CN113817708A

CN113817708A - 一种重组dna聚合酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN113817708A
Application number: CN202111395841.3A
Authority: CN
Inventors: 杨启文; 朱盈; 贾沛瑶; 喻玮; 林元奎; 詹昊; 王鑫朝; 王炳南; 周艳琼; 尤其敏; 帅金晓; 林艺志
Original assignee: Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd; Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Ustar Biotechnologies Hangzhou Ltd; Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: CN113817708B

Abstract

本发明公开了一种重组DNA聚合酶及其制备方法和应用，基于野生型DNA聚合酶I进行定点突变，通过逐步筛选，最终获得扩增效率较高的突变型DNA聚合酶。本发明的重组DNA聚合酶的方法是将含突变型DNA聚合酶编码基因的表达载体转化到大肠杆菌中，表达并纯化得到重组DNA聚合酶。通过该技术获得的重组DNA聚合酶相较于现有聚合酶在适用温度、扩增效率、DNA结合能力以及对干扰物的耐受能力均体现明显优势，并可应用于恒温扩增方法中检测核酸，具有广泛的应用前景。

Description

一种重组DNA聚合酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程、酶工程领域，具体地说涉及一种重组DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

脱氧核糖核酸（DNA)是一种生物遗传密码，随着物种的不同会有不同的序列。细胞中参与脱氧核糖核酸合成的DNA聚合酶（DNA Polymerase）在实现DNA分子复制和遗传信息传递功能中扮演着至关重要的角色。DNA聚合酶经由序列碱基之间的互补性以及识别碱基结构特性，使得DNA的复制过程得以保持高度的正确性。DNA聚合酶可分成I、II、III三型，依氨基酸序列相似度又可以分成A、B、C三大家族聚合酶。其中A家族（如Taq）有两个功能域，5’端到3’端聚合酶功能域，5’端到3’端外切酶功能域，而B家族（如Pfu）同样的也有两个功能域，5’端到3’端聚合酶功能域，3’端到端5’外切酶功能域。从结构与实际使用情况来说，A家族酶与DNA模板的结合度、扩增产物长度、扩增产物的准确性弱于B家族酶，但A家族酶对于不同引物的适配性优于B家族酶，因此扩增的反应条件较低，实验反应较容易成功，是目前应用范围最广的一种DNA聚合酶。

分子生物医学研究、遗传学诊断、法医检验与农业基因改良相关领域中，体外核酸扩增是一项重要的技术。目前，最常用的核酸扩增技术为PCR（Polymerase ChainReaction），此扩增技术通常可以分成三个步骤——变性、退火、延伸，利用温度连续的变化重复三个步骤可以在2~3小时内将目标核酸序列以指数的方式放大扩增。然而，PCR对机器设备的依赖要求较高且反应时间较长，较难及时报告检测结果。随着近年分子技术的发展，恒温扩增技术相继被开发出来，包括转录介导的恒温扩增技术、链置换扩增技术、环介导恒温扩增方式（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）、交叉引物扩增技术等（Cross Priming Amplification, CPA）。与传统PCR技术相比，恒温扩增脱离大型PCR设备并能够在恒定温度下进行。恒温扩增的速度与灵敏度都比传统扩增技术佳，但其技术壁垒较高，其中包括引物设计与核酸合成所需的酶。随着分子诊断技术的不断发展，市场对恒温扩增中聚合酶的性能要求越来越高。目前Bst DNA聚合酶反应合成速度慢，与DNA模板的亲和力较差并且容易在扩增过程中脱落限制了扩增片段长度和扩增效率，同时其对常见干扰物质的耐受性能也不理想。当前DNA聚合酶的性能已经成为限制恒温扩增技术开发应用的瓶颈。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种重组DNA聚合酶及其表达基因、重组载体和宿主细胞；本发明另一个目的是提供该重组DNA聚合酶的制备方法；本发明还有一个目的是提供该重组DNA聚合酶在恒温扩增上的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明所述的重组DNA聚合酶，包括SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，该序列的基因序列包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。其中，SEQID NO.1所示的氨基酸序列来源于嗜热菌DNA聚合酶I（DNA Pol I，GenBank: KP993175.1）。该聚合酶具有两种功能，其一为合成DNA新链，其二是做链的置换，将双链DNA模板解链成单链DNA。本发明所述的一种新型重组DNA聚合酶是在上述野生型DNA聚合酶I的基础上经突变筛选与增加亲和序列所得，其在适用温度、扩增效率、扩增片段长度、抗干扰等各方面性能均有明显提高，并优于市面主流产品。

