JP6416885B2 - 高温で活性なhivタイプ1グループo逆転写酵素 - Google Patents
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Description
−この配列の位置358と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸リシン(K)をアミノ酸アルギニン(R)で置換(変異K358R)
−この配列の位置359に、オリジナルのアミノ酸アラニン(A)をアミノ酸グリシン(G)で置換(変異A359G)
−この配列の位置360に、オリジナルのアミノ酸セリン(S)をアミノ酸アラニン(A)で置換(変異K360A)。
a) 配列番号1の位置69と相同の位置に、アミノ酸トレオニン(T)を2つのアミノ酸セリンと1つのグリシン(SSG)を挿入して置換(変異T69SSG)
b) 配列番号1の位置355と相同の位置に、アミノ酸トレオニン(T)をアミノ酸アラニン(A)で置換(変異T355A)
c) 配列番号1の位置357と相同の位置に、アミノ酸グルタミン(Q)をアミノ酸メチオニン(M)で置換(変異Q357M)
d) 配列番号1の位置478と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸グルタミン酸(E)をアミノ酸グルタミン(Q)アルギニン(R)で置換(E478Q)。
1)本発明のベクターを適切なホスト細胞(本発明のホスト細胞)に導入する、
2)適切な媒体中で本発明のホスト細胞を培養する、
3)RT活性のある本発明のポリペプチドを精製する。
a)本発明のポリペプチド、
b)i)バッファー、ii)プライマー、iii)DNA依存のDNAポリメラーゼ、及びiv)ヌクレオチドからの少なくとも1つの成分、を含んでなる。
−この配列の位置358と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸リシン(K)をアミノ酸アルギニン(R)で置換(変異K358R)
−この配列の位置359と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸アラニン(A)をアミノ酸グリシン(G)で置換(変異A359G)
−この配列の位置360と相同の位置に、オリジナルのアミノ酸セリン(S)をアミノ酸アラニン(A)で置換(変異K360A)。
a)配列番号1の69に相当する位置で、アミノ酸トレオニン(T)を2つのアミノ酸セリン及びグリシン(SSG)を挿入して置き換える(変異T69SSG)。
b)配列番号1の355に相当する位置で、アミノ酸トレオニン(T)をアミノ酸アラニン(A)で置き換える(変異T355A)。
c)配列番号1の357に相当する位置で、アミノ酸グルタミン(Q)をアミノ酸メチオニン(M)で置き換える(変異Q357M)。
d)配列番号1の478に相当する位置で、アミノ酸グルタミン酸(E)をアミノ酸グルタミン(Q)で置き換える(E478Q)。
a)分離されたポリヌクレオチド配列、或いはその相補的鎖の核酸分子、
b)相補的鎖がポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる核酸分子、或いは、
c)遺伝コードの変質により、配列が(a)及び/又は(b)と異なる配列である核酸分子。
1)本発明のベクターを適切なホスト細胞(本発明のホスト細胞)に導入する、
2)本発明のホスト細胞を適切な培地中で培養する、
3)RT活性のある本発明のポリペプチドを精製する、を含んでなる。
RTの分離は、溶解性差異技術、クロマトグラフィー、電気泳動、或いは等電点分画法で行うことができる。クロマトグラフィーの技術は、分子量、イオン電荷(操作条件でのアミノ酸の電離状態に基づく)、クロマトグラフィーマトリックス或いはカラムに対する蛋白質の親和性、或いは精製タグに基いており、カラム、紙またはプレートで行うことができる。蛋白質の分離は、例えば、精製時間の顕著な短縮及び精製収率を高める自動システムを使用して、硫酸アンモニウムを用いる析出、高速蛋白質液体クロマトグラフィー(FPLC)、或いは高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)で行うことができる。
a)テンプレート核酸を、本発明のRTと混合し、
b)ステップ(a)の混合物を、テンプレート核酸に相補的なDNAの合成を可能にする条件で培養する、を含んでなる。
a)核酸と本発明のRT及びDNA−依存型ポリメラーゼを混合し、
b)ステップ(a)の混合物を、核酸テンプレートに相補的なDNAの増幅を可能にする条件で培養する、を含んでなる。
a)核酸を、本発明のRTと接触させる、
b)この混合物を、テンプレート核酸に相補DNA分子集合の合成を可能にする条件で培養する、
