[相關申請案之交互參照] 本申請案主張2016年11月1日提出之美國臨時案第62/415,686號申請案，在此將其全文引入。 除非另有明確說明，本揭示與本文所用詞彙定義如下。當可理解，上文的一般性說明與下文的實施方式都僅是為了舉例與說明，而不應用以限制請求保護的標的。於本申請案中，除非另有明確說明，否則所用的單數名詞涵蓋其複數型。 於本申請案中，「或」一詞的用法涵蓋「及/或」，除非另有說明。更有甚者，「包括」一詞及該詞的其他型式，如「包括(includes)」以及「包括(included)」並無限制。 在此處，除非上下文另有明顯說明，單數型式的「一(a)、(an)」以及「該」等冠詞涵蓋其複數型。 在此處，「併入(incorporation)」一詞係指藉由與經修飾核苷酸的5′磷酸基團形成磷酸二酯鍵鍵結，將該經修飾核苷酸加入到第二個核苷酸的自由3′羥基。與該經修飾核苷酸接合的所述第二個核苷酸通常發生在一聚核苷酸鏈的3′端。 在此處，「經修飾核苷酸(modified nucleotides)」與「核苷酸類似物(nucleotide analogues)」在本揭示的文本中，係指其3′糖羥基經過修飾的核苷酸，而使得取代基大小大於天然存在的3′羥基。「經修飾核苷酸」與「核苷酸類似物」等詞可交替使用。 在此處，「持續合成能力(processivity)」係指可對聚合基質作用之酵素的特質。持續合成能力的程度係指該酵素每次與一模板結合時，可加入的平均核苷酸數目。一般的DNA聚合酶約花費1秒以定位且結合至一引子與模板接點。一旦結合之後，非持續合成之DNA聚合酶加入核苷酸的速率為每秒一個核苷酸。 在此處，該「突變(mutation)」一詞係指一多肽，相較於其天然對應物，有所改變。基於說明的目的，在此處，一突變聚合酶多肽係指源自一天然聚合酶，並在實驗室內經過人工突變或人為改變的聚合酶多肽。此處涵蓋任何突變，包括置換、插入及/或刪除一或多個核苷酸/胺基酸殘基、非天然排列(如，與外源多肽/胜肽融合)以及上述任何可能性的組合。當涵蓋多個突變時，這些突變可以是連續的殘基及/或非連續的殘基。 在本揭示某些實施方式中，所述DNA定序系統可以下步驟進行：1) 在每一DNA複製步驟中，利用一DNA聚合酶將一螢光核苷酸類似物加入至該新生引子；2) 由於3′-端螢光接合物使得DNA複製暫時中止，上述3′-端螢光接合物實例為核苷酸類似物或二核苷酸；3) 利用3′-端接合物發出的螢光信號，紀錄所加入核苷酸的種類；4) 利用DNA聚合酶的外切酶或酯酶活性移除3′-端螢光部分；以及5)回復3′-端羥基，且最後加入的核苷酸可供用於下一回合的核苷酸加入。 當將此種核苷酸類似物用於一種改良後的DNA定序系統時，於基質在一DNA聚合酶的活性位置和模板形成鹼基配對之後，螢光信號立刻亮起，且持續到藉由該DNA聚合酶的催化性編輯活性將染料部分由DNA聚合酶複合物切除為止。上述3′-染料基質的定序程序涉及至少兩階段酵素反應，亦即，聚合與催化編輯(或酯水解)活性，以完成每一次的核苷酸加入之循環，有效延長上述3′-染料產生之螢光訊號駐留於訊號偵測區之時間，相較於利用5′-端染料標記(5′-染料)基質的定序策略，利用上述3′-端染料-標記(3′-染料)核苷酸基質所產生的信號持續時間較長，因此更為精確。 本揭示的重組DNA聚合酶於併入一種經修飾核苷酸類似物或多種不同之經修飾核苷酸類似物時，展現了較佳的效率及/或觀測併入率。舉例來說，本揭示的重組DNA聚合酶能夠併入一系列經修飾核苷酸，這些經修飾核苷酸帶有相同的3′取代基但其核苷酸分子的某些其他部分可能不同，如其鹼基部分或是否帶有可偵測標記。其他聚合酶能夠併入帶有不同3′取代基的多種經修飾核苷酸。 於第一態樣中，本揭示提供一種組合物，其包含一重組DNA聚合酶以及3’-酯化核苷酸類似物，其中該重組DNA聚合酶包含一胺基酸序列，其與9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)有至少90%的相似度，且該重組DNA聚合酶包含在對應於該9°N DNA聚合酶胺基酸殘基141與143位置的至少二個突變。 在某些實施例中，本揭示的組合物還包含一引子與dNTP(s)。 在本揭示某些實施例中，位於該9°N DNA聚合酶胺基酸殘基141的突變為D (天冬胺酸) 141A (丙胺酸)。在某些實施例中，位於該9°N DNA聚合酶胺基酸殘基143的突變為E (麩胺酸) 143A。在某些實施例中，該9°N DNA聚合酶包含SEQ ID NO: 1所示的一胺基酸序列。 在本揭示某些實施例中，該重組DNA聚合酶係選自由以下所組成的群組：9°N-I DNA聚合酶(SEQ ID NO: 2)、9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO: 3)、KOD
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DNA聚合酶(SEQ ID NO: 5)、9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)及其突變株、KOD1 DNA聚合酶(SEQ ID NO: 4)及其突變株，及上述的組合。在本揭示某些實施例中，本揭示是關於一種熱穩定酵素，此酵素為源自
Thermococcus sp .
