CN105339491A - 在高温下具有活性的hiv-1型o组的逆转录酶 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域。更具体而言，本发明涉及逆转录酶，其在细菌中表达并纯化，并且具有人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)O组的逆转录酶的氨基酸序列，其中在位置358,359和360处具有修饰；并且本发明涉及该酶的变体，该变体在位置355和357、或者在478处或者在位置69处(在这种情况下伴有插入2个氨基酸)包含其他的变化。这些聚合酶在高温(高于60℃)下具有比未突变的酶更高的活性。此外，它们在高于70℃的温度下保持了DNA合成的能力。此外，这些酶的复制保真度明与未突变的逆转录不具有明显的差异。

Description

在高温下具有活性的HIV-1型O组的逆转录酶
技术领域
本发明为生物技术领域。更具体而言，本发明涉及逆转录酶，该逆转录酶在细菌中表达并纯化，并且具有在多个位置发生修饰的人类免疫缺陷病毒-1型O组(HIV-1)的逆转录酶的氨基酸序列。这些聚合酶在升高的温度(高于60℃)下比未突变的酶具有更高的活性。此外，它们在超过70℃的温度下还保持DNA合成。这些酶的复制保真度与未突变的逆转录酶不具有显著的差异。
背景技术
在逆转录病毒中，逆转录酶(RT)为负责复制病毒基因组的酶。RT将单链RNA基因组转化成能够整合至宿主细胞基因组中的双链DNA中[在LeGrice.JBiolChem,2012；287:40850-40857中综述]。正是这种聚合酶可以使用RNA或DNA作为模板来合成DNA。此外，RT还具有核酸内切酶活性(核糖核酸酶H)，这种活性使得RT能够在RNA依赖的DNA合成过程中降解RNA模板。
逆转录病毒RT为用于由信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)得到互补DNA(cDNA)的有用的酶，当通过传统技术(例如PCR)扩增互补DNA时，其可以用于检测基因在有机体或组织中的表达。RT的效率在许多生物技术的应用中是重要的。例如用于mRNA的检测，通过实时PCR的定量，使用“微阵列”的基因表达的研究以及使用大规模测序技术的转录组研究中。但是，RNA中存在二级结构可以降低这些技术的有效性。在升高的温度下能够合成DNA的RT得到利用可以用于改良扩增过程中的产率。
由方法学的观点来看，在商业上扩增反应中最常用的RT为禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)、Moloney鼠白血病病毒(MLV)(CotéandRoth.VirusRes2008；134:186-202)的那些，以及人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的RT的变体(在HiziandHerschhorn.VirusRes2008；134:203-220中综述)。AMV和MLVRT是RT-PCR检测中最常用的，但是AMV的RT在42℃至52℃的温度范围内具有更好的热稳定性(Gerardetal.NucleicAcidsRes.2002；30:3118-3129)。存在MLVRT的变体，例如AffinityScript(Agilent)或SuperScriptIII(Invitrogen)，它们是市场上出售的在较高的温度下具有活性的酶(AreziandHogrefe.NucleicAcidsRes.2009；37:473-481)。
使用HIV-1RT(分类属于M组(B亚型))进行的研究证明这些酶比MLVRT具有更高的活性和热稳定性，但是它们被由系统发生不同且分类属于O组的HIV-1衍生得到的“野生型”RT变体超越(etal.JMolBiol2009；392:872-884；patentWO2010130864(A1))。在用于微管蛋白信使RNA表达中的RT-PCR检测中，MLVRT在超过52℃的温度下不能扩增，但是O组或B亚型的“野生型”RT在高达64℃的温度下是具有活性的，而且是唯一的首先在66-68℃下扩增的(etal.JMolBiol2009；392:872-884)。HIV-1RT为由2个亚基组成的异源二聚体，其中一个亚基为560个氨基酸(称为p66)而另一个亚基为440个氨基酸(称为p51)。p51的序列与p66的氨基酸1-440的序列一致。HIV-1O组RT表征为当与B亚型的“野生型”原型比较时，显示出大约20％的氨基酸序列的差异(etal.Virology1997；236:364-373)。O组的多种RT表征为比“野生型”RT具有更高的复制保真度，例如突变V75I,K65R和K65R/V75I的载体。这些RT在升高的温度下具有与“野生型”RT所示的相似的热稳定性和催化效率(Barrioluengoetal.BiochemJ2011；436:599-607；专利WO2012080541(A1))。
发明概述
本发明涉及由人类免疫缺陷病毒1型O组(HIV-1)分离得到的并且在一个或多个位置处修饰的逆转录酶，该逆转录酶比原始的酶具有更高的热稳定性，从而保持了复制保真度；以及本发明涉及所述的逆转录酶用于实施核酸模板的逆转录、扩增或测序的用途。
本发明的第一个目的涉及多肽，该多肽编码了由HIV-1O组分离得到的具有RT活性的蛋白质；在高温下具有较高的稳定性；在超过75℃的温度下具有比WT酶更高的活性，从而保持了复制保真度；以及表征为以下氨基酸序列，其与亲代序列SEQIDNO1具有至少50％一致性并且在其氨基酸序列中在以下的位置处包含多种改变(例如取代、删除和/或插入)：
-与所述的亲代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸(R)替代原始氨基酸赖氨酸(K)(突变K358R)；
-与所述的亲代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸(G)替代原始氨基酸丙氨酸(A)(突变A359G)；
-与所述的亲代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸(A)替代原始氨基酸丝氨酸(S)(突变S360A)。
此外，还描述了其他逆转录酶变体，其包含另外变化成组合K358R/A359G/S360A(通常全部改变)，改良了WTRT的热稳定性，以及在升高的温度下使用RNA作为模板合成DNA的能力。这些氨基酸变化和插入属于(例如但未限定本发明的范围)以下几组：
a)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨酸(SSG)来替代氨基酸苏氨酸(T)(突变T69SSG)；
b)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸(A)替代氨基酸苏氨酸(T)(突变T355A)；
c)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸(M)替代氨基酸谷氨酰胺(Q)(突变Q357M)；
d)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酰胺(Q)替代氨基酸谷氨酸(E)(E478Q)。
作为本发明的具体目的，本发明包括多种HIV-1O组逆转录酶的变体，该变体被用作起点并具有上文所述的突变，并且其中具体的多肽序列相当于SEQIDNO3,SEQIDNO5,SEQIDNO7和SEQIDNO9；以及它们相应的核苷酸序列(SEQIDNO4,SEQIDNO6,SEQIDNO8,SEQIDNO10)。
本发明的另一个目的为载体，其包含编码本发明的逆转录酶的多核苷酸。
本发明的另一个目的是包含多核苷酸的细胞，其中所述的多核苷酸编码本发明的逆转录酶。优选地，所述的细胞为细菌，还要更优选地，为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
本发明的另一个目的是获得本发明的多肽的方法，该方法包括以下步骤：
1)将本发明的载体引入至合适的宿主细胞(本发明的宿主细胞)中；
2)在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞；以及
3)纯化具有RT活性的本发明的多肽。
本发明的另一个目的涉及本发明的多核苷酸用于获得具有逆转录酶活性的本发明的多肽的用途。
本发明的另一个目的涉及本发明的宿主细胞用于获得本发明的多肽的用途。
本发明的另一个目的是本发明的多肽在核酸的逆转录、扩增和测序方法中的用途。其中所述的核酸优选为mRNA。
本发明的另一个目的涉及包含用于实施本发明所述的各种方法的必需成分的试剂盒，并且该试剂盒优选地包含：
a)本发明的RT；以及
b)列表中的至少一种成分，包括：
i)缓冲液；
ii)引物；
iii)DNA依赖的DNA聚合酶；以及
iv)核苷酸。
附图简述
图1.通过RT-PCR扩增RNA片段，其中所述的片段编码由小鼠肝脏的总RNA得到的肌动蛋白(大约500至950个碱基对)。使用以下所示的酶来进行扩增：(A)HIV-1O组“野生型”的RT(RTO_WT*)(孔7)，以及突变体K358R/A359G/S360A(RTO_3M*)(孔1),T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A(RTO_5M*)(孔2),K65R/K358R/A359G/S360A(孔3),K65R/V75I/K358R/A359G/S360A(孔4),K358R/A359G/S360A/E478Q(RTO_E478Q_3M*)(孔5)和K65R/K358R/A359G/S360A/E478Q(孔6)；(B)HIV-1O组RT的突变体：K358R/A359G/S360A(RTO_3M*)(孔1),T69SSG/K358R/A359G/S360A(RTO_T69SSG_3M*)(孔2),V148I/K358R/A359G/S360A(孔3)和F61A/K358R/A359G/S360A(孔4)。所示的温度是指DNA复制合成反应。孔m和c分别示出低分子量标记(使用HindIII消化的phi29噬菌体的DNA)和阴性对照(不具有cDNA)。在RTO_WT序列中，引入了所示的所有突变。
图2.示出了通过实时PCR对野生型RT(由HIV-1M组B亚型BH10(BH10)和O组(RTO_WT*，在图中示为RTO)分离得到)以及突变体(其为本专利的目的RTO_3M*(3M),RTO_E478Q_3M*(3Q)和RTO_T69SSG_3M*(SG))以及参照突变体(其携带3M变化特征以及K65R和V75I(K65R/V75I/K358R/A359G/S360A,KV))一起估计的逆转录效率。(ACTB)表示肌动蛋白信使RNA的扩增，而(GAPDH)表示甘油醛3-磷酸脱氢酶的信使RNA的扩增。实施逆转录反应的温度恰好在各柱状体的上方显示。
图3.示出了与RTO_WT*(O_WT)相比，突变体RTRTO_3M*(3M),RTO_5M*(5M),RTO_T69SSG_3M*(SG)和RTO_E478Q_3M*(3Q)的错配末端(G:T,G:G和G:A)的延伸效率。
发明详述
逆转录病毒的逆转录酶(RT)为有用的酶，例如其用于由信使RNA获得互补DNA，当该DNA在扩增时，可以克隆于载体中。理想的是用于该目的的RT具有较高的热稳定性，因为在这种条件下，RNA中的二级结构的水平被降低，并且这改良了扩增过程。但是，RT为缺乏校正核酸外切酶活性的酶，因此具有相对高的错误率；因此，对于用于所述目的的RT而言，理想的是复制保真度提高。
由HIV-1M组B亚型(例如BH10或HXB2)的RT与O组的RT之间存在序列同源性开始，本发明根据保存在theProteinDataBank(作为文件1RTD(www.pdb.org))中的晶体学结构，构建了与模板-引物复合物结合的O组RT的分子模型。该结构为唯一一个可利用的，其中HIV-1(在毒株HXB2的情况下)的RT显示与双链DNA(模板-引物)以及靠近的核苷酸(在这种情况下为dTTP)形成了三元复合物。此外，这是完整的结构并具有良好分辨率。由基于序列同源性的分子模式开始，在模板-引物与2种酶的相互作用中识别了重要的位置。该信息用于设计对核酸具有较高的亲和性的O组RT(RTO)的变体。因此，通过定点诱变，本发明人得到HIV-1O组RT的4种新的变体，命名为RTO_3M,RTO_5M,RTO_T69SSG_3M,RTO_E478Q_3M，它们分别包含突变K358R/A359G/S360A,T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A,T69SSG/K358R/A359G/S360A和K358R/A359G/S360A/E478Q。
根据与在WO2010130864中所述的相似的程序，这些酶可以在大肠杆菌中表达，并纯化用于随后的表征。观察到与O组的“野生型”RT(RTO_WT)相比，所述的4种酶在通过RT-PCR的RNA扩增反应(定量(图1)检测和定性(图2)检测)中，在超过75℃的温度下都具有较高的DNA聚合酶活性。使用这些酶实施的保真度检测证明它们保持了相对于RTO_WT的复制保真度(表2和3，图3)。
本发明涉及由人类免疫缺陷病毒1型O组(HIV-1)分离得到的且在一个或多个位置具有修饰的RT，该RT比WT酶具有更高的热稳定性，从而保持了复制保真度；以及本发明涉及该RT实施模板核酸的逆转录、扩增或测序的用途。
起点为在患者中识别的RT，其中所述的患者未使用抗逆转录病毒的药品治疗过，并且被HIV-1O组(毒株ESP49)(具有多肽序列SEQIDNO1的RTO_WT)所感染(etal.Virology1997；236:364-373；Menéndez-Ariasetal.J.Biol.Chem.2001；276:27470-27479)。将这种RT的p66亚基的核苷酸序列克隆至表达载体中，该表达载体包含合适的限制性位点，以及为了获得并纯化所述的酶的在C末端处的组氨酸尾部(其后为终止密码子)(具有核苷酸序列SEQIDNO2)。使用该构造并且在定点诱变过程之后，得到4种变体，其显示比起始酶(RTO_WT)更高的热稳定性并保持了复制保真度。RT的这种改变潜在地用于扩增困难的RNA，即，包含二级结构的那些和/或富含G:C碱基对的序列。
本发明中所述的多核苷酸和多肽序列的概述示于表1中。
因此，本发明的第一个目的涉及多肽，下文称为本发明的多肽，其编码了由HIV-1O组分离得到的具有RT活性的蛋白质；在高温下具有较高的稳定性；在超过75℃的温度下具有比WT酶更高的活性，从而保持了其复制可靠性；并表征为：其氨基酸序列与亲代序列SEQIDNO1具有至少50％的一致性，并且在其氨基酸序列中包含以下位置的改变(例如取代、删除和/或加入)：
-与所述的亲代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸(R)替代原始氨基酸赖氨酸(K)(突变K358R)；
-与所述的亲代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸(G)替代原始氨基酸丙氨酸(A)(突变A359G)；
-与所述的亲代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸(A)替代原始氨基酸丝氨酸(S)(突变S360A)。
因此，在本发明的优选的目的中，在本发明的多肽中的取代为K358R,A359G和S360A(逆转录酶RTO_3M)。在本发明的具体的实施方案中，本发明的多肽相当于SEQIDNO3。
RT具有最大的DNA聚合酶活性的温度(取决于RNA或DNA)被称为最佳温度。在高于该温度时，部分由于RT的热变形而使得催化活性降低。术语“热稳定性”是指当经历升高的温度时，例如通常升高至至少50℃的温度、优选为至少63℃、更优选为至少68℃并且还要更优选为至少75℃，RT所显示的稳定性。