野生型DNA Pol I的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的重组载体，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该重组载体选用的载体优选地具有Nde I和Hind III双酶切位点。所述载体选自包括但不限于pET-30a(+)、pET-28a、pPICZα A、pHT43、pFastBac1的任意一种，优选采用pET-30a(+)或pET-28a。本发明提供的宿主细胞，含有前述的重组载体，通过转化感受态细胞获得。所述感受态细胞选自包括但不限于大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、昆虫细胞的任意一种，优选采用BL21大肠杆菌。

本发明的DNA聚合酶是SEQ ID NO.2所示的基因序列连接至表达载体中获得重组载体，将所述重组载体转入感受态宿主细胞获得克隆菌株，经诱导培养、破碎、纯化后获得。

其中，所述基因序列是将野生型DNA聚合酶I的氨基酸序列SEQ ID NO.3进行定点突变，再连接一段亲和序列后经密码子优化获得；所述定点突变是将野生型DNA聚合酶I的第313位氨基酸从D突变为V，第315位氨基酸从K突变为L；所述连接一段亲和序列是采用Linker在C端添加亲和序列VTVKFKYKGEELEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDDNGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKSGKK，获得SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

所述诱导培养条件为16-40℃，IPTG浓度0.2-5 mM。所述破碎工艺选自包括但不限于离心的方式，离心过滤后获得粗酶液；所述纯化工艺是对粗酶液进行镍离子亲和层析柱洗脱，在基因重组工序中，预先在DNA聚合酶的N端添加组氨酸纯化标签，以便于洗脱。洗脱时采用不同咪唑浓度的Tris-HCl缓冲液进行洗脱，选择纯度较高的洗脱液收集酶液。

所述的一种新型重组DNA聚合酶与野生型DNA聚合酶相比有效提高了合成速度，具有更大适用温度范围（55~70℃），最低的适用反应温度较之市面上主流产品降低了5℃，因此可以更好的与其他非耐热酶整合，如逆转录酶；且对DNA有更好的结合能力和更强的耐干扰物质能力。

基于本发明提供的DNA聚合酶与保存液可用于制备核酸恒温扩增方法中可能使用到的试剂盒，其中，所述保存液包括2-100 mM Tris-HCl、20-500 mM KCl、0.1-10 mM DTT、0.1-5 v/v % Tween 20、0.1-5 v/v % NP40、0.01-5mM EDTA、5-70 v/v %甘油；其中，Tris-HCl的pH值为7-11。

本发明提供的重组DNA聚合酶相较于现有聚合酶在同等条件下扩增效率、扩增长度与对温度范围的适应性均体现明显优势，扩增的速度显著快于现有产品，不仅可以让恒温扩增温度有更大的选择性（55~70℃），并可以快速扩增出比以往更长的序列，且对常见干扰物有更佳的耐受能力。此酶适用于交叉引物恒温扩增、环介导恒温扩增等利用链置换DNA聚合酶进行反应的扩增技术。该酶对于恒温扩增的性能提升对诸多领域具有重大价值，如病原体核酸检测、癌症早筛、遗传病诊断等。

附图说明

图1是本发明实施例4，各DNA聚合酶于不同温度扩增性能比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