9°N-7品系的DNA聚合酶。所述的9°N-7是一種具有3'-5'核酸外切酶活性的DNA聚合酶，以SDS-PAGE分析顯示其分子量約為90-95 kDa。在某些實施例中，於分離步驟之後，將經過放射活性物質標記之去氧核苷酸併入活化DNA中，以測定聚合酶活性。 在某些實施例中，一9°N-I DNA聚合酶包含SEQ ID NO: 2所示的一胺基酸序列，且該9°N-I DNA聚合酶(SEQ ID NO: 2)與該9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)有99%的序列相似度。在某些實施例中，該9°N-I DNA聚合酶包含三個突變位置，分別位於胺基酸殘基141、143與485。在某些實施例中，位於胺基酸殘基141的突變為D141A。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基143的突變為E143A。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基485的突變為A485L。在某些實施例中，可基於胺基酸序列比對及/或分子建模方式，得知所述序列相似度。可利用本領域已知的標準比對工具，如BLAST等來進行序列比對。 在某些實施例中，一9°N-III DNA聚合酶包含SEQ ID NO: 3所示的一胺基酸序列，且該9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO: 3)與該9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)有99%的序列相似度。在某些實施例中，該9°N-III DNA聚合酶包含六個突變位置，分別是胺基酸殘基141、143、408、409、410與485。在某些實施例中，位於胺基酸殘基141的突變為D141A。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基143的突變為E143A。在某些實施例中，位於胺基酸殘基408的突變為L (白胺酸) 408S (絲胺酸)。在某些實施例中，位於胺基酸殘基409的突變為Y (酪胺酸) 409A。在某些實施例中，位於胺基酸殘基410的突變為P (脯胺酸) 410V (纈胺酸)。在某些實施例中，位於胺基酸殘基485的突變為A485L。 在某些實施例中，一KOD
exo-
DNA聚合酶亦包含位於胺基酸殘基141與143的突變。在某些實施例中，該KOD
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DNA聚合酶包含SEQ ID NO: 5所示的一胺基酸序列，且該KOD
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DNA聚合酶(SEQ ID NO: 5)與該9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)有90%的序列相似度。 在本揭示某些實施例中，除了位於胺基酸殘基141與143的突變之外，本揭示的重組DNA聚合酶還包含位於該9°N DNA聚合酶胺基酸殘基480或486位置的至少一突變。在某些實施例中，相較於在聚合酶胺基酸殘基480或486包含一個突變的重組DNA聚合酶，位於該胺基酸殘基480與486的雙重突變使得該重組DNA聚合酶具備較高的併入活性。在某些實施例中，位於胺基酸殘基480的突變為D480A、D480C (半胱胺酸)、D480F (苯丙胺酸)、D480G (甘胺酸)、D480H (組胺酸)、D480I (異白胺酸)、D480M (甲硫胺酸)、D480N (天冬醯胺酸)、D480P、D480Q (麩醯胺酸)、D480R (精胺酸)或D480S。在某些實施例中，位於胺基酸殘基486的突變為I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W (色胺酸)或I486Y。 在本揭示某些實施例中，除了位於胺基酸殘基141與143以及可任選的480及/或486的突變之外，本揭示的重組DNA聚合酶還包含位於胺基酸殘基282、325、408或410的至少一個突變。在某些實施例中，位於胺基酸殘基282的突變為V282F或V282G。在某些實施例中，位於胺基酸殘基325的突變為E325A、E325M或E325S。在某些實施例中，位於胺基酸殘基408的突變為S408F或S408Y。在某些實施例中，位於胺基酸殘基410 的突變為V410A、V410G、V410I或V410P。 在本揭示某些實施例中，除了位於胺基酸殘基141與143以及可任選的480、486、282、325、408與410中的一或多個突變之外，本揭示的重組DNA聚合酶還包含位於247、268、407、409、477、485、385、589、590、676與742殘基的一或多個突變。在某些實施例中，位於殘基268的突變為I268G；位於殘基407的突變為S407A；位於殘基409的突變為A409Y；位於殘基477的突變為K (離胺酸) 477F或K477Y；位於殘基485的突變為L485F；位於殘基385的突變為A385K；位於殘基589的突變為V589H；位於殘基590的突變為T (蘇胺酸) 590H；位於殘基676的突變為T676K；以及位於殘基742的突變為E742H或E742R。 可利用任一種習知的方法，製備本揭示所述的重組DNA聚合酶。在本揭示某些實施例中，可利用重組DNA技術製備本揭示的重組DNA聚合酶。在某些實施例中，重組DNA聚合酶的製造通常包括以下步驟：(1)分離DNA片段，且經分離的DNA片段編碼本揭示之DNA聚合酶的活性型式；(2)之後，以一限制剪切酵素處理該經分離的DNA片段，所獲得的片段之兩末端可供連接到原核或真核宿主/載體系統；(3)之後，將由該宿主/載體系統製得的該經分離DNA片段與一DNA接合酶混合，以產生一重組DNA；(4)將該重組DNA引入一宿主生物體；(5)可由經轉型的宿主培養物製得本揭示的活性重組DNA聚合酶，並可由宿主細胞中收穫該重組DNA聚合酶，或是當宿主細胞透過細胞膜分泌該重組DNA聚合酶時，由培養液中收穫該重組DNA聚合酶。 在本揭示某些實施例中，由於已從9°N-7基因組DNA中選殖出編碼此酵素的基因，亦可透過重組DNA技術製得本揭示的重組DNA聚合酶。在某些實施例中，編碼9°N-I DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO: 6所示。在某些實施例中，編碼9°N-III DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO: 7所示。在某些實施例中，編碼KOD