可以通过不同类型的检测来测定本发明的RT的热稳定性。例如但不限于可以通过分析在RT-PCR(其可以是定性的或定量的)中使用信使RNA模板合成DNA的过程中所获得的产物的量来估计所述的热稳定性。为了实施上述过程，在升高的温度下进行逆转录酶的第一反应，然后通过PCR扩增所获得的互补DNA。在这些反应后所获得的产物的量构成了在实施逆转录酶反应的温度下RT稳定性的量度。对琼脂糖凝胶中的产物的分析能够定性地评价反应的效力。类似地，可以通过实施PCR来测定逆转录阶段的产率，从而测定的ΔCt值，其中ΔCt＝Ct–Ct(参照)，其中Ct为其中观察到明显扩增的周期，Ct(参照)为由用作参照的RT所获得的Ct值的平均值。
如本说明书中所用，“在升高的温度下的合成反应”是指在至少50℃的温度下、优选为至少63℃、更优选为至少68℃、更优选为至少75℃、并且还要更优选为至少78℃下实施的反应，更优选为逆转录反应。
热稳定性“增加”或“增强”的RT定义为与进行比较的RT的热稳定性明显增加或增强(使用统计学标准)至少1.5倍、更优选为至少2倍、还要更优选为至少3倍、并且还要更优选为至少4倍的RT。
术语“复制保真度”是指由RT催化的DNA聚合过程的精确性，其受到在合成核酸(作为模板)的互补DNA过程中区分正确和错误底物(核苷酸或模板-引物复合物)的能力的影响。
可以通过多种类型的检测来分析本发明的RT的保真度，例如但不限于细胞培养物中的保真度检测或“体外”保真度检测(基因或生物化学)。
在生物化学检测中，纯化的RT用于测定在特定的条件(pH、底物浓度等)下在RNA或DNA模板上的动力学常数。按照这种方式，在稳态和前稳态下，可以获得RT的DNA合成(RNA依赖的或DNA依赖的)的保真度的动力学参数。在稳态下用于错误引入的生物化学检测是以测定在引物的3'末端引入核苷酸的动力学常数(kcat和Km)为基础的，并提供了用于核苷酸的RT的选择性的估计。通过在形成RT/模板-引物二元复合物之后，在不同浓度的dNTP存在下，测量引物的3'末端(事先使用[γ32P]ATP标记该引物的5'末端)的核苷酸的引入，从而测定动力学参数。通过在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳来分析所得的产物。将所得的数据拟合Michaelis-Menten等式，并针对正确的和错误的核苷酸来测定参数kcat(引入的速率)和Km(Michaelis-Menten常数)。错误引入的效率(finc)定义为由错误的核苷酸所获得的催化效率(kcat/Km)与由正确的核苷酸所获得的催化效率之间的比例。因此，RT的较高的保真度意味着错误引入的效率较低。
为了使新生DNA中的错误被固定，引入错误的核苷酸是不够的，RT还必须能延伸由于这种错误的引入而生成的错配末端。通过错配延伸检测来进行这种保真度的测量。在这些检测中，计算在稳态下用于在2种类型的模板-引物复合物上引入正确的核苷酸的动力学常数：具有正确配对的3'末端的复合物以及具有错配的3'末端的相同的复合物。错配的延伸效率(fext)定义为用于延伸错配末端所获得的kcat/Km与用于延伸正确配对的末端所获得的kcat/Km之间的比例。
前稳态下生物化学的检测评估了短时间规模(例如在毫秒级数下)下RT接合及引入dNTP的能力。按照这种方式，可以计算dNTP与RT/模板-引物二元复合物之间相互作用的亲和常数(Kd)以及聚合常数(kpol)。在包含配对的或错配的3'-OH末端的模板-引物复合物上引入正确的和错误的核苷酸所获得的kpol/Kd值，或者由在包含配对的或错配的3'-OH末端的模板-引物复合物上引入正确的核苷酸所获得的kpol/Kd值，来测定错误引入的效率和错配末端的延伸的效率。
在由一条链上最初除去与lacZ基因相应的序列之后，通常使用M13mp2噬菌体的双链DNA作为DNA合成反应的模板-引物，实施最常用的基因检测，命名为“正向突变检测”。在RT和高浓度的dNTP存在下进行DNA合成反应。在使用反应产物进行细菌转化后，突变体在包含X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳吡喃糖苷)和IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)的培养基中识别为蓝色/白色噬菌斑。按照这种方式，如果在DNA合成反应中不具有错误，则结果为深蓝色的噬菌斑。相反，引入一个或多个错误意味着部分或全部失去了α-互补，这导得到蓝色或白色的噬菌斑。可以将由这些噬菌斑回收得到的DNA测序，从而测定在由RT引入突变的基因组中确切的数量、类型和位置。
复制保真度“增加”或“增强”的RT定义为与未修饰的RT的复制保真度相比增加或明显增加(使用统计学标准)通常为至少1.5倍、更优选为至少2倍、还要更优选为至少3倍、并且还要更优选为至少4倍的RT。例如在核苷酸引入的生物化学检测中，在由修饰的RT所获得的值明显高于未修饰的RT的值(使用统计学标准)时(通常为至少1.5倍、更优选为至少2倍、还要更优选为至少3倍、并且还要更优选为至少4倍)，考虑保真度增加。例如在基因检测(“正向突变检测”)中，当由修饰的RT所获得的突变的频率明显增加(使用统计学标准)时(通常为至少50％(1.5倍)、优选为至少2倍、更优选为至少3倍、并且还要更优选为至少4倍)，为保真度增加。
除了携带变化K358R,A359G和S360A的RT(RTO_3M)以外，描述了HIV-1O组的RT的其他变体，该变体包含除了K358R/A359G/S360A组合(通常全部改变)以外的变化，并且改良了WTRT的热稳定性，即，在升高的温度下使用RNA作为模板来合成DNA的能力。这些氨基酸变化和插入属于(例如但未限定本发明的范围)以下几组：
e)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨酸(SSG)来替代氨基酸苏氨酸(T)(突变T69SSG)；
f)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸(A)来替代氨基酸苏氨酸(T)(突变T355A)；
g)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸(M)来替代氨基酸谷氨酰胺(Q)(突变Q357M)；
h)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酰胺(Q)来替代氨基酸谷氨酸(E)(突变E478Q)。
因此，在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肽在氨基酸K358R/A359G/S360A中具有变化，并且还具有取代T355A和Q357M(逆转录酶RTO_5M)。在具体的实施方案中，本发明的多肽相当于SEQIDNO5。
在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肽在氨基酸K358R/A359G/S360A中具有变化，并且还具有T69SSG(逆转录酶RTO_T69SSG_3M)。在具体的实施方案中，本发明的多肽相当于SEQIDNO7。
在本发明的另一个优选的目的中，本发明的多肽在氨基酸K358R/A359G/S360A中具有变化，并且还具有替代E478Q(逆转录酶RTO_E478Q_3M)。在具体的实施方案中，本发明的多肽相当于SEQIDNO9。
此外，本发明的多肽可以具有小的多肽片段位于侧翼，这些小的多肽片段的存在是多肽在合适的载体中表达所必需的和/或有利的，并且是本领域已知的。其中在N-末端具有3个氨基酸(MNS，其为蛋氨酸-天冬酰胺-丝氨酸)，包含该序列有助于翻译的起始以及容留用于构建包含逆转录酶的表达载体的限制性核酸内切酶识别位点。此外，能够改良多肽的纯化的序列也被包含其中，例如在C-末端处的组氨酸残基尾部，此时其优选地由至少6个组氨酸残基组成。本发明的多肽的位于侧翼的残基形成了新的多肽序列，该序列包含本发明的多肽并保持了其逆转录酶的活性。
