ES2641871T3 - Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos - Google Patents

Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos Download PDF

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Abstract

Método para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario que comprende: (a) poner en contacto la molécula de ácido nucleico monocatenario, en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario está en una disolución de electrolito en contacto con un nanoporo en una membrana y en el que la molécula de ácido nucleico monocatenario tiene un cebador hibridado con una parte de la misma, con una ácido nucleico polimerasa y al menos cuatro análogos de polifosfato de nucleótido (NPP) marcados con etiqueta de fosfato en condiciones que permiten que la ácido nucleico polimerasa catalice la incorporación de uno de los análogos de NPP en el cebador si es complementario al residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está inmediatamente en 5' con respecto a un residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3'- terminal del cebador, para formar un producto de extensión de ácido nucleico y con la condición de que (i) el tipo de base en cada análogo de NPP es diferente del tipo de base en cada uno de los otros tres análogos de NPP, y (ii) o bien el número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada análogo de NPP es diferente del número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada uno de los otros tres análogos de NPP, o bien el número de fosfatos en la parte de polifosfato de cada uno de los cuatro análogos de NPP es el mismo y el tipo de etiqueta en cada análogo de NPP es diferente del tipo de etiqueta en cada uno de los otros tres análogos de NPP, en el que la incorporación del análogo de NPP da como resultado la liberación de un polifosfato que tiene la etiqueta unida al mismo; y (b) determinar qué análogo de NPP se ha incorporado en el cebador para formar un producto de extensión de ácido nucleico en la etapa (a) aplicando una tensión a través de la membrana y midiendo un cambio electrónico a través del nanoporo que resulta de que el polifosfato que tiene la etiqueta unida al mismo generado en la etapa (a) se transloca a través del nanoporo, en el que el cambio electrónico es diferente para cada número de fosfatos en la parte de polifosfato, o para cada tipo de etiqueta diferente, según sea apropiado, identificando de ese modo el residuo de nucleótido en el ácido nucleico monocatenario complementario al análogo de NPP incorporado; y (c) realizar de manera iterativa las etapas (a) y (b) para cada residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está secuenciándose, en el que en cada iteración de la etapa (a) se incorpora el análogo de NPP en el producto de extensión de ácido nucleico resultante de la iteración anterior de la etapa (a) si es complementario al residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario que está inmediatamente en 5' con respecto a un residuo de nucleótido de la molécula de ácido nucleico monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3'-terminal del producto de extensión de ácido nucleico, determinando así la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico monocatenario.

Description

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en la que la etiqueta es etilenglicol, un aminoácido, un hidrato de carbono, un colorante, mononucleótido, dinucleótido, trinucleótido, tetranucleótido, pentanucleótido o hexanucleótido, en la que R1 es OH, en la que R2 es H u OH, en la que X es O, NH, S o CH2, en la que Z es O, S o BH3, en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 5-metilpirimidina, y en la que n es 1, 2, 3 ó 4.
Compuesto que tiene la estructura:
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especies se identifican fácilmente.
Figura 22. (A) Separación y distribución de masas de unidades de polietilenglicol (PEG) mixtas a través de un único nanoporo; y (B) selección de 4 unidades de PEG diferenciadas con separación de línea base como etiquetas para las 4 bases, A, C, G, y T. También se muestran las estructuras de PEG lineales y ramificados.
Figura 23. Síntesis de PEG-trifosfatos cargados (la carga puede ajustarse basándose en los requisitos).
Figura 24. Síntesis de 5’-trifosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato.
Figura 25. Síntesis de 5’-tetrafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato.
Figura 26. Síntesis de 5’-pentafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal.
Figura 27. Plataforma de medición de nanoporos con CMOS integrado: (A) una microfotografía del chip preamplificador de CMOS de ocho canales con una imagen de un canal amplificador con el electrodo en el lado de cis integrado; (B) diagrama que muestra la integración de dos chips con un nanoporo en estado sólido; (C) diagrama que muestra la sección transversal del chip y cómo se graba el nanoporo directamente en el chip en la implementación de un chip; el empaquetamiento se produce con un pocillo independiente en el lado de cis; y una imagen de TEM de un nanoporo con un diámetro de 3,5 nm.
Figura 28. Rendimiento eléctrico de la electrónica de nanoporos con CMOS integrado (A) Espectro de ruido de corriente de línea base relacionado con la entrada para CF=0,15 pF, filtro de Bessel de 4 polos de 1 MHz, fs=4 MS/s. También se muestra el cabezal abierto medido de un instrumento Axopatch 200B en modo de célula completa con =1, filtro de Bessel de 4 polos de 100 kHz, fs=250 kS/s. (B) Umbral mínimo de ruido del nuevo amplificador con un nanoporo unido en comparación con el mismo nanoporo medido mediante el instrumento Axopatch 200B.
Figura 29. Anclaje de la polimerasa en las proximidades del nanoporo. Un pocillo ayuda a limitar la difusión. L indica la distancia crítica desde la abertura de poro a la que los movimientos moleculares debidos a difusión y electroforesis son iguales.
Figura 30. Síntesis de 5’-polifosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta.
Figura 31. Síntesis de PEG-nucleótidos bloqueados en 3’-O.
Figura 32. Secuenciación por síntesis con PEG-nucleótidos y detección con nanoporos (muchas copias de la misma molécula de ADN inmovilizadas sobre una perla y adición de un PEG-nucleótido cada vez). Se usa el mismo PEG unido a los cuatro nucleótidos. Se añade un PEG-nucleótido cada vez, se lee al menos una base por ciclo si se incorpora el nucleótido correcto.
Figura 33. Secuenciación por síntesis con PEG-nucleótidos bloqueados en 3’-O y detección con nanoporos (muchas copias de la misma molécula de ADN inmovilizadas sobre una perla y adición de los cuatro PEG-nucleótidos bloqueados en 3’-O). Se añaden los cuatro nucleótidos unidos a PEG de diferente tamaño, bloqueados en 3’ (dNTP-PEG bloqueados en 3’) juntos. Detección del nucleótido incorporado basándose en la señal de bloqueo de los PEG liberados. El grupo de bloqueo en 3’ se retira mediante tratamiento con TECP y se continúa el ciclo para secuenciar correctamente el molde incluyendo regiones homopoliméricas.
Figura 34. Un esquema para una matriz de micropocillos de alta densidad, en paralelo, masiva, para realizar el procedimiento bioquímico. Cada pocillo puede contener un molde de ADN diferente y dispositivo de nanoporos.
Descripción detallada de la invención
Método para determinar la secuencia de nucleótidos de un ADN monocatenario que comprende:
(a) poner en contacto el ADN monocatenario, en el que el ADN monocatenario está en una disolución de electrolito en contacto con un nanoporo en una membrana y en el que el ADN monocatenario tiene un cebador hibridado con una parte del mismo, con una ADN polimerasa y al menos cuatro análogos de polifosfato de desoxirribonucleótido (dNPP) en condiciones que permiten que la ADN polimerasa catalice la incorporación de uno de los análogos de dNPP en el cebador si es complementario al residuo de nucleótido del ADN monocatenario que está inmediatamente en 5’ con respecto a un residuo de nucleótido del ADN monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3’terminal del cebador, para formar un producto de extensión de ADN, en el que cada uno de los cuatro análogos de dNPP tiene la estructura:
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en las que la base es adenina, guanina, citosina, uracilo o timina, o derivado de cada una de las mismas, en las que Y es una etiqueta, y en las que R1 si está presente es OH, -OCH2N3 o -O-2-nitrobencilo, R2 si está presente es H, en las que X es un grupo de unión escindible, en las que Z es O, S o BH3, en las que n es 1, 2, 3 ó 4, en las que A es O, S, CH2, CHF, CFF o NH,
y si no se incorpora el análogo de dNPP, repetir de manera iterativa la puesta en contacto con un análogo de dNPP diferente hasta que se incorpora un análogo de dNPP, con la condición de que (1) el tipo de base en cada análogo de dNPP es diferente del tipo de base en cada uno de los otros análogos de dNPP, y (2) el tipo de etiqueta en cada análogo de dNPP es diferente del tipo de etiqueta en cada uno de los otros análogos de dNPP,
en el que la incorporación de un análogo de dNPP da como resultado la liberación de un polifosfato que tiene la etiqueta unida al mismo;
(b)
escindir la etiqueta del análogo de dNPP incorporado en la etapa (a); y
(c)
determinar qué análogo de dNPP se incorporó en la etapa (a) para formar un producto de extensión de ADN aplicando una tensión a través de la membrana y midiendo un cambio electrónico a través del nanoporo que resulta de que la etiqueta escindida en la etapa (b) se transloca a través del nanoporo, en el que el cambio electrónico es diferente para cada tipo de etiqueta, identificando de ese modo el residuo de nucleótido en el ADN monocatenario complementario al análogo de dNPP incorporado;
(d)
realizar de manera iterativa las etapas (a) a (c) para cada residuo de nucleótido del ADN monocatenario que está secuenciándose, en el que en cada iteración de la etapa (a) se incorpora el análogo de dNPP en el producto de extensión de ADN resultante de la iteración anterior de la etapa (a) si es complementario al residuo de nucleótido del ADN monocatenario que está inmediatamente en 5’ con respecto a un residuo de nucleótido del ADN monocatenario hibridado con el residuo de nucleótido 3’-terminal del producto de extensión de ADN,
determinando así la secuencia de nucleótidos del ADN monocatenario.
En una realización de los métodos, la etiqueta es etilenglicol, un aminoácido, un hidrato de carbono, un colorante, un mononucleótido, un dinucleótido, un trinucleótido, un tetranucleótido, un pentanucleótido o un hexanucleótido, un colorante fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un aminoácido, un péptido, un hidrato de carbono, un monofosfato de nucleótido, un difosfato de nucleótido, un ácido alifático o un ácido aromático o un alcohol o un tiol no sustituido o sustituido con uno o más halógenos, un grupo ciano, un grupo nitro, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo azido.
