JP7256849B2 - 熱安定逆転写酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、空軍科学研究局により支給された政府支援助成金第FA9550-10-1-0169号及び国防総省国防高等研究事業局により支給された助成金第HR0011-12-2-0001号でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示の実施形態は、少なくとも、分子生物学、細胞生物学、生化学、研究、医薬、及び診断の分野を包含する。
逆転写酵素が分子生物学で果たす重要な役割にもかかわらず、既知の逆転写酵素には固有の制約が存在する-それらは、プルーフリーディングドメインが欠けているためにエラーを起こしやすいのである。本開示は、プルーフリーディング逆転写酵素に関し、それらのうち少なくともあるものは、好熱性または超好熱性である。特定の実施形態において、本開示は、高忠実性超好熱性古細菌ファミリーBポリメラーゼ由来の逆転写酵素の新規ファミリーの定向進化に関する。本明細書中記載される進化過程にわたり、本ポリメラーゼのテンプレート境界面は、劇的に改変されて、効率的なRNA指向性DNAポリメラーゼ活性を有する酵素の発生を可能にした。改変ポリメラーゼの実施形態は、長いRNA(例えば、>5kb)の、高温(例えば、68℃)での、単独酵素逆転写PCRを可能にする。ある実施態様において、本ポリメラーゼは、活性プルーフリーディングドメインを保持し、最も高いin vitro忠実性を記録することに成功する。動態解析は、DNAテンプレート及びRNAテンプレートの両方でほぼ等しい重合効率を実証し、親ポリメラーゼと比較して特異性において大幅な変化を示した。本ポリメラーゼはまた、現在のRNA-Seqプラットフォームに容易に導入されること、ならびにcDNA中間体なしで直接RNA配列決定を可能にすることも示した。本ポリメラーゼのこの新規ファミリーの独自の性質は、トランスクリプトミクスのより深くかつより正確な理解を可能にし、将来のバイオテクノロジー革新を推進する。
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MILDTDYITEDGKPVIRIFKKENGEFKIEYDRTFEPYLYALLKDDSAIEEVKKITAERHGTVVTVKRVEKVQKKFLGRPVEVWKLYFTHPQDVPAIMDKIREHPAVIDIYEYDIPFAIRYLIDKGLVPMEGDEELKLLAFDIETLYHEGEEFAEGPILMISYADEEGARVITWKNVDLPYVDVVSTEREMIKRFLRVVKEKDPDVLITYNGDNFDFAYLKKRCEKLGINFALGRDGSEPKIQRMGDRFAVEVKGRIHFDLYPVIRRTINLPTYTLEAVYEAVFGQPKEKVYAEEITTAWETGENLERVARYSMEDAKVTYELGKEFLPMEAQLSRLIGQSLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNELAPNKPDEKELARRHQSHEGGYIKEPERGLWENIVYLDFRSLYPSIIITHNVSPDTLNREGCKEYDVAPQVGHRFCKDFPGFIPSLLGDLLEERQKIKKRMKATIDPIERKLLDYRQRAIKILANSLYGYYGYARARWYCKECAESVIAWGREYLTMTIKEIEEKYGFKVIYSDTDGFFATIPGADAETVKKKAMEFLKYINAKLPGALELEYEGFYKRGLFVTKKKYAVIDEEGKITTRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLEALLKDGDVEKAVRIVKEVTEKLSKYEVPPEKLVIHKQITRDLKDYKATGPHVAVAKRLAARGVKIRPGTVISYIVLKGSGRIVDRAIPFDEFDPTKHKYDAEYYIEKQVLPAVERILRAFGYRKEDLRYQKTRQVGLSARLKPKGT(配列番号3)
a)R97;Y384;V389;Y493;F587;E664;G711;及びW768;
b)F38;R97;K118;R381;Y384;V389;Y493;T514;F587;E664;G711;及びW768;
c)F38;R97;K118;M137;R381;Y384;V389;K466;Y493;T514;F587;E664;G711;及びW768;または
d)F38;R97;K118;M137;R381;Y384;V389;K466;Y493;T514;I521;F587;E664;G711;N735;及びW768。
a)R97M;Y384H;V389I;Y493L;F587L;E664K;G711V;及びW768R;
b)F38L;R97M;K118I;R381H;Y384H;V389I;Y493L;T514I;F587L;E664K;G711V;及びW768R;
c)F38L;R97M;K118I;M137L;R381H;Y384H;V389I;K466R;Y493L;T514I;F587L;E664K;G711V;及びW768R;または
d)F38L;R97M;K118I;M137L;R381H;Y384H;V389I;K466R;Y493L;T514I;I521L;F587L;E664K;G711V;N735K;及びW768R。
本開示の方法は、逆転写活性及びプルーフリーディング活性を有し、少なくともいくつかの場合において、好熱性または超好熱性である酵素(例えば、組換え酵素)の作製を提供する。酵素の作製は、少なくとも逆転写活性を欠いている親ポリメラーゼの操作で生じる。この目的を達成するために様々な方法が利用可能であるものの、特定の実施形態において、本方法は、親ポリメラーゼの変異型を得るハイスループット戦略を採用し、これにより、得られる酵素に新たな特性(複数可)を導入する。特定の実施形態において、通常は逆転写酵素活性を欠いているDNAポリメラーゼから逆転写酵素活性を持つ組換え酵素への発展をもたらすために、定向進化戦略が採用される。組換え酵素と親DNAポリメラーゼの間のそのような違いは、組換え酵素が、例えば、テンプレート鎖の代替塩基または糖を認識できるようになる(例えば、チミンの代わりにウラシルを含むテンプレートを認識できるようになること、及びリボース環の2’位の変異性を許容すること)ことにより、テンプレートとしてRNAを使用する能力を発達させることを含む。
