CN112703248A - 具有改良链置换能力的突变型dna聚合酶 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了相对于对应的未修饰聚合酶具有增加的5′‑3′链置换活性与显著降低的5′‑3′核酸外切酶和核酸内切酶活性的DNA聚合酶。所述聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法。还公开了相关的组合物,所述组合物包括重组核酸、载体和宿主细胞,其可用于例如DNA聚合酶的生产。
Description
优先权信息
本专利申请要求于2018年9月13日提交的美国临时专利申请号62/730,908的优先权,其内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的。2018年8月29日创建的150,900字节的机器格式IBM-PC、MS-Windows操作系统的文件SequenceListing_31934-US.txt中写入的序列表全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明提供了具有改良活性的DNA聚合酶,其包括增加的5'-3'链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性,以及此类聚合酶在各种应用中的用途,其包括核酸多核苷酸延伸和扩增。
背景技术
DNA聚合酶负责基因组的复制和维持,该作用对于准确地一代一代地传递遗传信息至关重要。DNA聚合酶在细胞中起负责DNA合成的酶的作用。它们在金属活化剂存在(诸如Mg2+)的情况下,按照复制的DNA模板或多核苷酸模板指示的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内,DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程,其包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每个DNA合成过程期间,DNA模板复制一次或至多几次,以产生相同的复制品。相反,在体外,DNA复制可以诸如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号4,683,202)重复很多次。
在用聚合酶链式反应(PCR)的初步研究中,在每轮DNA复制的开始添加DNA聚合酶(参见美国专利号4,683,202)。随后,确定可以从在高温下生长的细菌获得热稳定DNA聚合酶,并且确定这些酶仅需要添加一次(参见美国专利号4,889,818和美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下,这些酶不会不可逆地失活。结果,人们可以进行重复的聚合酶链式反应循环,而无需在每个合成加成过程的开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶、特别是热稳定的聚合酶是重组DNA研究和疾病的医学诊断中众多技术的关键。特别是对于诊断应用,靶核酸序列可能只是所讨论的DNA或RNA的一小部分,因此可能难以在不进行扩增的情况下检测出靶核酸序列的存在。
DNA聚合酶的整体折叠模式类似于人类的右手,并包含手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见Beese等人,Science 260:352-355,1993);Patel等人,Biochemistry34:5351-5363,1995)。尽管手指和拇指亚结构域的结构在大小和细胞功能不同的聚合酶之间差异很大,但催化性的手掌亚结构域均可重叠。例如,与引入的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序A可重叠,其中在哺乳动物polα和原核pol I家族DNA聚合酶之间的平均偏差约为一(Wang等人,Cell 89:1087-1099,1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反平行β-链起始并且延续至α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的一级氨基酸序列极为保守。在基序A的情况下,例如,序列DYSQIELR(SEQ ID NO:22)保留在来自由数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌、沙眼衣原体和大肠杆菌的聚合酶中。
除了高度保守之外,DNA聚合酶的活性位点也已证明是相对易突变的,其能够适应某些氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如Patel等人的美国专利号6,602,695)。此类突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择性优势。
链置换是指在DNA合成期间,聚合酶置换而不是降解所遇到的下游DNA的能力。在链置换复制期间,一次仅复制一条DNA链。链置换合成释放单链DNA,然后将其复制为双链DNA。许多热稳定DNA聚合酶表现出快速和持续的引物延伸DNA合成,但是链置换DNA合成效率低下。本公开提供了在高温下具有改良链置换活性的热稳定DNA聚合酶,其导致改良的5'-3'链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性。
发明内容
本文提供了当其他具有显著链置换活性的DNA聚合酶,例如Phi 29DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶不能起作用时,在高温下具有改良的链置换活性的热稳定DNA聚合酶。本公开描述了DNA聚合酶的聚合酶结构域中的突变,其导致改良的5'-3'链置换活性和显著降低的核酸外切酶和/或核酸内切酶活性。在一些实施例中,DNA聚合酶具有降低的5'-3'核酸外切酶和/或核酸内切酶活性。本文所述的突变提供了基于紧密相关的DNA聚合酶的现有三维结构无法预料到的出乎意料的优势,并且本文所述的突变型聚合酶也将表现出增强的链置换活性,这即使回顾也是不可预测的。
一方面,本文提供了相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有改良的活性、包括增加的5'-3'链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性的DNA聚合酶,以及制备并使用此类DNA聚合酶的方法。在一些实施例中,与对照DNA聚合酶相比,改良的DNA聚合酶具有增加的5'-3'链置换活性。在一些实施例中,与对照DNA聚合酶相比,改良的DNA聚合酶具有显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性。在一些实施例中,对照DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施例中,对照DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列,除了对照DNA聚合酶在与SEQ ID NO:1的位置46相对应的氨基酸处具有突变。在一些实施例中,对照DNA聚合酶在与SEQ ID NO:1的位置46相对应的氨基酸处包含甘氨酸(Gly/G)至谷氨酸(Glu/E)突变。G46E突变削弱了5'-3'核酸外切酶和核酸内切酶的活性,这对于链置换酶是非期望的。在一些实施例中,对照DNA聚合酶包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列。在一些实施例中,对照DNA聚合酶由SEQ ID NO:41的核酸序列编码。在一些实施例中,本文所述的改良的或突变型DNA聚合酶由与SEQ ID NO:41具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核酸序列编码。在一些实施例中,对照DNA聚合酶包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
686、693、516、633、415、420、636、752、768、525、694、491、516、515、666、402、555、582、737、759、521、546、668、456、507、571、652、832、498、524、598、616、444、498、660、673、493、511、648、749和635。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
I686V、A693V、T516I、V633I、Q415H、E420D、E636G、N752S、V768M、R525G、F694S、Q491H、T516S、S515F、T666M、E402V、V555A、N582D、A737T、A759T、L521Q、T546A、N668S、A456T、K507M、T571A、S652F、A832V、D498E、L524V、R598G、M616I、A444T、M660K、Y673N、E493D、T511S、M648I、M749L和/或Q635K。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中DNA聚合酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
686、693、516、633、415、420、636、752、768、525、694、491、516、515、666、402、555、582、737、759、521、546、668、456、507、571、652、832、498、524、598、616、444、498、660、673、493、511、648、749和635。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中DNA聚合酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
I686、A693、T516、V633、Q415、E420、E636、N752、V768、R525、F694、Q491、T516、S515、T666、E402、V555、N582、A737、A759、L521、T546、N668、A456、K507、T571、S652、A832、D498、L524、R598、M616、A444、D498、M660、Y673、E493、T511、M648、M749和/或Q635。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中:
i.与SEQ ID NO:1的位置686相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸;
ii.与SEQ ID NO:1的位置693相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
iii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
iv.与SEQ ID NO:1的位置633相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
v.与SEQ ID NO:1的位置415相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸;
vi.与SEQ ID NO:1的位置420相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
vii.与SEQ ID NO:1的位置636相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
viii.与SEQ ID NO:1的位置752相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
ix.与SEQ ID NO:1的位置768相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
x.与SEQ ID NO:1的位置525相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除R以外的任何氨基酸;
xi.与SEQ ID NO:1的位置694相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除F以外的任何氨基酸;
xii.与SEQ ID NO:1的位置491相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸;
xiii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xiv.与SEQ ID NO:1的位置515相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸;
xv.与SEQ ID NO:1的位置666相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xvi.与SEQ ID NO:1的位置402相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
xvii.与SEQ ID NO:1的位置555相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
xviii.与SEQ ID NO:1的位置582相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
xix.与SEQ ID NO:1的位置737相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xx.与SEQ ID NO:1的位置759相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxi.与SEQ ID NO:1的位置521相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除L以外的任何氨基酸;
xxii.与SEQ ID NO:1的位置546相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxiii.与SEQ ID NO:1的位置668相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
xxiv.与SEQ ID NO:1的位置456相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxv.与SEQ ID NO:1的位置507相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除K以外的任何氨基酸;
xxvi.与SEQ ID NO:1的位置571相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxvii.与SEQ ID NO:1的位置652相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸;
xxviii.与SEQ ID NO:1的位置832相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxix.与SEQ ID NO:1的位置498相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸;
xxx.与SEQ ID NO:1的位置524相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除L以外的任何氨基酸;
xxxi.与SEQ ID NO:1的位置598相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除R以外的任何氨基酸;
xxxii.与SEQ ID NO:1的位置616相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxiii.与SEQ ID NO:1的位置444相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxxiv.与SEQ ID NO:1的位置660相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxv.与SEQ ID NO:1的位置673相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除Y以外的任何氨基酸;
xxxvi.与SEQ ID NO:1的位置493相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
xxxvii.与SEQ ID NO:1的位置511相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxxviii.与SEQ ID NO:1的位置648相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxix.与SEQ ID NO:1的位置749相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;和/或
xl.与SEQ ID NO:1的位置635相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中:
i.与SEQ ID NO:1的位置686相对应的DNA聚合酶的氨基酸是V;
ii.与SEQ ID NO:1的位置693相对应的DNA聚合酶的氨基酸是V;
iii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的DNA聚合酶的氨基酸是I;
iv.与SEQ ID NO:1的位置633相对应的DNA聚合酶的氨基酸是I;
v.与SEQ ID NO:1的位置415相对应的DNA聚合酶的氨基酸是H;
vi.与SEQ ID NO:1的位置420相对应的DNA聚合酶的氨基酸是D;
vii.与SEQ ID NO:1的位置636相对应的DNA聚合酶的氨基酸是G;
viii.与SEQ ID NO:1的位置752相对应的DNA聚合酶的氨基酸是S;
ix.与SEQ ID NO:1的位置768相对应的DNA聚合酶的氨基酸是M;
x.与SEQ ID NO:1的位置525相对应的DNA聚合酶的氨基酸是G;
xi.与SEQ ID NO:1的位置694相对应的DNA聚合酶的氨基酸是S;