En una realización de los métodos la base se selecciona del grupo que consiste en adenina, guanina, citosina, timina, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina o 5-metilcitosina.
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En una realización los métodos comprenden además una etapa de lavado tras cada iteración de la etapa (b) para retirar análogos de dNPP no incorporados del contacto con el ADN monocatenario.
En una realización los métodos comprenden además una etapa de lavado tras cada iteración de la etapa (c) para retirar análogos de dNPP no incorporados del contacto con el ADN monocatenario.
5 En una realización los métodos comprenden además que el ADN monocatenario, la disolución de electrolito y el nanoporo en la membrana están ubicados dentro de un único recipiente.
En una realización de los métodos en la que R1 es -O-CH2N3, los métodos comprenden opcionalmente además tratar el análogo de dNPP incorporado para retirar el -CH2N3 y dar como resultado un grupo OH unido a la posición 3’ permitiendo así la incorporación de un análogo de dNPP adicional.
10 En una realización de los métodos en la que R1 es -O-2-nitrobencilo, los métodos comprenden opcionalmente además tratar el análogo de nucleótido incorporado para retirar el -2-nitrobencilo y dar como resultado un grupo OH unido a la posición 3’ permitiendo así la incorporación de un análogo de dNPP adicional.
En una realización de los métodos los análogos de dNPP tienen las siguientes estructuras:
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15 en las queR1es OH, en las queR2es Hu OH, en las queZ es O, S o BH3, yen las quela base es adenina,
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proteico. En una realización de los métodos el nanoporo comprende alfa-hemolisina. En una realización de los métodos, el nanoporo es grafeno. En una realización de los métodos, el nanoporo es un nanoporo en estado sólido. En una realización de los métodos el nanoporo está en una membrana en estado sólido.
En una realización de los métodos el ADN monocatenario, el cebador o la ADN polimerasa están unidos a una superficie sólida.
En otra realización de los métodos el nanoporo es parte de una matriz de nanoporos.
Procedimiento para producir un análogo de trifosfato de nucleótido, en el que el análogo de trifosfato de nucleótido difiere de un trifosfato de nucleótido por tener una etiqueta unida al fosfato terminal del mismo, que comprende:
a) poner en contacto un trifosfato de nucleótido con diciclohexilcarbodiimida/dimetilformamida en condiciones que permiten la producción de un trimetafosfato cíclico;
b) poner en contacto el producto resultante de la etapa a) con una etiqueta que tiene un grupo hidroxilo o amino unido a la misma en condiciones que permiten la apertura nucleófila del trimetafosfato cíclico para unir la etiqueta a un fosfato terminal formando así el análogo de trifosfato de nucleótido.
Procedimiento para producir un análogo de trifosfato de nucleótido, en el que el análogo de trifosfato de nucleótido difiere de un trifosfato de nucleótido por tener una etiqueta unida al fosfato terminal del mismo, que comprende:
a) poner en contacto un trifosfato de nucleótido con diciclohexilcarbodiimida/dimetilformamida en condiciones que permiten la producción de un trimetafosfato cíclico;
b) poner en contacto el producto resultante de la etapa a) con un nucleófilo para formar un compuesto funcionalizado con -OH o -NH2;
c) hacer reaccionar el producto de la etapa b) con una etiqueta que tiene un grupo -COR unido a la misma en condiciones que permiten que la etiqueta se una indirectamente a un fosfato terminal formando así el análogo de trifosfato de nucleótido.
En una realización del presente procedimiento el nucleófilo es H2N-R-OH, H2N-R-NH2, R’S-R-OH, R’S-R-NH2, o
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En una realización el presente procedimiento comprende en la etapa b) poner en contacto el producto resultante de la etapa a) con un compuesto que tiene la estructura:
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y después NH4OH para formar un compuesto que tiene la estructura:
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y hacer reaccionar el producto de la etapa b) con una etiqueta que tiene un grupo -COR unido a la misma en condiciones que permiten que la etiqueta se una indirectamente a un fosfato terminal formando así el análogo de trifosfato de nucleótido que tiene la estructura:
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en la que R1 es OH, en la que R2 es H u OH, en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7desazapurina o una 5-metilpirimidina.
Procedimiento para producir un análogo de tetrafosfato de nucleótido, en el que el análogo de tetrafosfato de nucleótido difiere de un tetrafosfato de nucleótido por tener una etiqueta unida al fosfato terminal del mismo, que
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en las que en cada estructura n es, independientemente, 1, 2, 3 ó 4, y m es, independientemente, un número entero
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de desde 0 hasta 100, y en las que cuando m es 0 el fosfato terminal del dNTP está unido directamente al átomo de O en 3’ del nucleósido mostrado en el lado izquierdo de la estructura, en las que R1 es -OH, o -O-CH2N3, y R2 es H u OH.
En una realización m es de desde 0 hasta 50. En una realización m es de desde 0 hasta 10. En una realización R1 es -OH. En una realización R2 es -H. En una realización R2 es -OH.
Compuesto que tiene la estructura:
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en la que m un número entero de desde 0 hasta 100, y en el que el compuesto comprende un único tipo de base, y en la que la base es adenina, guanina, citosina, uracilo o timina o un derivado de cada una de las mismas. 10 En una realización m es de desde 0 hasta 50. En una realización m es de desde 0 hasta 10. En una realización el compuesto tiene la estructura:
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en la que m es un número entero de desde 0 hasta 100. Compuesto que tiene la estructura:
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en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 5-metilpirimidina. Compuesto que tiene la estructura:
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en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 5-metilpirimidina, y R es un hidrocarbilo sustituido o no sustituido, de hasta 3000 Dalton.
Compuesto que tiene la estructura:
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Compuesto que tiene la estructura:
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10 en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 5-metilpirimidina, y m es un número entero de desde 1-50.
Compuesto que tiene la estructura:
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en la que n es 1 ó 2 y la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 515 metilpirimidina.
Compuesto que tiene la estructura:
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en la que R es NH2, OH, COOH, CHO, SH o N3, y W es un número entero de desde 0 hasta 100.
Composición que comprende al menos cuatro análogos de polifosfato de desoxinucleótido (dNPP), que tienen, cada uno, una estructura seleccionada de las estructuras expuestas en las reivindicaciones 74 y 75, en la que cada uno de los cuatro análogos de dNPP comprende un tipo de base diferente del tipo de base de los otros tres análogos de dNPP.
En una realización, cada uno de los cuatro análogos de dNPP tiene una etiqueta de polietilenglicol que es diferente en cuanto al tamaño de las etiquetas de polietilenglicol de cada uno de los otros tres análogos de dNPP.
En una realización la carga neta en el polifosfato de nucleósido marcado con etiqueta es neutra. En otra realización la etiqueta liberada tiene una carga positiva.
En una realización, el método comprende además una etapa de tratamiento con fosfatasa alcalina tras la etapa b), en el que la fosfatasa alcalina hidroliza los grupos fosfato libres en el pirofosfato con etiqueta liberado.
En una realización se inmovilizan múltiples copias del ADN monocatenario sobre una perla.
Un “derivado” de adenina, guanina, citosina, timina o uracilo, incluye una 7-desaza-purina y una 5-metilpirimidina. Los ejemplos incluyen 7-desaza-adenina, 7-desaza-guanina y 5-metil-citosina.
La presente invención también proporciona un compuesto que tiene la estructura de cualquiera de los compuestos expuestos en las figuras y/o los esquemas de la presente solicitud.
La presente invención también proporciona un análogo de dNPP que comprende una etiqueta que tiene la estructura de cualquiera de las etiquetas expuestas en las figuras y/o los esquemas de la presente solicitud.
En una realización, la etiqueta es un hidrocarbilo, sustituido o no sustituido, tal como un alquilo, alquenilo, alquinilo, y que tiene una masa de 3000 Dalton o menos.
Tal como se usa en el presente documento, “alquilo” incluye grupos hidrocarbonados alifáticos saturados, tanto ramificados como de cadena lineal, que tienen el número especificado de átomos de carbono y pueden estar sustituidos o no sustituidos. Por tanto, se define que C1-Cn tal como en “alquilo C1-Cn” incluye grupos que tienen 1, 2, ...., n-1 o n carbonos en una disposición lineal o ramificada. Por ejemplo, se define que un “alquilo C1-C5” incluye grupos que tienen 1, 2, 3, 4 ó 5 carbonos en una disposición lineal o ramificada, e incluye específicamente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, y pentilo.
Tal como se usa en el presente documento, “alquenilo” se refiere a un radical hidrocarbonado no aromático, lineal o ramificado, que contiene al menos 1 doble enlace carbono-carbono, y puede estar presente hasta el número máximo posible de dobles enlaces carbono-carbono no aromáticos, y puede estar sustituido o no sustituido. Por ejemplo, “alquenilo C2-C5” significa un radical alquenilo que tiene 2, 3, 4 ó 5, átomos de carbono, y hasta 1, 2, 3 ó 4, dobles enlaces carbono-carbono, respectivamente. Los grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo y butenilo.
El término “alquinilo” se refiere a un radical hidrocarbonado lineal o ramificado, que contiene al menos 1 triple enlace carbono-carbono, y puede estar presente hasta el número máximo posible de triples enlaces carbono-carbono no aromáticos, y puede estar sustituido o no sustituido. Por tanto, “alquinilo C2-C5” significa un radical alquinilo que tiene 2 ó 3 átomos de carbono y 1 triple enlace carbono-carbono, o que tiene 4 ó 5 átomos de carbono y hasta 2 triples enlaces carbono-carbono. Los grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo y butinilo.