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所望の特性(複数可)を持つ酵素がいったん同定されたら、その酵素を、逆転写酵素活性を必要とするまたは必要とする可能性があるポリメラーゼ活性の様々な用途に利用することができる。場合によっては、本実施形態の酵素は、標準の逆転写酵素が採用される状況で使用され、そのような状況として、少なくとも次世代配列決定用途(数百万の配列読み取りを並行して処理する能力をもつ用途、例えば、ILLUMINA(登録商標)(Solexa)シークエンス;Roche 454シークエンス;Ion torrent:Proton/PGMシークエンス;Pacbio SMRTシークエンス、及びSOLiDシークエンスなど)が挙げられる。本酵素(複数可)は、特に、高い忠実性が必要とされるまたは必要とされる可能性がある場合に、採用することができる。この場合、プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を持つポリメラーゼ酵素が好ましいと思われる。ある特定の実施形態において、本酵素は、診断(生体試料の核酸または生体試料の核酸に由来する核酸の分析など);cDNAライブラリークローニング、及び次世代RNA配列決定法などの分子生物学的用途に少なくとも採用される。
逆転写の前に、PCR阻害剤など(例えば、タンパク質または感熱性分子)、構成要素の熱変性を必要とする方法。
油中水乳濁液などの区画中での改善された逆転写酵素及び/または核酸種の重合。そのような方法は、個々の細胞または組織試料をはじめとする試料の配列を増幅させるために使用することができ、重複伸長RT-PCRで2つ以上のRNA配列を対形成させることを含む。例えば、これらの増幅は、デジタルPCRなどの技法を含むことができる。
本実施形態のポリメラーゼ(例えば、CORE3)の3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を用いて、プライマーミスマッチ伸長アッセイでRNAまたはDNA配列中に存在する一塩基遺伝子多型(SNP)を検出することができる。これらの増幅産物は、配列決定及び/または直接可視化を用いて読み出すことができる。
本実施形態のポリメラーゼ(例えば、CORE3)を他の既知のRT(MMLV、AMV、Tth、及び他の操作改変体、例えばTaqポリメラーゼなど)とともに用いるポリメラーゼブレンドは、合成が困難な核酸配列の検出性能のさらなる上昇をもたらすことができる。
本実施形態のポリメラーゼは、複数テンプレート組成物(DNA、RNA、及び2’C-Oメチル)とともに働くことが実証されており、さらなる非天然核酸組成物を逆転写するはずであるので、さらなる治療用途、診断用途、または配列決定用途に応用可能である。
本実施形態のポリメラーゼは、ポリメラーゼが逆転写酵素の役割を果たし、DNA/RNAポリメラーゼをはじめとする他のポリメラーゼは増幅を助ける増幅スキームで利用可能であり、そのようなスキームとは、例えば:RT-Lamp、3SR(NASBA)、転写介在増幅法(TMA)、RCA、RPA、HDA、鎖置換増幅法である。
SLIC、またはギブソンアッセンブリーなどの分子クローニング法も、RNAまたはRNA含有プライマーを直接使用できるように、本実施形態のポリメラーゼを利用することができる。
ポリメラーゼは、高忠実性cDNAライブラリー作製に使用することができる。
免疫PCR増幅技法は、本実施形態のポリメラーゼを使用して、小分子またはタンパク質代謝産物を検出することができる。
本実施形態のポリメラーゼは、同様に、RNA修飾アプタマーをはじめとするRNAアプタマー配列のin vitroまたはin vivo選択に使用することができる。
本実施形態のポリメラーゼのin vivo発現は、細胞中のRNAをDNAに変換するのに使用することができる。これは、例えば、核酸情報のプログラムされた組換え(例えば、レトロン、レトロエレメント)または保存に利用することができる。
ポリメラーゼは、区画化対形成複製または協同CSR定向進化技法をはじめとする定向進化のための選択技法にも使用することができる。
本開示の酵素を作製、試験、及び/または使用するのに必要とされる必須の材料及び試薬の全てまたは一部を、キットで提供することができる。キットは、RNA塩基含有プライマー、ベクター、ポリメラーゼをコードする核酸、緩衝剤、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、塩、ならびに酵素の作製、特性決定、及び/または使用の実施形態の少なくとも幾つかに該当するものなどの1つ以上を含むことができる。キットの実施形態は、例えば、対照核酸または酵素の検出及び/または使用のための試薬を含むことができる。キットは、説明書、対照物、試薬、容器、及び/または本開示の酵素を用いて様々なアッセイまたは他の方法(例えば、本明細書中記載されるもの)を行うための他の材料を提供することができる。
〔1〕RNAであるテンプレートを転写し、かつ野生型古細菌ファミリーBポリメラーゼと比較して1つ以上の変異を有する、組換え古細菌ファミリーBポリメラーゼ。