xii.与SEQ ID NO:1的位置491相对应的DNA聚合酶的氨基酸是H;
xiii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的DNA聚合酶的氨基酸是S;
xiv.与SEQ ID NO:1的位置515相对应的DNA聚合酶的氨基酸是F;
xv.与SEQ ID NO:1的位置666相对应的DNA聚合酶的氨基酸是M;
xvi.与SEQ ID NO:1的位置402相对应的DNA聚合酶的氨基酸是V;
xvii.与SEQ ID NO:1的位置555相对应的DNA聚合酶的氨基酸是A;
xviii.与SEQ ID NO:1的位置582相对应的DNA聚合酶的氨基酸是D;
xix.与SEQ ID NO:1的位置737相对应的DNA聚合酶的氨基酸是T;
xx.与SEQ ID NO:1的位置759相对应的DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxi.与SEQ ID NO:1的位置521相对应的DNA聚合酶的氨基酸是Q;
xxii.与SEQ ID NO:1的位置546相对应的DNA聚合酶的氨基酸是A;
xxiii.与SEQ ID NO:1的位置668相对应的DNA聚合酶的氨基酸是S;
xxiv.与SEQ ID NO:1的位置456相对应的DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxv.与SEQ ID NO:1的位置507相对应的DNA聚合酶的氨基酸是M;
xxvi.与SEQ ID NO:1的位置571相对应的DNA聚合酶的氨基酸是A;
xxvii.与SEQ ID NO:1的位置652相对应的DNA聚合酶的氨基酸是F
xxviii.与SEQ ID NO:1的位置832相对应的DNA聚合酶的氨基酸是V;
xxix.与SEQ ID NO:1的位置498相对应的DNA聚合酶的氨基酸是E;
xxx.与SEQ ID NO:1的位置524相对应的DNA聚合酶的氨基酸是V;
xxxi.与SEQ ID NO:1的位置598相对应的DNA聚合酶的氨基酸是G;
xxxii.与SEQ ID NO:1的位置616相对应的DNA聚合酶的氨基酸是I;
xxxiii.与SEQ ID NO:1的位置444相对应的DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxxiv.与SEQ ID NO:1的位置660相对应的DNA聚合酶的氨基酸是K;
xxxv.与SEQ ID NO:1的位置673相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除Y以外的任何氨基酸;
xxxvi.与SEQ ID NO:1的位置493相对应的DNA聚合酶的氨基酸是D;
xxxvii.与SEQ ID NO:1的位置511相对应的DNA聚合酶的氨基酸是S;
xxxviii.与SEQ ID NO:1的位置648相对应的DNA聚合酶的氨基酸是I;
xxxix.与SEQ ID NO:1的位置749相对应的DNA聚合酶的氨基酸是L;和/或
xl.与SEQ ID NO:1的位置635相对应的DNA聚合酶的氨基酸是K。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中DNA聚合酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
I686V、A693V、T516I、V633I、Q415H、E420D、E636G、N752S、V768M、R525G、F694S、Q491H、T516S、S515F、T666M、E402V、V555A、N582D A737T、A759T、L521Q、T546A、N668S、A456T、K507M、T571A、S652F、S515F、A832V、D498E、L524V、R598G、M616I、A444T、D498E、M660K、Y673N、E493D、T511S、M648I、M749L和/或Q635K。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
686、693、516、633、415、420、636、752、768、525、694、491、516、515、666、402、555、582、737、759、521、546、668、456、507、571、652、515、832、498、524、598、616、444、498、660、673、493、511、648、749和635。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
I686V、A693V、T516I、V633I、Q415H、E420D、E636G、N752S、V768M、R525G、F694S、Q491H、T516S、S515F、T666M、E402V、V555A、N582D、A737T、A759T、L521Q、T546A、N668S、A456T、K507M、T571A、S652F、S515F、A832V、D498E、L524V、R598G、M616I、A444T、M660K、Y673N、E493D、T511S、M648I、M749L和/或Q635K。
在一些实施例中,DNA聚合酶的氨基酸序列包括在与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的以下项的位置相对应的位置的单一突变和/或突变的组合:
i.I686V和A693V;
ii.T516I和V633I;
iii.Q415H、E420D、E636G、N752S和V768M;
iv.R525G和F694S;
v.Q491H和T516S;
vi.S515F和T666M;
vii.E402V、V555A和N582D;
viii.A737T和A759T;
ix.L521Q和T546A;
x.N668S;
xi.A456T;
xii.K507M、T571A和S652F;
xiii.S515F和A832V;
xiv.D498E、L524V、R598G和M616I;
xv.A444T、D498E、M660K和Y673N;
xvi.E493D、T511S、M648I和M749L;和/或
xvii.Q635K。
在一些实施例中,突变位于与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的氨基酸515-516、521-525、633-636、666-668、和693-694相对应的一级氨基酸序列中的以下“热点”或片段中。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶进一步包含与SEQ ID NO:40基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中与SEQ ID NO:40的位置46相对应的DNA聚合酶的氨基酸是Glu(E)。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶进一步包含与SEQ ID NO:1基本相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中与SEQID NO:1的位置580相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的位置580相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的位置580相对应的DNA聚合酶的氨基酸选自由L、G、T、Q、A、S、N、R和K组成的组。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的位置580相对应的DNA聚合酶的氨基酸是G。
在一些实施例中,改良的DNA聚合酶进一步包含与SEQ ID NO:1基本上相同(例如,具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性)的氨基酸序列,其中与SEQ ID NO:1的位置709相对应的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的位置709相对应的DNA聚合酶的氨基酸选自由K、R、S、G和A组成的组。在一些实施例中,与SEQ ID NO:1的位置709相对应的DNA聚合酶的氨基酸是K。
多种DNA聚合酶适合于根据本发明的突变。特别适宜的是热稳定聚合酶,其包括来自各种嗜热菌的物种中的野生型或天然存在的热稳定聚合酶,以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其他修饰来源于此类野生型或天然存在的酶的合成热稳定聚合酶。示例性的未修饰形式的聚合酶包括例如CS5、CS6或Z05 DNA聚合酶,或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。其他未修饰聚合酶包括例如来自以下嗜热菌的物种中的任一个的DNA聚合酶(或与此类聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶):海栖热袍菌;水生栖热菌;嗜热栖热菌;黄栖热菌;丝状栖热菌;栖热菌种sps17;栖热菌种Z05;那不勒斯栖热袍菌;非洲栖热腔菌;Thermus caldophilus、耐辐射奇异球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或热坚芽孢杆菌。适合的聚合酶还包括那些具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸(诸如核糖核苷酸或其他2'-修饰的核苷酸)的聚合酶。
尽管具有有效逆转录活性的热稳定DNA聚合酶特别适合于执行RT-PCR,尤其是单酶RT-PCR,但是具有有效逆转录活性的热活性而并非热稳定的DNA聚合酶也适合于根据本发明的突变。例如,增加的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT抑制剂耐受性的属性可用于RT-PCR中的RT步骤,并且此步骤无需在会使热活性而并非热稳定的DNA聚合酶失活的温度下执行。在RT步骤之后,可以添加热稳定DNA聚合酶,或者它可能已经包含在反应混合物中,以执行PCR扩增步骤。例如,如示例中所述,在RT步骤之前,本文所述的改良的DNA聚合酶可以在适用于RNA和DNA模板的延伸和扩增的缓冲剂中与第二热稳定DNA聚合酶组合。合适的热稳定DNA聚合酶的示例在授予Gelfand等人的美国专利号4,889,818和美国专利号5,773、258和5,677,152中进行了描述,其全文以引用方式明确并入本文。在一些实施例中,第二热稳定DNA聚合酶是DNA聚合酶(脱氧核苷三磷酸:DNA脱氧核苷酸转移酶,E.C.2.7.7.7)。在一些实施例中,第二热稳定DNA聚合酶是可逆失活的热稳定聚合酶,如下所述。在一个实施例中,可逆失活的热稳定聚合酶是AmpliTaqDNA聚合酶(Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA)。通过使用化学修饰的热稳定DNA聚合酶(或其他使热稳定DNA聚合酶失活的HotStart技术),此第二方法将特别受益,从而使其在RT步骤期间不会完全活化。具有有效的逆转录活性的热活性而并非热稳定的DNA聚合酶的示例是来自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的DNA聚合酶(Chy;SEQ ID NO:39)。参见例如美国专利号6,468,775和6,399,320。
在一些实施例中,DNA聚合酶与选自由以下项组成的组中的聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性:
(a)栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)(SEQ ID NO:1);
(b)水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)(SEQ ID NO:2);
(c)丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)(SEQ ID NO:3);
(d)黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)(SEQ ID NO:4);
(e)栖热菌种sps17DNA聚合酶(Sps17)(SEQ ID NO:5);
(f)嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)(SEQ ID NO:6);以及
(g)Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)(SEQ ID NO:7)
(h)生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(Chy)(SEQ ID NO:39)
在一些实施例中,DNA聚合酶是栖热袍菌属DNA聚合酶。例如,在一些实施例中,DNA聚合酶与选自由以下项组成的组中的聚合酶具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性:
(a)海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)(SEQ ID NO:34);
(b)那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)(SEQ ID NO:35)。
在一些实施例中,DNA聚合酶与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、或SEQ ID NO:42具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的氨基酸序列同一性。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05DNA聚合酶,其进一步包括位置580处的取代,并且位置580处的氨基酸为除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05DNA聚合酶,并且位置580处的氨基酸可为除D以外的任何氨基酸。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶,并且位置580处的氨基酸选自由L、G、T、Q、A、S、N、R、和K组成的组。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶,并且位置580处的氨基酸为G。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶,其进一步包括位置709的取代,并且位置709处的氨基酸为除I以外的任何氨基酸。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶,并且位置709处的氨基酸选自由K、R、S、G和A组成的组。在一些实施例中,DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶,并且位置709处的氨基酸为K。
在一些实施例中,对照DNA聚合酶是Z05、Z05 D580G、或Z05D580G I709K聚合酶。在一些实施例中,对照DNA聚合酶是C21或C21G46E聚合酶(SEQ ID NO:40)。在一些实施例中,对照DNA聚合酶包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40、或SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
突变型或改良聚合酶可包括其他非取代性修饰。一种此类修饰是使酶失活的热可逆共价修饰,但在高温(诸如通常用于多核苷酸延伸的温度)下孵育时,其逆转以活化酶。用于此类热可逆修饰的示例性试剂描述于美国专利号5,773,258和5,677,152中,其全文以引用方式明确并入本文。
在各个其他方面,本公开提供了编码本文所述的突变型或改良DNA聚合酶的重组核酸、包括重组核酸的载体、以及使用载体转化的宿主细胞。在某些实施例中,载体是表达载体。包括此类表达载体的宿主细胞在本发明的方法中可用于通过在适用于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞来产生突变型或改良聚合酶。本发明的聚合酶可包含在反应混合物和/或试剂盒中。重组核酸、宿主细胞、载体、表达载体、反应混合物和试剂盒的实施例如上所述并且如本文所述。
在又一方面,提供了一种进行多核苷酸延伸的方法。该方法通常包括在适用于引物延伸的条件下,将本文所述的具有增加的链置换活性和显著降低的5'-3'核酸外切酶/核酸内切酶活性的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸接触,从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。核苷三磷酸可以包括非常规的核苷酸,诸如核糖核苷酸和/或标记核苷酸。进一步地,引物或模板可以包括一种或多种核苷酸类似物。在一些变体中,多核苷酸延伸法是用于多核苷酸扩增的方法,其包括在适用于多核苷酸扩增的条件下,将突变型或改良DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板和核苷三磷酸接触。多核苷酸延伸反应可以是例如PCR、等温延伸或测序(例如,454测序反应)。多核苷酸模板可以来自任何类型的生物样品。
在一些实施例中,引物延伸方法包括链置换反应、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增、或选自环介导扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CSA)和聚合酶链置换反应(PCDR)的扩增反应。在一些实施例中,适用于引物延伸的条件包括高温。
任选地,引物延伸反应可包括参考或未修饰聚合酶的实际或潜在抑制剂。抑制剂可以抑制参考或未修饰(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或链置换活性。在一些实施例中,抑制剂为血红蛋白或其降解产物。例如,在一些实施例中,血红蛋白降解产物是一种血红素分解产物,诸如血红素、血卟啉或胆红素。在一些实施例中,抑制剂是铁螯合剂或紫色颜料。在一些实施例中,抑制剂是肝素或黑色素。在某些实施例中,抑制剂是嵌入染料。在一些实施例中,嵌入染料是[2-[N-双-(3-二甲氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施例中,嵌入染料是[2-[N-(3-二甲氨基丙基)-N-丙胺基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施例中,嵌入染料不是[2-[N-(3-二甲氨基丙基)-N-丙胺基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施例中,适用于延伸的条件包括Mg++。在一些实施例中,适用于延伸的条件包括Mn++。