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DNA聚合酶的序列如SEQ ID NO: 8所示。 在本揭示某些實施例中，本揭示的重組DNA聚合酶能夠併入3’-酯化核苷酸類似物，其帶有透過一酯鍵而連接到3' 位置的一連接子。在本揭示某些實施例中，對於包括一嘌呤或嘧啶鹼基以及一核糖或去氧核糖之糖部分且具有一可移除的3'-OH阻斷基與其共價結合之核苷酸，本揭示的重組DNA聚合酶能夠更有效率地併入此種核苷酸。在某些實施例中，該3’-酯化核苷酸類似物為3’-酯化核苷酸、3’-酯基-染料類似物或其磷酸基接有淬滅劑的3’-酯基-染料類似物 (3’-酯基-染料/5’-Q)。在某些實施例中，該3’-酯基-染料/5’-Q 有化學式(I)所示結構:
(I), 其中m為整數且1≦m≦10，L為該連接子基團； Rm與Rm+1隨m不同而改變，且當m大於1時，Rm為一組範圍涵蓋R1至Rm的官能基，各Rm可獨立地為氫(H)或由一連接子基團Lm與一Fm組成的一官能基，而Rm+1可為氫(H)或由一連接子基團Lm+1與該Fm+1所組成的一官能基；該F、Fm或Fm+1獨立地為一螢光染料或一淬滅劑；該連接子基團Lm或Lm+1獨立地選自烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、雜環基、聚乙二醇、酯基、胺基、磺醯基或其組合； B為一鹼基，其係選自腺嘌呤、胞嘧啶、鳥糞嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黃嘌呤或5-甲基胞嘧啶； Z可獨立地選自氫、羥基、硫醇基、鹵素或胺基；以及 化學式(I)中Y為氧(O)或硫(S)。 在本揭示某些實施例中，上述作為螢光染料而連接到核苷酸3’-端的F、Fm或Fm+1，不僅可作為一信號報導物，還可作為聚合反應過程中的中止物。在某些實施例中，使用其磷酸基接有淬滅劑(3’-酯基-染料/5’-Q)以降低由位在核苷酸3’-端的標記所產生的光可偵測信號(如由該螢光染料產生的螢光信號)，此類螢光信號值為反應液之螢光背景值，降低背景值亦具有提升訊號正確率之功能。在某些實施例中，該連接子基團的長度為1-50個原子。在本揭示某些實施例中，具有化學式(I)結構之3’-酯化核苷酸類似物中的F為一光可偵測的標記，如ATTO 488、ATTO 532、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 647N、ATTO 633、STAR 488、FAM、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 568、Alexa 647、Alexa 660、Alexa 700、FRET 染料、Cy3、Cy5、HEX、TAMRA、ROX、JOE以及TET。在某些實施例中，該3’-酯化核苷酸類似物還包含一第一標記部分，其連接至該連接子；以及選擇性的一第二標記部分，其連接至該3’-酯化核苷酸類似物之5’磷酸根。在某些實施例中，相較於利用5′-端染料標記(5′-染料)基質的定序策略，利用上述3′-端染料-標記(3′-染料)核苷酸基質所產生的信號持續時間較長，因此更為精確。 在所述第一態樣的一實施例中，本揭示的組合物包含重組DNA聚合酶，其胺基酸序列與9°N DNA聚合酶(SEQ ID NO: 1)有至少90%的相似度；舉例來說，可以是9°N-I DNA聚合酶(SEQ ID NO: 2)、9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO: 3)、KOD1 DNA聚合酶(SEQ ID NO: 4)或KOD
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DNA 聚合酶(SEQ ID NO: 5)；且所述3’-酯化核苷酸類似物為例如3’-酯基-染料類似物或其磷酸基接有淬滅劑的3’-酯基-染料類似物 (3’-酯基-染料/5’-Q)。 於第二態樣中，本揭示提供一種重組DNA聚合酶，其包含一胺基酸序列，此序列與9°N-III DNA聚合酶(SEQ ID NO: 3)有至少90%的相似度，且該重組DNA聚合酶包含對應於該9°N-III DNA聚合酶胺基酸殘基480與486位置的一個或二個突變。在某些實施例中，該9°N-III DNA聚合酶包含位於該胺基酸殘基141與143的突變。在一實施例中，該9°N-III DNA聚合酶包含SEQ ID NO: 3所示的一胺基酸序列。 在某些實施例中，該重組DNA聚合酶包含位於該胺基酸殘基480與486的雙重突變，且相較於在該胺基酸殘基480或486具有單一突變的重組DNA聚合酶，在胺基酸殘基480與486帶有雙重突變的重組DNA聚合酶有較佳的併入活性。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基480的突變為D480A、D480C、D480F、D480G、D480H、D480I、D480M、D480N、D480P、D480Q、D480R或D480S。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基486的突變為I486A、I486F、I486G、I486H、I486L、I486M、I486P、I486R、I486V、I486W或I486Y。