c)相補DNA分子の集合を分離し、ヌクレオチド配列を決定する。
a)本発明のRT、及び
b)i)バッファー、ii)プライマー、iii)DNA依存DNAポリメラーゼ、iV)ヌクレオチド、の群からの少なくとも1つの成分、を含んでなる。
異なる温度での逆転写反応の効率を、得られたDNA複写のPCRによる増幅の後に測定した。37〜78℃の範囲の異なる温度で行なった逆転写反応におけるアクチン遺伝子由来の凡そ500と950塩基対のRNAフラグメントの増幅で、変異体K358R/A359G/S360A(RTO_3M*)、K358R/A359G/S360A/E478Q(RTO_E478Q_3M*)、T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A(RTO_5M*)、及びT69SSG/K358R/A359G/S360A(RTO_T69SSG_3M*)は、HIV−1グループOの“野生型”RT及び他の変異体RTより有効であった(図1)。
逆転写酵素RTO_3M*、RTO_5M*、及びRTO_E478Q_3M*は、一本鎖ヌクレオチドの挿入試験で、“野生型”酵素(RTO_WT*)と同じ触媒活性を示し(表2)、変異体RTO_T69SSG_3M*の触媒効率(kpol/Kd)は、野生型酵素より僅かに低かった。3’ミスペアーG:T末端の拡張試験で検討した酵素の間に顕著な差異は見出されなかった。G:AとG:G末端の拡張では、全てのRTが“野生型”酵素と同じ効率を示し、変異体RTO_T69SSG_3M*は、他よりG:G或いはG:A末端を拡張する傾向が大きかった(図3)。
〔グループOのRTとその変異体の発現及び精製〕
RTの発現及び精製は、アンピシリン(ampicillin)耐性遺伝子を含み、HIV−1グループOのRTのp66サブユニットをコードしている領域がクローン化されているp66RTBプラスミド改変版[Boretto et al.;Anal.Biochem.,2001;292:139−147;Matamoros et al.;J.Mol.Biol.,2005;349:451−463]で行った[Menendez−Arias et al.;J.Biol.Chem.,2001;276:27470−27479;Alvarez et al.;J.Mol.Biol,2009;392:872−884;特許WO2010130864]。 RT精製は、細菌溶解と均質化のステップ、次いでイオン交換クロマトグラフィー(リン酸セルロース中)と親和性クロマトグラフィー(Ni2+−ニトリロ酢酸アガロースカラムで)のステップを行うボレット(Boretto)らの記載している方法に従って行った[Anal.Biochem.,2001;292:139−147]。
変異体RT、RT RTO_3M*、RTO_E478Q_3M*、RTO_5M*、及びRTO_T69SSG_3M*を発現するプラスミドは、ストラタジーン(Stratagene)からの“迅速変化特定部位変異誘発”キットを用い、製造者の説明書に従って特定部位変異誘発により得た。
a)変異K358R/A359G/S360Aの導入には:
5′−GGGAAATATACTAGGCAAAGGGGCGCCCACACAAATGAC−3′
5′−GTCATTTGTGTGGGCGCCCCTTTGCCTAGTATATTTCCC−3′
b)T355Aには:
5′−ACAGGGAAATATGCTAGGATGAGGGGCGCC−3′
5′−GGCGCCCCTCATCCTAGCATATTTCCCTGT−3′
c)Q357Mには:
5′−GGGAAATATACTAGGATGAGGGGCGCCCACACAAATGAC−3′
5′−GTCATTTGTGTGGGCGCCCCTCATCCTAGTATATTTCCC−3′
d)E478Qには:
5′−CCAATCAAAAGGCTCAATTAATGGCAG−3′
5′−CTGCCATTAATTGAGCCTTTTGATTGG−3′
e)Ser−Glyの挿入と変更T69Sを導入するために:
5′−GCTATAAAAAAGAAAGATAGTAGTTCCGGGAAGTGGAGAAAGCTGGTAGAC−3′
5′−GTCTACCAGCTTTCTCCACTTCCCGGAACTACTATCTTTCTTTTTTATAGC−3′