本公开还提供了一种可用于此类多核苷酸延伸方法的试剂盒。通常,试剂盒包括至少一个容器,该容器提供本文所述的突变型或改良DNA聚合酶。在某些实施例中,试剂盒进一步包括提供一种或多种其他试剂的一个或多个其他容器。例如,在特定的变体中,一个或多个其他容器提供核苷三磷酸;适用于多核苷酸延伸的缓冲剂;和/或在多核苷酸延伸条件下能够与预定多核苷酸模板杂交的一个或多个引物或探针多核苷酸。多核苷酸模板可以来自任何类型的生物样品。
进一步提供了包含本文描述的聚合酶的反应混合物。反应混合物还可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)、一种或多种引物或探针多核苷酸、核苷三磷酸(包括例如脱氧核糖核苷三磷酸、核糖核苷三磷酸、标记的核苷三磷酸、非常规的核苷三磷酸)、缓冲剂、盐、标记(例如,荧光团)。在一些实施例中,反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施例中,反应混合物包含血红蛋白或血红蛋白的降解产物。例如,在某些实施例中,血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物,诸如血红素、血色素、血卟啉和胆红素。在其他实施例中,反应混合物包含肝素或其盐。任选地,反应混合物包含嵌入染料(包括但不限于上文或本文其他地方所述的那些)。在某些实施例中,反应混合物包含与血液分离的模板核酸。在其他实施例中,模板核酸是RNA,并且反应混合物包含肝素或其盐。
在一些实施例中,反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如,在一些实施例中,反应混合物包含如本文所述具有增加的链置换活性的改良的DNA聚合酶,和具有增加的逆转录效率(例如延伸RNA模板的增加的活性)的另一种聚合酶。在一个实施例中,反应混合物包含如本文所述的具有增加的链置换活性的改良的DNA聚合酶和第二热稳定DNA依赖性聚合酶的共混物。第二热稳定DNA依赖性聚合酶可以是如上所述的可逆修饰的聚合酶,使得酶在适用于逆转录步骤的温度下失活,在合适的条件下例如在约90℃至100℃的高温下持续多达约12分钟的时间段进行活化。例如在热启动PCR反应中提供了用于活化可逆失活的热稳定聚合酶的合适条件。合适的第二热稳定DNA依赖性聚合酶的示例描述于美国专利号5,773、258和5,677,152中。
本文描述进一步的实施例。
定义
除非另外指明,本文所用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管基本上任何与本文描述的方法和材料相似的方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中,但是仅描述了示例性方法和材料。出于本发明的目的,以下术语定义如下。
除非上下文另外清楚指出,术语“一个”、“一种”、“所述”包含复数指代。
“氨基酸”是指代可以合并为肽、多肽或蛋白质的任何单体单元。如本文所用,术语“氨基酸”包括以下二十种天然或遗传编码的α-氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在“X”个残基未定义的情况下,应将其定义为“任何氨基酸”。这二十种天然氨基酸的结构例如在Stryer等人,Biochemistry,第5版,Freeman and Company(2002)中示出,其以引用方式并入。其他氨基酸诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也可遗传编码(Stadtman(1996)“Selenocysteine,”Annu Rev Biochem.65:83-100和Ibba等人(2002)“Genetic code:introducingpyrrolysine,”Curr Biol.12(13):R464-R466,其均以引用方式并入)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、经修饰的氨基酸(例如具有经修饰的侧链和/或主链)和氨基酸类似物。参见例如Zhang等人(2004)“Selective incorporation of5-hydroxytryptophan intoproteins in mammalian cells,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24):8882-8887,Anderson等人(2004)“An expanded genetic code with a functional quadrupletcodon”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20):7566-7571,Ikeda等人(2003)“Synthesis ofa novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein invivo,”Protein Eng.Des.Sel.16(9):699-706,Chin等人(2003)“An Expanded EukaryoticGenetic Code,”Science 301(5635):964-967,James等人(2001)“Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues,”Protein Eng.Des.Sel.14(12):983-991,Kohrer等人(2001)“Import ofamber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells:Ageneral approach to site-specific insertion of amino acid analogues intoproteins,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25):14310-14315,Bacher等人(2001)“Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable ofGrowth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue,”J.Bacteriol.183(18):5414-5425,Hamano-Takaku等人(2000)“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNASynthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficientlythan Tyrosine,”J.Biol.Chem.275(51):40324-40328,和Budisa等人(2001)“Proteinswith{beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores andpharmaceutically active amino acids,”Protein Sci.10(7):1281-1292,其各自以引用方式并入。
为了进一步说明,氨基酸通常为包括取代的或未被取代的氨基、取代的或未被取代的羧基、和一种或多种侧链或基团、或这些基团的任一个的类似物的有机酸。示例性的侧链包括例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤代、酰肼、烯基、炔基、醚、硼酸酯、硼酸盐、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任意组合。其他代表性的氨基酸包括但不限于,包含光活化交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、包含金属的氨基酸、具有新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光敏笼形(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、可化学裂解的和/或可光裂解的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。
术语“生物样品”涵盖从生物体获得的多种样品类型,并且可以用于诊断或监测测定中。该术语涵盖尿液、尿沉渣、血液、唾液和其他生物学来源的液体样品、固体组织样品,诸如活检样本或组织培养物或由其衍生的细胞及其后代。该术语涵盖在采购后以任何方式处理过的样品,诸如通过使用试剂、增溶、沉淀或某些成分富集来处理的样品。该术语涵盖临床样品,还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物液和组织样品。
在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”意指相对于对应的功能性DNA聚合酶,包含一个或多个氨基酸取代的多肽,其通常为重组多肽。
在突变型聚合酶上下文中的术语“未修饰形式”是本文中用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语:术语“未修饰形式”是指具有除指定为表征突变型聚合酶的一个或多个氨基酸位置外的突变型聚合酶氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此,参考在(a)其未修饰形式和(b)一个或多个特定氨基酸取代方面的突变型DNA聚合酶意指除特定的氨基酸取代之外,突变型聚合酶以其他方式在特定的基序中具有与未修饰形式相同的氨基酸序列。“未修饰的聚合酶”(以及因此具有增加的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂耐受性的经修饰的形式)可以包含其他突变以提供需要的功能性,例如改良的双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的掺入,调节5'-核酸酶活性,调节3'-核酸酶(或校正)活性等。因此,在进行本文所述的本发明时,预定未修饰形式的DNA聚合酶。未修饰形式的DNA聚合酶可以是,例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶,或已经有意修饰过的DNA聚合酶。未修饰形式的聚合酶优选为热稳定DNA聚合酶,诸如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶及其功能性变体,该功能性变体与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本的序列同一性。此类变体可以包括,例如嵌合DNA聚合酶,诸如描述于美国专利号6,228,628和7,148,049中的嵌合DNA聚合酶,其全文以引用方式并入本文。在某些实施例中,未修饰形式的聚合酶具有逆转录酶(RT)活性。
术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶,它是耐热的,当在高温下经过实现双链核酸变性所需要的时间后,其保留足够的活性以实现随后的多核苷酸延伸反应,并且不会不可逆变性(失活)。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的并在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明,这些专利以引用方式并入本文。如本文所用,热稳定聚合酶适用于温度循环反应,诸如聚合酶链式反应(“PCR”)。用于本文目的的不可逆变性是指永久的和完全的酶活性丧失。对于热稳定聚合酶,酶活性是指以适当的方式组合核苷酸以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产品的催化作用。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括,例如来自海栖热袍菌、水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种sps17、栖热菌种Z05、Thermus caldophilus、热坚芽孢杆菌、那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。
术语“热活性”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中的逆转录或退火/延伸步骤的温度(即45-80℃)下保持催化特性的酶。热稳定酶是在经受核酸变性所需的高温时不会不可逆地失活或变性的热稳定酶。热活性酶可能是热稳定的,也可能不是。热活性DNA聚合酶可以是依赖于嗜热菌种或嗜温菌种的DNA或RNA,其包括但不限于大肠杆菌、莫洛尼小鼠白血病病毒和禽成髓细胞瘤病毒。
如本文所用,“嵌合”蛋白质是指其氨基酸序列代表来自至少两个不同的蛋白质的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白质。嵌合蛋白通常并不通过氨基酸序列的直接操作产生, 而是从编码嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达出来。在某些实施例中,例如,本发明的未修饰形式的突变型DNA聚合酶是由来源于栖热菌种DNA聚合酶的氨基端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域是指从N-末端(氨基酸位置1)延伸至内部氨基酸的区域。类似地,C-末端区域是指从内部氨基酸延伸至C-末端的区域。
术语“适配体”是指识别并结合至DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA,如美国专利号5,693,502中所述,其在此全文以引用方式明确并入本文。适配体和dUTP/UNG在RT-PCR中的用途例如在Smith,E.S.等人, (Amplification of RNA:High-temperatureReverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activatedThermostable DNA Polymerase,in PCR Primer:A Laboratory Manual,第2版,Dieffenbach,C.W.和Dveksler,G.S.,编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,211-219,(2003))的著作中亦被提及讨论。
在突变型DNA聚合酶的上下文中, 与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“对应”基于根据核苷酸或氨基酸的位置数的编号惯例,然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列。“对应于[特定序列]的位置[X]”的氨基酸是指目标多肽中与指定序列的等同氨基酸比对的氨基酸。通常,如本文所述,可以使用比对算法,诸如如下所述的BLAST,来确定对应于聚合酶位置的氨基酸。因为不是给定的“对应区域”内的所有位置都需要相同,对应区域内的非匹配位置可能被认为是“对应位置”。因此,如本文所用,特定DNA聚合酶的“与氨基酸位置[X]对应的氨基酸位置”是指其他DNA聚合酶和结构同系物和家族中基于比对的等同位置。在本发明的一些实施例中,氨基酸位置的“对应”相对于包含一个或多个SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:39的基序的聚合酶区域来进行确定。当聚合酶多肽序列不同于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:39时(例如,通过氨基酸变化或氨基酸的添加或缺失),可能与本文讨论的改良活性相关联的特定突变将不在如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、或SEQ ID NO:39中一样的位置编号中。例如,在表1中对此进行了说明。
如本文所用,“重组”是指已经通过重组方法有意修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”意指通常通过限制性核酸内切酶对核酸的操作以自然界中通常不存在的形式而最初体外形成的核酸。因此,出于本发明的目的,分离的线性形式的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不接合的DNA分子而在体外形成的表达载体均被认为是重组。应当理解,一旦制备了重组核酸并将其重新引入宿主细胞,它将使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作非重组地复制;然而,这种核酸一旦被重组产生,尽管随后非重组地复制,但是出于本发明的目的仍被认为是重组。“重组蛋白质”是使用重组技术,即通过上述的重组核酸的表达制造的蛋白质。
当核酸与另一个核酸序列置于功能性关系中时,该核酸是“可操作连接的”。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,则所述启动子或增强子可操作地连接至所述编码序列,或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译,则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。
术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及细胞培养物中生长的来自高等植物或者动物的单个的细胞。
术语“载体”是指一段DNA,通常是双链的,其可以已经插入一段外源DNA。载体可以是例如质粒来源的。载体包含“复制子”多核苷酸序列,其促进载体在宿主细胞中的自主复制。外源DNA被定义为异源DNA,其是宿主细胞中天然不存在的DNA,所述异源DNA例如复制载体分子、编码可选择标志物或可筛选标志物或编码转基因。载体用于将外源或异源DNA转运到合适的宿主细胞中。一旦进入宿主细胞,载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA整合,并且可以生成所述载体及其插入的DNA的多个拷贝。另外,载体还可以包含允许插入的DNA转录成mRNA分子或以其他方式引起插入的DNA复制成RNA的多个拷贝的必需元件。一些表达载体还另外包含与插入的DNA相邻的序列元件,其增加了表达的mRNA的半衰期和/或允许mRNA翻译成蛋白分子。因此,可以快速合成由插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子。