在本揭示某些實施例中，除了位於胺基酸殘基480及/或486的突變之外，本揭示的重組DNA聚合酶還包含位於胺基酸殘基282、325、408或410的至少一突變。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基282的突變為V282F或V282G。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基325的突變為E325A、E325M或E325S。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基408的突變為S408F或S408Y。在某些實施例中，位於該胺基酸殘基410的突變為V410A、V410G、V410I或V410P。 在本揭示某些實施例中，除了位於胺基酸殘基480與486以及可任選的282、325、408與410中的一或多個突變之外，本揭示的重組DNA聚合酶還包含位於殘基247、268、407、409、477、485、385、589、590、676與742的一或多個突變。在某些實施例中，位於該殘基268的突變為I268G；位於該殘基407的突變為S407A；位於該殘基409的突變為A409Y；位於該殘基477的突變為K477F或K477Y；位於該殘基485的突變為L485F；位於該殘基385的突變為A385K；位於該殘基589的突變為V589H；位於該殘基590的突變為T590H；位於該殘基676的突變為T676K；及位於該殘基742的突變為E742H或E742R。 本揭示的重組DNA聚合酶能夠提升DNA聚合酶的所欲活性，且特別是可以提升對於在3’位置帶有較大取代基團的核苷酸類似物之併入率。 可利用所述技術領域中具有通常知識者所知的任一種方法來產生一或多個突變，如：定位突變誘發(site-directed mutagenesis)，例如利用Amersham的Sculptor.TM.活體外突變誘發系統，Les Ullis，France)；PCR突變誘發；DNA洗排(DNA shuffling)；以及利用化學合成技術，例如產生一合成核酸分子。根據某些實施例，本揭示所欲涵蓋的一或多突變包含對一或多個胺基酸殘基進行一或多個刪除及/或置換，所述胺基酸殘基直接或間接地涉及一天然DNA聚合酶所展現的至少一種酵素活性。在一實施例中，所述突變可增加酵素活性，如該聚合酶活性。在本揭示的文本中，相對於該未突變部分中相對應的天然DNA聚合酶，該所製得之突變株聚合酶多肽整體保留了相當高的同一性(如，至少90%)。 在本揭示某些實施例中，本揭示的重組DNA聚合酶能夠併入3’-酯化核苷酸類似物，其帶有透過一酯鍵而連接到3'位置的一連接子。在某些實施例中，該3’-酯化核苷酸類似物為3’-酯化核苷酸或其磷酸基接有淬滅劑的3’-酯基-染料類似物(3’-酯基-染料/5’-Q)。該具有化學式(I)所示結構之3’-酯基-染料/5’-Q以及淬滅劑的實施例如本文所述。 在第三態樣中，本揭示提供一種用以進行聚合反應的方法，此方法包含以下步驟：(a)提供一組合物，其包含一核酸模板、一本揭示所述之DNA聚合酶以及選擇性地一引子；(b)使該組合物與一3’-酯化核苷酸類似物接觸，其中該3’-酯化核苷酸類似物包含透過一酯鍵而連接到3’端的一連接子；(c)允許該DNA聚合酶以一模板依賴性的型式，將該3’-酯化核苷酸類似物併入一新生股中；以及(d)允許該DNA聚合酶由該新生股移除所併入的3’-酯化核苷酸類似物之該連接子。 所述DNA聚合酶、具有化學式(I)所示結構之3’-酯基-染料/5’-Q以及淬滅劑的實施例如本文所述。 在某些實施例中，該聚合反應係用於聚合酶連鎖反應、qPCR、dPCR、q-RT-PCR、核酸合成、合成定序、焦磷酸定序、質子釋放定序、單分子即時定序(single molecule real-time sequencing, SMRT)、核酸上螢光顯影、單一核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphism, SNP)基因分型或核酸上即時螢光淬滅。 在本揭示某些實施例中，可利用包含一重組DNA聚合酶與3’-酯化核苷酸類似物之本揭示的組合物或本揭示之重組DNA，以將經修飾核苷酸類似物併入一聚核苷酸鏈中。本揭示之經修飾核苷酸類似物的3′糖羥基經過修飾，而使得取代基大小大於天然存在的3′羥基。可利用本揭示之經修飾核苷酸類似物，以偵測一DNA模板的序列。在某些實施例中，可將本揭示的重組DNA聚合酶利用於定序相關應用，且可和任何類型的陣列式定序技術合併使用，上述陣列式定序技術需要利用一DNA聚合酶，以將核苷酸併入一聚核苷酸鏈中。在某些實施例中，可將包含一重組DNA聚合酶與3’-酯化核苷酸類似物之本揭示的組合物或本揭示之重組DNA用於在任何類型之陣列上進行核酸定序，所述陣列係將核酸固定於一固態基質上。 上文說明摘要整理出數個實施例的特徵，這使得所屬技術領域中具有通常知識者夠更加理解本揭示的多種態樣。所屬技術領域中具有通常知識者可輕易地使用本揭示作為基礎，以設計或修改其他組合物，以便實現與此處揭示之實施例相同的目的及/或達到相同的優點。所屬技術領域中具有通常知識者亦可理解，這些均等的實例並未悖離本揭示的精神與範疇，且其可對本揭示進行各種改變、替換與修改，而不會悖離本揭示的精神與範疇。
實驗例
[縮寫對照] 表1 下表列出全文中所用的縮寫對照。
[化學品與酵素] 除非另有說明，此處所用的化學品皆購自Sigma-Aldrich。作為引子或模板的寡核苷酸是商業合成。本揭示所使用的核苷酸類似物皆由Personal Genomics Inc.合成。Therminator、Vent (exo-)、Bst-Lg、Bsu、Taq以及Klenow (exo-) 片段(Klenow (去除外切酶活性)片段) DNA聚合酶係購自New England Biolabs。Tfl與TthDNA聚合酶則是購自Promega。 [蛋白表現與純化] 將編碼9°N-I、9°N-III以及KOD
exo-
的質體DNA轉型至大腸桿菌（
E. coli