〔2〕野生型古細菌ファミリーBポリメラーゼと比較して1つ以上の遺伝子操作された変異を有し、配列番号1と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1に示されるアミノ酸配列の、Y493、Y384、V389、I521、E664、及びG711からなる群より選択される位置、またはこれらの位置のいずれかに対応する位置にある1つ以上のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基に置換されている、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔3〕Y493に対応する位置におけるロイシン残基またはシステイン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔4〕Y493に対応する位置におけるロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔5〕Y384に対応する位置における、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、システイン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔6〕Y384に対応する位置における、ヒスチジン残基またはイソロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔5〕に記載のポリメラーゼ。
〔7〕V389に対応する位置における、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トレオニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、またはヒスチジン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔8〕V389に対応する位置における、イソロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔9〕I521に対応する位置における、ロイシンへのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔10〕E664に対応する位置における、リジン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔11〕G711に対応する位置における、ロイシン残基、システイン残基、トレオニン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、リジン残基、またはメチオニン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕に記載のポリメラーゼ。
〔12〕G711に対応する位置における、バリン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔11〕に記載のポリメラーゼ。
〔13〕配列番号1に示されるアミノ酸配列中のR97位における別のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を含む、前記〔2〕から〔12〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔14〕配列番号1に示されるアミノ酸配列の、A490、F587、M137、K118、T514、R381、F38、K466、E734、及びN735からなる群より選択される位置、またはこれらの位置のいずれかに対応する位置にある1つ以上のアミノ酸残基が、別のアミノ酸残基で置換されている、前記〔2〕から〔13〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔15〕プルーフリーディング活性を有する、前記〔1〕から〔14〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔16〕プルーフリーディング活性を欠いている、前記〔1〕から〔14〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔17〕好熱性活性を有する、前記〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔18〕少なくとも10のヌクレオチドをRNAテンプレートから転写する、前記〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔19〕さらに、2’-OメチルDNAであるテンプレートを転写する、前記〔1〕から〔16〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔20〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ493、384、389、97、521、711、735位、またはそれらの組み合わせに対応する位置にあるアミノ酸におけるアミノ酸置換を有する、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔21〕さらに、664位のアミノ酸に対応するアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔22〕493位に対応する位置における、ロイシン残基、システイン残基、またはフェニルアラニン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔23〕493位に対応する位置における、ロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔24〕493位に対応する位置における、イソロイシン残基、バリン残基、アラニン残基、ヒスチジン残基、トレオニン残基、またはセリン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔25〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ493、384、389、521、711位、またはそれらの組み合わせに対応する位置にあるアミノ酸においてアミノ酸置換を有する、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔26〕さらに、490、587、137、118、514、381、38、466、734位、またはそれらの組み合わせに対応する位置においてアミノ酸置換を有する、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔27〕384位に対応する位置における、ヒスチジン残基またはイソロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔28〕384位に対応する位置における、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、システイン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔29〕389位に対応する位置における、イソロイシン残基またはロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔30〕389位に対応する位置における、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トレオニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、またはヒスチジン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔31〕664位に対応する位置における前記アミノ酸置換は、リジン残基またはグルタミン残基への置換である、前記〔21〕に記載のポリメラーゼ。
〔32〕97位に対応する位置における、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔33〕521位に対応する位置におけるロイシンへのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔34〕521位に対応する位置における、フェニルアラニン残基、バリン残基、メチオニン残基、またはトレオニン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔35〕711位に対応する位置における、バリン残基、セリン残基、またはアルギニン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔36〕711位に対応する位置における、ロイシン残基、システイン残基、トレオニン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、リジン残基、またはメチオニン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔37〕735位に対応する位置におけるリジン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔38〕735位に対応する位置における、アルギニン残基、グルタミン残基、アルギニン残基、チロシン残基、またはヒスチジン残基へのアミノ酸置換を含む、前記〔20〕に記載のポリメラーゼ。
〔39〕490位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、トレオニン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔40〕490位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、バリン残基、セリン残基、またはシステイン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔41〕587位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、ロイシン残基またはイソロイシン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔42〕587位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、アラニン残基、トレオニン残基、またはバリン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔43〕137位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、ロイシン残基またはイソロイシン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔44〕137位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、アラニン残基、トレオニン残基、またはバリン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔45〕118位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、イソロイシン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔46〕118位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、メチオニン残基、バリン残基、またはロイシン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔47〕514位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、イソロイシン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔48〕514位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、バリン残基、ロイシン残基、またはメチオニン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔49〕381位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、ヒスチジン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔50〕381位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、セリン残基、グルタミン残基、またはリジン