因此，在本发明的另一个优选的目的中，逆转录酶RTO_3M,RTO_5M,RTO_T69SSG_3M和RTO_E478Q_3M在N-末端具有MNS侧翼序列并且在C-末端具有组氨酸尾部，从而得到具有逆转录酶活性的多肽：RTO_3M*,RTO_5M*,RTO_T69SSG_3M*和RTO_E478Q_3M*，其在具体的目的中分别相当于多肽序列SEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO17和SEQIDNO19。
可以通过基因改造或重组DNA技术来获得在由HIV-1O组分离得到的RT的“野生型”多肽序列中引入了如本发明所述的突变，例如通过定点诱变或随机诱变使编码RT的序列突变；或者可以通过化学合成核苷酸序列来获得所述的突变，其中所述的核苷酸序列编码了携带所述的突变的RT的p66亚基。
如本说明书中所用，术语“突变”是指一个氨基酸被另一个不同的氨基酸取代。在序列中单个氨基酸在本发明中表示为XN，其中X为序列中的氨基酸(其设计为氨基酸命名系统的被广泛接受的单字母代码)，二N为序列中的位置。氨基酸序列中的取代点突变表示为X1NX2，其中X1为未突变的蛋白质序列中的氨基酸，X2为突变的蛋白质序列的新的氨基酸，而N为氨基酸序列中的位置。
此外，使用所提供的信息，本领域的专家能够将本发明中上文所提及的突变结合起来，从而生成在升高的温度下具有相似的或改良的新的RT变体。一种可能性是上文提及的位置中的氨基酸的保守取代。因此，例如保守取代为保持被取代氨基酸的极性和电荷特征的取代。例如赖氨酸和精氨酸为其中在中性pH下侧链带正电荷的氨基酸，因此赖氨酸变成精氨酸或者精氨酸变成赖氨酸表示保守变化。根据保守性，构成所有天然蛋白质的基础的20种氨基酸分类成以下几组：(i)芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(ii)脂肪族氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸)；(iii)碱性可电离的氨基酸(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)；(iv)酸性可电离的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)；(v)氨基酸酰胺(天冬酰胺和谷氨酰胺)；以及(vi)羟基化的氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)。一些作者将半胱氨酸包含在最后一组中。
编码本发明的多肽的本发明所述的多核苷酸相当于由编码RT(由HIV-1O组的毒株分离得到的(SEQIDNO2))的区域的定点诱变所获得的那些变体。这些多核苷酸相当于核苷酸序列，其构成了本发明的多肽的编码序列，下文称为本发明的多核苷酸。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核苷酸的序列”、“核酸”和“寡核苷酸”在本发明中可交换使用，并且是指可以或不可以进行生物化学修饰的任何长度的核苷酸的聚合形式。
因此，本发明的第二个目的涉及编码本发明的多肽的多核苷酸序列，下文称为本发明的多核苷酸，其中所述的多肽在超过68℃的温度下具有比WT酶更高的活性，从而保持了原始酶的复制保真度，并且所述的多核苷酸表征为其序列与亲代序列SEQIDNO2具有至少50％的一致性，并且该多核苷酸所编码的多肽在其上文所述的氨基酸序列中具有变化。
因此，本发明的优选的目的是编码本发明的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽具有氨基酸K358R,A359G和S360A(逆转录酶RTO_3M)的变化。在本发明的具体的实施方案中，本发明的多核苷酸相当于SEQIDNO4。
本发明的另一个优选的目的是编码本发明的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽具有氨基酸K358R,A359G和S360A的变化，以及额外的取代T355A和Q357M(逆转录酶RTO_5M)。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸相当于SEQIDNO6。
因此，本发明的另一个优选的目的是编码本发明的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽具有氨基酸K358R,A359G和S360A的变化，以及额外的T69SSG(逆转录酶RTO_T69SSG_3M)。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸相当于SEQIDNO8。
本发明的另一个优选的目的是编码本发明的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽具有氨基酸K358R,A359G和S360A的变化，以及额外的取代E478Q(逆转录酶RTO_E478Q_3M)。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸相当于SEQIDNO10。
因此，在本发明的另一个优选的目的中，逆转录酶RTO_3M,RTO_5M,RTO_T69SSG_3M和RTO_E478Q_3M具有编码了N-末端的MNS侧翼多肽序列和C-末端的组氨酸尾部的核苷酸序列，从而得到编码逆转录酶RTO_3M*,RTO_5M*,RTO_T69SSG_3M*和RTO_E478Q_3M*的多核苷酸，该多核苷酸在具体的目的中分别相当于核苷酸序列SEQIDNO14,SEQIDNO16,SEQIDNO18和SEQIDNO20。
考虑到HIV的不同流行毒株和分离物的RT可以类似地演变，希望编码这些RT的基因的整体一致性等于或大于50％，更具体为在相当于SEQIDNO2(RTO_WT)的多核苷酸序列的水平下，整体一致性等于60％或更高。此外，在作为本发明的目的的RT的氨基酸序列与其他类似的RT的序列之间的一致性或同源性程度可以通过本领域已知的方法来测定。例如通过将假定的RT的氨基酸序列与相当于本文件的RTO_3M的氨基酸序列比对。
如本文件中所用，术语“同源性”是指由于具有共同的演变谱系而在2个结构之间存在的相似性，更具体而言是指在2个或多个多核苷酸中在相当位置处的核苷酸之间的相似性或一致性。
如本文件中所用，术语“一致性”是指在相比较的2个多核苷酸之间一致的核苷酸的比率。用于序列比较的方法是本领域已知的，并且包括但不限于BLASTP或BLASTN,ClustalW和FASTA程序。考虑到如果2种蛋白质具有相同的演变起源或者如果它们具有相似的功能和结构则认为这2种蛋白质是同源的，通常认为相似性或一致性的值高于30％表明同源的结构。因此，我们认为一致性百分率为至少80％将保持所述的多肽的相同的性质。
人类免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)是人类中AIDS的病因。该病毒属于逆转录病毒科慢病毒属(逆转录病毒)，其中它们的主要特征之一是极大的遗传多样性。HIV-1分类成4组：M、O、N和P。HIV-1O组的首次分离物是在1987年的感染患者得到，并且它们的核苷酸序列在3年后公开(DeLeysetal.J.Virol.1990；64:1207-1216)。目前，HIV-1O组的变体(例如毒株MVP5180/91)可以得自NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram(http://www.aidsreagent.org)(Germantown,Maryland,USA)。此外，本发明所包含的信息还能够使本领域的专家能够由不同毒株的RT序列开始，生成热稳定性比原始的酶更高的RT变体。
如本文件中所用，术语“分离的”是指以下的核苷酸或肽，其：1)基本不含在自然情况下通常与它们相伴的或者与它们相互作用的成分；或者2)如果在自然介质中发现它们，则它们是通过人类干预在合成时(非自然的)被改变和/或被引入至通常不包含它们的细胞中。例如如果天然的多核苷酸通过人类干预(通过例如但不限于定点诱变、加入插入物和/或删除等)而被改变，则其为“分离物”。类似地，如果天然多核苷酸通过非自然的方式被引入至用于该多核苷酸(转染)的非天然有机体中，则其为“分离物”。因此，在后一种情况下，术语“分离物”相当于术语“异源的”。