术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体之外,本文中还应理解为涉及其相关的结构变体,其包括衍生物和类似物,其相对于使用核苷酸的特定上下文(例如,与互补碱基杂交)在功能上是等同的,除非上下文另外明确指出。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物,其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物,诸如RNA和DNA,以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰)形式,和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚基两者)。示例性的修饰包括甲基化,用类似物取代天然存在的核苷酸中的一个或多个,核苷酸间的修饰诸如不带电荷的键(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等),悬垂部分(例如多肽),嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等),螯合剂,烷化剂,和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括在其能力中模拟多核苷酸以经由氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的合成分子。通常核苷酸单体经由磷酸二酯键连接,尽管合成形式的核酸可以包括其他键(例如,如Nielsen等人(Science 254:1497-1500,1991)所述的肽核酸。核酸可以是或包括例如染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是例如单链、双链、或三链,并且不限于任何特定的长度。除非另外指出,除了任何明确指出的序列之外,特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单元(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸通常包括约六至约175个核酸单体单元,更通常为约八至约100个核酸单体单元,并且更通常为约10至约50个核酸单体单元(例如约15、约20、约25、约30、约35或更多的核酸单体单元)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素,其包括寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备,其包括但不限于现有或天然序列的分离、DNA复制或扩增、逆转录、适当序列的克隆和限制性酶切,或通过诸如Narang等人的磷酸三酯法(Meth.Enzymol.68:90-99,1979);Brown等人的磷酸二酯法(Meth.Enzymol.68:109-151,1979);Beaucage等人的二乙基亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett.22:1859-1862,1981);Matteucci等人的三酯法(J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191,1981);自动合成法;或美国专利号4,458,066的固体支持法,或本领域技术人员所知的其他方法直接化学合成。这些参考文献中的全部以引用方式并入。
本文中使用的术语“引物”是指在引发多核苷酸延伸的条件下(例如,在包括在适当的缓冲剂中和合适的温度或温度周期(例如在聚合酶链式反应中)下存在所需的核苷三磷酸(由所复制的模板决定)和聚合酶的条件下)能够作为模板定向核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步说明,引物还可以用于其他多种寡核苷酸介导的合成过程,其包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物通常是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适当长度取决于引物预定的用途,但是其范围通常为从6至40个核苷酸,更通常为从15至35个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确序列,但是必须是足够互补以与模板杂交以用于发生引物延伸。在某些实施例中,术语“引物对”意指一组引物,其包括与待扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为“正向”)以及与待扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为“反向”)(例如,如果靶序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要,引物可以通过与用光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法可检测的标记相结合来进行标记。例如,有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISA测定)、生物素、或者对其可利用抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。
当涉及核酸碱基、核苷三磷酸或核苷酸时,术语“常规的”或“天然的”是指所述多核苷酸中天然存在的那些(即,对于DNA这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外,在体外DNA合成反应诸如测序中,dITP和7-脱氮-dGTP经常用于代替dGTP,而7-脱氮-dATP可以用于代替dATP。这些可统称为dNTP。
当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时,术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTP相比,某些非常规核苷酸在核糖的2'位置修饰。因此,尽管对于RNA天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP,统称为rNTP),因为这些核苷酸具有在糖2'位的羟基,与之相比dNTP中没有,如本文所用,作为用于DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸是非常规的核苷酸。如本文所用,非常规的核苷酸包括但不限于用于核酸测序的用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2',3'双脱氧结构的称为双脱氧核苷三磷酸的那些化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP统称为ddNTP。终止剂化合物的其他示例包括核糖核苷酸的2'-PO4类似物(参见例如美国公开号2005/0037991和2005/0037398,其均以引用方式并入)。其他非常规的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTP([α-S]dNTP)、5'-[α-硼烷]-dNTP、[α]-甲基-磷酸酯dNTP和核糖核苷三磷酸(rNTP)。非常规的碱基可以用放射性同位素来标记,诸如32P、33P或35S;荧光标记;化学发光标记;生物发光标记;半抗原标记,诸如生物素;或者酶标记,诸如链霉亲和素或亲和素。荧光标记可以包括带负电荷的染料,诸如荧光素家族的染料,或者电中性的染料,诸如罗丹明家族的染料,或者带正电荷的染料,诸如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。由Perkin-Elmer(Boston,MA)、AppliedBiosystems(Foster City,CA)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,OR)出售各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、德克萨斯红和TAMRA标记的核苷酸。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7,并且由GE Healthcare UK Limited(Amersham Place,Little Chalfont,Buckinghamshire,England)出售。
如本文所用,“序列同一性百分比”通过在比较窗口比较两条最佳比对的序列来确定,其中对于两条序列的最佳比对,在比较窗口中的序列部分与参考序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。百分比通过确定存在于两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将该结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。
在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中,术语“相同的”或“同一性”百分比是指相同的两条或更多条序列或子序列。当在比较窗口或者指定区域中使用以下序列比较算法中的一种或用手工比对及目检测量为针对最大对应而比较和比对时,如果序列具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如在特定区域中具有至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%同一性)),则它们彼此“基本上相同”。如果序列具有至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、或者至少55%同一性,那么它们“基本上相同”。这些定义也指测试序列的互补序列。任选地,同一性存在于至少约50核苷酸长度的区域中,或更通常在100至500或1000或更多核苷酸长度的区域中。
在两个或更多多肽序列的上下文中,术语“相似性”或“相似性百分比”是指当在比较窗口或者指定区域中,使用以下序列比较算法中的一种或用手工比对及目检测量为针对最大对应而比较和比对时,具有特定百分比的由保守氨基酸取代定义为相同或相似的(例如在特定区域中具有60%相似性,任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相似性)氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。如果序列彼此具有至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、或者至少55%相似性,则它们彼此“基本上相似”。任选地,此相似性存在于至少约50氨基酸长度的区域中,或更通常存在于至少约100至500或1000或更多氨基酸长度的区域中。
对于序列比较,通常以一条序列作为参考序列,用测试序列与其比较。当使用序列比较算法时,将测试和参考序列输入电脑,指定子序列坐标,如有必要,指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数,或者可以指定替代参数。然后基于程序参数,序列比较算法计算相对于参考序列的测试序列的序列同一性或相似性百分比。
如本文所用,“比较窗口”包括参考选自由以下项组成的组的任一数目连续位置的片段:20至600,通常约50至约200,更通常约100至约150,其中在两条序列最佳比对后序列可以与相同数目连续位置的参考序列进行比较。用来比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482,1970),通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443,1970),通过Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988),通过这些算法的计算机化执行(例如,威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.),或者通过手工比对及目检(参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995supplement))来进行。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的示例是BLAST和BLAST 2.0算法,其描述于Altschul等人(Nuc.Acids Res.25:3389-402,1977)和Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(参见互联网www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法涉及:首先通过在查询序列中识别长度W的短字段来识别高分序列对(HSP),其在与数据库序列的相同长度字段比对时匹配或满足一定阳性阈值评分T。T称为邻近字段评分阈值(Altschul等人,同上)。这些最初的邻近字段命中作为用于引发搜索的种子以发现包含它们的更长HSP。字段命中沿着各序列双向延伸,只要累计的比对分数可增加。对于核苷酸序列,使用参数M(用于匹配残基对的奖分;始终>0)和N(用于错配残基的罚分;始终<0)来计算累计分数。对于氨基酸序列,使用评分矩阵以计算累计分数。当累计比对分数从其最大实现值降低数量X;由于一个或多个负分残基比对的累积,累计分数达到或低于零时;或者到达任一序列的末端时,字段命中在各方向上的延伸停止。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11,期望值(E)10,M=5,N=-4,并比较两条链。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用默认字长3,期望值(E)10,和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)比对(B)50,以及期望值(E)10,M=5,N=-4。
BLAST算法也执行两条序列之间相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-87,1993)。由BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N)),其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指示。例如,如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于约0.2,通常低于约0.01,以及更通常低于约0.001,则核酸被认为与参考序列相似。
术语“逆转录效率”是指在给定的逆转录反应中逆转录为cDNA的RNA分子的比例。在某些实施例中,相对于这些未修饰形式的DNA聚合酶,本发明的突变型DNA聚合酶具有改良的逆转录效率。即,在特定的一组反应条件下,这些突变型DNA聚合酶比其未修饰形式逆转录更高比例的RNA模板。不受理论的限制,本文所述的突变型DNA聚合酶逆转录更高比例的RNA模板的能力可以归因于增加的逆转录活性,例如,增加的核苷酸掺入率和/或增加的酶持续合成能力。逆转录效率可例如通过使用RNA模板测量PCR反应的交叉点(Cp)、并将Cp值与对照反应的Cp值进行比较来测得,其中相同序列的DNA模板(除了U以T进行代替)扩增,其中RNA和DNA扩增使用共同的引物集和相同的聚合酶,例如,如示例中所述。测试聚合酶具有改良的RT效率:当在RNA用作模板时,测试聚合酶与对照聚合酶相比具有降低的Cp值,而在DNA用作模板时,其相对于对照聚合酶具有基本上不变的Cp值。在一些实施例中,本发明的聚合酶具有改良的RT效率,使得Cp比RNA模板上的对应对照聚合酶少至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个单元。
术语“错配耐受性”是指当以模板依赖性方式通过将一个或多个核苷酸(例如共价地)附接至核酸来延伸核酸(例如,引物或其他寡核苷酸)时,聚合酶耐受包含错配序列的能力。术语“3'错配耐受性”是指聚合酶耐受包含错配(几乎互补)序列的能力,其中待延伸的核酸(例如引物或其他寡核苷酸)与其模板在引物的3'末端核苷酸处具有错配。与模板的错配也可能位于引物的3'倒数第二个核苷酸处,或位于引物序列内的另一个位置。
术语“错配判别”是指当以模板依赖性方式通过将一个或多个核苷酸(例如共价地)附接至核酸来延伸核酸(例如,引物或其他寡核苷酸)时,聚合酶区分完全互补序列与包含错配序列的能力。术语“3'-错配判别”是指聚合酶区分完全互补序列与包含错配(几乎互补)序列的能力,其中与核酸杂交的模板相比,待延伸核酸(例如引物或其他寡核苷酸)在核酸3'末端处具有错配。术语“错配”是指在一段互补的双链体形成(或潜在的双链体形成)序列内存在一个或多个碱基错配(或“非互补碱基对立”)。
术语“Cp值”或“交叉点”值是指允许对输入的目标核酸进行定量的值。可以根据二阶导数最大法(the second-derivative maximum method)确定Cp值(Van Luu-The,等人,“Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements usingsecond derivative calculation and double correction,”BioTechniques,第38卷,第2期,2005年2月,第287–293页)。在二阶导数法中,Cp对应二阶导数曲线的第一峰。此峰对应对数线性相的开始。二阶导数法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值,且仅获得一个值。初始Cp方法基于强度值的局部定义的可微分的近似值,例如,通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小的根。也可以使用拟合点法确定Cp,其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉确定Cp(Van Luu-The,等人,BioTechniques,第38卷,第2期,2005年2月,第287–293页)。Roche提供的LightCycler仪器通过根据二阶导数最大法计算而提供Cp值。