El término “sustituido” se refiere a un grupo funcional tal como se describió anteriormente tal como un alquilo, o un hidrocarbilo, en el que al menos un enlace con un átomo de hidrógeno contenido en el mismo se sustituye por un enlace con un átomo distinto de hidrógeno o distinto de carbono, siempre que se mantengan las valencias normales y que la(s) sustitución/sustituciones de(n) como resultado un compuesto estable. Los grupos sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces con un átomo de carbono o de hidrógeno se sustituyen por uno o más enlaces, incluyendo dobles o triples enlaces, con un heteroátomo. Los ejemplos no limitativos de sustituyentes incluyen los grupos funcionales descritos anteriormente y, por ejemplo, N, por ejemplo para formar -CN.
Se entiende que los sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos de la presente invención puede seleccionarlos un experto habitual en la técnica para proporcionar compuestos que son químicamente estables y que pueden sintetizarse fácilmente mediante técnicas conocidas en la técnica, así como los métodos expuestos a continuación, a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Si un sustituyente está en sí mismo sustituido con más de un grupo, se entiende que estos múltiples grupos pueden estar en el mismo carbono o en carbonos diferentes, siempre que se obtenga como resultado una estructura estable.
Al elegir los compuestos de la presente invención, un experto habitual en la técnica reconocerá que los diversos sustituyentes, es decir R1, R2, etc., deben elegirse de conformidad con principios bien conocidos de conectividad de estructuras químicas.
En las estructuras de compuestos representadas en el presente documento, generalmente no se muestran los
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b. 5’-Tetrafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal
Para la síntesis de 5’-tetrafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal, en primer lugar se hace reaccionar el trifosfato correspondiente con CDI en DMF para activar el grupo fosfato terminal que después se hace reaccionar con ácido fosfórico o etiqueta-monofosfato para dar el tetrafosfato (figura 6). El fosfato terminal en el tetrafosfato puede activarse adicionalmente con CDI seguido por reacción con nucleófilos apropiados para proporcionar un tetrafosfato unido a grupo de unión que puede usarse adicionalmente para unir etiquetas de diferente masa, longitud o volumen, tales como m-dPEG-éster NHS, también mostrado en la figura 6.
c. 5’-Penta y hexafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal
La síntesis de 5’-penta y hexafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal sigue el mismo principio tal como se muestra en la figura 7. Pueden prepararse a partir de o bien trifosfatos o bien tetrafosfatos activados haciendo reaccionar con ácido fosfórico, pirofosfato o fosfatos unidos a etiqueta. Alternativamente, puede unirse un grupo de unión a penta o hexafosfato seguido por reacción con ésteres NHS activados.
d. Polifosfatos de nucleósidos unidos a etiqueta de oligonucleótido
Hay varios problemas con el enfoque actual a la secuenciación con nanoporos tales como el reconocimiento de las bases a medida que pasan a través del nanoporo y la velocidad o tasa de transporte para permitir registrar el reconocimiento de la nucleobase. El ADN pasa a través de un nanoporo de -hemolisina a una velocidad de 1-5 s, lo cual es demasiado rápido como para registrar para los experimentos de secuenciación de moléculas individuales. Se ha producido cierto progreso para superar estos problemas mediante una variedad de estrategias de ingeniería de proteínas incluyendo el uso de frenos moleculares (oligonucleótidos cortos unidos de manera covalente) [Bailey,
H. 2006].
Tal como se da a conocer en el presente documento, pueden unirse oligonucleótidos cortos al fosfato terminal de un polifosfato de nucleósido mediante reacción del fosfato terminal activado con el 3’-OH o el 5’-OH del oligonucleótido. Alternativamente, puede activarse el 3’-o 5’-fosfato del oligonucleótido con CDI o imidazol/DCC y hacerse reaccionar con 5’-polifosfatos de nucleósidos. En las figuras 8(a) y 8(b) se muestran estructuras de fosfatos de nucleósidos unidos a oligonucleótido (oligo-3’ a 5’-fosfato; oligo-5’ a 5’-fosfato), respectivamente. En la figura 8(c) se muestra el subproducto de reacción con polimerasa que se monitoriza mediante paso a través del nanoporo.
La velocidad de migración a través del nanoporo del subproducto de reacción con polimerasa puede controlarse uniendo oligonucleótidos de diferente longitud a diferentes 5’-polifosfatos de nucleósidos. Por ejemplo, si el nucleósido dA tiene 1 ó 2 unidades de oligo-dA unidas, dT puede tener 3 unidades de oligo-dT, dC puede tener 4 unidades de oligo-dC, y dG puede tener 5 unidades de oligo-dG. Pueden usarse diferentes combinaciones del número de oligonucleótidos para cada nucleótido para controlar el transporte y el tiempo de retención en un nanoporo.
El transporte y el tiempo de retención en un nanoporo también pueden controlarse añadiendo diferentes números de grupos fosfato a los nucleótidos. Por tanto, la carga y la masa pueden variar para cada polifosfato de nucleótido.
Ejemplos de estructura de etiqueta con grupo de unión
En la tabla 1 se proporcionan ejemplos específicos de grupos reactivos en los fosfatos terminales o el resto de base de nucleósido y grupos con los que pueden reaccionar los grupos. Los grupos reactivos con los que pueden reaccionar pueden estar presentes o bien en el grupo de unión o bien en la etiqueta.
TABLA 1
Posibles sustituyentes reactivos y grupos funcionales que reaccionan con los mismos
Grupos reactivos
Grupos funcionales
Ésteres de succinimidilo
Amino primario, amino secundario
Anhídridos, haluros de ácido
Grupos amino e hidroxilo
Carboxilo
Amino, hidroxilo, tioles
Aldehído, isotiocianato e isocianatos
Grupos amino
Vinilsulfona y diclorotriazina
Grupos amino
Haloacetamidas
Tioles, imidazoles
Maleimidas
Tioles, hidroxilo, amino
Tioles
Tioles, maleimida, haloacetamida
Fosforamiditos, P. activado
Grupos hidroxilo, amino, tiol
Azido
Alquino
En el presente documento se incluyen etiquetas que pueden detectarse por el nanoporo, pero no se limitan de ningún modo a estos grupos de compuestos. Un experto en la técnica puede cambiar el/los grupo(s) funcional(es) para obtener una etiqueta adecuada.
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Las etiquetas incluyen compuestos alifáticos, aromáticos, arilo, heteroarilo con uno o más anillos de 4-8 miembros y pueden estar opcionalmente sustituidos con halo, hidroxilo, amino, nitro, alcoxilo, ciano, alquilo, arilo, heteroarilo, ácido, aldehído, azido, alquenilo, alquinilo u otros grupos. Estos incluyen polietilenglicoles (PEG), hidratos de carbono, aminoácidos, péptidos, colorantes fluorescentes, fluorogénicos (no fluorescentes pero que se vuelven fluorescentes tras la eliminación de un grupo protector), cromogénicos (incoloros pero que se vuelven de color tras la eliminación de un grupo protector), compuestos quimioluminiscentes, nucleósidos, mono, di o polifosfatos de nucleósidos, oligonucleótidos, arilo, heteroarilo o compuestos alifáticos. En la figura 16 se facilitan algunos ejemplos.
En la figura 17 se muestra a modo de ejemplo la estructura de nucleótidos marcados con etiqueta de PEG-fosfato y algunos ejemplos de posibles PEG con diferentes grupos reactivos para reaccionar con grupos funcionales.
En el presente documento se proporcionan algunos otros ejemplos de los colorantes o compuestos que pueden usarse para unirse al fosfato terminal o al resto de base de los nucleótidos. Estos no son de ningún modo los únicos compuestos que pueden usarse. Se indican en el presente documento como ejemplos y un experto en la técnica puede obtener fácilmente una etiqueta con grupo de unión adecuada que puede unirse al nucleótido y detectarse mediante un nanoporo.
Otros ejemplos de etiquetas adecuadas son:
Colorantes fluorescentes: colorantes de xantina, colorantes de bodipy, colorantes de cianina.
Compuestos quimioluminiscentes: compuestos de 1,2-dioxetano (Tropix Inc., Bedford, MA).
Aminoácidos y péptidos: aminoácidos que se producen de manera natural o modificados y polímeros de los mismos.
Hidratos de carbono: glucosa, fructosa, galactosa, manosa, etc.
NMP y NDP: monofosfatos de nucleósidos, difosfatos de nucleósidos. Ácidos alifáticos o aromáticos, alcoholes, tioles, sustituidos con halógenos, ciano, nitro, alquilo, alquenilo, alquinilo, azido u otros grupos de este tipo.
2) 5’-trifosfatos de nucleósidos con base modificada
Se sintetiza una variedad de terminadores reversibles de nucleótidos (NRT) para la secuenciación por síntesis (SBS) de ADN en los que un grupo de unión escindible une un colorante fluorescente a la base de nucleótido y el 3’-OH del nucleótido se bloquea con un grupo de terminación reversible pequeño [Ju et al. 2006, Guo et al. 2008 & 2010]. Usando estos NRT, la síntesis de ADN se detiene de manera reversible en cada posición. Tras registrar la señal fluorescente a partir de la base incorporada, se retiran los restos escindibles de los nucleótidos incorporados y se repite el ciclo.
También puede usarse el mismo tipo de nucleótidos para la secuenciación de ADN con nanoporos. Tal como se muestra en la figura 9(A), pueden sintetizarse un pequeño grupo de bloqueo en 3’-OH y una etiqueta unida a la base unida a través de un grupo de unión escindible. Tras la reacción de extensión con polimerasa, se escinden tanto el grupo de bloqueo en 3’-O como la etiqueta de la base y puede usarse la etiqueta liberada para pasar a través del nanoporo y monitorizarse la señal de bloqueo. Pueden usarse cuatro etiquetas diferentes (por ejemplo polietilenglicoles (PEG) de diferente longitud y peso molecular, tal como se muestra en la figura 9(A)), uno para cada una de las cuatro bases, diferenciando así las señales de bloqueo.