本实施例提供不同突变型的重组DNA聚合酶的制备方法如下：

（1）合成包含编码不同突变位点DNA聚合酶的核苷酸序列，合成的核苷酸序列包括Nde I与Hind III酶切位点，作为目的基因。将Nde I与Hind III进行双酶切的载体pET-30a(+)与目的基因用T4 DNA连接酶连接，反应温度为16℃，过夜，获得不同突变位点的重组载体。

（2）将重组载体与大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞混合，冰浴30分钟，42℃热激60秒，冰浴5分钟，加液体LB培养基500 µl，37℃培养45分钟，涂布于含卡那霉素的平板，37℃过夜培养。选用大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主细胞主要考虑到其可高效表达含T7启动子的载体的基因。

（3）将筛选的阳性克隆菌株，接种到液体LB培养基中37℃，200 rpm培养，当培养液OD₆₀₀值达到0.6后加入IPTG至终浓度1 mM进行诱导，20℃过夜诱导。诱导结束后离心收集菌体。

（4）将收集的菌体称重，以菌体湿重 : 破菌缓冲液 = 1 g : 20 ml的比例重悬菌体，500W超声破碎，每运行2 秒间隙4秒。

（5）破碎后13000 rpm离心30分钟，收集上清液。将上清液置于60℃水浴30分钟，再13000 rpm离心30分钟，收集上清液，将上清液用0.22 µm滤膜过滤，获得粗酶液。

（6）将粗酶液过镍离子亲和层析柱，以不同咪唑浓度的缓冲液进行杂蛋白洗涤、目标蛋白洗脱。通过SDS-PAGE凝胶鉴定收集液中目的蛋白量及纯度，选择纯度较高的洗脱液进行收集。

本领域技术人员可根据需求选择性地配置洗脱液。本发明提供了一种优选的洗脱液，包括如下组分：

上样缓冲液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、10mM咪唑、5 v/v %甘油；

杂蛋白洗脱液1：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、30mM咪唑；

杂蛋白洗脱液2：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、100mM咪唑；

目的蛋白洗脱液：20 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、200mM咪唑。

（7）将目标蛋白的酶液置于30KD的透析袋中，过夜透析。将透析袋中的酶液用0.22µm滤膜过滤，测定浓度。在65℃，30分钟内，将10 nmol的dNTP掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位（U）。获得的重组DNA聚合酶，在保存液中酶浓度为200U/µl。

该重组DNA聚合酶可根据应用场景配置为不同的DNA聚合酶试剂盒。作为其中一种优选的实施方式，本实施例提供了一种DNA聚合酶试剂盒，特别适用于恒温扩增技术，例如交叉引物恒温扩增技术(CPA)、滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链置换扩增、重组聚合酶扩增等。其中，重组DNA聚合酶为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，保存液为20 mM Tris-HCl、100 mM KCl、1.5 mM DTT、0.5 v/v % Tween 20、0.5 v/v % NP40、0.1 mM EDTA、50 v/v %甘油组成；其中，Tris-HCl的pH值为8.9。

实施例2

本实施例提供不同突变型的重组DNA聚合酶扩增效率试验。

实验组为野生型DNA聚合酶，具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。该DNA聚合酶氨基酸序列共660个氨基酸，其中第1~591位来源于DNA聚合酶I（DNA Pol I，GenBank:KP993175.1）。利用生物信息学技术预测该DNA聚合酶的多个活性位点及关键功能区域后，进行单位点突变，制备不同突变型的重组DNA聚合酶。单位点突变包括：第249位氨基酸从L突变为V (L249V)、第269位氨基酸从Y突变为P (Y269P)、第299位氨基酸从Q突变为K(Q299K)、第313位氨基酸从D突变为V (D313V)、第314位氨基酸从T突变为S (T314S)、第315位氨基酸从K突变为L (K315L)、第335位氨基酸从E突变为D (E335D)、第359位氨基酸从E突变为P (E359P)、第453位氨基酸从R突变为L (R453L)、第509位氨基酸从T突变为A(T509A)、第530位氨基酸从L突变为I (L530I)、第541位氨基酸从L突变为M (L541M)。