术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用以下方程式计算每种条件的PCR效率:%PCR效率=(10(-斜率)-1)x 100计算每种条件的PCR效率,其中通过y轴上绘制的对数拷贝数和x轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完全匹配或错配的引物模板测量PCR效率。
术语“核酸延伸速率”是指生物催化剂(例如酶,诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖性或非模板依赖性方式通过将一个或多个核苷酸(例如共价地)附接至核酸来延伸核酸(例如,引物或其他寡核苷酸)的速率。为了说明,本文描述的某些突变型DNA聚合酶相对于这些未修饰形式的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率,使得在一组给定的反应条件下它们可以高于这些未修饰形式的速率延伸引物。
术语“RT和聚合酶抑制剂的耐受性”是指在存在一定量的抑制剂的情况下,聚合酶维持活性(聚合酶或逆转录活性)的能力,该抑制剂会抑制对照聚合酶的聚合酶活性或逆转录活性。在一些实施例中,在存在一定量的抑制剂的情况下,改良的聚合酶能够具有聚合酶或逆转录活性,该抑制剂将基本上消除对照聚合酶活性。
术语“5'-核酸酶探针”是指包含至少一个发光标记部分并且用于5'-核酸酶反应以实现靶核酸检测的寡核苷酸。在一些实施例中,例如,5'-核酸酶探针仅包括单个发光部分(例如,荧光染料等)。在某些实施例中,5'-核酸酶探针包括自身互补的区域,使得探针能够在选定条件下形成发夹结构。为了进一步说明,在一些实施例中,5'-核酸酶探针包含至少两个标记部分,并且在从寡核苷酸切割或以其他方式分离两个标记中的一个后,发射强度增加的辐射。在某些实施例中,5'-核酸酶探针用两种不同的荧光染料标记,例如5'末端报告染料和3'末端淬灭染料或部分。在一些实施例中,在与末端位置不同或除了末端位置之外的一个或多个位置标记5'-核酸酶探针。当探针完好无损时,通常在两个荧光团之间发生能量转移,使得来自报告染料的荧光发射至少部分淬灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间,例如,结合至模板核酸的5'-核酸酶探针由例如Taq聚合酶或具有此活性的另一种聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割,使得报告染料的荧光发射不再淬灭。示例性的5'-核酸酶探针也描述于例如美国专利号5,210,015、美国专利号5,994,056和美国专利号6,171,785,其各自以引用方式并入本文。在其他实施例中,可以用两种或更多种不同的报告染料和3'末端淬灭染料或部分来标记5'核酸酶探针。
术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是指至少两个发色团、供体发色团和受体发色团(被称为淬灭剂)之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时,供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。当受体是“黑暗”淬灭剂时,它以除光以外的形式耗散转移的能量。特定的荧光团充当供体还是受体起作用取决于FRET对的其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的淬灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗淬灭剂包括BlackHoleQuenchersTM(BHQ)(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)和BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich.)。
术语“链置换活性”是指聚合酶置换在合成期间遇到的下游DNA的能力。英国皇家化学学会将术语“链置换”定义为“将与完整双链DNA中其互补链形成异源双链DNA的断裂3'单链DNA分子排斥出去。恢复了原始双链体中的Watson-Crick碱基对。受排斥的3'单链DNA分子以其原始互补序列重新退火,以重新形成两个完整的双链分子。”在一些实施例中,该术语包括称为链置换扩增(SDA)的等温扩增方法。
术语“高温”是指高于双链DNA分子的解链温度的温度。解链温度(Tm)定义为一半DNA链处于无规卷曲或单链(ssDNA)状态的温度。如本领域中众所周知的,Tm取决于DNA分子的长度及其特定核苷酸序列。在PCR变性、退火和延伸反应中遇到高温的典型示例,诸如60℃或更高,例如,从约60℃至约95℃。
附图说明
图1提供了以下DNA聚合酶I酶之间的序列同一性:栖热菌种Z05DNA聚合酶(Z05);水生栖热菌DNA聚合酶(Taq);丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi);黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl);栖热菌种sps17 DNA聚合酶(Sps17);嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth);Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca);耐辐射奇异球菌DNA聚合酶(Dra);海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma);那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne);非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf);嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst);以及热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)。(A)整个聚合酶I酶上的序列同一性(对应于Z05的氨基酸1-834);以及(B)与Z05的氨基酸420-834相对应的聚合酶亚结构域上的序列同一性。
图2提供了各种栖热菌种DNA聚合酶I酶之间的序列同一性:栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05);水生栖热菌DNA聚合酶(Taq);丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi);黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl);栖热菌种sps17 DNA聚合酶(Sps17);嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth);以及Thermuscaldophilus DNA聚合酶(Tca)。(A)整个聚合酶I酶上的序列同一性(对应于Z05的氨基酸1-834);以及(B)与Z05的氨基酸420-834相对应的聚合酶亚结构域上的序列同一性。
图3示出了示例中描述的测定设计。四个互补的寡核苷酸Oligo A(绿色)、Oligo B(浅蓝色)、Oligo C(深蓝色)和锁定核酸(LNA)Oligo D(红色)彼此退火。Oligo A与Oligo B互补,并引发聚合反应。Oligo B是模板,并且在5'-末端具有FAM–荧光报告剂。Oligo C与Oligo B互补,并且在3'-末端处具有BHQ淬灭剂。锁定核酸Oligo D与模板Oligo B互补,并且用作高能栅栏。当将聚合酶、Mg2+和核苷酸添加至退火的混合物时,聚合反应使Oligo A延伸,并且新合成的链置换LNA Oligo D和Oligo C,从而从荧光探针释放淬灭剂。循环完成后生成荧光信号。
图4A示出了具有细菌菌落(克隆)的孔的结果,所述菌落表达了与对照G46E C21克隆相比具有增加的链置换活性的突变型聚合酶。板6示出了G46E C21克隆的结果(板6的所有孔包含原始G46E C21克隆)。板1示出了随后经测序的以下克隆的增加的链置换活性:F24(包含I686V和A693V突变)、L3(包含T516I和V633I突变)和P19(包含Q415H、E420D、E636G、N752S和V768M突变)。
图4B示出了针对板2-5的结果。板6(上方)用作所有这些实验的对照。板2示出了以下克隆的增加的链置换活性,其具有针对克隆的后续测序结果:M22(包含R525G和F694S突变)、G9(包含Q491H和T516S突变)、N19(包含S515F和T666M突变)和N7(包含E402V、V555A和N582D突变)。板3示出了以下克隆的增加的链置换活性,其具有针对克隆的后续测序结果:A24(包含A737T和A759T突变)、F21(包含L521Q和T546A突变)、G10(包含N668S突变)和I14(包含A456T突变)。板4示出了以下克隆的增加的链置换活性,其具有针对克隆的后续测序结果:G23(包含K507M、T571A和S652F突变)和K12(包含S515F和A832V突变)。板5示出了以下克隆的增加的链置换活性,其具有针对克隆的后续测序结果:C6(包含D498E、L524V、R598G和M616I突变)、G20(包含A444T、D498E、M660K和Y673N突变)、G23(包含E493D、T511S、M648I和M749L突变)和H21(包含Q635K突变)。
图5A和图5B提供示出了本文所述的突变型聚合酶具有显著降低的核酸内切酶和核酸外切酶活性的数据。
具体实施方式
本公开提供了改良DNA聚合酶,其中相对于功能性DNA聚合酶,聚合酶结构域中的一个或多个氨基酸已经突变。本文所述的DNA聚合酶是相对于未修饰形式的聚合酶具有增加的链置换活性和/或增加的错配耐受性、延伸速率以及RT和聚合酶抑制剂的耐受性。在某些实施例中,突变型DNA聚合酶可在更低的浓度下用于与亲本酶相比优越或等同的性能。在一些实施例中,突变型DNA聚合酶相对于未修饰或对照聚合酶具有增加的链置换活性,同时保留基本上相同的DNA依赖性聚合酶活性。在一些实施例中,突变型DNA聚合酶具有显著降低的核酸外切酶或核酸内切酶活性。在一些实施例中,突变型DNA聚合酶具有降低的5'至3'核酸外切酶活性。
具有增加的链置换活性的DNA聚合酶可用于例如高温下的聚合酶链式反应(PCR)和等温扩增(诸如链置换扩增(SDA)),并且用于诸如环介导扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CSA)和聚合酶链置换反应(PCDR)的DNA扩增技术。因此,DNA聚合酶可用于涉及多核苷酸延伸的多种应用,其包括例如在重组DNA研究和疾病的医学诊断中的应用。
在一些实施例中,DNA聚合酶进一步包含SEQ ID NO:29和/或SEQ ID NO:38的基序。
此基序存在于许多家族A型DNA依赖性DNA聚合酶的“手指”结构域(Lα螺旋)中,特别是来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶(Li等人,EMBOJ.17:7514-7525,1998)。例如,图1示出了来自若干种细菌的DNA聚合酶“手指”结构域的区域的氨基酸序列比对:热坚芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、耐辐射奇异球菌、非洲栖热腔菌、海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、水生栖热菌、Thermus caldophilus、丝状栖热菌、黄栖热菌、栖热菌种sps17、栖热菌种Z05和嗜热栖热菌。如图所示,与上述基序相对应的天然序列存在于这些聚合酶中的每一个中,这表明用于聚合酶的此区域的保守功能。图2提供了这些DNA聚合酶之间的序列同一性。
在一些实施例中,本文所述的具有改良的活性和/或特性的聚合酶是野生型或天然存在的DNA聚合酶,诸如,来自以上所列嗜热菌的物种中的任一个的聚合酶,或与此类野生型或天然存在的DNA聚合酶基本相同。例如,在一些实施例中,聚合酶与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42具有至少80%、85%、90%或95%同一性。在一个变体中,未修饰形式的聚合酶来自栖热菌种属的一个物种。在本发明的其他实施例中,未修饰的聚合酶来自除栖热菌种以外的嗜热菌种,例如,栖热袍菌属。可获得用于许多热稳定DNA聚合酶的完整核酸和氨基酸序列。水生栖热菌(Taq)(SEQ ID NO:2)、嗜热栖热菌(Tth)(SEQID NO:6)、栖热菌种Z05(SEQ ID NO:1)、栖热菌种sps17(SEQ ID NO:5)、海栖热袍菌(Tma)(SEQ ID NO:34)和非洲栖热腔菌(Taf)(SEQ ID NO:33)聚合酶中的每个的序列已在PCT国际专利公开号WO 92/06200中公开,其以引用方式并入本文。来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:4)已经在Akhmetzjanov和Vakhitov(Nucleic Acids Research 20:5839,1992)中公开,其以引用方式并入本文。来自Thermus caldophilus的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:7)参见EMBL/GenBank登录号U62584。来自丝状栖热菌的热稳定DNA聚合酶的序列可以使用例如美国专利号4,889,818中提供的方法以及表1中提供的序列信息从ATCC保藏号42380恢复。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:35)来自GeneSeq专利数据库登录号R98144和PCT WO 97/09451,其各自以引用方式并入本文。来自热坚芽孢杆菌的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:37描述于例如Uemori等人(J Biochem(Tokyo)113(3):401-410,1993;另参见Swiss-Prot数据库登录号Q04957以及GenBank登录号D12982和BAA02361),其各自以引用方式并入。可以如本文所述进行修饰的未修饰形式的DNA聚合酶的示例还描述于例如美国专利号6,228,628;6,346,379;7,030,220;6,881,559;6,794,177;6,468,775;和美国专利号7,148,049;7,179,590;7,410,782;7,378,262,其各自以引用方式并入。序列表中还提供了代表性的全长聚合酶序列。
还适合于本文描述的突变的是先前已修饰(例如,通过氨基酸取代、添加或缺失)的功能性DNA聚合酶。在一些实施例中,此类功能性修饰的聚合酶包含SEQ ID NO:40或SEQID NO:42的氨基序列,或与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42具有基本上的序列同一性或相似性,例如与SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。在一些实施例中,合适的未修饰的DNA聚合酶还包括野生型或天然存在的聚合酶的功能性变体。此类变体通常将与野生型或天然存在的聚合酶具有基本的序列同一性或相似性,通常具有至少80%序列同一性,并且更通常具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
在一些实施例中,本文所述的聚合酶还包含核酸酶结构域(例如,对应于Z05(SEQID NO:1)的位置1至291)。
在一些实施例中,本文所述的聚合酶是嵌合聚合酶,即,其包含来自两种或更多种酶的多肽区域。此类嵌合DNA聚合酶的示例描述于例如美国专利号6,228,628,其全文以引用方式并入本文。嵌合CS家族DNA聚合酶是特别合适的,其包括CS5(SEQ ID NO:27)和CS6(SEQ ID NO:28)聚合酶及其变体,其具有与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28基本上的氨基酸序列同一性或相似性(通常具有至少80%的氨基酸序列同一性,并且更通常具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性)。CS5和CS6 DNA聚合酶为来源于栖热菌种Z05和海栖热袍菌(Tma)DNA聚合酶的嵌合酶。它们包含栖热菌种酶的N-末端5'-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端3'-5'核酸外切酶和聚合酶结构域。这些酶具有有效的逆转录酶活性,可以延伸含核苷酸类似物的引物,并且可以掺入α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP以及荧光素和花菁染料家族标记的dNTP。CS5和CS6聚合酶也是有效的Mg2+活化PCR酶。CS5和CS6嵌合聚合酶进一步描述于例如美国专利号7,148,049中,其全文以引用方式并入本文。
在一些实施例中,氨基酸取代是单个氨基酸取代。相对于未修饰的聚合酶,本文提供的DNA聚合酶可以在活性位点中包含一个或多个氨基酸取代。
在一些实施例中,本文所述的聚合酶进一步如下包含SEQ ID NO:38的氨基酸基序(对应于Z05(SEQ ID NO:1)的D580X突变):
Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-X7-X8-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn
(在本文中也用单字母代码称为
T-G-R-L-S-S-X7-X8-P-N-L-Q-N)(SEQ ID NO:38);其中
X7是Ser(S)或Thr(T);并且
X8是除Asp(D)或Glu(E)以外的任何氨基酸
在例如美国专利公开号2009/0148891中更详细地讨论了由SEQ ID NO:38表征的突变。此类功能性变体聚合酶通常将与野生型或天然存在的聚合酶(例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:42)具有基本上的序列同一性或相似性,通常具有至少80%的氨基酸序列同一性,更通常具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中,本文所述的聚合酶进一步如下包含SEQ ID NO:29的氨基酸基序(对应于Z05(SEQ ID NO:1)的I709X突变):
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Gly-Tyr-Val-