使用本发明所提供的信息，本领域的专家能够识别与本发明所述的那些同源的核苷酸序列，该核苷酸序列编码了与针对本发明的RT所述的那些具有相同特征的RT。因此，本发明的多核苷酸构成编码RT变体的序列，该RT变体由HIV-1O组分离得到，并具有所述的改良的活性，其中所述的多核苷酸序列相当于：
a)分离的多核苷酸序列或其互补链的核酸分子；
b)其中互补链能够与(a)中所述的多核苷酸序列杂交的核酸分子；或者
c)核酸分子，其中该序列由于遗传密码子的简并性而不同于(a)和/或(b)。
本发明的多核苷酸可以以原样分离，或者作为载体的成分分离，其中所述的载体能够使这些多核苷酸在合适的宿主细胞中增殖。因此，在另一个目的中，本发明涉及载体，在下文中称为本发明的载体，其包含之前所述的本发明的多核苷酸。
所述的载体可以为例如克隆载体或表达载体。优选地，该载体为用于表达和纯化本发明的RT的合适的质粒。
如本说明书中所用，术语“克隆载体”是指其中可以整合另一个DNA片段但不会失去自我复制的能力的DNA分子。表达载体的实例为但不限于质粒、粘粒、DNA噬菌体或人工酵母染色体。
如本说明书中所用，术语“表达载体”是指适用于表达核酸的克隆载体，其中所述的核酸在被引入至细胞(称为宿主细胞)中之后在载体中克隆。该核酸通常可任选地与控制序列结合。
术语“表达”是指其中由多核苷酸开始合成多肽的过程。其包括多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)，以及该mRNA翻译成蛋白质或多肽。
如本说明书中所用，术语“起宿主作用的细胞”或“宿主细胞”是指作为表达或克隆载体或者任何其他DNA分子的受体的任何原核或真核有机体。
用于插入本发明的多核苷酸的合适的载体为：用于在原核生物中表达蛋白质的质粒，例如pUC18,pUC19,Bluescript及衍生物,mp18,mp19,pBR322,pMB9,Co1E1,pCR1,RP4,噬菌体和"穿梭"载体(例如pSA3和pAT28)；在酵母中的表达载体，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2微米质粒,整合质粒,YEP载体,着丝粒质粒等；在昆虫细胞中的表达载体，例如表达载体的pAC和pVL系列的载体；植物中的表达载体，例如piBi,pEarleyGate,PAVA,pCAMBIA,PGSA,PGWB,PMDC,PMY,孢子等；以及在真核细胞中使用的蛋白质的其他表达质粒，包括适用于使用本领域的任何系统来转染昆虫细胞的杆状病毒。
如本文件所用，“宿主细胞”或“其宿主作用的细胞”包括可以通过引入DNA进行修饰的任何可培养的细胞，其中所述的DNA并非天然包含在所述的细胞中，所述的细胞在下文中称为本发明的宿主细胞。
优选的，宿主细胞为其中本发明的多核苷酸可以表达从而得到稳定的多肽、翻译后修饰以及定位于合适的亚细胞区间的细胞。此外，还可以通过选择检测信号来影响合适的宿主细胞的选择。例如使用具有报告基因(例如lacZ,荧光素酶,胸苷激酶或绿色荧光蛋白“GFP”)的构建体可以通过响应于调节转录的蛋白质来活化或抑制所关注的基因的转录，从而提供可选择的信号。为了取得最佳的选择或“筛选”，应该考虑宿主细胞的表现型。
本发明的宿主细胞包括原核和真核细胞。原核生物可以包括革兰氏阴性有机体(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))或革兰氏阳性有机体(例如芽孢杆菌属的细菌)。原核细胞优选地用于增殖载体(其包含本发明的多核苷酸(多个))的转录控制序列，其能够获得包含本发明的多核苷酸(多个)的大量拷贝的载体。用于转化这种载体的合适的原核宿主细胞包括例如但不限于大肠杆菌，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)，以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的其他物种。真核宿主细胞包括酵母、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞和寄生虫有机体的细胞(例如锥虫)。如本文件中所用，术语酵母不仅包括严格分类意义上的酵母(其为单细胞真菌)，而且还包括与酵母和丝状真菌类似的多细胞真菌。其物种的实例为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis)，并且酿酒酵母和毕赤酵母(Pichiapastoris)作为优选的有机体。可以用于生产本发明的聚氨基酸序列的其他酵母为粗糙链孢菌(Neurosporacrassa),黑曲霉(Aspergillusniger),构巢曲霉(Aspergillusnidulans),热带念珠菌(Candidatropicalis)以及多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)。使用哺乳动物宿主细胞的培养系统包括包括所建立的细胞系，例如COS细胞、L细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵细胞(CHO)、胚胎干细胞，并且BKH、HeK或HeLa为优选的细胞。真核细胞优选地用于通过使用转录调节序列或本发明的表达载体来表达重组基因。
因此，本方面的另一个目的涉及用于获得本发明的多肽的方法，该方法包括：
1)将本发明的载体引入至合适的宿主细胞(本发明的宿主细胞)中；
2)在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞；以及
3)纯化具有RT活性的本发明的多肽。
宿主细胞的培养物
宿主细胞的培养是指保持并使宿主细胞生长的过程。细胞培养需要受控的温度、pH、气体百分率(氧气和二氧化碳)的条件，以及存在能够保持活力和细胞分裂的合适的营养物。可以在固体底物(例如琼脂)或液体培养基(其可以在悬液中培养大量的细胞)上进行细胞培养。
如本说明书中所用，术语“纯化”是指将本发明的多肽或其浓缩物与本发明的宿主细胞的培养基中存在的其他多肽分离。可以通过差异溶解度技术、色谱、电泳或等电子聚焦来分离RT。色谱技术可以基于分子量、离子电荷(基于工作条件下氨基酸的离子化状态)、蛋白质对某些色谱基质或柱的亲和性、或者通过纯化标签，并且可以在柱中、在纸或板上实施。可以例如通过使用硫酸铵的沉淀、快速蛋白质液相色谱(FPLC)或高效液相色谱(HPLC)、使用显著减少纯化时间并增加纯化产率的自动化系统来分离蛋白质。
如本说明书中所用，表达“纯化标签”或“亲和标签”是指被引入至(通常通过基因改造)蛋白质中从而有利于纯化的氨基酸序列。可以作为另一种蛋白质或氨基酸短序列的标签能够通过例如亲和色谱来纯化蛋白质。本领域已知的纯化标签为例如但不限于钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸残基的尾部。
本发明的另一个目的涉及用于获得本发明的多核苷酸的方法，在下文中称为本发明的方法，该方法通过以下过程实施，例如但不限于：由未突变的多核苷酸起来通过定点或随机诱变，完整多核苷酸的化学合成，或者通过组装编码所述的序列(待获得)的不同部分的DNA片段。
本发明的另一个目的涉及本发明的多核苷酸用于获得具有RT活性的本发明的多肽的用途。
本发明的另一个目的涉及本发明的宿主细胞用于获得本发明的多肽的用途。优选地，本发明的宿主细胞为细菌，更优选为大肠杆菌。
在升高的温度下稳定的RT(例如本发明的多肽)可用于多种应用中，例如困难RNA的扩增，其中所述的困难RNA为包含二级结构和/或富含G:C碱基对的序列的那些。
因此，本发明的另一个目的是本发明的多肽在本领域早已已知的任何应用或方法中的用途。
本发明的特定的目的涉及逆转录核酸模板(优选为mRNA或miRNA)的方法，该方法包括：
a)将模板核酸与本发明的RT混合；以及