本实施例将不同突变型的重组DNA聚合酶作为实验组，野生型DNA聚合酶I（DNAPol I，GenBank : KP993175.1）作为对照组（WT），对比60℃条件下各聚合酶的扩增时间，具体方法如下：

以固定拷贝数（1000 拷贝/测试）的人DNA为模板，于60℃进行交叉引物恒温扩增。实验物料及反应体系如下：

CPA人源β-actin 基因引物如下：

正向外围引物FB：5’-AGTACCCCATCGAGCACG-3’

反向外围引物RB：5’-AGCCTGGATAGCAACGTACA-3’

正向交叉扩增引物CPF：5’-GAGCCACACGCAGCTCATTGTATCACCAACTGGGACGACA-3’

反向交叉扩增引物CPR：5’-CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3’

增强引物IP1：5’-GAGTGTGGGTGTTCCCTTTGTACGGGCCCG-3’

检测探针IP2：5’-(FAM)-GCGTCGGCCTACCCTCGTCCTAACACGGGAGCCTGCACTGACCCGACGC-(BHQ1)3’

CPA反应体系如下：

总DNA 5µl

FB (20µM) 0.4µl

RB (20µM) 0.4µl

CPF (20µM) 2µl

CPR (20µM) 2µl

IP1 (20µM) 1.5µl

IP2 (20µM) 0.7µl

DNA聚合酶 10U

CPA-MIX 12µl

ddH₂O 补足至40µl

将不同的DNA聚合酶按上述体系进行荧光扩增反应，反应条件为60℃，持续反应60分钟，反应仪器为BIO-RAD CFX96，记录扩增产物检出时间。上述试验的结果如表1所示：

表1 不同DNA聚合酶扩增效率试验

如表1所示，D313V和K315L突变型的重组DNA聚合酶，与野生型和其他突变型的重组DNA聚合酶相比，在60℃条件下扩增产物的平均检出时间最短，扩增效率最高。

实施例3 重组DNA聚合酶温度梯度试验

野生型DNA聚合酶氨基酸序列共660个氨基酸，其中第1~591位来源于DNA聚合酶I。本实施例将以实施例2提供的D313V和K315L型重组DNA聚合酶连接亲和序列作为新型重组DNA聚合酶（Mut-D），其中，第592~597位为Linker（GTGGGG），第598~660位为亲和序列VTVKFKYKGEELEVDISKIKKVWRVGKMISFTYDDNGKTGRGAVSEKDAPKELLQMLEKSGKK。

将新型重组DNA聚合酶（Mut-D）作为实验组，对照组包括D313V单位点突变未连接亲和序列的聚合酶（Mut-313）、K315L单位点突变未连接亲和序列的聚合酶（Mut-315）、D313V和K315L双位点突变未连接亲和序列的聚合酶（Mut-313/315）以及野生型DNA聚合酶I（DNA Pol I，GenBank : KP993175.1）。对比不同温度下各酶活性具体方法如下：

以固定拷贝数(1000 拷贝/测试)的人DNA为模板，分别于55℃、60℃、65℃、70℃进行交叉引物恒温扩增。实验物料及反应体系如下：

CPA人源β-actin 基因引物如下：

正向外围引物FB：5’-AGTACCCCATCGAGCACG-3’

反向外围引物RB：5’-AGCCTGGATAGCAACGTACA-3’

反向交叉扩增引物CPR：5’-CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3’

增强引物IP1：5’-GAGTGTGGGTGTTCCCTTTGTACGGGCCCG-3’

CPA反应体系如下：

总DNA 5µl

FB (20µM) 0.4µl

RB (20µM) 0.4µl

CPF (20µM) 2µl

CPR (20µM) 2µl

IP1 (20µM) 1.5µl

IP2 (20µM) 0.7µl

DNA聚合酶 10U

CPA-MIX 12µl

ddH₂O 补足至40µl

将不同的DNA聚合酶样品按上述体系进行荧光扩增反应，反应条件为55℃、60℃、65℃、70℃，持续反应60分钟，反应仪器为BIO-RAD CFX96，记录扩增产物检出时间。