）BL21品系中，並培養於5 ml的即時TB培養基中以誘導表現。於14小時後收集細胞，並以玻璃珠破碎細胞。於離心後，取得澄清的裂解物。利用鎳-氮基三醋酸(nickel-nitrilotriacetic acid，簡稱Ni-NTA))樹脂分離C端帶有6個組胺酸標籤的9°N-III突變株與KOD
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突變株。利用洗提緩衝液沖提結合的蛋白。將純化的9°N-III與KOD
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突變株分裝後儲存於−80°C。 [定位與飽和突變] 利用Phusion高度忠誠度DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific)以及帶有9°N-III基因作為模板的重組表現載體pET28b (-)進行定位飽和突變實驗。於進行飽和突變時，使用經良好設計的成對互補引子對(比例1：1)。所有引子皆由Mission Biotech (臺灣)生產。以20-μL的反應體積在相同條件下進行突變反應。反應物包含1倍HF緩衝液、各種dNTP各200 μM、100 ng模板、各種混合引子各2 μM以及0.06U/μL的Phusion聚合酶。所用的溫度設定為：98°C下2分鐘，接著是35個循環的98°C 30秒、55°C 30秒以及72°C 5分鐘，且最終的培養階段為72°C下10分鐘。在擴增後，將反應混合物以DpnI (Thermo Fisher Scientific)在37°C下消化1小時，以消化掉甲基化的親代DNA。將5 μL經DpnI消化的混合物用於轉型E。coli DH5a化學勝任細胞。將細胞在冰上解凍，加入5 μL反應物後輕輕混合，接著在冰上培養30分鐘。以42ºC處理細胞60秒，使其熱休克，之後將其再度置於冰上2分鐘。接著，加入500 μL的SOC培養液，並將經轉型的細胞在37ºC下振盪培養30分鐘。進行離心使經轉型的細胞沈澱，再將其重新懸浮於150 μL的SOC培養基中。最後，將經轉型的細胞接種於含有康黴素 (Kanamycin) (50 μg/mL)的LB瓊脂盤上，並於37ºC下過夜培養。一般來說，隔天培養盤上可形成50到100個菌落。將經轉型的培養物接種於添加50 μg/mL康黴素的LB瓊脂盤上。由Mission Biotech (臺灣)進行序列分析。 [MALDI-TOF MS分析] 使用Bruker AutoFlex III smartbeam TOF/TOF200系統進行核苷酸併入(併入)後的DNA質量測量。在將引子和核苷與DNA聚合酶混合之前，先於10倍緩衝液(含100 mM Tris-HCl、100 mM KCl、20 mM MnCl
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，且pH 7.5)中加入10 μM引子使其和模板以1：1的比例預先黏合。將反應混合物加熱至95°C下1分鐘、55°C下2分鐘，接著冷卻至30°C下2分鐘。將0.4 μM的DNA聚合酶加入引子/模板複合物，並於冰上培育30分鐘。於冰上將40 μM的特定改性化合物(specific modified compound)加入到聚合酶反應物中，並在60°C下培育60分鐘。以2 μL的乙腈使反應終止。在進行質譜分析前，利用Micro Bio-SpinTM 30管柱(RNase-Free，Bio-Rad，7326251)清潔反應產物。 [結晶與結構確認] 結晶前一天，將上述經黏合DNA加入至含有9°N-I以及含CaCl
2
的緩衝液的混合物中，並於冰上培養10分鐘。最後，將3’-AL加入至混合物中，並於4°C下培養過夜。混合物的混合比例如下：[Pol]：[DNA]：[dNTP]：[Ca
2+
] = 1：1：10：20。在室溫下進行懸滴蒸氣擴散(hanging drop vapor diffusion)實驗，結晶於數週內出現。收集結晶的條件如下：混合2 μL的蛋白-DNA複合物(以10 mg/ml的量在pH 7.5下添加於50mM HEPES溶液中，溶液含150 mM KCl與2 mM DTT)以及1.5 μL的儲存溶液(含30-37.5% MPD、0-10%甘油、100 mM NaCl以及0-10 mM CaCl
2
)。在NSRRC(臺灣)進行X光繞射實驗，並利用HKL2000處理所收集到的資料，其後再以CCP4進行分子置換。之後利用Coot程式優化所建構的蛋白質模型，再以CCP4進行計算。 [螢光偏極化分析 (Fluorescence polarization assay)] 根據已建立方法進行螢光偏極化(fluorescence polarization；FP)實驗與運算(參見，Chen et al.，Genome Research，9:492–498 (1999))。在將核苷酸與DNA聚合酶混合之前，先於10倍反應緩衝液(含200 mM Tris-HCl、100 mM (NH
4
)
2
SO
4
、100 mM KCl、20 mM MnCl
2
，且pH 7.5)中，將10 μM引子與該模板以1：1的比例預先黏合。將反應混合物加熱至95°C下1分鐘、55°C下2分鐘，接著冷卻至30°C下2分鐘。將1 μM的DNA聚合酶加入引子/模板複合物，並於冰上培養30分鐘。於冰上，將0.5 μM的特定經修飾化合物加入到聚合酶反應物中，並在60°C下培養60分鐘。在進行螢光測量前，以1.4 μL的0.5M EDTA猝滅該反應以終止該反應。 [引子延伸] 表2列出用於延伸分析的所有DNA基質，這些DNA基質是由Integrated DNA Technologies所合成。以5’-6-羧基螢光素(5’-6-carboxyfluorescein；FAM)標記用於併入與持續合成能力(processivity)分析的引子以供螢光偵測。實驗流程概述如下：在將去氧核糖核苷三磷酸(dNTP)與DNA聚合酶混合之前，先於1倍ThermoPol緩衝液(含20 mM Tris-HCl、10 mM (NH
4
)
2
SO
4
、10 mM KCl、2 mM MgSO
4