b)在能够合成DNA的条件下温育步骤(a)的混合物，其中所述的DNA与模板核酸互补。
本发明的另一个特定的目的涉及核酸模板(优选为mRNA或miRNA)的扩增方法，该方法包括：
a)将所述的核酸与本发明的RNT以及DNA依赖的聚合酶混合；以及
b)在能够扩增DNA的条件下温育步骤(a)的混合物，其中所述的DNA与模板核酸互补。
本发明的另一个特定的目的涉及核酸(优选为mRNA或miRNA)的测序方法，该方法包括：
a)使所述的核酸与本发明的RT相接触；
b)在能够合成大量DNA分子的条件下温育所述的混合物，其中所述的DNA分子与模板核酸互补；以及
c)分离这种大量的互补DNA分子，从而测定核苷酸序列。
如本说明书中所用，术语“逆转录”或“反转录”是指与RNA互补的DNA的合成。
如本说明书中所用，术语“扩增”是指模板核酸的拷贝数增加。在优选的实施方案中，扩增通过PCR进行。
如本说明书中所用，术语“测序”是指测定模板核酸的核苷酸的顺序。
如本说明书中所用，术语“模板核酸”或“模板”是指有待被逆转录、扩增或测序的单链或双链核酸分子。
表达“能够合成互补DNA的条件”是指其中通过与模板核酸的碱基互补性而可以将核苷酸加入至新生DNA中的条件。
其中进行DNA合成的条件通常包括：(a)使模板核酸与本发明的RT在还包含引物、二价阳离子(例如Mg2+)和核苷酸的混合物中接触；以及(b)使该混合物经历足够的温度，使得DNA聚合酶(例如本方面的RT)通过与模板核酸的碱基互补性而开始将核苷酸引入至引物中，从而得到大量不同大小的互补DNA分子。分离大量的互补DNA分子能够测定模板核酸的核苷酸序列。
在互补DNA合成的过程中引入有害配对的核苷酸可以得到一个或多个错配的碱基。因此，合成的DNA链不能精确地与模板核酸互补。
表达“能够合成模板核酸的大量互补DNA分子的条件”是指以下条件，其中在该条件下实施测序，并且通常包括(a)使模板核酸与本发明的RT在包含引物、二价阳离子(例如Mg2+)和核苷酸(通常为dNTP和至少一种ddNTP)的混合物中接触；以及(b)使该混合物经历足够的温度，使得DNA聚合酶(例如本发明的RT)通过与模板核酸的碱基互补性而开始将核苷酸引入至引物中，从而得到大量不同大小的互补DNA分子。分离这种大量的互补DNA分子(通常通过电泳)能够测定模板核酸的核苷酸序列。
如本发明所用，术语“引物”是指当其与模板核酸杂交时能够起到DNA合成的起点作用的寡核苷酸。优选地，引物为脱氧核糖的核苷酸。
引物可以通过任何合适的方法制备，包括例如但不限于合适序列的克隆和限制，以及直接化学合成。引物可以被设计成与模板核酸中特定的核酸序列杂交(特定的引物)，或者可以随机合成(随机引物)。
如本说明书中所用，术语“特定的引物”是指以下引物，其中所述的引物序列与待逆转录、扩增或测序的模板核酸中的特定的核苷酸序列互补。
术语“随机引物”是指以下引物，其中所述的引物序列被随机合成，并且其用于在待逆转录、扩增或测序的模板核酸的随机位置处开始合成DNA。往往可以使用大量的不同的随机引物。术语“随机引物”是指一组引物，其中所述的引物序列被随机成，并且其用于在待逆转录、扩增或测序的模板核酸的随机位置处开始DNA合成。
如本说明书中所用，术语“杂交”是指互补的单链核酸(DNA和/或)RNA分子的2个分子配对，从而得到双链分子。优选地，互补性为100％。换言之，在互补性区域中，2个核酸分子的每个分子的每个核苷酸都可以与其他核酸分子中存在的核苷酸形成氢键。但是，具有本领域的常规经验的那些人员将意识到互补性区域低于100％的2个核酸分子也可以杂交。
如本说明书中所用，术语“核苷酸”是指通过戊糖、含氮碱基和磷酸基团的共价结合而形成的有机分子。术语核苷酸包括脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，例如但不限于dATP,dCTP,dITP,dUTP,dGTP,dTTP或它们的衍生物。此外，术语核苷酸还包括双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)，例如ddATP,ddCTP,ddGTP,ddlTP,ddTTP或它们的衍生物。根据本发明，“核苷酸”或“引物”可以通过本领域公知的技术来标记或形成标签。可检测的标签包括例如放射性同位素、荧光标签、化学发光标签、生物发光标签或酶标签。
如本说明书所用，术语“DNA依赖的DNA聚合酶”是指能够使用DNA作为模板核酸而催化脱氧核糖核苷酸聚合的DNA聚合酶。DNA依赖的DNA聚合酶(可用于本发明的扩增方法)的实例为但不限于嗜热链球菌(Thermusthermophilus)(Tth),水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)(Taq),新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)(Tne),海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(Tma),Thermococcuslitera/Is(TlioVentTM),激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu),火球菌属的菌种GB-D(DeepVentTM),Pyrococcuswaasii(Pwo),嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Bst),Bacilluscaldaphilus(Bca),酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)(Sac),嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum)(Tac),黄色栖热菌(Thermusflavus)(Tfl/Tub),红栖热菌(Thermusruber)(Tru),Thermusbrockianus(DyNAzymeTM),嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(Mth)或分枝杆菌属的菌种(Mtb,Mlep)的DNA聚合酶。
本发明的另一个目的涉及试剂盒，其包含用于实施本说明书中之前所述的任何方法的所必需的成分，在下文中为本发明的试剂盒。
本发明的该目的的优选的实施方案涉及本发明的试剂盒，其用于实施在本说明书中之前所述的任何方法，并且包括：
a)本发明的RT；以及
b)列表中的至少一种成分，包括：
i)缓冲液；
ii)引物；
iii)DNA依赖的DNA聚合酶；以及
iv)核苷酸。
本发明的特定目的涉及本发明的试剂盒用于模板核酸的逆转录、扩增或测序的用途，其中所述的核酸优选为信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)或miRNA前体。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变体不排除其他的技术特征、添加剂、成分或步骤。对于本领域的专家而言，本发明的其他目的、优点和特征部分由说明书得到，部分由本发明的实践得到。提供以下实施例和附图是为了说明本发明，并且无意于限定本发明。
实施例
逆转录反应的温度对使用HIV-1O组不同突变体的RT-PCR反应效力的影响
在通过PCR扩增所得的DNA拷贝之后，来测定在不同温度下逆转录反应的效力。在37至78℃范围内的不同温度下实施的逆转录反应中，在扩增由肌动蛋白基因衍生得到的大约500至950碱基对的RNA片段中，突变体K358R/A359G/S360A(RTO_3M*),K358R/A359G/S360A/E478Q(RTO_E478Q_3M*),T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A(RTO_5M*)和T69SSG/K358R/A359G/S360A(RTO_T69SSG_3M*)比HIV-1O组的“野生型”RT(RTO_WT*)和其他的突变体RT更有效(图1)。