上述试验的结果如表2所示：

表2 不同DNA聚合酶温度梯度试验

如表2所示，经过改造后的新型重组DNA聚合酶Mut-D适用温度范围从60℃-70℃扩大为55℃-70℃，通过扩增产物的检出时间可得知改造后的DNA聚合酶在扩增速率上也有了明显的提高。

实施例4

本专利所述的一种重组DNA聚合酶与市售同型DNA聚合酶扩增性能比较。

测试酶包括A公司的Bst DNA聚合酶2.0为对照A，B公司的Bst II DNA聚合酶为对照B、新型重组DNA聚合酶Mut-D作为实验组。

以固定拷贝数（1000 拷贝/测试）的人DNA为模板，分别于55℃、58℃、60℃、63℃进行交叉引物恒温扩增。实验物料及反应体系如下：

CPA人源GAPDH基因引物如下：

正向外围引物FB：5’-GACATCGAAGTAGTTGCTATC-3’

负向外围引物RB：5’-CAACATCAATGGCGTGTT-3’

正向交叉扩增引物CPF：5’-TGGGAATTTTCCATGAACTGAATCA-GACCCATTTATGGATATCCATCA-3’

负向交叉扩增引物CPR：5’-TAACCCCAACTGAAGGAGGTATAAT-CCCCATGGAATCGTAGCT-3’

增强引物IP1：5’-TGTTTTAATAAGTAGATTA-3’

检测探针IP2：5’-(FAM)- GCGTCGGCCGGTTGGAAACAAAAAAGTCGTTGTCCCGACGC-(BHQ1)3’

CPA反应体系如下：

总DNA 5µl

FB (20µM) 0.4µl

RB (20µM) 0.4µl

CPF (20µM) 2µl

CPR (20µM) 2µl

IP1 (20µM) 1.5µl

IP2 (20µM) 0.7µl

DNA聚合酶 10U

CPA-MIX 12µl

ddH₂O 补足至40µl

将3种DNA聚合酶按上述体系进行荧光扩增反应，反应条件为55℃、58℃、60℃、63℃，持续反应60分钟，反应仪器为BIO-RAD CFX96，记录扩增产物检出时间。

如图1所示，本专利所述一种新型重组DNA聚合酶Mut-D相比市售A、B两种产品具有更好的扩增性能。扩增产物的检出时间明显短于对比产品，尤其是在55℃条件下时间缩短了8-9分钟。

实施例5

本实施例对不同DNA聚合酶与DNA的结合能力进行比较。

本发明提供的DNA聚合酶除了提高扩增效率与适用温度范围，亦能显著增加DNA结合能力。本实施例评价各个试验组DNA聚合酶的持续合成能力。其中包括氨基酸序列如SEQID NO.3所示的野生型DNA聚合酶(WT)，双位点定向突变（D313V, K315L）的DNA聚合酶（Mut-313/315），新型重组DNA聚合酶Mut-D，以及前文所述的对照A和对照B。

整个实验过程在避光条件下进行：在恒温扩增体系中对荧光标记物M13-40LF和ssM13mp18DNA（NEB）进行退火，之后再分别向体系中加入不同的聚合酶（聚合酶:模引物退火后的模板=1:500）。

M13-40LF引物序列为：5’-(FAM)-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

反应温度为60℃，为了避免聚合酶对同一扩增产物的多次延伸，因此每隔一段时间取出反应产物。反应结束时，向各反应管中加入50mM EDTA终止反应。将反应产物运用DNA测序仪中进行测序，得到对应的扩增产物长度数据。

产物扩增长度计算公式：log (n _I / n _T) = (n-1) log P _I+ log (1-P _I)