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔52〕38位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、バリン残基、メチオニン残基、またはセリン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔53〕466位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、アルギニン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔54〕466位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、またはグルタミン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔55〕734位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、リジン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔56〕734位に対応する位置におけるアミノ酸置換が、アルギニン残基、グルタミン残基、またはアスパラギン残基への置換である、前記〔26〕に記載のポリメラーゼ。
〔57〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号1における以下:R97;Y384;V389;Y493;F587;E664;G711;及びW768に対応する位置の1つ以上にアミノ酸置換を有する、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔58〕配列番号1の以下:R97M;Y384H;V389I;Y493L;F587L;E664K;G711V;及びW768Rに対応するアミノ酸置換を1つ以上有する、前記〔57〕に記載のポリメラーゼ。
〔59〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号1における以下:F38;R97;K118;R381;Y384;V389;Y493;T514;F587;E664;G711;及びW768に対応する位置の1つ以上にアミノ酸置換を有する、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔60〕配列番号1における以下:F38L;R97M;K118I;R381H;Y384H;V389I;Y493L;T514I;F587L;E664K;G711V;及びW768Rに対応するアミノ酸置換を1つ以上有する、前記〔59〕に記載のポリメラーゼ。
〔61〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号1における以下:F38;R97;K118;M137;R381;Y384;V389;K466;Y493;T514;F587;E664;G711;及びW768に対応する位置の1つ以上にアミノ酸置換を有する、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔62〕配列番号1における以下:F38L;R97M;K118I;M137L;R381H;Y384H;V389I;K466R;Y493L;T514I;F587L;E664K;G711V;及びW768Rに対応するアミノ酸置換を1つ以上有する、前記〔61〕に記載のポリメラーゼ。
〔63〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1における以下:F38;R97;K118;M137;R381;Y384;V389;K466;Y493;T514;I521;F587;E664;G711;N735;及びW768に対応する位置の1つ以上にアミノ酸置換を有する、前記〔1〕に記載のポリメラーゼ。
〔64〕配列番号1における以下:F38L;R97M;K118I;M137L;R381H;Y384H;V389I;K466R;Y493L;T514I;I521L;F587L;E664K;G711V;N735K;及びW768Rに対応するアミノ酸置換を1つ以上有する、前記〔63〕に記載のポリメラーゼ。
〔65〕さらに、追加ドメインを含む、前記〔1〕から〔64〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔66〕重合促進活性を有する、前記〔65〕に記載のポリメラーゼ。
〔67〕追加ドメインが、DNA結合タンパク質7d(Sso7d)、増殖細胞核抗原(PCNA)、ヘリカーゼ、一本鎖結合タンパク質、ウシ血清アルブミン(BSA)、1つ以上の親和性タグ、1つ以上の標識、及びそれらの組み合わせの一部または全部を含む、前記〔65〕に記載のポリメラーゼ。
〔68〕3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いている、前記〔1〕から〔64〕のいずれかに記載のポリメラーゼ。
〔69〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ前記ポリメラーゼは、N210に対応するアミノ酸の置換を有する、前記〔68〕に記載のポリメラーゼ。
〔70〕N210Dに対応するアミノ酸置換を有する、前記〔69〕に記載のポリメラーゼ。
〔71〕配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を有し、かつ、D141及びE143に対応するアミノ酸の置換を有する、前記〔68〕に記載のポリメラーゼ。
〔72〕D141A及びE143Aに対応するアミノ酸置換を有する、前記〔71〕に記載のポリメラーゼ。
〔73〕前記〔1〕から〔72〕のいずれかに記載のポリメラーゼをコードする、核酸分子。
〔74〕前記〔1〕から〔67〕のいずれかに記載のポリメラーゼの使用方法であって、重合分子を生成させるのに適切な条件下、前記ポリメラーゼを核酸テンプレートと接触させる工程を含む、前記方法。
〔75〕乳濁液中で行われる、前記〔55〕に記載の方法。