Alternativamente, no se usa el grupo de bloqueo en 3’-O porque se ha mostrado que un grupo o base de nucleótido voluminoso puede prevenir que la ADN polimerasa añada más de un nucleótido cada vez [Harris et al. 2008]. Tal como se muestra en la figura 9(B), se introduce un dNMP voluminoso a través de un grupo de unión escindible. Por tanto, se introducen diferentes dNMP a través de un grupo de unión según el dNTP original. Por ejemplo, con el nucleótido dTTP, se introduce un dTMP (para dATP, se introduce un dAMP; para dGTP, un dGMP y para dCTP, un dCMP). Tras la incorporación con polimerasa y escisión con TCEP, se generan dNMP modificados que se hacen pasar a través del canal de nanoporo y se detectan mediante métodos apropiados.
3) 5’-Trifosfatos de nucleósidos modificados en 2’-o 3’-OH
Puede llevarse a cabo la síntesis de los cuatro 5’-trifosfatos de nucleósidos modificados en 3’ [Guo et al. 2008, Li et al. 2003, Seo et al. 2004]. Los dNTP unidos a 3’-O-2-nitrobencilo y 3’-O-azidometilo (figuras 10A y 10B, respectivamente) son buenos sustratos para ADN polimerasas. Tras la incorporación mediante ADN/ARN polimerasa en una reacción de secuenciación, estos nucleótidos marcados con etiqueta en 3’-O terminan la síntesis tras una extensión de una única base debido al grupo de bloqueo en 3’-OH. Una extensión adicional sólo es posible tras la escisión del grupo de bloqueo a partir de la posición 3’-O. El grupo 3’-O-2-nitrobencilo puede escindirse de manera eficaz mediante luz UV y 2’-O-azidometilo mediante tratamiento con TCEP para generar el grupo OH libre para una extensión adicional. Se monitoriza el producto escindido de la reacción (figuras 10C o 10D) para determinar el bloqueo electrónico mediante paso a través del nanoporo y registro de la señal. Se sintetizan cuatro dNTP protegidos con nitrobencilo sustituidos diferentes y cuatro dNTP sustituidos con azidometilo diferentes, uno para cada una de las cuatro bases de ADN.
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nanoporos en estado sólido sintéticos fabricados en nitruro de silicio, óxido de silicio u óxidos de metales [Storm et al. 2005; Wanunu et al. 2008] o un híbrido entre poro en estado sólido y -hemolisina [Hall et al. 2010].
La figura 18 muestra un esquema de matriz de nanoporos para secuenciación por síntesis de ADN en paralelo masiva. Los nanoporos pueden detectar cada subproducto de adición de nucleótido catalizado por ADN/ARN polimerasa (etiqueta unida al fosfato o la base y/o 2’,3’-OH del resto de azúcar) a medida que pasa a través del nanoporo. Las propiedades eléctricas de diferentes etiquetas distinguirán las bases basándose en su propiedad de bloqueo en los nanoporos. La matriz de nanoporos mostrada en la figura 18 pueden leer, cada uno, la misma secuencia o secuencias diferentes. Aumentar el número de veces que se lee cada secuencia dará como resultado una mejor calidad de los datos de secuencia resultantes.
EJEMPLO 2
I. Síntesis de desoxiguanosina 5’-tetrafosfatos marcados con PEG (dG4P-PEG):
Se sintetizan desoxiguanosina 5’-tetrafosfatos marcados con PEG (dG4P-PEG) según la figura 19. En primer lugar, 2’-desoxiguanosina trifosfato (dGTP) reacciona con CDI en DMF para activar el grupo fosfato terminal que después se hace reaccionar con fosfato de dibutilamonio para dar el tetrafosfato. Se activa adicionalmente el fosfato terminal en este tetrafosfato con EDAC en tampón de imidazol 0,1 M seguido por reacción con diaminoheptano para proporcionar un tetrafosfato unido a amino que se hace reaccionar adicionalmente con mPEG-ésteres NHS para proporcionar los cuatro PEG-dG4P requeridos. Tras la incorporación con polimerasa, la carga neta en el PEG liberado es de -3 (PEG-NH-trifosfato).
II.
Pruebas de nucleótidos modificados en reacciones de extensión de bases individuales.
Se caracterizan los dG4P-PEG mediante espectroscopía de masas de MALDI-TOF tal como se muestra en la tabla
II.
Tabla II. Resultados de MS de MALDI-TOF para dG4P-PEG
P.M. calculado
P.M. medido
dG4P-PEG24
1798 1798
dG4P-PEG37
2371 2374
Los dG4P-PEG son sustratos excelentes para ADN polimerasa en la extensión de cebador. En la figura 20 se muestran los espectros de masas de MALDI-TOF de los productos de extensión de ADN.
EJEMPLO 3 – Detección de moléculas individuales mediante nanoporo de los PEG usados para marcar los nucleótidos
Polietilenglicol es un polímero no electrolito que se une débilmente a cationes (por ejemplo, se une a iones K+ con una Kd ∼2 M). Por tanto, la carga neta en el polímero depende de la concentración de catión móvil y de la presencia de otros restos que se unen químicamente al mismo. Se ha demostrado que un único nanoporo de -hemolisina puede distinguir fácilmente entre polímeros de PEG de diferentes tamaños con una resolución mejor que monomérica, es decir, mejor que 44 g/mol [Reiner et al. 2010; Robertson et al. 2007]. Ese nivel de distinción se vuelve posible porque el polímero reduce la conductancia del poro debido a la exclusión de volumen (la conductancia de poro disminuye al aumentar el tamaño de polímero) y mediante la unión a cationes móviles que de lo contrario fluirían libremente a través del poro [Reiner et al. 2010]. Además, el tiempo de residencia del polímero en el poro es altamente sensible a la carga del polímero, que para PEG aumenta a escala en proporción a la longitud del polímero. Un nanoporo debe poder distinguir entre PEG de diferentes tamaños que están químicamente unidos a otros restos. Se someten a prueba en nanoporo PEG (PEG 16, 24, 37 y 49) para marcar nucleótidos y generan firmas de bloqueo electrónico diferenciadas a nivel de moléculas individuales tal como se muestra en la figura 21.
Para investigar el efecto de la voluminosidad de los polifosfatos marcados con diversas etiquetas sobre señales de bloqueo electrónico generadas en el nanoporo, se sintetizan diversos nucleótidos unidos a fosfato con etiquetas de polietilenglicol (PEG) de diferente tamaño unidas al fosfato terminal del nucleótido. En primer lugar, tal como se muestra en la figura 4, se sintetiza una serie de 5’-tri, tetra y penta-fosfatos de nucleósidos con el fosfato terminal unido a través de un grupo de unión al que pueden unirse diferentes etiquetas, por ejemplo PEG u otras moléculas de diferente longitud y masa para aumentar el tamaño molecular o modificar la carga del polifosfato liberado. Después se someten a prueba estos nucleótidos en reacciones con polimerasa acopladas con detección mediante nanoporo para ver qué etiquetas o grupos voluminosos unidos al fosfato terminal producen diferencias más drásticas en señales de bloqueo electrónico entre diferentes bases.
I. Examen y selección de 4 etiquetas de PEG con señales de bloqueo de nanoporos diferenciadas
Recientemente se ha mostrado que cuando una molécula de polietilenglicol (PEG) entra en un único poro de hemolisina, provoca estados de conductancia dependientes de la masa diferenciados con tiempos de residencia medios característicos [Robertson et al. 2007]. La figura 22A muestra que el espectro de masas basado en conductancia resuelve claramente las unidades de repetición de etilenglicol, y el tiempo de residencia aumenta con
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la masa de PEG.
I.a Pruebas de PEG para determinar firmas de bloqueo de nanoporos.
Se seleccionan PEG de diferente longitud y peso molecular (disponibles comercialmente de Quanta Biodesign Ltd u otros proveedores) y se monitorizan las señales de bloqueo de nanoporos, tal como se describe en el ejemplo 2. Tal como se muestra en la figura 22A, se distinguen claramente PEG de 28-48 unidades de etilenglicol mediante nanoporo. Por tanto, se seleccionan PEG con un amplio intervalo de unidades de etilenglicol que presentan señales de bloqueo de nanoporos muy diferenciadas como etiquetas para marcar los nucleótidos A, C, G y T. En la figura 22B se muestran ejemplos. También se evalúan PEG ramificados como etiquetas ya que pueden modificarse con cargas positivas de una manera más directa. En la parte inferior de la figura 22 se muestran estructuras de algunos PEG lineales y ramificados.
I.b Diseño y síntesis de PEG marcados con fosfato seleccionados en I.a
En la secuenciación con nanoporos, las señales de bloqueo de corriente en el nanoporo se generan mediante los PEG-fosfatos liberados durante la reacción con polimerasa. Por tanto, se diseñan y sintetizan PEG marcados con fosfato con grupos de unión con carga positiva, y se someten a prueba estas moléculas con nanoporos orgánicos (por ejemplo, -hemolisina) y sintéticos (fase sólida) para evaluar sus señales de bloqueo de corriente. Se convierten los PEG seleccionados en sus trifosfatos tal como se muestra en la figura 23. Por ejemplo, puede convertirse amino-butanol protegido con Fmoc en el trifosfato correspondiente haciéndolo reaccionar en primer lugar con oxicloruro de fósforo seguido por reacción con pirofosfato de tributilamonio en una reacción en una sola etapa. Tras la purificación, se activa el trifosfato con DCC/DMF o CDI/DMF para proporcionar trifosfato activado que reacciona con el grupo OH de los PEG para generar PEG-trifosfatos. El mismo esquema puede aplicarse para PEG tanto lineales como también ramificados. Estos PEG-fosfatos se someten a prueba en nanoporos para optimizar las condiciones para generar señales de bloqueo de corriente diferenciadas.