这些结果符合实时PCR反应中扩增由肌动蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的信使RNA衍生得到的序列所得到的结果。在上述2种情况下，观察到在75至78℃的温度下，突变体RTO_3M*和RTO_E478Q_3M*的逆转录的效力明显高于“野生型”RT的效力(图2)。在突变体RTO_T69SSG_3M*的情况下，观察到扩增的效力高于用于GAPDH的RNA的“野生型”酶，并与用于肌动蛋白的RNA的酶类似。
在升高的温度下具有最高活性的突变体的复制保真度
在引入单一核苷酸的检测中，逆转录酶RTO_3M*,RTO_5M*和RTO_E478Q_3M*显示出与“野生型”酶(RTO_WT*)相似的催化活性(表2)，但是突变体RTO_T69SSG_3M*的催化效力(kpol/Kd)稍微低于野生型酶。发现，在3'错配的G:T末端的延伸检测中，所研究的酶之间无显著性差异。在G:A和G:G末端的延伸中，所有RT均显示与“野生型”酶相似的效力，但是突变体RTO_T69SSG_3M*比其他酶更倾向于延伸G:G或G:A末端(图3)。
表2.在前稳态下测定的，对于“野生型”HIV-1O组(RTO_WT*)以及突变体RTO_3M*,RTO_5M*,RTO_T69SSG_3M*和RTO_E478Q_3M*的RT而言，在模板-引物复合物31T/21P上错配末端的延伸的动力学参数。在最后一列中，括号之间所示的数值显示错配末端的延伸效率之间，与RTO_WT*的系数相比，保真度增加。
此外，在互补作用的检测中测量这些酶的一部分酶的复制保真度，其中所述的检测利用了携带lacZ基因的M13mp2噬菌体的多样性。测定在使用不同的重组RT实施合成过程时获得突变体的频率。此外，在这些检测中，未观察到突变体与“野生型”酶的复制保真度之间的显著性差异(表3)。综上，这些数据表明由本发明所述的突变体所显示的、在高温下逆转录效率的升高对酶的复制保真度不具有不利的影响。
表3.与RTO_WT*相比的并且通过基因互补作用检测(M13mp2lacZα“正向突变检测”)所评估的、突变体RTO_3M*,RTO_T69SSG_3M*和RTO_E478Q_3M*的复制保真度。由2个独立的试验所获得的RTO_WT*的数据之前已经公开(etal.NucleicAcidsRes2013；41:4601-4612)。
材料和方法
O组RT及其突变体的表达和纯化
使用改良形式的p66RTB质粒实施RT的表达和纯化(Borettoetal.Anal.Biochem.2001；292:139-147；Matamorosetal.J.Mol.Biol.2005；349:451-463)，所述的质粒包含氨苄青霉素抗性基因，并且其中编码HIV-1O组分离物的RT的p66亚基的基因被克隆(Menéndez-Ariasetal.J.Biol.Chem.2001；276:27470-27479；etal.JMolBiol2009；392:872-884；专利WO2010130864)。通过根据Boretto等人所述的程序来实施RT的纯化(Anal.Biochem.2001；292:139-147)，其包括细菌溶解和均化步骤，然后实施离子交换色谱(在磷酸纤维素中)和亲和色谱(在Ni2+-腈基乙酸琼脂糖柱中)。
在HIV-1O组的RT的情况下，构建带有突变的质粒
使用得自的Stratagene的“Quik-ChangeSite-DirectedMutagenesis”试剂盒，根据制造商提供的说明书，通过定点诱变而获得用于表达突变体TsRTO_3M*,RTO_E478Q_3M*,RTO_5M*和RTO_T69SSG_3M*的质粒。
使用以下诱变寡核苷酸：
a)引入突变K358R/A359G/S360A：
5’-GGGAAATATACTAGGCAAAGGGGCGCCCACACAAATGAC-3’
5’-GTCATTTGTGTGGGCGCCCCTTTGCCTAGTATATTTCCC-3’
b)用于T355A：
5’-ACAGGGAAATATGCTAGGATGAGGGGCGCC-3’和
5’-GGCGCCCCTCATCCTAGCATATTTCCCTGT-3’
c)用于Q357M：
5’-GGGAAATATACTAGGATGAGGGGCGCCCACACAAATGAC-3’和
5’-GTCATTTGTGTGGGCGCCCCTCATCCTAGTATATTTCCC-3’
d)用于E478Q：
5’-CCAATCAAAAGGCTCAATTAATGGCAG-3’和
5’-CTGCCATTAATTGAGCCTTTTGATTGG-3’
e)引入变化T69S，并插入Ser-Gly：
5’-GCTATAAAAAAGAAAGATAGTAGTTCCGGGAAGTGGAGAAAGCTGGTAGAC-3’
5’-GTCTACCAGCTTTCTCCACTTCCCGGAACTACTATCTTTCTTTTTTATAGC-3’
按照之前所述，使用编码“野生型”HIV-1O组p66的序列的质粒载体作为模板，用于引入K358R/A359G/S360A(etal.JMolBiol2009；392:872-884；专利WO2010130864)。将突变T355A和E478Q、以及突变T69S(与插入SG有关)分别引入至K358R/A359G/S360A的质粒载体中，从而得到突变体：T355A/K358R/A359G/S360A,K358R/A359G/S360A/E478Q和T69SSG/K358R/A359G/S360A。最后，在变化T355A/K358R/A359G/S360A的表达质粒载体中引入变化Q357M，从而得到突变体T355A/Q357M/K358R/A359G/S360A。在所有情况下，在诱变后，检查这些质粒中编码p66的区域的序列是正确的，并且仅包含引入的突变。
突变对逆转录反应偶联PCR扩增的效力的影响
在不同的温度下实施逆转录反应，然后在标准的条件下通过PCR来扩增反应产物(cDNA)(etal.JMolBiol2009；392:872-884)。通常，在20μl体积(4μl250mMTris-HCl缓冲液(pH8.3，在25℃下)，其包含375mMKCl,15mMMgCl2和50mM二硫苏糖醇；由小鼠肝脏分离得到的1μl总RNA(1μg/μl)；4μl4种dNTP的混合物(每种2.5mM)；1μl寡(dT)16(100μM)；0.5μl核糖核酸酶抑制剂(40单位/μl)；大致浓度为150nM的RT；剩余部分用水补至20μl)下实施逆转录反应。开始时，将RNA和寡dT在68℃下温育3min。然后加入其它的反应成分(包括RT)，并在所需的温度下温育1小时，从而得到cDNA。最后，通过在92℃下温育10min将酶灭活来终止反应。在标准的条件下，使用Taq聚合酶或其他类似的酶(例如ExpandHighFidelityDNA聚合酶)，通过PCR来扩增cDNA。
实时PCR
在不同的温度(37,50,68,75和78℃)下通过实时PCR来测定RT的逆转录的效率。为了实现此目的，在各试验中实施3个独立的反应。所有的反应均是在20μl体积(50mMTris-HCl缓冲液(pH8.3)，其包含75mMKCl,3mMMgCl2,10mM二硫苏糖醇；1U/μl核糖核酸酶抑制剂(Plus,Promega)；500μM各种dNTP；5μM寡(dT)16；50ng/μl小鼠肝脏的总RNA(Stratagene)以及相应的150nM的RT)下实施的。在上文部分中所述的条件下进行模板RNA与寡(dT)16的杂交以及cDNA的合成反应。