X14-Thr-Leu(在本文中也用单字母代码称为X1-X2-X3-
X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-G-Y-V-X14-T-L)
(SEQ ID NO:29);其中
X1是Ala(A)、Asp(D)、Ser(S)、Glu(E)、Arg(R)或
Gln(Q);
X2是Trp(W)或Tyr(Y);
X3是除Ile(I)、Leu(L)或Met(M)以外的任何氨基酸;
X4是Glu(E)、Ala(A)、Gln(Q)、Lys(K)、Asn(N)或
Asp(D);
X5是Lys(K)、Gly(G)、Arg(R)、Gln(Q)、His(H)或
Asn(N);
X6是Thr(T)、Val(V)、Met(M)或Ile(I);
X7是Leu(L)、Val(V)或Lys(K);
X8是Glu(E)、Ser(S)、Ala(A)、Asp(D)或Gln(Q);
X9是Glu(E)或Phe(F);
X10是Gly(G)或Ala(A);
X11是Arg(R)或Lys(K);
X12是Lys(K)、Arg(R)、Glu(E)、Thr(T)或Gln(Q);
X13是Arg(R)、Lys(K)或His(H);以及
X14是Glu(E)、Arg(R)或Thr(T)。
在一些实施例中,此类功能性变体聚合酶通常将与野生型或天然存在的聚合酶(例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:42)具有基本上的序列同一性或相似性,通常具有至少80%的氨基酸序列同一性,更通常具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。
在一些实施例中,DNA聚合酶包含与SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:29相对应的氨基酸取代。在一些实施例中,氨基酸取代包括在SEQ ID NO:38的位置X8的亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。在某些实施例中,氨基酸取代包括SEQ ID NO:38的位置X8处的甘氨酸(G)。在一些实施例中,氨基酸取代包括在SEQ ID NO:29的位置X3处的赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。在某些实施例中,氨基酸取代包括SEQ ID NO:29的位置X3处的赖氨酸(K)。
可以使用例如定点诱变的已知方法和在本文进一步描述的或本领域技术人员已知的测定中多核苷酸延伸性能的确定,来确定在已识别位点中的一个或多个处的其他合适的氨基酸取代,例如描述于美国专利申请公开号2009/0148891和2009/0280539中的氨基酸取代,其全文以引用方式并入本文。
因为DNA聚合酶的精确长度变化,所以对应于X8(SEQ ID NO:38)和X3(SEQ ID NO:29)的精确氨基酸位置可以根据所使用的特定突变型聚合酶而变化。氨基酸和核酸序列比对程序是容易获得的(参见例如上文提及的那些),并且鉴于本文中识别的特定基序,用于辅助识别根据本发明的用于修饰的确切氨基酸(和对应的密码子)。表1中示出了来自示例性嗜热菌种的代表性嵌合热稳定DNA聚合酶和热稳定DNA聚合酶的对应于X8和X3的位置。
表1.在示例性聚合酶中对应于基序位置(SEQ ID NO:38的)X8和(SEQ ID NO:29的)X3的氨基酸位置。
在一些实施例中,本发明的DNA聚合酶来源于栖热菌种Z05 DNA聚合酶(SEQ IDNO:1)或其变体(例如,带有D580G突变等)。如上所提及,在栖热菌种Z05 DNA聚合酶中,位置X8对应于位置580处的天冬氨酸(D),位置X3对应于位置709处的异亮氨酸(I)。因此,在本发明的某些变体中,相对于栖热菌种Z05 DNA聚合酶(或与SEQ ID NO:1基本相同、例如具有至少约60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的DNA聚合酶),突变型聚合酶进一步包含在D580和/或I709处的至少一个氨基酸取代。在某些实施例中,SEQ ID NO:1的位置580处的氨基酸残基可以选自亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。因此,在一些实施例中,在SEQ IDNO:1的位置580处的氨基酸残基是甘氨酸(G)。进一步地,在某些实施例中,SEQ ID NO:1的位置709处的氨基酸不是I。在一些实施例中,SEQ ID NO:1的位置709处的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、L、M或H。在一些实施例中,SEQ ID NO:1的位置709处的氨基酸是K、R、S、G或A。在一些实施例中,SEQ ID NO:1的位置709处的氨基酸是K。
示例性的栖热菌种Z05 DNA聚合酶突变体包括那些包含氨基酸取代I709K(或I709R、I709S、I709G、I709A)和/或D580G的突变体。
本发明人已经示出,在与上述SEQ ID NO:1的位置709相对应的氨基酸处的取代可以导致DNA聚合酶具有改良的(即,增加的)逆转录效率、增加的RT-PCR活性(例如,更有效的RNA模板扩增而不影响DNA模板上的PCR效率)、在存在Mg2+的情况下增加的RT-PCR效率、在存在抑制剂(例如,血红蛋白的分解产物,诸如血红素和/或肝素)的情况下增加的逆转录酶活性、与对照聚合酶相比增加的延伸速率和改良的3'-错配耐受性。参见美国专利公开号US2012-0258501,其内容全文以引用方式并入本文。因此,预期本文所述的在与SEQ ID NO:1的位置709相对应的氨基酸处包含取代的改良的聚合酶也将具有上述改良的特性。
除了本文描述的突变和取代之外,本发明的DNA聚合酶还可以包括其他非取代性修饰。此类修饰可以包括例如本领域已知的共价修饰以给予包括多核苷酸延伸的应用中的其他优点。例如,一种此类修饰是使酶失活的热可逆共价修饰,但在高温(诸如通常用于多核苷酸延伸的温度)下孵育时,其逆转以活化酶。在美国专利号5,773,258和5,677,152中描述了用于此类热可逆修饰的示例性试剂,其全文以引用方式明确并入本文。
本发明的DNA聚合酶可以通过对编码对应的未修饰聚合酶(例如,野生型聚合酶或者本发明的聚合酶所来源于的对应变体)的DNA序列进行突变来构建,诸如通过使用通常称为定点诱变的技术。编码未修饰形式的聚合酶的核酸分子可以通过本领域普通技术人员熟知的各种聚合酶链式反应(PCR)技术来突变。(参见例如PCR Strategies(M.A.Innis,D.H.Gelfand,and J.J.Sninsky编辑,1995,Academic Press,San Diego,CA)第14章;PCRProtocols:A Guide to Methods andApplications(M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编辑,Academic Press,NY,1990)中描述。
作为非限制性示例,用于来自Clontech的转化定点诱变试剂盒中的双引物系统可以用于将定点突变引入编码未修饰形式的聚合酶的多核苷酸。在此系统中的靶质粒变性之后,两条引物同时退火至质粒;这些引物中的一条包含需要的定点突变,另一条包含引起限制性位点消除的在质粒中的另一个点的突变。然后进行第二条链的合成,紧密连接这两个突变,并且将产生的质粒转化至大肠杆菌mutS菌株中。质粒DNA从转化的细菌中分离,用相关的限制酶进行限制性酶切(从而线性化未突变的质粒),然后重新转换至大肠杆菌中。此系统允许直接在表达质粒中生成突变,而无需亚克隆或者生成单链的噬粒。两个突变的紧密连接和随后的未突变质粒的线性化导致高突变效率并允许最少的筛选。在初始限制性位点引物的合成之后,此方法对每个突变位点只需要使用一种新的引物类型。可以合成一组“已设计的简并”寡核苷酸引物,以便同时在给定的位点引入所有需要的突变体,而非分别准备各位置的突变体。可以对通过诱变处理区域的质粒DNA进行测序来筛选转化体,以识别并分选突变体克隆。然后每个突变型DNA可诸如在突变检测增强凝胶(MallinckrodtBaker,Inc.,Phillipsburg,NJ)上经限制性酶切并由电泳分析,以证实在该序列上不存在其他改变(通过与未诱变处理的对照进行带移比较)。可替代地,可以对整个DNA区域测序以证实在靶区域之外没有其他突变事件发生。
具有多于一个氨基酸取代的DNA聚合酶可以用各种方式生成。在氨基酸密集地位于多肽链中的情况下,它们可以使用编码所有需要的氨基酸取代的一条寡核苷酸来同时突变。然而如果氨基酸彼此定位隔开一定距离(例如由十个以上氨基酸分隔),则生成编码所有需要的变化的单一寡核苷酸更困难。作为替代,可以采用两种替代方法中的一种。在第一种方法中,针对每个待取代的氨基酸产生分离的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时退火至单链模板DNA,并且从模板合成的DNA第二条链将编码所有需要的氨基酸取代。一个替代方法涉及两轮或更多轮诱变以产生需要的突变体。第一轮如针对单突变体所述:编码未修饰聚合酶的DNA用于模板,将编码需要的第一氨基酸取代的寡核苷酸退火至此模板,然后生成异源双链DNA分子。第二轮的诱变利用第一轮的诱变中产生的突变DNA作为模板。因此,此模板已经包含一个或多个突变。然后将编码其他需要的氨基酸取代的寡核苷酸退火至此模板,并且产生的DNA链现在编码来自第一轮诱变和第二轮诱变两者的突变。由此产生的DNA能够在第三轮的诱变中用作模板等等。可替代地,可以利用Seyfang和Jin的多位点诱变法(Anal.Biochem.324:285-291.2004)。
因此,还提供了编码本发明的DNA聚合酶中的任一个的重组核酸。使用本发明的编码DNA聚合酶的核酸可以制成各种载体。包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体可用于本发明的实践中。通常,表达载体包括与编码DNA聚合酶的核酸可操作连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中为可操作连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子,任选地操纵子序列,和核糖体结合位点。另外,载体可以包含正反向调控元件(PRE)以增强转录的mRNA的半衰期(参见Gelfand等人的美国专利号4,666,848)。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用于表达聚合酶的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的多种适当的表达载体和合适的调控序列。通常,转录和翻译调控序列可以包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活子序列。在典型的实施例中,调控序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体通常也包括包含若干用于外源DNA插入的限制性位点的多接头区域。在某些实施例中,“融合标记”用于促进纯化和随后的标签/标记序列的去除(如果需要的话),例如“组氨酸标签(His-Tag)”。然而,当从嗜温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热活性和/或热稳定蛋白质时这些通常是不必要的,其中可采用“热步骤”。包含编码复制序列、调控序列、表型选择基因和目标聚合酶的DNA的合适的载体的构建使用标准重组DNA程序来制备。分离的质粒、病毒载体和DNA片段以特定顺序切割、裁剪和连接到一起以便生成需要的载体,其是本领域所熟知的(参见例如Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,NY,第2版1989))。
在某些实施例中,表达载体包括可选择标记基因以允许转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域众所周知的,并且将随所使用的宿主细胞而变化。合适的选择基因可以包括例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因,其使以这些载体转化的细胞能够在这些抗生素存在的情况下生长。
在本发明的一方面,编码DNA聚合酶的核酸以单独或与载体结合的形式被引入细胞。本文中的“引入”或语法等同形式意指核酸以一种适用于随后的核酸整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由靶细胞类型决定。示例性的方法包括CaPO4沉淀、脂质体融合、电穿孔、病毒感染等。
在一些实施例中,原核生物通常用作本发明最初的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产、用于定点诱变的单链DNA模板的生产、同时筛选许多突变体和生成的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC No.31,446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No.27,325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No.53,606)、大肠杆菌X1776(ATCC No.31,537)和大肠杆菌B;然而大肠杆菌的诸如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539的许多其他菌株、以及许多其他种和属的原核生物包括诸如枯草芽孢杆菌的杆菌、诸如鼠伤寒沙门氏杆菌或粘质沙雷氏菌的其他肠杆菌科和各种假单胞菌属的菌种全部都能用作为宿主。原核宿主细胞或其他具有刚性细胞壁的宿主细胞通常使用如上文的Sambrook等人的1.82节中描述的氯化钙方法来转化。可替代地,可使用电穿孔法以用于转化这些细胞。原核生物转化技术阐述于例如Dower,in Genetic Engineering,Principlesand Methods 12:275-296(Plenum Publishing Corp.,1990);Hanahan等人,Meth.Enzymol.,204:63,1991。通常用于大肠杆菌转化的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCIl8、pUC119和Bluescript M13,它们中的全部均描述于上文的Sambrook等人的1.12-1.20节。然而,许多其他合适的载体也可用。
本发明DNA聚合酶通常在诱导或引起DNA聚合酶表达的适当条件下,通过培养宿主细胞而产生,该宿主细胞用包含编码DNA聚合酶的核酸的表达载体进行转化。在适用于蛋白质表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域所熟知的(参见例如Sambrook等人,同上)。用于从包含λpL启动子的质粒载体生产聚合酶的合适的宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116(ATCC No.53606)(参见美国专利号5,079,352和Lawyer,F.C.等人,PCR Methods andApplications 2:275-87,1993,其均以引用方式并入本文)。表达之后,可以收获和分离聚合酶。用于纯化热稳定DNA聚合酶的方法描述于例如上文的Lawyer等人。一旦纯化,就可以测试DNA聚合酶具有增加的链置换活性、改良的RT效率、增加的错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的能力(例如,如示例中所述)。
本发明的改良的DNA聚合酶可以用于其中此类酶活性是必要或需要的任何目的。因此,在本发明的另一个方面,提供了使用聚合酶的多核苷酸延伸方法(例如PCR)。适用于多核苷酸延伸的条件是本领域已知的。(参见例如Sambrook等人,同上另参见Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(第4版,John Wiley&Sons 1999)。通常,将引物退火、即杂交至靶核酸以形成引物-模板复合物。在合适的环境中将引物-模板复合物与DNA聚合酶及核苷三磷酸接触,以允许一个或多个核苷酸添加至引物的3'-末端,从而产生与靶核酸互补的延伸的引物。引物可以包括例如一个或多个核苷酸类似物。另外,核苷三磷酸可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如核糖核苷酸或标记的核苷酸)或其混合物。在一些变体中,多核苷酸延伸反应包括靶核酸的扩增。适用于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如PCR扩增方法)。(参见例如Sambrook等人,同上;Ausubel等人,同上;PCR Applications:Protocols for Functional Genomics(Innis等人编辑,Academic Press1999)。在其他非互斥的实施例中,多核苷酸延伸反应包括RNA模板的逆转录(例如RT-PCR)。在一些实施例中,发现改良的聚合酶用于454测序(Margulies,M等人2005,Nature,437,376-380)。
任选地,引物延伸反应可包括参考或未修饰聚合酶的实际或潜在抑制剂。抑制剂可以抑制例如参考或未修饰的(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或逆转录效率。在一些实施例中,抑制剂为血红蛋白或其降解产物。例如,在一些实施例中,血红蛋白降解产物是一种血红素分解产物,诸如血红素、血卟啉或胆红素。在一些实施例中,抑制剂是铁螯合剂或紫色颜料。在一些实施例中,抑制剂是肝素。在某些实施例中,抑制剂是嵌入染料。在某些实施例中,抑制剂是黑色素,其已描述为聚合酶抑制剂。参见例如Ekhardt,等人,BiochemBiophysRes Commun.271(3):726-30(2000)。
本发明的DNA聚合酶可在存在从包含聚合酶抑制剂的样品(诸如血液)中分离的多核苷酸模板的情况下用于延伸模板。例如,本发明的DNA聚合酶可用于在存在血液的主要成分血红蛋白或存在血红蛋白降解产物的情况下延伸模板。血红蛋白可以降解为各种血红素分解产物,诸如血红素、血色素、血卟啉和胆红素。因此,在某些实施例中,本发明的DNA聚合酶可用于在存在血红蛋白降解产物(包括但不限于血红素、血色素、血卟啉和胆红素)的情况下延伸模板。在某些实施例中,血红蛋白降解产物是血红素。在一些实施例中,本发明的DNA聚合酶可以用于在存在约0.5至20.0μM、约0.5至10.0μM、约0.5至5.0μM、约1.0至10.0μM、约1.0至5.0μM、约2.0至5.0μM、或约2.0至3.0μM血红素的情况下延伸模板。在其他实施例中,本发明的DNA聚合酶可用于在存在至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0或大于20μM血红素的情况下延伸模板。血红蛋白的分解产物包括铁螯合剂和紫色颜料。因此,在一些实施例中,本发明的DNA聚合酶可用于在存在铁螯合剂和/或紫色颜料的情况下延伸模板。在其他实施例中,本发明的DNA聚合酶可以用于在存在一定量的血红蛋白降解产物的情况下延伸模板,该血红蛋白降解产物会抑制由参考或对照DNA聚合酶延伸同一模板。