、0.1% Triton X-100，且pH 7.5)中，將30 nM引子與該模板以1：6的比例預先黏合。將反應混合物加熱至85°C下5分鐘，接著以0.1°C/s的速率冷卻至25°C。將指定量的DNA聚合酶加入該引子/模板複合物，並於冰上培養30分鐘。於冰上將特定經修飾化合物加入到聚合酶反應物中，並在該等適當溫度下培養10分鐘。以1.25 μL的終止溶液(0.5 mM EDTA)猝滅該反應。在ABI 3500基因分析儀(Applied Biosystem)上利用POP-7聚合物與36公分長的毛細管柱進行毛細管電泳分析，以測定該延伸產物的螢光與大小。依循已公開的方法製備毛細管膠體電泳與樣品(參見，Nucleic Acids Res。2016。44(2):e15)。使用GeneMapper v4.0搭配特定偵測參數來分析資料，以產物形成相對於化合物濃度的線性-對數圖來呈現分析結果。對於各DNA聚合酶/經修飾核苷酸進行三重複的聚合酶終點(polymerase end point；PEP)分析，以計算平均IC50±SD。 表2 寡核苷酸基質
[前穩態動力學分析 (pre-steady state kinetic assay)] 於反應中，測定將正確鹼基併入至含25/36鹼基雙股核酸的比例。藉由混合含有酵素與DNA基質的溶液和含有Mg
2+
/dNTP的第二種溶液以起使該反應。加入0.25 M EDTA (最終濃度)、pH 8.0猝滅該反應。使用快速淬滅儀器(KinTek Instrument Corp.，State College，PA)，以將反應時間控制在20毫秒到20秒之間。 [DNA延伸的電泳分析] 將經淬滅的反應混合物樣品和等體積的電泳膠載樣緩衝液，在85°C下處理5分鐘使其變性，而後載入至16%丙烯醯胺-7 M尿素凝膠中。根據Werneburg et al。(1996)等人所述的方法，利用α-掃描器(Betagen)來定量基質與產物條帶。 [DNA持續合成能力分析] 持續合成能力分析中，使用M13mp18 DNA製備的線性單股DNA片段作為模板。使用正向引子-A與反相引子-B來擴增M13mp18 DNA (150bp)的特定區域。為了獲得單股DNA，以λ外切酶在37°C下處理PCR片段1小時。由於正向引子-A經磷酸化，以引子A新合成的該股會被消化。 [3’-酯化核苷酸的單一鹼基併入] 在本揭示中，利用MALDI-TOF質譜分析與X光結晶分析來探討3’-AL的單一鹼基併入，上述3’-AL是一種以3’-酯基-乙二醇連接子修飾的dATP。如圖1A所示，當以9°N-I DNA聚合酶和3’-AL在一模板DNA存在下，於60°C下反應60分鐘後，可觀察到引子DNA的分子質量增加，原本的引子波峰N (7473 m/z)位移到延伸產物波峰N-dAL (7989 m/z)。再者，可利用如圖1B所示的三維結構來分析單一鹼基的併入，如圖所示，3’-AL併入引子DNA時，其連接子部分仍然連接於dATP的3’-OH而未被切除。 [3’-酯化核苷酸的多鹼基併入] 在本揭示中，利用如圖2所示的MALDI-TOF質譜分析，來探討3’-酯化dNTP (3’-NL、3’-Na與5’Q-3’-Na)和天然dNTP的多鹼基併入。當以9°N DNA聚合酶和天然與經修飾核苷酸於60°C下反應60分鐘後，可觀察到引子DNA的分子質量增加。對於dNTP，以9°N-I催化所得各延伸產物的波峰如下：dATP (N-dA
4
, 8728 m/z)、dTTP (N-dT
4
, 8692 m/z)、dCTP (N-dC
2
, 8053 m/z)以及dGTP (N-dG
3
, 8460 m/z以及N-dG
4
, 8792 m/z)。對於3’-NL，以9°N-I Y409A催化所得各延伸產物的波峰如下：3’-AL (N-dAL, 7992 m/z以及N-dA-dAL, 8305 m/z)、3’-TL (N-dTL, 7980 m/z; N-dT
3
, 8387 m/z; N-dT
2
-dTL, 8589 m/z;以及N-dT
4
, 8692 m/z)、3’-CL (N-dCL, 7967 m/z以及N-dC-dCL, 8256 m/z)以及3’-GL (N-dGL, 8007 m/z以及N-dG-dGL, 8337 m/z)。對於3’-Na，以9°N-I Y409A催化所得各延伸產物的波峰如下：3’-Aa (N-dA
3
, 8414 m/z; N-dAa, 8620 m/z;以及N-dA-dAa, 8932 m/z)、3’-Ta (N-dT, 7778 m/z; N-dT
2
, 8083 m/z; N-dT
3
, 8388 m/z;以及N-dTa, 8610 m/z)、3’-Ca (N-dC, 7761 m/z; N-dC
3
, 8340 m/z; N-dCa, 8596 m/z; 以及N-dC-dCa, m/z 8885)以及3’-Ga (N-dGa, 8636 m/z以及N-dG-dGa, 8964 m/z)。對於5’Q-3’-Na，以9°N-III催化所得各延伸產物的波峰如下：5’Q-3’-Aa (N-dA, 7733 m/z)、5’Q-3’-Ta (N-dT, 7779 m/z; N-dT
3
, 8387 m/z;以及N-dT
4
, 8692 m/z)、5’Q-3’-Ca (N-dCa, 8597 m/z; N-dC-dCa, 8892 m/z;以及N-dC
2
-dCa, 9173 m/z)以及5’Q-3’-Ga (N-dG, 7803 m/z以及N-dG
2
, 8130 m/z)。 [3’-經修飾核苷酸於併入引子後的螢光偏極化(FP)測量] 進行螢光偏極化(FP)分析，以探討核苷酸與9°N DNA聚合酶的暫時結合。如圖3A所示，只有在二價離子Mn
2+
存在下，以9°N-I Y409A催化後，可觀察到併入後3’-Na之顯著FP信號。然而，如圖3B所示，利用9°N-III來併入5’Q-3’-Na時，Mn
2+
與Mg
2+