其中，n _I为背景信号长度差，n _T为产物信号长度，n为引物末端碱基数目；计算1/(1-P _I)为平均引物扩增长度，P _I为持续合成能力。

表3 各试验组聚合酶持续扩增长度

测试结果如表3所示，本发明提供的新型重组DNA聚合酶Mut-D所测得结果显示引物持续合成能力优于野生型聚合酶、双位点突变组(Mut-313/315)与对照A和对照B的聚合酶，且其平均引物扩增长度亦优于其他实验组别。

实施例6

本实施例评估各DNA聚合酶对常见干扰物耐受的能力。利用恒温扩增CPA反应体系中外加不同干扰物浓度梯度进行恒温扩增，扩增人源基因β-actin，测试组包括野生型DNA聚合酶I（DNA Pol I，GenBank: KP993175.1）作为对照组（WT）、A公司的Bst DNA聚合酶2.0为对照A、新型重组DNA聚合酶Mut-D作为实验组。比较各组对不同常见干扰物耐受能力具体方法如下：

CPA反应试验以固定拷贝数（1000 拷贝/测试）的人源DNA为模板。实验物料及反应体系如下：

CPA人源β-actin 基因引物：

正向外围引物FB：5’-AGTACCCCATCGAGCACG-3’

反向外围引物RB：5’-AGCCTGGATAGCAACGTACA-3’

反向交叉扩增引物CPR：5’-CTGAACCCCAAGGCCAACCGGCTGGGGTGTTGAAGGTC-3’

增强引物IP1：5’-GAGTGTGGGTGTTCCCTTTGTACGGGCCCG-3’

CPA反应体系如下：

总DNA 5µl

FB (20µM) 0.4µl

RB (20µM) 0.4µl

CPF (20µM) 2µl

CPR (20µM) 2µl

IP1 (20µM) 1.5µl

IP2 (20µM) 0.7µl

DNA聚合酶 10U

CPA-MIX 12µl

干扰物 1-5µl

ddH₂O 补足至40µl

三组DNA聚合酶按照上述体系进行恒温扩增反应，于60℃进行交叉引物恒温扩增，持续反应60分钟，反应仪器为BIO-RAD CFX96，并记录扩增产物检出时间。所得检出时间经计算得出各DNA聚合酶对干扰物的半抑制浓度（IC 50），进一步得到各DNA聚合酶对干扰物耐受的能力。

表4 DNA聚合酶对不同干扰物的IC50浓度

实验结果如表4所示，重组DNA聚合酶Mut-D对不同干扰物耐受的能力(IC50)优于野生型DNA聚合酶与市售通用DNA聚合酶。

实施例7

本发明提供一种重组DNA聚合酶在环介导恒温扩增(LAMP)方法上的应用。通过LAMP检测金黄色葡萄球菌的核酸，检测样本：金黄色葡萄球菌培养物经生理盐水稀释制备。

引物序列：

正向剥离引物：5’-GATGAATATTTAAGWGATTTCGC-3’

负向剥离引物：5’-TGGAGCTTTTTATCGTAAAGTT-3’

正向环引物：5’-ACCTAATAGATGTGAAGTCGCTTTTTTCATCTTACAACTAATGAAACAGAA-3’

负向环引物：5’-TATGTTGGTCCCATTAACTCTGAAGTTCCCTTTTTACCAATAACTGCA-3’

增强引物：5’-TTCTAGAGGATAGTTACGACT-3’

探针：5’-(FAM)-CAAAAAGAATATAAAGGCTATAA-3’

LAMP反应体系如下：

样本 5µl

正向剥离引物 (20µM) 0.4µl

负向剥离引物 (20µM) 0.4µl

正向环引物 (20µM) 2µl

负向环引物 (20µM) 2µl

增强引物 (20µM) 1.5µl

探针 (20µM) 0.7µl

重组DNA聚合酶Mut-D 10U

LAMP-MIX 12µl

ddH₂O 补足至40µl

测试方法：

按照上述体系配制反应，将金黄色葡萄球菌使用生理盐水进行梯度稀释至:10000cfu/mL, 1000 cfu/mL, 100 cfu/mL, 10 cfu/mL, 1 cfu/mL，使用生理盐水作为阴性对照。