Se sintetizan los grupos de unión de poliaminoácido (polilisina, poliarginina, polilisina interrumpida) mediante estrategias de síntesis peptídica convencionales; si se incorpora una unión éster en la cadena de polifosfato, debe poder usarse fosfatasa alcalina para escindirlo, dando como resultado etiquetas más fuertemente positivas para el análisis con nanoporos. También pueden incorporarse cargas positivas en las cadenas de PEG.
I.c Diseño y síntesis de una biblioteca de 5’-trifosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal.
Se diseñan y se sintetizan 5’-tri, tetra y penta-fosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal. Estas moléculas se someten a prueba en la reacción con polimerasa y se seleccionan las óptimas para la detección con nanoporos. Se ha mostrado que ADN polimerasas aceptan 5’-tri, tetra, y penta-fosfatos de nucleósidos marcados con fosfato terminal con una variedad de etiquetas, incluyendo polilisinas pequeñas o grandes, aminoácidos, una variedad de colorantes con carga negativa o positiva, tales como colorantes de transferencia de energía, y unidades de etilenglicol, como sustratos excelentes para la extensión de cebador [Kumar et al. 2006 y 2008; Sood et al. 2005; y Eid et al. 2009].
I.c.1 Diseño y síntesis de 5’-trifosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal.
Tal como se muestra en la figura 24, se sintetizan 5’-trifosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal haciendo reaccionar el dNTP correspondiente con DCC/DMF para proporcionar un trimetafosfato cíclico que puede abrirse con nucleófilos para generar un 5’-trifosfato de nucleósido unido a etiqueta o grupo de unión. Además, el grupo de unión unido al fosfato puede hacerse reaccionar con PEG-ésteres NHS para proporcionar 5’-trifosfatos de nucleósidos unidos a PEG alternativos. El 5’-trifosfato de nucleósido marcado con etiqueta de fosfato terminal resultante se usa en la reacción de extensión de molde-cebador y se detecta el pirofosfato unido a etiqueta liberado y se diferencia mediante sus parámetros de bloqueo de corriente de nanoporo específicos.
I.c.2 Diseño y síntesis de 5’-tetrafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal.
Para la síntesis de 5’-tetrafosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal, en primer lugar se hace reaccionar el trifosfato correspondiente con CDI en DMF para activar el grupo fosfato terminal que después se hace reaccionar con ácido fosfórico o etiqueta-monofosfato para dar el tetrafosfato tal como se muestra en la figura
25. El fosfato terminal en el tetrafosfato puede activarse adicionalmente con EDAC en tampón de imidazol 0,1 M seguido por reacción con un nucleófilo apropiado para proporcionar un tetrafosfato unido a grupo de unión que puede usarse para unirse a etiquetas de diferente masa, longitud o carga, tales como m-PEG-ésteres NHS. En este caso, se usan cuatro trimetil-lisinas para neutralizar la carga de cuatro fosfatos. Tras la incorporación con polimerasa, la carga neta en el PEG liberado es de +1 o, si se trata con fosfatasa alcalina, de +4, lo cual puede detectarse por el nanoporo.
I.c.3 Diseño y síntesis de 5’-penta-fosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal.
La síntesis de 5’-penta-fosfatos de nucleósidos marcados con etiqueta de fosfato terminal sigue el mismo principio tal como se muestra en la figura 26. Pueden prepararse a partir de o bien trifosfatos o bien tetrafosfatos activados
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para capturar bases en el orden correcto.
Un valor aproximado para el coeficiente de difusión de moléculas de PEG de 25 unidades en agua es de D=3e-10 m2/s [Shimada et al. 2005], que es del mismo orden de magnitud que un fragmento de ADNmc de longitud similar [Nkodo et al. 2001]. Suponiendo la validez de la relación de Nernst-Einstein (aunque esto no siempre es válido para polímeros), la movilidad puede estimarse como función de la constante de difusión y la carga neta (imagen54Q),
Entonces, para estas estimaciones, con I=5 nA en KCl 1 M, véase la siguiente tabla.
+1e
+4e
50% de captura
2,1 nm 5,8 nm
90% de captura
0,7 nm 1,9 nm
tcaptura
7,1 ns 114 ns
EJEMPLO 5 – Fabricación de una matriz de nanoporos en estado sólido
Además de un rendimiento mejorado, sólo con la electrónica integrada es posible producir matrices de nanoporos paralelos de manera masiva. Esto implica la topología de un chip mostrada en la figura 27C en la que se integran nanoporos directamente en el dado de CMOS con sistemas fluídicos a ambos lados del chip. En la figura 27C también se muestra el enfoque para integrar múltiples poros. En este caso, se usan pocillos de resina fotosensible SU-8 para aislar nanoporos individuales unos de otros. Esto es un enfoque similar al de Rothberg et al. 2011. Sin embargo, en Rothberg et al. los pocillos todavía pueden permanecer “conectados” por el depósito de disolución por encima del chip. En el presente caso, dado que se necesita aislamiento eléctrico entre los depósitos en cis, se usa una tapa de PDMS para sellar los pocillos para la medición tras la introducción de reactivos tal como se muestra en la figura 27C. Se integran 64 nanoporos en estado sólido en el mismo dado de 5 mm por 5 mm. El diseño de amplificador que integra corriente, que tendría que duplicarse en cada sitio de poro, sólo mide 250 um por 150 um, pero tiene que dejarse espacio adicional para la fabricación del propio poro. A medida que se desarrollan adicionalmente técnicas de fabricación para reducir el área de chip, esto puede ajustarse fácilmente a escala a una matriz de 16 por 16 electrodos.
EJEMPLO 6 – Pirosecuenciación usando nucleótido marcado con etiqueta de fosfato y detección con nanoporos
La pirosecuenciación es un método de secuenciación por síntesis (SBS) que se basa en la detección de pirofosfato que se libera cuando se incorpora un nucleótido en la cadena de ADN en crecimiento en la reacción con polimerasa [Ronaghi et al. 1998]. En este enfoque, a cada uno de los cuatro dNTP se le añade de manera secuencial un cóctel de enzimas, sustratos, y los componentes habituales de reacción con polimerasa. Si el nucleótido añadido es complementario a la primera base disponible en el molde, se incorporará el nucleótido y se liberará un pirofosfato. A través de una cascada enzimática, el pirofosfato liberado se convierte en ATP, y después pasa a ser una señal de luz visible mediante luciferasa de las luciérnagas. Por otro lado, si el nucleótido añadido no se incorpora, no se producirá luz y el nucleótido simplemente se degradará por la enzima apirasa. La pirosecuenciación se ha aplicado satisfactoriamente a la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y secuenciación de ADN. Se desarrolló una plataforma de secuenciación comercial combinando pirosecuenciación y amplificación de molde de ADN en microperlas individuales para la secuenciación de ADN de alto rendimiento [Margulies et al. 2005]. Sin embargo, hay dificultades inherentes en la pirosecuenciación para determinar el número de nucleótidos incorporados en regiones homopoliméricas (por ejemplo, un tramo de varias T seguidas) del molde. Además de esto, hay otros aspectos de pirosecuenciación que todavía necesitan mejorarse. Por ejemplo, cada uno de los cuatro nucleótidos tiene que añadirse y detectarse por separado. La acumulación de nucleótidos no degradados y otros componentes también pueden reducir la precisión del método cuando se secuencia un molde de ADN largo.
Esto es un enfoque de pirosecuenciación modificado que se basa en la detección de etiqueta o fosfatos con etiqueta liberados durante la reacción con polimerasa. En este enfoque se usan nucleótidos marcados con etiqueta de fosfato en reacción catalizada con polimerasa en un complejo de molde-cebador. Tras la incorporación de los nucleótidos marcados con etiqueta, se libera el resto de etiqueta de fosfato, que puede detectarse mediante paso a través de un nanoporo. Puede usarse la misma etiqueta en cada nucleótido o puede usarse una etiqueta de peso molecular y longitud diferentes (tal como PEG). Se ha mostrado que polietilenglicoles (PEG) de diferente longitud y masa pueden resolverse a una sensibilidad de moléculas individuales cuando pasan a través de un nanoporo de hemolisina [Robertson et al. 2009].
Puede usarse un canal de -hemolisina para detectar ácidos nucleicos a nivel de moléculas individuales [Kasianowicz et al. 1996]. El polipéptido monomérico se autoensambla para dar una bicapa lipídica para formar un poro heptamérico, con una abertura limitante de 1,5 nm de diámetro. En una disolución acuosa de sal iónica, el poro formado por el canal de -hemolisina transporta una corriente iónica intensa y estable cuando se aplica una tensión apropiada a través de la membrana. La abertura limitante del nanoporo permite que moléculas de ácido nucleico (diámetro ∼2,0 nm) monocatenarias lineales, pero no bicatenarias, pasen a través. Los ácidos nucleicos polianiónicos se impulsan a través del poro mediante el campo eléctrico aplicado, que bloquea o reduce la corriente iónica. Este paso genera una firma electrónica única. Por tanto, se obtendrá un diagrama de acontecimientos
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Claims (2)

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    en la que la etiqueta es polietilenglicol, un aminoácido, un hidrato de carbono, un mononucleótido, dinucleótido, trinucleótido, tetranucleótido, pentanucleótido o hexanucleótido, en la que R1 es OH, en la que R2es Hu OH, en la que X es O, NH, S oCH2, en la que Z es O, S o BH3, en la que la base es adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, una 7-desazapurina o una 5-metilpirimidina, y en la que n es 1, 2, 3, 4 ó 5;
    en el que si la etiqueta es polietilenglicol, la etiqueta tiene la siguiente estructura:
    imagen9
    en la que W es un número entero de entre 0 y 100, o la etiqueta tiene la siguiente estructura:
    imagen10
    en la que R es NH2, OH, COOH, CHO, SH o N3, y W es un número entero de desde 0 hasta 100, y en el que el compuesto no es:
    imagen11
    en el que ETIQUETA2 es polietilenglicol, un aminoácido, un hidrato de carbono, un mononucleótido, dinucleótido, trinucleótido, tetranucleótido, pentanucleótido o hexanucleótido, en el que R1 es OH, en el que R2 es H u OH, en el que X es O, NH, S oCH2, en el que Z es O, S o BH3, yen el que n es 1, 2, 3, 4 ó 5.