通过定量PCR(qPCR)来测定逆转录的效率，从而计算由β-肌动蛋白和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的信使RNA所生产的cDNA的相对量。为了实现此目的，寡核苷酸5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’和5’-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3’用于肌动蛋白，而5’-CTCCCACTCTTCCACCTTCG-3’和5’-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3’用于GAPDH。在10μl的最终体积中一式三份进行PCR反应的扩增，其中cDNA的量约等于5ng的总RNA,250nM的各寡居核苷酸("引物")和5μl的PowerSybrGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystemsPN4367659)，PowerSybrGreenPCRMasterMix包含AmpliTaqDNA聚合酶,dNTPs和其他实施PCR反应所必需的其他试剂。在95℃(10min)的最初的变性期后，使样品经历40个扩增循环(在95℃下，15s；加上在60℃烯，1min)。在该程序结束时包括60至95℃的变性曲线(2％斜率)，从而证明PCR的特异性。在ABI7900HT定量PCR仪器(AppliedBiosystems)中，在60℃及变性下在所述的步骤中测量荧光。在所有的板中均包括阴性对照以及基因扩增效率控制曲线。
使用SDS2.2.1程序(AppliedBiosystems)进行数据分析。针对各种样品来计算ΔCt值：ΔCt＝Ct–Ctref，其中Ct为其中观察到明显扩增的周期，为Ctref由BH10克隆的WTRT所获得的Ct值的平均值。按照2ΔCt来计算所获得的cDNA的相对量，并将其值表示为平均值±各试验中所计算的3个值的标准偏差。
复制保真度的检测
通过错配延伸动力学检测来测定RT的复制保真度，所有的测定均是在前稳态条件下实施的，从而测定各种RT延伸正确或错误配对的模板-引物复合物的能力(Matamorosetal.J.Mol.Biol.2008；375:1234-1248；Barrioluengoetal.BiochemJ2011；436:599-607)。此外，在M13mp2噬菌体的情况下，根据lacZα基因的表达来进行基因检测(BebenekandKunkel.MethodsEnzymol.1995；262:217-232；Barrioluengoetal.BiochemJ2011；436:599-607)。

Claims (26)

1.编码具有逆转录酶活性的、由HIV-1O组分离得到的蛋白质的多肽，其中所述的蛋白质在高温下具有较高的稳定性；在超过75℃的温度下具有高于亲代酶的活性，从而保持了复制保真度；并且特征在于其氨基酸序列与亲代序列SEQIDNO1具有至少50％的一致性，并且其至少包含以下的氨基酸变化：
-在与SEQIDNO1的位置358同源的位置处，使用氨基酸精氨酸(R)替代原始氨基酸赖氨酸(K)(突变K358R)；
-在与SEQIDNO1的位置359同源的位置处，使用氨基酸甘氨酸(G)替代原始氨基酸丙氨酸(A)(突变A359G)；以及
-在与SEQIDNO1的位置360同源的位置处，使用氨基酸丙氨酸(A)替代原始氨基酸丝氨酸(S)(突变S360A)。
2.权利要求1所述的多肽，其中所述的氨基酸序列还具有以下其他突变的至少一种或者它们的组合：
a)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨酸(SSG)来替代代原氨基酸苏氨酸(T)(突变T69SSG)；
b)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸(A)替代氨代原基酸苏氨酸(T)(突变T355A)；
c)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸(M)替代原始氨基酸谷氨酰胺(Q)(突变Q357M)；
d)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酰胺(Q)替代代原氨基酸谷氨酸(E)(E478Q)。
3.权利要求1所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO3。
4.权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO5。
5.权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO7。
6.权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO9。
7.权利要求1至6所述的多肽，其另外具有位于N-末端的MNS侧翼序列以及位于C-末端的组氨酸尾部，所述的多肽特征在于其序列相当于以下的任意一种：SEQIDNO13,SEQIDNO15,SEQIDNO17,SEQIDNO19。
8.编码具有逆转录酶活性的、由HIV-1O组分离得到的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽在高温下具有较高的稳定性；在超过75℃的温度下具有高于亲代酶的活性，从而保持了复制保真度；并且特征在于其编码了权利要求1至7所述的任意一种核苷酸序列。
9.权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于其序列相当于以下的任意一种：SEQIDNO4,SEQIDNO6,SEQIDNO8,SEQIDNO10,SEQIDNO14,SEQIDNO16,SEQIDNO18,SEQIDNO20。
10.载体，其特征在于其包含权利要求8和9所述的多核苷酸。
11.宿主细胞，其特征在于其包含权利要求8和9所述的多核苷酸或者权利要求10所述的载体，并且能够生产权利要求1至7所述的多肽。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于其为细菌。
13.权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于其为大肠杆菌。
14.用于获得权利要求1至7所述的多肽的方法，其特征在于其包括以下步骤：
a)将权利要求10所述的载体引入至合适的宿主细胞中；
b)在所述的合适的培养基中培养所述的宿主细胞；以及
c)纯化所述的具有逆转录酶活性的多肽。
15.权利要求8和9所述的多核苷酸用于获得权利要求1至7所述的多肽的用途。
16.权利要求11至13所述的宿主细胞用于获得权利要求1至7所述的多肽的用途。
17.权利要求1至7所述的多肽用于逆转录模板核酸的用途。
18.权利要求1至7所述的多肽用于扩增模板核酸的用途。
19.权利要求1至7所述的多肽用于对模板核酸进行测序的用途。
20.权利要求17至19所述的多肽的用途，其中所述的模板核酸为mRNA或miRNA。
21.逆转录模板核酸的方法，其包括：
a)将所述的模板核酸与权利要求1至7所述的多肽混合；
b)在能够合成DNA的条件下温育步骤(a)所述的混合物，其中所述的DNA与所述的模板核酸互补。
22.扩增模板核酸的方法，其包括：
a)将所述的核酸与权利要求1至7所述的多肽以及至少一种DNA依赖的DNA聚合酶混合；以及
b)在能够扩增DNA的条件下温育步骤(a)所述的混合物，其中所述的DNA与所述的模板核酸互补。
23.核酸的测序方法，其包括：
a)使所述的核酸与权利要求1至7所述的多肽相接触；
b)在能够合成大量DNA分子的条件下温育所述的混合物，其中所述的DNA分子与所述的模板核酸互补；以及
c)分离这种大量的互补DNA分子，从而测定所述的核苷酸序列。
24.权利要求21至23所述的方法，其中所述的模板核酸为mRNA或miRNA。
25.试剂盒，其包含用于实施权利要求21至24所述的方法的必需成分，所述的试剂盒包含：
a)权利要求1至7所述的多肽；以及
b)列表中的至少一种成分，包括：
i)缓冲液；
ii)引物；
iii)DNA依赖的DNA聚合酶；以及
iv)核苷酸。
26.权利要求25所述的试剂盒用于实施权利要求21至24所述的方法的用途。
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