〔76〕テンプレートがRNAである、前記〔74〕に記載の方法。
〔77〕テンプレートが2’-OメチルDNAである、前記〔74〕に記載の方法。
〔78〕重合分子が非DNAヌクレオチド重合体ではない、前記〔76〕に記載の方法。
〔79〕テンプレートがRNAであり、cDNAが生成される、前記〔76〕に記載の方法。
〔80〕さらに、ポリメラーゼ連鎖反応により、前記cDNAの少なくとも一部分を増幅させることを含む、前記〔79〕に記載の方法。
〔81〕さらに、複数の個別cDNAを生成させることを含む、前記〔79〕に記載の方法。
〔82〕さらに、重複伸長PCRにより、前記cDNAを増幅することを含む、前記〔81〕に記載の方法。
〔83〕さらに、VHドメイン及びVLドメインをコードするcDNAの増幅方法として定義される、前記〔79〕に記載の方法。
〔84〕cDNAが対になったVHドメイン及びVLドメインをコードする、前記〔79〕に記載の方法。
〔85〕cDNA分子の生成を欠いている、前記〔74〕に記載の方法。
〔86〕テンプレートの少なくとも一部に関する配列情報を提供する、前記〔76〕または〔85〕に記載の方法。
〔87〕テンプレートがDNAである、前記〔74〕に記載の方法。
〔88〕重合分子が非DNAヌクレオチド重合体ではない、前記〔87〕に記載の方法。
〔89〕重合分子が配列決定される、前記〔74〕から〔88〕のいずれかに記載の方法。
〔90〕核酸テンプレートが核酸分子の集団の一部である、前記〔89〕に記載の方法。
〔91〕集団がゲノムである、前記〔90〕に記載の方法。
〔92〕集団がトランスクリプトームである、前記〔90〕に記載の方法。
〔93〕逆転写酵素活性を持つ酵素の選択方法であって、以下:
a)ポリメラーゼをコードする領域を含む核酸の集団を用意する工程であって、前記ポリメラーゼは、逆転写酵素活性を有するまたは有さない場合が有り、前記ポリメラーゼをコードする前記領域は、前記核酸中のプライマーが結合する領域にフランキングされており、前記プライマーは、1つ以上のRNAヌクレオチド塩基を含む、前記工程;
b)前記核酸プールを、各容器が前記集団の核酸メンバー及び前記核酸メンバーによりコードされる前記ポリメラーゼを含むように、複数の容器に分割して入れる工程;
c)前記核酸メンバー及び前記ポリメラーゼを適切な条件に供して、前記プライマーからの重合を起こさせることにより、RNA塩基含有テンプレートを生成させる工程;及び
d)テンプレートとして前記RNA塩基含有テンプレートを用いて核酸分子の重合をアッセイする工程であって、重合が起こる場合、前記ポリメラーゼは、逆転写酵素活性を有するものである、前記工程、
を含む、前記方法。
〔94〕さらに、ポリメラーゼを用いてRNA塩基含有テンプレートを増幅する工程及び/またはポリメラーゼを用いてRNA塩基含有テンプレートから重合した分子を増幅する工程を含む、前記〔93〕に記載の方法。
〔95〕さらに、ポリメラーゼをコードする領域を含む核酸の集団を作製する工程を含む、前記〔93〕または〔94〕に記載の方法。
〔96〕集団がポリメラーゼをコードする核酸に1つ以上の変異を導入することにより作製される、前記〔95〕に記載の方法。
〔97〕1つ以上の変異が、核酸に無作為に導入される、前記〔96〕に記載の方法。
〔98〕1つ以上の変異が、ポリメラーゼ連鎖反応により導入される、前記〔97〕に記載の方法。
〔99〕1つ以上の変異が、核酸に定方向様式で導入される、前記〔96〕に記載の方法。
〔100〕1つ以上の変異が導入される核酸が、逆転写酵素活性を欠いている古細菌ファミリーBポリメラーゼをコードするものに該当する、前記〔96〕に記載の方法。
〔101〕古細菌ファミリーBポリメラーゼがKODポリメラーゼである、前記〔100〕に記載の方法。
〔102〕プライマーが、1つより多いRNAヌクレオチド塩基を含む、前記〔93〕から〔101〕のいずれかに記載の方法。
〔103〕プライマーが、全てRNAヌクレオチド塩基で構成される、前記〔93〕から〔101〕のいずれかに記載の方法。
〔104〕ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を有し、配列決定に供される、前記〔93〕から〔103〕のいずれかに記載の方法。
〔105〕
前記〔1〕から〔67〕のいずれかに記載のポリメラーゼを含む、キット。
〔106〕ベクター、ヌクレオチド、緩衝剤、塩、及び説明書の1つ以上を含む、前記〔105〕に記載のキット。
以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を実証するために挙げられている。当業者には当然だろうが、実施例に開示される技法は本発明の技法に従うものであり、本発明を実施する上で上手く機能することが本発明者らにより見出されているので、本発明を実施する好適な様式を構成するものと見なすことができる。しかしながら、本開示に照らして、当業者には当然ながら、開示される具体的な実施形態に多くの変更を加えることが可能であり、それでもなお、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様なまたは類似の結果を得ることができる。
れかを形成するようにオリゴヌクレオチドを合成した。ミスマッチにより、プルーフリーディング活性を刺激することができる。DNAテンプレートを用いてプライマー伸長法を行った場合、親KOD及びCORE3は、両方とも、1回の伸長でミスマッチプライマーを伸長することができたが、それらのエキソヌクレアーゼ欠損型プライマーは、できなかった。RNAテンプレートを用いてこのアッセイを繰り返したところ、CORE3ポリメラーゼは、プルーフリーディング活性を失っておらず、その活性は、DNAテンプレートで重合していた間のプルーフリーディング活性に匹敵するものだった(図2A)。
本開示は、親酵素から誘導体酵素を作製する方法を提供し、誘導体は、親酵素には欠けている1つ以上の活性を有する。本方法は、無作為及び/または作為的修飾手段により、親酵素を修飾する工程を利用することができる。本開示の実施形態は、逆転写酵素活性を欠いた親DNAポリメラーゼに対する修飾を含む。
本実施例は、本開示の実施形態のための材料及び方法の例を提供する。