  2. 13. Compuesto que tiene la estructura:
    67
    imagen12
    imagen13
    imagen14
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Families Citing this family (161)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001296645A1 (en) 2000-10-06 2002-04-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
EP3363809B1 (en) 2002-08-23 2020-04-08 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US9169510B2 (en) 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
US8796432B2 (en) 2005-10-31 2014-08-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-DNTP-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
WO2007053702A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of four color 3'-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
WO2007146158A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by nanopore using modified nucleotides
GB2457402B (en) 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
EP2209911B1 (en) * 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
US20110014611A1 (en) 2007-10-19 2011-01-20 Jingyue Ju Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequences by synthesis
WO2010004265A1 (en) 2008-07-07 2010-01-14 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme-pore constructs
CN102369298B (zh) 2009-01-30 2017-03-22 牛津纳米孔技术有限公司 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
US9017937B1 (en) 2009-04-10 2015-04-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using ratiometric impedance
US9194838B2 (en) 2010-03-03 2015-11-24 Osaka University Method and device for identifying nucleotide, and method and device for determining nucleotide sequence of polynucleotide
US8652779B2 (en) 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
JP6016792B2 (ja) 2010-07-14 2016-10-26 ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミズーリ ナノポア促進型の核酸の単分子検出
ES2641871T3 (es) 2010-12-17 2017-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos
US9121059B2 (en) 2010-12-22 2015-09-01 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based single molecule characterization
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
IN2014DN00221A (es) 2011-07-25 2015-06-05 Oxford Nanopore Tech Ltd
US20130040827A1 (en) * 2011-08-14 2013-02-14 Stephen C. Macevicz Method and compositions for detecting and sequencing nucleic acids
JP6333179B2 (ja) 2012-01-20 2018-05-30 ジニア テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノポアベースの分子検出および配列決定
EP2836604B1 (en) * 2012-04-09 2021-09-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
US9494554B2 (en) 2012-06-15 2016-11-15 Genia Technologies, Inc. Chip set-up and high-accuracy nucleic acid sequencing
EP2864502B1 (en) * 2012-06-20 2019-10-23 The Trustees of Columbia University in the City of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
EP2875154B1 (en) 2012-07-19 2017-08-23 Oxford Nanopore Technologies Limited SSB method for characterising a nucleic acid
EP3511424B1 (en) 2012-08-03 2023-10-18 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Compositions and methods for improving nanopore sequencing
US9605309B2 (en) 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
EP2958927A4 (en) * 2013-02-20 2016-09-14 Eve Biomedical Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING BASED ON NANOSTRUCTURE
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP2964779B1 (en) 2013-03-08 2018-08-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Use of spacer elements in a nucleic acid to control movement of a helicase
DK2970356T3 (en) 2013-03-15 2018-08-27 Illumina Cambridge Ltd Modified nucleosides or nucleotides
AU2014227754B2 (en) * 2013-03-15 2018-03-01 The Curators Of The University Of Missouri Encoded nanopore sensor for multiplex nucleic acids detection
EP2971051A4 (en) * 2013-03-15 2017-03-01 The Trustees of Columbia University in the City of New York Method for detecting multiple predetermined compounds in a sample
WO2014144883A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
CN105992634B (zh) 2013-08-30 2019-06-14 华盛顿大学商业中心 选择性修饰聚合物亚单位以改进基于纳米孔的分析
EP3047282B1 (en) 2013-09-18 2019-05-15 Quantum Biosystems Inc. Biomolecule sequencing devices, systems and methods
JP2015077652A (ja) 2013-10-16 2015-04-23 クオンタムバイオシステムズ株式会社 ナノギャップ電極およびその製造方法
CN109797199A (zh) 2013-10-23 2019-05-24 吉尼亚科技公司 使用纳米孔的高速分子感测
US9567630B2 (en) 2013-10-23 2017-02-14 Genia Technologies, Inc. Methods for forming lipid bilayers on biochips
EP3074551B1 (en) * 2013-11-25 2023-11-22 Northeastern University Freestanding ultra thin membranes and transfer-free fabrication thereof
US10047392B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 Northeastern University Fluorescence-based analysis of biopolymers using nanopores
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
WO2015148402A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York Chemical methods for producing tagged nucleotides
US10438811B1 (en) 2014-04-15 2019-10-08 Quantum Biosystems Inc. Methods for forming nano-gap electrodes for use in nanosensors
WO2015170782A1 (en) 2014-05-08 2015-11-12 Osaka University Devices, systems and methods for linearization of polymers
EP3146075B1 (en) * 2014-05-19 2019-07-17 The Trustees of Columbia University in the City of New York Ion sensor dna and rna sequencing by synthesis using nucleotide reversible terminators
DK3152320T3 (da) * 2014-06-03 2021-01-11 Illumina Inc Sammensætninger, systemer og fremgangsmåder til at detektere begivenheder med anvendelse af tethere, der er forankret til eller hosliggende til nanoporer
ES2912963T3 (es) * 2014-07-31 2022-05-30 Illumina Inc Sensores híbridos de nanoporo
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2016065248A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (scs) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
US10060903B2 (en) * 2014-11-05 2018-08-28 Genia Technologies, Inc. Exporting measurements of nanopore arrays
CA2974456A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Polymerase variants
WO2016154215A1 (en) * 2015-03-23 2016-09-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Polymer tagged nucleotides for single molecule electronic snp assay
CN104844674B (zh) * 2015-04-30 2019-11-12 赛纳生物科技(北京)有限公司 新型聚合酶底物：荧光可产生多聚磷酸末端标记核苷酸及其应用
CN104910229B (zh) * 2015-04-30 2019-11-12 赛纳生物科技(北京)有限公司 多聚磷酸末端荧光标记核苷酸及其应用
US10526588B2 (en) 2015-05-14 2020-01-07 Roche Sequencing Solutions, Inc. Polymerase variants and uses thereof
MX2017015517A (es) * 2015-06-03 2018-11-09 Illumina Inc Composiciones, sistemas y metodos para secuenciar polinucleotidos usando amarres anclados a polimerasas adyacentes a nanoporos.