逆転写反応は、異なる温度で行い、次いでその反応生成物(cDNA)を標準条件でPCRにより増幅させた[Alvarez et al.;J.Mol.Biol.,2009;392:872−884]。 典型的に、逆転写反応は、375mMのKCl、15mMのMgCl2、及び50mMのジチオスレイトールを含む250mMのトリス−塩酸バッファー(25℃で、pHが8.3)を4μLマウス肝臓から分離した全RNAを1μL(1μg/μL);4つのdNTPs混合物を4μL(それぞれ2.5mM);オリゴ(dT)16を1μL(100μM);リボヌクレアーゼインヒビターを0.5μL(40ユニット/μL);凡そ150nM濃度でRT;そして残部を水で20μLとした。最初に、RNAとオリゴdTを、68℃で3分間保持した。次いで、他の反応成分(RTを含む)を加え、所定温度で1時間保持し、cDNAを得た。最後に、92℃に10分保持して酵素を不活性にして反応を止めた。cDNAを、Taqポリメラーゼ或いは他の同様の酵素(例えば、エクスパンド・ハイ・ファイデリティ・DNAポリメラーゼ(Expand High Fidelity DNA polymerase)を使用する標準条件で、PCRによって増幅させた。
RTの逆転写効率は、リアルタイムPCRによって、様々な温度(37、50、68、75及び78℃)で決定した。これをするために、それぞれの実験で3つの独立した反応を行った。 全ての反応を、75mMのKCl、3mMのMgCl2、10mMのジチオスレイトール、1U/μLのリボヌクレアーゼインヒビター(RNasin(R)Plus、プロメガ(Promega))、5μMのオリゴ(dT)16、50ng/μLのマウス肝臓の全RNA(ストラタジーン(Stratagene))、及び150nMの対応するRTを含む50mMのトリス−塩酸バッファー(pH:8.3)中、容量20μLで行った。テンプレートRNAのオリゴ(dT)16、とのハイブリダイゼーション、及びcDNA合成反応は、前項に記載した条件で行った。
RTの複写忠実度は、ミスペアー拡張動力学試験により決定した。正しく或いは不正確に対になったテンプレート−プライマー複合物を拡張する種々のRTの能力を決めるために、全て前定常的条件で行った[Matamoros et al.;J.Mol.Biol.,2008;375:1234−1248;Barrioluengo et al.;Biochem.J.,2011;436:599−607]。 さらに、遺伝子試験は、M13mp2ファージ中のlacZα遺伝子の発現に基づいて行った[Bebenek and Kunkel.;Methods Enzymol.,1995;262:217−232;Barrioluengo et al.;Biochem.J.,2011;436:599−607]。
Claims (28)
- HIV−1グループOから分離された逆転写酵素活性をもつ蛋白質をコードし、高温での安定性が高く、複写忠実度を維持しつつ75℃を超える温度で親酵素より活性が高いポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、アミノ酸配列が、配列番号1の親配列において、
− 配列番号1の位置358で、オリジナルのアミノ酸リシン(K)がアミノ酸アルギニン(R)で置換(変異K358R)され、
− 配列番号1の位置359で、オリジナルのアミノ酸アラニン(A)がアミノ酸グリシン(G)で置換(変異A359G)され、
− 配列番号1の位置360で、オリジナルのアミノ酸セリン(S)がアミノ酸アラニン(A)で置換(変異K360A)されており、3箇所の前記変異のみを有することを特徴とするポリペプチド。 - その配列が、配列番号3に対応することを特徴とする請求項1に記載のポリペプチド。
- さらに、N−末端にMNSフランキング配列を、C−末端にヒスチジンテイルを有し、そのアミノ酸配列が配列番号13に対応することを特徴とする請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 高温での安定性が高く、75℃を超える温度で複写忠実度を維持しつつ親酵素より活性が高いHIV−1グループOから分離された逆転写酵素活性をもつポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであって、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列を有していることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号4、配列番号14に対応することを特徴とする請求項4に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項4又は5に記載のポリヌクレオチド又は請求項6に記載のベクターを含み、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドを生成可能であることを特徴とするホスト細胞。
- 細菌であることを特徴とする請求項7に記載のホスト細胞。
- 前記細菌が、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)であることを特徴とする請求項8に記載のホスト細胞。