全B細胞の単離-凍結PBMC(1mL中、1000万の細胞)を、37℃で解凍し、10%ウシ胎児血清、1×非必須アミノ酸、1×ピルビン酸ナトリウム、1×グルタミン、1×ペニシリン/ストレプトマイシン、及び20U/mLのDNAアーゼIを補充したRPMI1640(Lonza)50mLに再懸濁させ、遠心(300g、20℃で10分間)を介して回収した。次いで、細胞を4mLのRPMIに再懸濁させ、37℃にて30分間で回収した。細胞を、10mLの冷MACS緩衝液(0.5%BSA及び2mMのEDTAを補充したPBS)で希釈し、遠心(300g、4℃で10分間)により回収し、Human Memory B Cell Isolation KitにLDカラム(Miltenyi Biotec)を用いて、取扱説明書とおりに、非B細胞を減少させた。これにより、1バイアルあたり、400,000~500,000のB細胞を得た。
プライマー伸長アッセイ-5pmolの5’フルオレセイン標識化プライマー(RT.NoU.Probe)を、12.5pmolのテンプレートRNA(RT.NoU.Template)及び0.4μgのポリメラーゼを用いて、80℃で1分間熱変性させ、室温に冷却することにより、アニールした。これらの試験のため、テンプレートRNAは、「U」位置を欠くように設計された。1×アッセイ緩衝液、1mMのMgSO4、及び200μMのdNTPを含有する「開始」混合物を加えることにより、反応を開始した。反応物を、68℃で30分間インキュベートした。試料を、1×色素(47.5%ホルムアミド、0.01%SDS)及び1nmolの未標識ブロッカーオリゴヌクレオチド(テンプレート鎖と競合的に結合させるため)中、75℃で5分間、加熱することにより、標識化プライマーを、テンプレート鎖から除去した。試料を、15%(7Mの尿素)アクリルアミドゲル上で泳動させた。
本明細書で言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関連する当該分野の当業者のレベルを示す。全ての特許及び刊行物は、個々の刊行物がそれぞれ具体的かつ個別に参照として援用されると記載されたのと同程度に、そのまま全体が本明細書中に参照として援用される。
特許及び特許出願
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Claims (20)
- 組換え古細菌ファミリーBポリメラーゼの使用方法であって、核酸テンプレートを、重合分子を生成するに適切な条件下で前記ポリメラーゼと接触させることを含み、前記ポリメラーゼが配列番号1と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリメラーゼが配列番号1の位置Y439に対応する位置にアミノ酸置換を含み、前記置換がロイシンまたはシステイン残基への置換であり、前記組換え古細菌ファミリーBポリメラーゼが逆転写活性を有する、前記前記方法。
- ポリメラーゼがさらに配列番号1のアミノ酸配列の位置E664に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項1記載の方法。
- ポリメラーゼがさらに位置E664に対応する位置にリジン残基へのアミノ酸置換を含む、請求項2記載の方法。
- ポリメラーゼがさらに位置Y493に対応する位置にロイシン残基へのアミノ酸置換を含む、請求項1記載の方法。
- ポリメラーゼがさらに配列番号1のアミノ酸配列の位置Y384、V389、I521およびG711に対応する1以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項1記載の方法。
- 位置Y384における置換が、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、アラニン残基、システイン残基、セリン残基、ヒスチジン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基、またはグルタミン残基への置換である、請求項5記載の方法。
- 位置Y384における置換が、ヒスチジン残基またはイソロイシン残基への置換である、請求項6記載の方法。
- 位置V389における置換が、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トレオニン残基、チロシン残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、またはヒスチジン残基への置換である、請求項5記載の方法。
- 位置V389における置換がイソロイシン残基への置換である、請求項8記載の方法。
- 位置I521における置換がロイシン残基への置換である、請求項5記載の方法。
- 位置G711における置換が、ロイシン残基、システイン残基、トレオニン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、リジン残基、またはメチオニン残基への置換である、請求項5記載の方法。
- 位置G711における置換が、バリン残基への置換である、請求項11に記載の方法。
- ポリメラーゼがさらに配列番号1のアミノ酸配列におけるR97に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項1記載の方法。
- ポリメラーゼが、配列番号1のアミノ酸配列の位置A490、F587、G711、M137、K118、T514、R381、F38、I521、K466、E664、Y493、V389、R97、E734、W768およびN735に対応する位置の1以上においてアミノ酸置換を含む、請求項1記載の方法。
- 乳濁液中で行われる、請求項1記載の方法。
- テンプレートがDNAである、請求項1記載の方法。
- テンプレテートが2’-OメチルDNAである、請求項1記載の方法。
- テンプレートがRNAである、請求項1記載の方法。
- 重合分子がcDNAである、請求項18記載の方法。
- さらにポリメラーゼ連鎖反応によってcDNAの少なくとも一部を増幅することを含む、請求項19記載の方法。
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