WO2016206593A1 (zh) * 2015-06-23 2016-12-29 深圳华大基因研究院 微孔电极及分析化学物质的方法
CN105001292A (zh) * 2015-07-14 2015-10-28 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 一种光可断裂的荧光标记可逆终端化合物及其在dna或rna测序中的用途
EP3329007B1 (en) * 2015-07-30 2021-02-24 Illumina, Inc. Orthogonal deblocking of nucleotides
EP4303314A3 (en) 2015-09-10 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Polypeptide tagged nucleotides and use thereof in nucleic acid sequencing by nanopore detection
WO2017050723A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 Genia Technologies, Inc. Pol7 polymerase variants
JP6956709B2 (ja) 2015-09-22 2021-11-02 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｏｍｐｇバリアント
EP3766987B1 (en) 2015-09-24 2023-08-02 F. Hoffmann-La Roche AG Alpha-hemolysin variants
CN114989235A (zh) 2015-09-28 2022-09-02 哥伦比亚大学董事会 用作dna合成测序的可逆终止物的基于新的二硫键接头的核苷酸的设计与合成
US20180327828A1 (en) * 2015-11-18 2018-11-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Ion sensor dna and rna sequencing by synthesis using nucleotide reversible terminators
WO2017132567A1 (en) 2016-01-28 2017-08-03 Roswell Biotechnologies, Inc. Massively parallel dna sequencing apparatus
JP7280590B2 (ja) 2016-01-28 2023-05-24 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 大スケールの分子電子工学センサアレイを使用する被分析物を測定するための方法および装置
JP6854532B2 (ja) 2016-02-09 2021-04-07 ロズウェル バイオテクノロジーズ，インコーポレイテッド 電子的、標識フリーのｄｎａおよびゲノムシークエンシング
WO2017148860A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Genia Technologies, Inc. Polymerase-template complexes for nanopore sequencing
EP3423575B1 (en) 2016-02-29 2021-06-16 Genia Technologies, Inc. Exonuclease deficient polymerases
EP3423576B1 (en) 2016-02-29 2021-05-12 Genia Technologies, Inc. Polymerase variants
US10590480B2 (en) 2016-02-29 2020-03-17 Roche Sequencing Solutions, Inc. Polymerase variants
US10640822B2 (en) 2016-02-29 2020-05-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer
CN109069662B (zh) 2016-03-24 2022-02-11 吉尼亚科技公司 可用于纳米孔系统的位点特异性生物缀合方法和组合物
EP3436602A1 (en) 2016-03-31 2019-02-06 Genia Technologies, Inc. Nanopore protein conjugates and uses thereof
CN109562142B (zh) * 2016-04-04 2022-09-13 纽约哥伦比亚大学董事会 使用核苷酸类似物和拉曼检测的dna合成测序
CN109562376B (zh) * 2016-04-04 2022-03-08 纽约哥伦比亚大学董事会 一种基于荧光能量转移的单分子/集群dna合成测序
WO2017180309A1 (en) * 2016-04-12 2017-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct activity assays and compositions for nucleotide pool sanitizing enzymes
EP3445775A1 (en) 2016-04-21 2019-02-27 H. Hoffnabb-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants and uses thereof
ES2877193T3 (es) * 2016-04-27 2021-11-16 Quantum Biosystems Inc Sistemas y métodos para la medición y secuenciación de biomoléculas
WO2017205336A1 (en) 2016-05-23 2017-11-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleotide derivatives and methods of use thereof
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2017202917A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Tagged multi-nucleotides useful for nucleic acid sequencing
EP3478706B1 (en) 2016-06-30 2022-02-09 F. Hoffmann-La Roche AG Long lifetime alpha-hemolysin nanopores
EP3491150A4 (en) * 2016-08-01 2020-03-11 Roswell Biotechnologies, Inc MODIFIED NUCLEOTIDE TRIPHOSPHATES FOR MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS
US9816988B1 (en) * 2016-08-10 2017-11-14 Multerra Bio, Inc. Apparatuses and methods for detecting molecules and binding energy
US10444179B2 (en) 2016-08-10 2019-10-15 Multerra Bio, Inc. Apparatuses and methods for detecting molecules and binding energy
US10669580B2 (en) 2016-08-26 2020-06-02 Roche Sequencing Solutions, Inc. Tagged nucleotides useful for nanopore detection
WO2018054970A2 (en) 2016-09-22 2018-03-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Pol6 polymerase variants
WO2018069484A2 (en) 2016-10-13 2018-04-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Molecular detection and counting using nanopores
TWI658139B (zh) * 2016-11-01 2019-05-01 體學生物科技股份有限公司 用以提升核苷酸類似物併入之重組dna聚合酶
EP3568407A4 (en) 2017-01-10 2020-12-23 Roswell Biotechnologies, Inc DNA DATA STORAGE METHODS AND SYSTEMS
WO2018136148A1 (en) 2017-01-19 2018-07-26 Roswell Biotechnologies, Inc. Solid state sequencing devices comprising two dimensional layer materials
US11591647B2 (en) 2017-03-06 2023-02-28 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid sequencing-by-synthesis (SBS) methods that combine SBS cycle steps
EP3609897A1 (en) 2017-04-12 2020-02-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag A method for labeling of aldehyde containing target molecules
US10508296B2 (en) 2017-04-25 2019-12-17 Roswell Biotechnologies, Inc. Enzymatic circuits for molecular sensors
KR20200002897A (ko) 2017-04-25 2020-01-08 로스웰 바이오테크놀로지스 인코포레이티드 분자 센서들을 위한 효소 회로들
EP4023764A3 (en) 2017-05-09 2022-09-21 Roswell Biotechnologies, Inc. Binding probe circuits for molecular sensors
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
WO2019046589A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Roswell Biotechnologies, Inc. PROCESSIVE ENZYME MOLECULAR ELECTRONIC SENSORS FOR STORING DNA DATA
CN111373051A (zh) 2017-10-10 2020-07-03 罗斯威尔生命技术公司 用于无扩增dna数据存储的方法、装置和系统
WO2019071474A1 (zh) * 2017-10-11 2019-04-18 深圳华大智造科技有限公司 修饰的核苷或核苷酸
TWI827559B (zh) * 2017-10-30 2024-01-01 美商艾瑞迪亞公司 用於寫入、讀出以及控制儲存在聚合物中之數據之系統及方法
JP6868541B2 (ja) * 2017-12-05 2021-05-12 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
CN111094316A (zh) * 2017-12-28 2020-05-01 深圳华大智造科技有限公司 核苷酸衍生物及其应用
WO2019166457A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Tagged nucleoside compounds useful for nanopore detection
WO2019166458A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Alpha-hemolysin variants and uses thereof
US20210139976A1 (en) * 2018-03-15 2021-05-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Nucleotide analogues and use thereof for nucleic acid sequencing and analysis
DE102018207098A1 (de) * 2018-05-08 2019-11-14 Robert Bosch Gmbh Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Nanostruktur-Sequenzierung von Nukleotidsträngen
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2019228995A1 (en) 2018-05-28 2019-12-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Enzymatic enrichment of dna-pore-polymerase complexes
US11332787B2 (en) 2018-06-29 2022-05-17 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for delivery of molecules and complexes to reaction sites
EP3815092A2 (en) 2018-06-29 2021-05-05 F. Hoffmann-La Roche AG Detection of microsatellite instability
WO2020043653A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Ruthenium-containing electrodes
CN109232693A (zh) * 2018-09-28 2019-01-18 上海交通大学 一种核苷四磷酸的合成方法
EP3870593A4 (en) * 2018-10-25 2022-11-16 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEOTIDE ANALOGUES
US11493499B1 (en) 2018-10-30 2022-11-08 Seagate Technology Llc Event timing detection for DNA sequencing
WO2020113581A1 (zh) * 2018-12-07 2020-06-11 深圳华大生命科学研究院 纳米孔测序方法
AU2019403077B2 (en) 2018-12-19 2022-09-29 F. Hoffmann-La Roche Ag 3' protected nucleotides
US10822653B1 (en) 2019-01-08 2020-11-03 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleotide cleavable linkers and uses thereof
JP2022521730A (ja) 2019-02-19 2022-04-12 ウルティマ・ゲノミクス・インコーポレーテッド 光検出および配列決定のためのリンカーおよび方法
EP3940073A4 (en) * 2019-03-13 2023-03-01 Toyobo Co., Ltd. PRODUCTION AND AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
US11655465B1 (en) 2019-05-02 2023-05-23 Iridia, Inc. Enzymes and systems for synthesizing DNA
EP4004237A1 (en) 2019-07-22 2022-06-01 F. Hoffmann-La Roche AG Systems and methods for cell of origin determination from variant calling data
EP4003382A4 (en) * 2019-07-31 2023-10-11 Axbio Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR EVALUATION OF A TARGET MOLECULE
EP4031679A1 (en) 2019-09-20 2022-07-27 F. Hoffmann-La Roche AG Immune repertoire profiling by primer extension target enrichment
US20220392572A1 (en) 2019-11-21 2022-12-08 Roche Sequencing Solutions, Inc. Systems and methods for contamination detection in next generation sequencing samples
JP2023513128A (ja) 2020-02-06 2023-03-30 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー ナノポアへの鋳型の貫通を低減する組成物
US11807851B1 (en) 2020-02-18 2023-11-07 Ultima Genomics, Inc. Modified polynucleotides and uses thereof
US11174281B1 (en) 2020-04-24 2021-11-16 Singular Genomics Systems, Inc. Modified nucleotides and uses thereof
WO2021239834A1 (en) 2020-05-28 2021-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Sequence alignment systems and methods to identify short motifs in high-error single-molecule reads
WO2022002251A1 (zh) * 2020-07-02 2022-01-06 深圳今是科技有限公司 核酸测序方法及装置
US20230249178A1 (en) 2020-07-08 2023-08-10 Roche Sequencing Solutions, Inc. Split-pool synthesis apparatus and methods of performing split-pool synthesis
US11837302B1 (en) 2020-08-07 2023-12-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels
US20240150824A1 (en) 2020-08-11 2024-05-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Nucleoside-5'-oligophosphates tagged with postiviely-charged polymers, nanopores incorporating negative charges, and methods and systems using the same
US20240058753A1 (en) 2020-10-15 2024-02-22 Roche Sequencing Solutions, Inc. Electrophoretic devices and methods for next-generation sequencing library preparation
US20220177950A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Whole transcriptome analysis in single cells
JP2024506899A (ja) 2021-02-09 2024-02-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 核酸中のメチル化の塩基レベル検出のための方法
CN117062902A (zh) 2021-03-03 2023-11-14 豪夫迈·罗氏有限公司 用于从生物学样品中电泳提取核酸的装置和方法
EP4308723A1 (en) 2021-03-15 2024-01-24 F. Hoffmann-La Roche AG Targeted next-generation sequencing via anchored primer extension
US20220308001A1 (en) * 2021-03-25 2022-09-29 The Regents Of The University Of California Apparatus and method for single cell discrimination
CN117098854A (zh) 2021-03-26 2023-11-21 豪夫迈·罗氏有限公司 杂交缓冲液配制品
EP4314337A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 F. Hoffmann-La Roche AG Immune cell counting of sars-cov-2 patients based on immune repertoire sequencing
CN117730155A (zh) 2021-05-24 2024-03-19 豪夫迈·罗氏有限公司 用于核酸杂交的增强子寡核苷酸
EP4355912A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Engineered nanopore with a negatively charged polymer threaded through the channel
EP4355757A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Nucleoside-5 -oligophosphates having a cationically-modified nucleobase
WO2022271852A1 (en) * 2021-06-22 2022-12-29 University Of Washington Ultrathin free-standing solid state membrane chips and methods of making
WO2023107899A2 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Caribou Biosciences, Inc. A method of capturing crispr endonuclease cleavage products
WO2023191858A2 (en) * 2021-12-08 2023-10-05 Twist Bioscience Corporation Nanoelectric devices and use thereof
WO2023107673A2 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Singular Genomics Systems, Inc. Cleavable disulfide linkers and uses thereof
WO2023213766A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods that reduce prussian blue formation during nanopore sequencing
WO2023242075A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of epigenetic cytosine modification
WO2024003332A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins
WO2024038069A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of epigenetic modifications
WO2024046992A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Improvements to next-generation target enrichment performance