- a)請求項6のベクターを適切なホスト細胞に導入する、
b)前記ホスト細胞を適切な培地中で培養する、
c)逆転写酵素活性のあるポリペプチドを精製する、
のステップを含んでなることを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドを得るための方法。 - 請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドを得るための、請求項4又は5に記載のポリヌクレオチドの使用。
- 請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドを得るための、請求項7乃至9のいずれかに記載のホスト細胞の使用。
- テンプレート核酸を逆転写するための、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
- テンプレート核酸を増幅するための、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
- テンプレート核酸を配列決定するための、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
- 前記テンプレート核酸がmRNAまたはmiRNAであることを特徴とする請求項13乃至15のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
- a)テンプレート核酸を請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドと混合する、
b)ステップ(a)の混合物を、テンプレート核酸に相補的なDNAを合成できる条件で培養する、
を含んでなることを特徴とするテンプレート核酸の逆転写方法。 - a)核酸を、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドと少なくとも1つのDNA依存DNAポリメラーゼと混合し、
b)ステップ(a)の混合物を、テンプレート核酸に相補的なDNAの増幅を可能にする条件で培養する、
を含んでなることを特徴とするテンプレート核酸の増幅方法。 - a)核酸を、請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチドと接触させる、
b)この混合物を、テンプレート核酸に相補的なDNAの集合を合成できる条件で培養する、
c)相補DNAの分子集合を分離し、ヌクレオチド配列を決定する、
を含んでなることを特徴とする核酸の配列決定方法。 - 前記テンプレート核酸が、mRNAまたはmiRNAであることを特徴とする請求項17に記載のテンプレート核酸の逆転写方法。
- 前記テンプレート核酸が、mRNAまたはmiRNAであることを特徴とする請求項18に記載のテンプレート核酸の増幅方法。
- 前記テンプレート核酸が、mRNAまたはmiRNAであることを特徴とする請求項19に記載の核酸の配列決定方法。
- a)請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチド、
b)i)バッファー、ii)プライマー、iii)DNA依存DNAポリメラーゼ、及びiv)ヌクレオチド、からの少なくとも1つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項17に記載のテンプレート核酸の逆転写方法を実施するために必要な成分を含むキット。 - a)請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチド、
b)i)バッファー、ii)プライマー、iii)DNA依存DNAポリメラーゼ、及びiv)ヌクレオチド、からの少なくとも1つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項18に記載のテンプレート核酸の増幅方法を実施するために必要な成分を含むキット。 - a)請求項1乃至3のいずれかに記載のポリペプチド、
b)i)バッファー、ii)プライマー、iii)DNA依存DNAポリメラーゼ、及びiv)ヌクレオチド、からの少なくとも1つの成分、
を含んでなることを特徴とする請求項19に記載の核酸の配列決定方法を実施するために必要な成分を含むキット。 - 請求項17に記載のテンプレート核酸の逆転写方法を実施するための、請求項23に記載のキットの使用。
- 請求項18に記載のテンプレート核酸の増幅方法を実施するための、請求項24に記載のキットの使用。
- 請求項19に記載の核酸の配列決定方法を実施するための、請求項25に記載のキットの使用。
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