皆可調節FP信號之產生。如圖3C與圖3D所示，在3’-Na與5’Q-3’-Na中皆可得到FP信號，且其呈現時間相關性(0-6 hr)，其中FP在6小時達到最大強度。因此，這種隨著時間過去而增強的FP信號意味著成功地延伸產物以及帶有螢光基團之3’-併入中間產物的累積。 [3’-酯化核苷酸併入的聚合酶終點(PEP)分析] 利用定量PEP分析來測定3’酯化化合物3’-NL與5’Q-3’-Na的併入效率，其可用以高通量地篩選經修飾化合物。因此，計算各核苷酸的終點濃度、IC
50
值。如圖4A所示，利用8種DNA聚合酶(包括Taq、Vent、Tth、Tfl、Bst-Lg、Klenow、Bsu與THN)來估算dCTP與3’-CL，其中針對每一核苷酸進行適當濃度範圍的滴定。使用所有欲分析的聚合酶來併入這兩種化合物，其IC
50
值分別介於0.59 nM至5.16 nM (dCTP)以及276.69 nM至2087.36 nM (3’-CL)。在這八種DNA聚合酶中，發現THN和Klenow對3’-CL的併入效率較高，約為其他DNA聚合酶的5-6倍(參見表3)。 表3 由8種DNA聚合酶測定之dCTP及3’-CL的IC
50
值
如圖4B、4C、4D與4E所示，進一步利用所選DNA聚合酶(Bst-Lg、THN與Klenow)來估算dNTP與3’-NL，並使用每一核苷酸之適當濃度範圍。對於3’-NL，THN與Klenow的IC
50
值優於Bst-Lg，且對這些經修飾核苷酸的併入效率偏好大致上為3’-TL ＞ 3’-GL ＞ 3’-AL ＞ 3’-CL (參見表4)。 表4 由Bst-Lg、THN及Klenow測定之dNTP及3’-NL的IC
50
值
如圖5A、5B、5C與5D所示，利用重組9°N-III DNA聚合酶來估算dTP與5’Q-3’-Na的併入效率，其中針對每一核苷酸進行適當濃度範圍的滴定。5’Q-3’-Ca (875 nM) 的併入效率(IC
50
)大致上優於5’Q-3’-Ga (1689 nM)、5’Q-3’-Ta (12420 nM)與5’Q-3’-Aa (24140 nM)，結果顯示，相對於其天然核苷酸，這些經修飾核苷酸的併入偏倚範圍分別為202.08至1724.28 (參見表5)。 表5 由9°N-III DNA聚合酶測定dNTP及5’Q-3’-Na的IC
50
值
[9°N DNA聚合酶的前穩態動力學分析] 為了檢視9°N DNA聚合酶對3’-酯化核苷酸的單周轉(single-turnover)動力學，在30°C下進行前穩態動力學分析，以測定對dNTP、3’-NL與5’Q-3’-Na的常數
kpol
與
Kd
(參見表6)。對於3’-NL，
kpol
速率常數為10.2s
-1
(3’-AL)、14.6s
-1
(3’-TL)、0.094s
-1
(3’-CL)以及7.7s
-1
(3’-GL)，這些結果相較於其天然核苷酸對應物慢了5到13倍，除了3’-CL之外，其顯示比dCTP慢了330倍。對於5’Q-3’-Na，
kpol
速率常數為0.0209s
-1
(5’Q-3’-Aa)、0.0359s
-1
(5’Q-3’-Ta)、0.0185s
-1
(5’Q-3’-Ca)以及0.1348s
-1
(5’Q-3’-Ga)，這些結果比其3’-NL對應物慢了約5到488倍。對5’Q-3’-Na結合常數(
Kd
)與其天然核苷酸對應物相似，且比3’-NL者高了3.9到19倍；這些結果顯示，在9°N DNA聚合酶活性位置中對於其淬滅劑/螢光基團修飾有較高的結合親和力。
表
69°N DNA聚合酶與dNTP、3’NL和5’Q-3’Na核苷酸的前穩態動力學分析
k pol
: 每秒由9°N DNA聚合酶併入的核苷酸數目
K d
: 由9°N DNA聚合酶的核苷酸結合親和力 [以同型聚合模板進行併入] 為了探討3’-酯化核苷酸在同型聚合物模板股上的併入表現，以由12個胸腺嘧啶重複(即，TTTTTTTTTTTT)組成的一模板，進行3’-AL的引子延伸，此處使用Bst-Lg DNA聚合酶在不同溫度(如，30、45與60°C)下進行反應1分鐘，並以其天然核苷酸對應物作為比較(參見圖6)。對於3’-AL，延伸產物展現了時間相關性的增加，其dA重複的數目為3至6 (亦即，dA
3
於30°C、dA
5
於45°C以及dA
6
於60°C)，此一結果短於dATP的反應結果，其在所有反應條件下通常有12個以上dA重複(dA
12
)。 [3’-經修飾核苷酸的延長活性] 為了探討3’-酯化核苷酸在隨機模板股上的DNA延長表現，以9°N DNA聚合酶在不同pH條件(如，pH 7.5、8.0與8.8)下，進行3’-NL，3’-Na與5’Q-3’-Na的引子延伸(參見圖7A與圖7B)。此外，亦使用不同螢光基團透過一連接子連接到天然核苷酸的組合(亦即，3’-Na-d，總計有表7所列的24種組合)以及不同螢光基團/淬滅劑(亦即，5’Q-3’-Na,d，總計有表8所列的16種組合)的組合來進行引子延伸(參見圖7C與圖7D)。 對各別3’-酯化核苷酸的延長活性係為核苷酸-相關性(亦即，3’-NL ＞ 3’-Na ＞ 5’Q-3’-Na)以及pH-相關性(即，pH 8.8 ＞ pH8.0 ＞ pH 7.5)，且在併入3’-NL時，9°N-I展現的效能優於9°N-III (參見圖7A)；相較之下，在併入5’Q-3’-Na時，9°N-III的效能則優於9°N-I (參見圖7B)。 對於3’-Na-d，在24種組合中，至少有三種組合的延長表現較佳，例如組合3B、3C與3E (參見圖7C與表7)。 表7 用於延伸分析的3’-Na-d核苷酸組合列表
對於5’Q-3’-Na,d，某些組合的效果較佳，例如組合A1、A3、A5與C5 (參見圖7D與表8)，這代表9°N DNA聚合酶活性在天然核苷酸上會受到螢光基團選擇偏好影響。 表8 用於延伸分析的5’Q-3’-Na,d核苷酸組合列表