本发明的DNA聚合酶可用于在存在肝素的情况下延伸模板。肝素通常作为抗凝剂存在于从血液中分离的样品中。在一些实施例中,本发明的DNA聚合酶可以用于在存在约1.0至400ng/μl、1.0至300ng/μl、1.0至200ng/μl、5.0至400ng/μl、5.0至300ng/μl、5.0至200ng/μl、10.0至400ng/μl、10.0至300ng/μl或10.0至200ng/μl肝素的情况下延伸模板。在一些实施例中,本发明的DNA聚合酶可以用于在存在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400ng/μl或大于400ng/μl肝素的情况下延伸模板。在其他实施例中,本发明的DNA聚合酶可用于在存在一定量的肝素的情况下延伸模板,该肝素会抑制由参考或对照DNA聚合酶延伸同一模板。
在一些实施例中,本文所述的改良的聚合酶用于链置换反应中。在一些实施例中,链置换反应在包含DNA模板、一种或多种引物和本文所述的热稳定DNA聚合酶的混合物中进行。反应混合物通常包含所有四种标准的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和含有二价阳离子和一价阳离子的缓冲剂。示例性的阳离子包括例如Mg2+,尽管其他阳离子诸如Mn2+或Co2+可以活化DNA聚合酶。在其他实施例中,链置换反应用本发明的热活性DNA聚合酶进行。在特定实施例中,本文所述的改良的聚合酶允许在高温下进行更有效的链置换反应,同时具有降低的核酸外切酶和/或核酸内切酶活性。
在一些实施例中,与对照聚合酶相比,改良的聚合酶具有增加的链置换活性。先前未理解到,在本文所述的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:40的对应位置处的氨基酸取代可导致链置换活性增加。
在一些实施例中,使用RNA模板,改良的聚合酶具有增加的逆转录效率,而使用DNA模板,聚合酶活性没有显著降低。因此,在一些实施例中,当与对照聚合酶相比时,改良的DNA聚合酶具有增加的RT效率,而DNA依赖性聚合酶活性没有显著降低。在一些实施例中,本文所述的改良的DNA聚合酶具有与对照多聚酶基本相同的DNA依赖性聚合酶活性。因此,在一些实施例中,本文所述的改良的DNA聚合酶具有的DNA依赖性聚合酶活性为对照聚合酶活性的至少约90%,例如为对照聚合酶活性的至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%或更高。DNA依赖性聚合酶活性可以例如通过如本文所述扩增DNA模板并确定Cp值来测得。因此,在一些实施例中,DNA聚合酶具有改良的RT效率,其测量为在将RNA用作模板时与对照聚合酶相比具有降低的Cp值,而在将DNA用作模板时相对于对照聚合酶具有基本上不变的Cp值。例如,当扩增DNA模板时,与对照聚合酶相比,改良的DNA聚合酶可以具有相差小于1.0、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1的Cp值。在一些实施例中,如示例中所述确定DNA依赖性聚合酶活性。
在一些实施例中,本发明的改良的聚合酶通过减少延伸RNA模板所需的反应时间来增加逆转录效率。例如,与对照聚合酶相比,本文描述的改良的聚合酶可以显著缩短将RNA转录成cDNA所需的反应时间,从而提高逆转录酶效率。不受理论的限制,改良的聚合酶可以通过例如增加在RNA模板上的酶的活性,诸如增加核苷酸掺入的速率和/或增加聚合酶的持续合成能力,来增加RT效率,从而有效地缩短RNA模板或RNA模板群体的延伸时间。当使用未修饰的或对照的聚合酶时,用于初始RT步骤的反应时间通常在65摄氏度下为约30分钟或更长时间。因此,在一些实施例中,改进的聚合酶可以在65摄氏度下在小于约30分钟、小于约20分钟、小于约10分钟、小于约8分钟、小于约5分钟、小于约4分钟、小于约3分钟或小于约2分钟的时间内将RNA模板转录成cDNA。在一些实施例中,改良的聚合酶可以比对照聚合酶在更短时间内或更快地将来源于丙型肝炎病毒(HCV)转录本JP2-5的RNA模板(包含HCV基因型Ib5'NTR的前800个碱基)转录成cDNA。例如,改良的聚合酶可以在相同的反应条件下在比对照聚合酶约少15秒、少30秒、少一分钟、少两分钟、少3分钟、少4分钟、少5分钟、或约少10分钟的时间内将HCV JP2-5 RNA模板的240个碱基转录成全长cDNA。在一些实施例中,改良的聚合酶可以比对照聚合酶更快地将HCV JP2-5 RNA模板的240个碱基转录成全长cDNA,例如在相同的反应条件下比对照聚合酶快约5秒、10秒、15秒、30秒、45秒或60秒或更快。在一些实施例中,反应条件是示例中描述的那些。在一些实施例中,本文所述的改良的聚合酶在上述反应混合物中在65摄氏度下与RNA模板接触约2分钟。如示例中所述,延伸步骤之后可以是延伸模板的PCR扩增。
使用Mn2+作为二价金属离子活化剂,已经实现了热稳定DNA聚合酶中最有效的RT活性。然而,众所周知,当反应中存在Mn2+时,DNA聚合酶的保真度较低。除非人们尝试生成突变,否则通常倾向于保持较高的保真度。幸运的是,大多数常规测序、PCR和RT-PCR应用不需要高保真度条件,因为检测系统通常关注产物群体。随着下一代测序、数字PCR等的出现,产物的保真度变得越来越重要,而允许更高保真度的DNA合成的方法变得至关重要。使用Mg2+作为二价金属离子活化剂来实现有效的RT活性是一种显著提高DNA聚合酶保真度并允许更可靠地复制核酸靶的极好方法。因此,在一些实施例中,如示例中所述,本发明的改良的聚合酶允许使用Mg2+作为二价金属离子活化剂来有效延伸和/或扩增RNA模板。
因为本文所述的聚合酶也可具有增加的错配耐受性,所以聚合酶用于可能发生靶模板变化而无论在高温下如何变化仍期望扩增模板的方法中。此类模板的示例可以包括例如病毒、细菌或其他病原体序列。在许多实施例中,期望简单地确定个体(人类或非人类动物)是否具有病毒感染或其他感染,而不管已经感染个体的确切病毒变体如何。作为示例,即使感染个体的特定病毒具有在引物杂交位点处导致错配的突变,也可以使用引物对以使用本发明的聚合酶扩增HCV并检测HCV的存在。
靶核酸可以来自生物或合成来源。靶可以是例如DNA或RNA。通常,在生成扩增子的地方,扩增子将由DNA组成,尽管核糖核苷酸或合成核苷酸也可以掺入扩增子中。在希望检测RNA的情况下,扩增过程通常将涉及逆转录的使用,其包括例如逆转录PCR(RT-PCR)。
特定靶序列可以包括例如病毒核酸(例如人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、(巨细胞病毒(CMV)、细小B19病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、墨累谷脑炎病毒和昆金病毒)、细菌核酸(例如金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、恶性疟原虫、鼠型沙眼衣原体、沙眼衣原体)、分枝杆菌、真菌核酸、或动植物核酸。在一些实施例中,靶核酸是动物(例如人)核酸或来源于动物(例如人)样品(即病毒或其他病原生物体核酸可以存在于来自动物活检的样品、血液样品、尿液样品、粪便样品、唾液等)。在一些实施例中,靶核酸是例如人类遗传区域,其可以包括与疾病(例如,癌症、糖尿病等)相关联的变体。因为在一些实施例中,本发明的聚合酶具有错配耐受性,所以例如在靶序列中可以存在多种相关序列的情况下,此类酶特别有用。作为示例,本发明可用于检测病毒病原体,其中病毒病原体在其基因组中具有足够的变异,以使其难以或不可能设计单个或小集合的引物,所述引物将扩增大部分或全部可能的病毒基因组;或在已知或可能发生序列变异的癌症或其他疾病遗传标记具有足够的变异。
用于使用本文所述的改良的聚合酶来检测延伸产物或扩增产物的其他方法包括使用荧光双链核苷酸结合染料或荧光双链核苷酸嵌入染料。荧光双链DNA结合染料的示例包括SYBR-green(分子探针)。结合染料的双链DNA可以与解链曲线分析结合使用,以测量引物延伸产物和/或扩增产物。解链曲线分析可以在实时PCR仪器上执行,诸如具有机载软件(SDS2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)仪器。可替代地,可以将解链曲线分析作为终点分析加以执行。熔点分析的示例性方法描述于美国专利公开号2006/0172324中,其内容全文以引用方式明确并入本文。
在本发明的另一个方面,提供了用于本文描述的引物延伸方法的试剂盒。在一些实施例中,将试剂盒划区以便于使用并包含至少一个容器,该容器提供根据本发明的改良DNA聚合酶。还可以包括一个或多个提供其他试剂的其他容器。在一些实施例中,试剂盒还可包括包含肝素或其盐或将肝素释放至溶液中的血液收集管、容器或单元。血液收集单元可以是肝素化管。此类其他容器可以包括用于根据上述方法的引物延伸程序的为熟练技术人员所知的任何试剂或其他元件,其包括用于例如核酸扩增程序(例如PCR、RT-PCR)、DNA测序程序或DNA标记程序的试剂。例如,在某些实施例中,试剂盒进一步包括容器,该容器提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'有义引物,或提供包括5'有义引物和对应的3'反义引物的引物对。在其他非互斥的变体中,试剂盒包括一个或多个提供核苷三磷酸的(常规的和/或非常规的)容器。在特定的实施例中,试剂盒包括α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP,和/或标记的dNTP,诸如荧光素或花菁染料家族dNTP。在其他非互斥的实施例中,试剂盒包括一个或多个提供适用于引物延伸反应的缓冲剂的容器。
在本发明的另一方面,提供了反应混合物,其包含本文所述的具有增加的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂耐受性的聚合酶。反应混合物可进一步包含用于例如核酸扩增程序(例如PCR、RT-PCR)、DNA测序程序或DNA标记程序的试剂。例如,在某些实施例中,反应混合物包含适用于引物延伸反应的缓冲剂。反应混合物还可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)、一种或多种引物或探针多核苷酸、核苷三磷酸(包括例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、标记的核苷酸、非常规的核苷酸)、盐(例如Mn2+、Mg2+)、标记(例如,荧光团)。在一些实施例中,反应混合物包含在引物延伸条件下可与预定多核苷酸模板杂交的5'-有义引物,或包含5'-有义引物和对应的3'反义引物的引物对。在一些实施例中,反应混合物包含α-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dITP和/或标记的dNTP,诸如荧光素或花菁染料家族dNTP。在一些实施例中,反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施例中,反应混合物包含血红蛋白或血红蛋白的降解产物。例如,在某些实施例中,血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物,诸如血红素、血色素、血卟啉和胆红素。在其他实施例中,反应混合物包含肝素或其盐。在某些实施例中,反应混合物包含与血液分离的模板核酸。在其他实施例中,模板核酸是RNA,并且反应混合物包含肝素或其盐。
在一些实施例中,反应混合物包含两种或更多种聚合酶。例如,在一些实施例中,反应混合物包含与对照聚合酶相比具有增加的逆转录酶效率的第一DNA聚合酶,和具有DNA依赖性聚合酶活性的第二DNA聚合酶。第二DNA聚合酶可以是野生型或未修饰的聚合酶,或者可以是具有增加的DNA依赖性聚合酶活性的改良的聚合酶。通过提供具有增加的逆转录酶活性的聚合酶和具有DNA依赖性聚合酶活性的聚合酶,此类反应混合物可用于扩增RNA模板(例如,RT-PCR)。
实例
提供以下实例以说明但不限制要求保护的发明。
实例1:文库生成
简而言之,此筛选过程中的步骤包括文库生成、突变型酶的表达和部分纯化、用于所需特性的酶的筛选、DNA测序、克隆纯化,和所选候选突变体的进一步表征。这些步骤中的每一个都进一步描述于下文。
克隆文库生成:编码C21 DNA聚合酶G46E突变的核酸使用用于易错PCR的GeneMorph IITM随机诱变试剂盒(Agilent Technologies)来经受易错(诱变)PCR。使用In-FusionTM克隆系统(Takara Bio USA,Inc)来克隆PCR片段,以创建诱变文库。克隆的插入物转化至化学感受态LK4细胞中。然后针对表达的突变型聚合酶的升高的链置换活性筛选文库。
测定设计:测定设计在图3中示出。四个互补的寡核苷酸Oligo A(绿色)、Oligo B(浅蓝色)、Oligo C(深蓝色)和锁定核酸(LNA)Oligo D(红色)彼此退火。Oligo A与Oligo B互补,并引发聚合反应。Oligo B是模板,并且在5'-末端具有FAM–荧光报告剂。Oligo C与Oligo B互补,并且在3'-末端处具有BHQ淬灭剂。锁定核酸Oligo D与模板Oligo B互补,并且用作高能栅栏。当将聚合酶、Mg2+和核苷酸添加至退火的混合物时,聚合反应使Oligo A延伸,并且新合成的链置换LNA Oligo D和Oligo C,从而从荧光探针释放淬灭剂。循环完成后生成荧光信号。热循环条件为:
变性 95℃ 3”
退火 60℃ 5”
延伸 65℃ 30”
30周期
对克隆的PCR片段进行测序以确定在任何单个克隆中存在的突变。
核酸酶活性为了确定核酸酶活性,在不添加dNTP的情况下进行延伸反应。当反应中不存在dNTP时,荧光信号的任何增加均归因于酶的核酸酶活性。如果未观察到荧光信号增加,则酶几乎没有或具有显著降低的核酸内切酶和核酸外切酶活性。
结果:识别出许多与亲本G46E C21聚合酶相比具有增加的链置换活性的克隆。包含单个细菌菌落(克隆)的代表性板在图4A和4B中示出。总之,对以下具有增加的链置换活性的克隆进行测序,并且指示突变(其中第一个数字对应于图4A和4B中示出的板号,而字母-数字(例如,F24)对应于板上的孔):
板1_克隆F24:突变:I686V和A693V
板1_克隆L3:突变:T516I和V633I
板1_克隆P19:突变:Q415H、E420D、E636G、N752S、V768M
板2_克隆M22:突变:R525G和F694S
板2_克隆G9:突变:Q491H和T516S
板2_克隆N19:突变:S515F和T666M
板2_克隆N7:突变:E402V、V555A和N582D
板3_克隆A24:突变:A737T和A759T
板3_克隆F21:突变:L521Q和T546A
板3_克隆G10:突变:N668S
板3_克隆I14:突变:A456T
板4_克隆G23:突变:K507M、T571A和S652F
板4_克隆K12:突变:S515F和A832V
板5_克隆C6:突变:D498E、L524V、R598G和M616I
板5_克隆G20:突变:A444T、D498E、M660K和Y673N
板5_克隆G23:突变:E493D、T511S、M648I和M749L
板5_克隆H21:突变:Q635K
突变扩散至整个聚合酶结构域。这些突变包括一级氨基酸序列中的以下“热点”或片段:515–516、521–525、633–636、666–668、693–694。
核酸酶活性:图5A和5B示出了来自没有将dNTP添加至延伸反应中的两个板的结果。大多数克隆不示出任何荧光信号。应当注意,一些孔示出荧光信号,但其处于背景水平且不高于0.5的相对荧光单元(RFU)。
此示例证实,与G46E亲本酶相比,上述突变型聚合酶具有增加或增强的链置换活性。突变型聚合酶还可以在高温下发挥作用(即,它们承受95℃的变性温度、60℃的退火温度和65℃的延伸温度。另外,突变型聚合酶表现出非常少的核酸外切酶或核酸内切酶活性。
应当理解,本文描述的示例和实施例仅用于说明目的,并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员,并且将被包括在本申请的精神和界限内以及本发明所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
Claims (23)
1.一种DNA聚合酶,其与对照DNA聚合酶相比具有增加的5′-3′链置换活性和显著降低的5′-3′核酸外切酶和核酸内切酶活性,其中所述DNA聚合酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1的以下位置相对应的位置包含一个或多个突变、或突变的组合:
686、693、516、633、415、420、636、752、768、525、694、491、516、515、666、402、555、582、737、759、521、546、668、456、507、571、652、832、498、524、598、616、444、498、660、673、493、511、648、749和635,并且其中,所述对照DNA聚合酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:40或SEQID NO:42的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的DNA聚合酶,其中在SEQ ID NO:1的对应位置的所述一个或多个突变、或突变的组合选自:
I686V、A693V、T516I、V633I、Q415H、E420D、E636G、N752S、V768M、R525G、F694S、Q491H、T516S、S515F、T666M、E402V、V555A、N582D A737T、A759T、L521Q、T546A、N668S、A456T、K507M、T571A、S652F、S515F、A832V、D498E、L524V、R598G、M616I、A444T、D498E、M660K、Y673N、E493D、T511S、M648I、M749L和/或Q635K。
3.根据权利要求1所述的DNA聚合酶,其中:
i.与SEQ ID NO:1的位置686相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸;
ii.与SEQ ID NO:1的位置693相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
