酸样品。

91.权利要求86-89中任一项的方法，其中以至少约2:1、100:1或1,000:1的信噪比检测所述一个或多个核酸亚单位。

92.权利要求86-89中任一项的方法，其中在至多约1秒、1毫秒或1微秒的时间段检测所述一个或多个核酸亚单位。

93.权利要求86-89中任一项的方法，其中所述核酸亚单位包含三个核酸碱基或更少。

94.用于核酸测序的方法，其包括：

(a) 将核酸分子锚定至其中具有纳米孔的膜；

(b) 使所述核酸分子或其部分穿过或接近于所述纳米孔；和

(c) 在步骤(b)过程中感测所述核酸分子的一个或多个单个碱基，

其中使核酸分子锚定至所述膜防止核酸分子完全穿过所述纳米孔。

95.权利要求94的方法，其进一步包括反转穿过的方向。

96.权利要求94的方法，其中所述膜进一步包含核酸结合蛋白，和(a)包括通过核酸结合蛋白锚定所述核酸分子。

97.权利要求94的方法，其中将所述核酸分子直接锚定至膜。

98.权利要求94的方法，其中将所述核酸分子锚定至纳米孔。

99.用于感测来自受试者的生物样品的系统，所述系统包含：

a) 壳体；

b) 壳体内的传感器，所述传感器具有邻近于其中具有纳米孔的膜的电路，其中所述电路适配成生成响应于流经或邻近于纳米孔的生物样品的电信号；和

c) 壳体上或壳体内的识别元件，所述识别元件具有与系统相关且适配成帮助将电信号或源自电信号的特征信息与受试者关联的独特标识符。

100.权利要求99的系统，其中所述识别元件选自电可擦除可编程只读存储器、射频识别标签、闪存、条形码和序列号。

101.权利要求99的系统，其中所述壳体具有至多27,000 cm³、10,000 cm³、5,000 cm³或500 cm³的体积。

102.权利要求99的系统，其中所述系统能够在至多10小时、1小时或10分钟内测序个体的基因组。

103.用于在表面上操纵流体的方法，其包括：

(a) 提供表面、接近于所述表面的电极阵列、和包含亲水相和疏水相的流体，其中所述疏水相邻近于所述表面；和

(b) 以空间和/或时间模式为电极通电，从而减小所述疏水相相对于接近于所述电极的所述亲水相的体积。

104.权利要求103的方法，其中(b)中为电极通电影响与所述表面接触的所述疏水相的稀释。

105.权利要求103的方法，其中所述疏水相包含脂质。

106.权利要求105的方法，其中所述脂质为DPhPC。

107.权利要求105的方法，其中所述脂质溶解于癸烷中。

108.权利要求103的方法，其中所述疏水相包含经稀释以形成表面上的双层的脂质。

109.权利要求103的方法，其中为所述电极通电从表面的边缘牵引脂质。

110.权利要求103的方法，其中为所述电极通电沿所述表面重新分布脂质。

111.权利要求103的方法，其中所述表面是疏水的、实质上平的、或疏水且实质上平的。

112.权利要求103的方法，其中所述电极是紧密间隔的、独立可控的、单独可寻址的、或其任何组合。

113.权利要求112的方法，其中以空间和/或时间模式为所述电极通电，从而使得使疏水相的波移动跨过所述表面。

114.权利要求112的方法，其中所述表面包含适合于核酸测序的纳米孔。

115.权利要求112的方法，其进一步包括借助于所述表面上或邻近于所述表面的纳米孔测序核酸分子。

116.权利要求112的方法，其中，在为所述电极通电时，将来自所述表面的边缘的脂质引导至所述表面上的选择位置，从而使得核酸分子能够在所述表面上的所述位置处被测序。

117.生物芯片，其包含设置在孔内、邻近于孔或接近于孔的膜中的纳米孔，其中所述孔包含电极，所述电极能够检测通过响应于经过、接近于或邻近于纳米孔的种类的所述纳米孔的离子流的变化，其中所述电极能够检测离子流的所述变化至少1小时，而无需重新调整膜的任一侧上的离子浓度。

118.权利要求117的生物芯片，其中所述孔具有至少0.5微米的深度。

119.权利要求117的生物芯片，其中选择所述孔的体积使得在为所述电极再充电之前孔中的离子没有完全耗尽。

120.权利要求117的生物芯片，其中所述电极在至少40 mV跨过所述膜的施加电势下具有至少15分钟的运行寿命。

121.用于形成生物芯片的方法，所述方法包括：

(a) 提供半导体衬底；

(b) 以至少500个孔/mm²的密度在所述半导体衬底中形成多个孔；

(c) 在所述多个的单个孔中形成电极，其中所述电极能够进行设置在所述半导体衬底上或邻近于所述半导体衬底的可检测种类的电测量，和其中所述电极在40 mV施加电势下具有至少15分钟的运行寿命；和

(d) 制备衬底用于形成膜，所述膜以至少约10千兆欧姆的电阻密封所述单个孔。

122.权利要求121的方法，其中所述半导体衬底包含硅。

123.权利要求121的方法，其中所述膜是脂质双层。

124.权利要求121的方法，其中所述电极能够测量通过嵌入所述膜中的纳米孔的离子电流。

125.权利要求121的方法，其中生物芯片在将所述生物芯片与具有基于氯离子的盐的最低0.2 M溶液接触2小时之后是可操作的。