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69305160T2 (de) 1992-04-22 1997-04-30 Ecole Polytech Lipidmembranen fur biosensoranwendungen
GB9315847D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
US20120160687A1 (en) 1995-03-17 2012-06-28 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5804386A (en) 1997-01-15 1998-09-08 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Sets of labeled energy transfer fluorescent primers and their use in multi component analysis
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
US5876936A (en) 1997-01-15 1999-03-02 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators
US6485703B1 (en) 1998-07-31 2002-11-26 The Texas A&M University System Compositions and methods for analyte detection
US6267872B1 (en) 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US6399335B1 (en) 1999-11-16 2002-06-04 Advanced Research And Technology Institute, Inc. γ-phosphoester nucleoside triphosphates
US6383749B2 (en) 1999-12-02 2002-05-07 Clontech Laboratories, Inc. Methods of labeling nucleic acids for use in array based hybridization assays
EP1255772A2 (en) 2000-02-11 2002-11-13 The Texas A & M University System Biosensor compositions and methods of use
US6616895B2 (en) 2000-03-23 2003-09-09 Advanced Research Corporation Solid state membrane channel device for the measurement and characterization of atomic and molecular sized samples
US6413792B1 (en) 2000-04-24 2002-07-02 Eagle Research Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
CA2412567A1 (en) 2000-06-07 2001-12-13 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
US7238795B2 (en) 2000-08-03 2007-07-03 Roche Molecular Systems, Inc. Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses
US20060057565A1 (en) 2000-09-11 2006-03-16 Jingyue Ju Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
WO2002022883A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
US6627748B1 (en) 2000-09-11 2003-09-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and their applications for multiplex genetic analyses
AU2001296645A1 (en) 2000-10-06 2002-04-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
WO2002031183A1 (en) * 2000-10-10 2002-04-18 Bioforce Nanosciences, Inc. Nanoscale sensor
EP1354064A2 (en) * 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20030027140A1 (en) 2001-03-30 2003-02-06 Jingyue Ju High-fidelity DNA sequencing using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
CA2457513C (en) * 2001-08-29 2013-07-23 Amersham Biosciences Corp Labeled nucleoside polyphosphates
US7223541B2 (en) * 2001-08-29 2007-05-29 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
WO2003064621A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
WO2003101386A2 (en) 2002-05-30 2003-12-11 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Kinase suppressor of ras inactivation for therapy of ras mediated tumorigenesis
US7074597B2 (en) 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
AU2003297859A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
WO2004071155A2 (en) 2003-02-05 2004-08-26 Amersham Biosciences Corp Solid phase sequencing
US7393640B2 (en) * 2003-02-05 2008-07-01 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Terminal-phosphate-labeled nucleotides with new linkers
WO2004092331A2 (en) 2003-04-08 2004-10-28 Li-Cor, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
US7019346B2 (en) 2003-12-23 2006-03-28 Intel Corporation Capacitor having an anodic metal oxide substrate
EP1730307A4 (en) 2004-03-03 2008-11-05 Univ Columbia PHOTOSPACTABLE FLUORESCENZ NUCLEOTIDES FOR DNA SEQUENCING ON A MEASUREMENT BASED BY STATION-SPECIFIC COUPLING SCHEME CONSTRUCTED CHIP
US7279337B2 (en) 2004-03-10 2007-10-09 Agilent Technologies, Inc. Method and apparatus for sequencing polymers through tunneling conductance variation detection
WO2006028508A2 (en) 2004-03-23 2006-03-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7622934B2 (en) 2004-07-23 2009-11-24 Electronic Bio Sciences, Llc Method and apparatus for sensing a time varying current passing through an ion channel
CA2577079C (en) 2004-08-13 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College An ultra high-throughput opti-nanopore dna readout platform
EP1794237A2 (en) * 2004-09-30 2007-06-13 GE Healthcare UK Limited Fluorescent nucleotide analogues
US20060105461A1 (en) 2004-10-22 2006-05-18 May Tom-Moy Nanopore analysis system
EP1842061A4 (en) 2004-12-21 2009-05-13 Texas A & M Univ Sys HIGH-TEMPERATURE ION CHANNELS AND ION PORES
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
US9169510B2 (en) 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
WO2007041621A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xingsheng Sean Ling Hybridization assisted nanopore sequencing
US7397232B2 (en) 2005-10-21 2008-07-08 The University Of Akron Coulter counter having a plurality of channels
WO2007053702A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of four color 3'-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
US8796432B2 (en) 2005-10-31 2014-08-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-DNTP-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
US8936926B2 (en) 2005-12-22 2015-01-20 Pacific Biosciences Of California Active surface coupled polymerases
US20070298511A1 (en) 2006-04-27 2007-12-27 The Texas A&M University System Nanopore sensor system
US7777505B2 (en) 2006-05-05 2010-08-17 University Of Utah Research Foundation Nanopore platforms for ion channel recordings and single molecule detection and analysis
WO2007146158A1 (en) 2006-06-07 2007-12-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by nanopore using modified nucleotides
GB2457402B (en) 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8003319B2 (en) 2007-02-02 2011-08-23 International Business Machines Corporation Systems and methods for controlling position of charged polymer inside nanopore
EP2122344B8 (en) 2007-02-20 2019-08-21 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor system
WO2008103848A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Invitrogen Corporation Materials and methods for single molecule nucleic acid sequencing
AU2008236694B2 (en) 2007-04-04 2014-01-23 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
WO2009020682A2 (en) 2007-05-08 2009-02-12 The Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
US20090073293A1 (en) 2007-06-27 2009-03-19 Yoel Yaffe CMOS image sensors with increased dynamic range and methods of operating the same
EP2165353B1 (en) * 2007-06-29 2017-08-30 Applied Biosystems, LLC Systems and methods for electronic detection with nanofets
GB0713143D0 (en) 2007-07-06 2007-08-15 Ucl Business Plc Nucleic acid detection method
EP2201136B1 (en) 2007-10-01 2017-12-06 Nabsys 2.0 LLC Nanopore sequencing by hybridization of probes to form ternary complexes and variable range alignment
EP2205765B1 (en) 2007-10-02 2012-09-12 President and Fellows of Harvard College Capture, recapture, and trapping of molecules with a nanopore
US20110014611A1 (en) 2007-10-19 2011-01-20 Jingyue Ju Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequences by synthesis
EP2209911B1 (en) * 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
ATE530497T1 (de) 2008-03-31 2011-11-15 Sony Deutschland Gmbh Verfahren zur herstellung einer membran mit konischer pore
US8133672B2 (en) 2008-03-31 2012-03-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
CN102124018A (zh) 2008-04-29 2011-07-13 生命科技公司 可维持从核苷酸模板酶促合成双链核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法
US8940142B2 (en) 2008-05-05 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Functionalized nanopipette biosensor
AU2009257369B2 (en) * 2008-06-11 2015-03-26 Agilent Technologies, Inc. Nucleotides and nucleosides and methods for their use in DNA sequencing
US8921046B2 (en) 2008-09-19 2014-12-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequence analysis
US20100227414A1 (en) 2009-03-05 2010-09-09 Trex Enterprises Corp. Affinity capture mass spectroscopy with a porous silicon biosensor
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
WO2011038241A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
AU2010301128B2 (en) 2009-09-30 2014-09-18 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
US20110287414A1 (en) 2010-02-08 2011-11-24 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for identifying a portion of a molecule
US20110192723A1 (en) 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore
US8324914B2 (en) 2010-02-08 2012-12-04 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for characterizing a molecule
US9605307B2 (en) 2010-02-08 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
CA2788331C (en) 2010-02-08 2018-04-03 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in nanopore
US20120052188A1 (en) 2010-02-08 2012-03-01 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for assembling a lipid bilayer on a substantially planar solid surface
EP2539465B1 (en) 2010-02-23 2024-03-06 University Of Washington Analyte sequencing with nanopores
US8652779B2 (en) * 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
JP6016792B2 (ja) 2010-07-14 2016-10-26 ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミズーリ ナノポア促進型の核酸の単分子検出
ES2641871T3 (es) 2010-12-17 2017-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Secuenciación de ADN mediante síntesis usando nucleótidos modificados y detección con nanoporos
US9121059B2 (en) 2010-12-22 2015-09-01 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based single molecule characterization
US8962242B2 (en) 2011-01-24 2015-02-24 Genia Technologies, Inc. System for detecting electrical properties of a molecular complex
US9110478B2 (en) 2011-01-27 2015-08-18 Genia Technologies, Inc. Temperature regulation of measurement arrays
WO2012109574A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Nabsys, Inc. Assay methods using dna binding proteins
US9624539B2 (en) 2011-05-23 2017-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using Raman and infrared spectroscopy detection
CN104011866B (zh) 2011-07-27 2017-06-09 伊利诺伊大学评议会 用于生物分子表征的纳米孔传感器
US8541849B2 (en) 2012-02-14 2013-09-24 Genia Technologies, Inc. Noise shielding techniques for ultra low current measurements in biochemical applications
WO2013123450A1 (en) 2012-02-16 2013-08-22 Genia Technologies, Inc Methods for creating bilayers for use with nanopore sensors
EP2836604B1 (en) 2012-04-09 2021-09-15 The Trustees of Columbia University in the City of New York Method of preparation of nanopore and uses thereof
US9494554B2 (en) 2012-06-15 2016-11-15 Genia Technologies, Inc. Chip set-up and high-accuracy nucleic acid sequencing
EP2864502B1 (en) 2012-06-20 2019-10-23 The Trustees of Columbia University in the City of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
US9605309B2 (en) 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
EP2971051A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 The Trustees of Columbia University in the City of New York Method for detecting multiple predetermined compounds in a sample
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
WO2015123430A2 (en) 2014-02-12 2015-08-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Single molecule electronic multiplex snp assay and pcr analysis
WO2015148402A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York Chemical methods for producing tagged nucleotides
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