iii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
iv.与SEQ ID NO:1的位置633相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
v.与SEQ ID NO:1的位置415相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸;
vi.与SEQ ID NO:1的位置420相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
vii.与SEQ ID NO:1的位置636相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
viii.与SEQ ID NO:1的位置752相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
ix.与SEQ ID NO:1的位置768相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
x.与SEQ ID NO:1的位置525相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除R以外的任何氨基酸;
xi.与SEQ ID NO:1的位置694相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除F以外的任何氨基酸;
xii.与SEQ ID NO:1的位置491相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸;
xiii.与SEQ ID NO:1的位置515相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸;
xiv.与SEQ ID NO:1的位置666相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xv.与SEQ ID NO:1的位置402相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
xvi.与SEQ ID NO:1的位置555相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除V以外的任何氨基酸;
xvii.与SEQ ID NO:1的位置582相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
xviii.与SEQ ID NO:1的位置737相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xix.与SEQ ID NO:1的位置759相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xx.与SEQ ID NO:1的位置521相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除L以外的任何氨基酸;
xxi.与SEQ ID NO:1的位置546相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxii.与SEQ ID NO:1的位置668相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除N以外的任何氨基酸;
xxiii.与SEQ ID NO:1的位置456相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxiv.与SEQ ID NO:1的位置507相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除K以外的任何氨基酸;
xxv.与SEQ ID NO:1的位置571相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxvi.与SEQ ID NO:1的位置652相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除S以外的任何氨基酸;
xxvii.与SEQ ID NO:1的位置832相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxviii.与SEQ ID NO:1的位置498相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸;
xxix.与SEQ ID NO:1的位置524相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除L以外的任何氨基酸;
xxx.与SEQ ID NO:1的位置598相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除R以外的任何氨基酸;
xxxi.与SEQ ID NO:1的位置616相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxii.与SEQ ID NO:1的位置444相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除A以外的任何氨基酸;
xxxiii.与SEQ ID NO:1的位置660相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxiv.与SEQ ID NO:1的位置673相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除Y以外的任何氨基酸;
xxxv.与SEQ ID NO:1的位置493相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除E以外的任何氨基酸;
xxxvi.与SEQ ID NO:1的位置511相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除T以外的任何氨基酸;
xxxvii.与SEQ ID NO:1的位置648相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;
xxxviii.与SEQ ID NO:1的位置749相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除M以外的任何氨基酸;和/或
xxxix.与SEQ ID NO:1的位置635相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除Q以外的任何氨基酸。
4.根据权利要求3所述的DNA聚合酶,其中:
i.与SEQ ID NO:1的位置686相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是V;
ii.与SEQ ID NO:1的位置693相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是V;
iii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是I;
iv.与SEQ ID NO:1的位置633相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是I;
v.与SEQ ID NO:1的位置415相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是H;
vi.与SEQ ID NO:1的位置420相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是D;
vii.与SEQ ID NO:1的位置636相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是G;
viii.与SEQ ID NO:1的位置752相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是S;
ix.与SEQ ID NO:1的位置768相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是M;
x.与SEQ ID NO:1的位置525相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是G;
xi.与SEQ ID NO:1的位置694相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是S;
xii.与SEQ ID NO:1的位置491相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是H;
xiii.与SEQ ID NO:1的位置516相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是S;
xiv.与SEQ ID NO:1的位置515相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是F;
xv.与SEQ ID NO:1的位置666相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是M;
xvi.与SEQ ID NO:1的位置402相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是V;
xvii.与SEQ ID NO:1的位置555相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是A;
xviii.与SEQ ID NO:1的位置582相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是D;
xix.与SEQ ID NO:1的位置737相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是T;
xx.与SEQ ID NO:1的位置759相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxi.与SEQ ID NO:1的位置521相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是Q;
xxii.与SEQ ID NO:1的位置546相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是A;
xxiii.与SEQ ID NO:1的位置668相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是S;
xxiv.与SEQ ID NO:1的位置456相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxv.与SEQ ID NO:1的位置507相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是M;
xxvi.与SEQ ID NO:1的位置571相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是A;
xxvii.与SEQ ID NO:1的位置652相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是F
xxviii.与SEQ ID NO:1的位置832相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是V;
xxix.与SEQ ID NO:1的位置498相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是E;
xxx.与SEQ ID NO:1的位置524相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是V;
xxxi.与SEQ ID NO:1的位置598相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是G;
xxxii.与SEQ ID NO:1的位置616相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是I;
xxxiii.与SEQ ID NO:1的位置444相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是T;
xxxiv.与SEQ ID NO:1的位置660相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是K;
xxxv.与SEQ ID NO:1的位置673相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是除Y以外的任何氨基酸;
xxxvi.与SEQ ID NO:1的位置493相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是D;
xxxvii.与SEQ ID NO:1的位置511相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是S;
xxxviii.与SEQ ID NO:1的位置648相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是I;
xxxix.与SEQ ID NO:1的位置749相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是L;和/或
x1.与SEQ ID NO:1的位置635相对应的所述DNA聚合酶的氨基酸是K。
5.根据权利要求1所述的DNA聚合酶,其中所述DNA聚合酶的氨基酸序列包括在SEQ IDNO:1的选自以下的对应位置的单一突变和/或突变的组合:
i.I686V和A693V;
ii.T516I和V633I;
iii.Q415H、E420D、E636G、N752S和V768M;
iv.R525G和F694S;
v.Q491H和T516S;
vi.S515F和T666M;
vii.E402V、V555A和N582D;
viii.A737T和A759T;
ix.L521Q和T546A;
x.N668S;
xi.A456T;
xii.K507M、T571A和S652F;
xiii.S515F和A832V;
xiv.D498E、L524V、R598G和M616I;
xv.A444T、D498E、M660K和Y673N;
xvi.E493D、T511S、M648I和M749L;和/或
xvii.Q635K。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的DNA聚合酶,其中所述DNA聚合酶包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:40具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的DNA聚合酶,其中所述DNA聚合酶包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:40具有至少95%同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的DNA聚合酶,其中所述增加的5′-3′链置换活性和显著降低的5′-3′核酸外切酶和核酸内切酶活性在高温下发生。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置580相对应的所述氨基酸是除D以外的任何氨基酸。
10.根据权利要求9所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置580相对应的所述氨基酸选自由L、G、T、Q、A、S、N、R和K组成的组。
11.根据权利要求10所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置580相对应的所述氨基酸是G。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置709相对应的所述氨基酸是除I以外的任何氨基酸。
13.根据权利要求12所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置709相对应的所述氨基酸选自由K、R、S、G和A组成的组。
14.根据权利要求13所述的DNA聚合酶,其中与SEQ ID NO:1的位置709相对应的所述氨基酸是K。
15.一种重组核酸,其编码根据权利要求1至14中任一项所述的DNA聚合酶。
16.根据权利要求15所述的重组核酸,其包含与SEQ ID NO:41具有至少90%同一性的核酸片列。
17.一种用于进行引物延伸的方法,其包括:
在适合引物延伸的条件下将根据权利要求1至14中任一项所述的DNA聚合酶与所述引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸接触,从而产生延伸的引物。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述引物延伸方法包括链置换反应、聚合酶链式反应(PCR)、等温扩增、或选自环介导扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CSA)和聚合酶链置换反应(PCDR)的扩增反应。
19.根据权利要求17和18中任一项所述的方法,其中所述条件包括高温。
20.一种用于生产延伸的引物的试剂盒,其包括:
至少一个容器,所述容器提供根据权利要求1至14中任一项所述的DNA聚合酶。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其进一步包括一个或多个其他容器,所述其他容器选自由以下项组成的组:
(a)提供在引物延伸条件下可与预定多核苷酸模板杂交的引物的容器;
(b)提供核苷三磷酸的容器;以及
(c)提供适用于引物延伸的缓冲剂的容器。
22.一种反应混合物,其包含根据权利要求1至14中任一项所述的DNA聚合酶、至少一种引物、多核苷酸模板和核苷三磷酸。
23.根据权利要求22所述的反应混合物,其进一步包含第二热稳定DNA聚合酶。
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