利用毛細管電泳分析9°N DNA聚合酶在較長DNA模板(M13噬菌體，長度為100個鹼基)上對3’-酯化核苷酸的持續合成能力。如圖8A所示，使用Bst-Lg DNA聚合酶時，對於天然與3’-NL核苷酸都可觀察到FAM-標記引子之時間相關性延長，其中模板位置介於107.15 (15分鐘內)至144.79 (60分鐘內)。在THN與Klenow中亦可觀察到類似的結果，其模板位置分別位於144.76與118。更有甚者，如圖8B所示，以DNA聚合酶Bst-Lg (144.76)、THN (144.76)與Klenow (144.67)催化3’-Na時，可觀察到完全延伸的產物。以9°N-III DNA聚合酶催化5’Q-3’-Na時，亦可觀察到類似的結果(參見圖8C)。 [篩選具有較佳併入活性的9°N-III] 為了提升9°N-III DNA聚合酶在5’Q-3’-Na上的表現，利用毛細管電泳，以所選的9°N-III 突變株進行單一鹼基併入分析。對9°N-III進行的突變主要發生在兩個區域，包括位於核苷酸結合位點的胺基酸位置(如，T267、I268、V282、E325、D404、R406、S407、S408、A409、V410、K477、D480、R484、L485、I486、K487、I488、N491、D540、T541、D542、G543、E580、G581、D598、E599、E600、K602、T604、T605、R606)以及DNA結合區(如，M244、G245、D246、R247、N269、L270、S347、S348、T349、N351、L352、E354、G382、G383、Y384、A385、G386、G387、Y388、V389、E391、P392、S492、Y494、G495、Y496、G498、A500、T514、Y538、V589、T590、K592、Y594、G607、L608、E609、W615、H663、E664、Q665、I666、T667、D672、Y673、K674、A675、T676、G677、H679、V680、V698、G708、R709、I710、G711、Y731、E734、N735、Q736、P739、A740、E742)，以上區域分別能夠直接和3’-酯化核苷酸以及DNA (黏合的模板與引子) 交互作用。 對於所選的核苷酸結合位點中的位置，使用傳統定位突變誘發，得到在9°N-III殘基的相對應19種胺基酸類型。在所有上述胺基酸中，於初步篩選階段，至少有12個所選部位在5’Q-3’-Ga上展現比9°N-III較高的併入活性，其轉換率(C.R.) ＞50%；上述位置包括I268、V282、E325、S407、S408、A409、V410、K477、D480、L485、I486與E580 (參見圖9A)。具體來說，相較於9°N-III (48%) (參見圖9B)，增加的併入產物(表示為C.R百分比)可見於V282F (66%)、V410G (69%)、V410P (78%)、K477F (82%)、D480A (81%)、D480G (80%)、D480I (82%)、D480M (80%)、D480P (82%)、D480R (83%)、L485F (74%)、I486A (82%)、I486F (81%)、I486G (83%)、I486H (82%)、I486L (81%)、I486M (82%)、I486P (100%)、I486R (87%)、I486V (80%)、I486W (81%)、I486Y (82%)。更有甚者，利用所選的9°N-III之D480與I486突變株來分析對5’Q-3’-Aa的併入，且相較9°N-III的C.R為0%下，大多數的所述突變株展現增加的併入產物(參見圖9C)。 對於所選的DNA結合區域中的位置，使用傳統定位突變誘發，得到9°N-III相對應殘基的三個胺基酸(離胺酸、精胺酸與組胺酸)。在所有上述胺基酸中，於初步篩選階段，有6個所選部位在5’Q-3’-Ga展現比9°N-III較高的併入活性，其轉換率(C.R.) ＞50%，包括R247、A385、V589、T590、T676與E742 (參見圖10A)。具體來說，相較於9°N-III (48%) (參見圖10B)，增加的併入產物(表示為C.R百分比)可見於A385K (66%)、V589H (76%)、T590H (63%)以及E742H (63%)。 亦利用毛細管電泳分析9°N-III在長度為100個鹼基的M13噬菌體模板上，對5’Q-3’-Na的持續合成能力。所選的9°N-III突變株，包括來自核苷酸結合位點(D480P、I486G、I486P與I486W)以及來自DNA結合區域(T590H與E742H)的突變，都可觀察到增加的模板位置且其VIC信號大於60(繪示代表ATTO532併入) (參見圖9D與圖10C)。 為了進一步探討能否透過所選突變株的組合而提升併入效率，製備了三種來自9°N-III核苷酸結合位點的雙重突變株(D480P/I486G、D480P/I486P以及D480P/I486W)，並進行PEP與持續合成能力分析。PEP分析顯示，對於5’Q-3’-Ca的IC
50
值為57.6 nM (D480P/I486G)、74 nM (D480P/I486P)以及341.2 nM (D480P/I486W)，對照組為875 nM (9°N-III)，這代表併入效率提升了2.5至15倍(參見圖11與表9)。 表9 由所選9°N-III DNA聚合酶雙突變株測定5’Q-3’-Ca之IC
50
值
更有甚者，利用毛細管電泳分析9°N-III雙重突變株在長度為100個鹼基的M13噬菌體模板上，對5’Q-3’-Na的持續合成能力。這三種雙重突變株皆可觀察到增加的模板位置且其VIC信號大於100(繪示代表ATTO532併入) (參見圖12)。可在KOD
exo-
與其D480和I486突變株上觀察到相似的結果，其中於篩選後，5’Q-3’-Ga的轉換率在D480H (84%)、D480N (83%)、D480W (77%)以及I486G (78%)上高於KOD
exo-
(37%)，且通常由毛細管電泳分析該持續合成能力提高至100以上。 總結來說，此處提出一種組合物，其包含A家族與B家族DNA聚合酶，以及3’-酯化核苷酸，以MALDI-TOF質譜分析與X光結晶分析，證實其展現了9°N DNA聚合酶的3’編輯活性。透過螢光偏極化與毛細管電泳分析，以依序的方式配合螢光進一步證實3’-酯化核苷酸的延長活性。再者，可透過在核苷酸結合位點與DNA結合區域中的所選突變株，提升9°N DNA聚合酶對3’-酯化核苷酸的活性。這些結果顯示，上述組合物可在有螢光偵測或不需要螢光偵測的情形下，用於DNA合成與定序。