取1 mL不同浓度的样本煮沸10分钟后作为模板。每个测试加入5µl 模板于ABI7500荧光PCR仪上60℃恒温扩增，30分钟，记录扩增产物检出时间。

表5一种重组DNA聚合酶应用在LAMP检测

测试结果如表5所示，一种重组DNA聚合酶结合LAMP检测金黄素葡萄球菌可以检出100 cfu/mL的样本。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

杭州优思达生物技术有限公司

<120> 一种重组DNA聚合酶及其制备方法和应用

<130> 23542-Y-PUMC

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 660

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala Phe

1 5 10 15

Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala

20 25 30

Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val

35 40 45

Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu

50 55 60

Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr

65 70 75 80

Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys

85 90 95

Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala

100 105 110

Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr

130 135 140

Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu

145 150 155 160

His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe

165 170 175

Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val

195 200 205

Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu

210 215 220

Gln Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu

225 230 235 240

Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys

245 250 255

Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser

260 265 270

Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn

275 280 285

Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu

290 295 300

Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Val Thr Leu Lys Val His Thr Ile

305 310 315 320

Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro

325 330 335

Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg

340 345 350

Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp

355 360 365

Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp

370 375 380

Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr

385 390 395 400

Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met

405 410 415

Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser

420 425 430

Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala

435 440 445

Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr

450 455 460

Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr

465 470 475 480

Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe

485 490 495

Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln

500 505 510

Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala

515 520 525

Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His

530 535 540

Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys

545 550 555 560

Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro

565 570 575

Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys Gly

580 585 590

Thr Gly Gly Gly Gly Val Thr Val Lys Phe Lys Tyr Lys Gly Glu Glu

595 600 605

Leu Glu Val Asp Ile Ser Lys Ile Lys Lys Val Trp Arg Val Gly Lys

610 615 620

Met Ile Ser Phe Thr Tyr Asp Asp Asn Gly Lys Thr Gly Arg Gly Ala

625 630 635 640

Val Ser Glu Lys Asp Ala Pro Lys Glu Leu Leu Gln Met Leu Glu Lys

645 650 655

Ser Gly Lys Lys

660

<210> 2

<211> 1980

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaagcccga gcagcgaaga agaaaaaccg ctggcgaaaa tggcgtttac cctggcggat 60

cgcgtgaccg aagaaatgct ggcggataaa gcggcgctgg tggtggaagt ggtggaagaa 120

aactatcatg atgcgccgat tgtgggcatt gcggtggtga acgaacatgg ccgctttttt 180

ctgcgcccgg aaaccgcgct ggcggatccg cagtttgtgg cgtggctggg cgatgaaacc 240

aaaaaaaaaa gcatgtttga tagcaaacgc gcggcggtgg cgctgaaatg gaaaggcatt 300

gaactgtgcg gcgtgagctt tgatctgctg ctggcggcgt atctgctgga tccggcgcag 360

ggcgtggatg atgtggcggc ggcggcgaaa atgaaacagt atgaagcggt gcgcccggat 420

gaagcggtgt atggcaaagg cgcgaaacgc gcggtgccgg atgaaccggt gctggcggaa 480

catctggtgc gcaaagcggc ggcgatttgg gcgctggaac gcccgtttct ggatgaactg 540

cgccgcaacg aacaggatcg cctgctggtg gaactggaac agccgctgag cagcattctg 600

gcggaaatgg aatttgcggg cgtgaaagtg gataccaaac gcctggaaca gatgggcgaa 660

gaactggcgg aacagctgcg caccgtggaa cagcgcattt atgaactggc gggccaggaa 720

tttaacatta acagcccgaa acagctgggc gtgattctgt ttgaaaaact gcagctgccg 780

gtgctgaaaa aaaccaaaac cggctatagc accagcgcgg atgtgctgga aaaactggcg 840

ccgtatcatg aaattgtgga aaacattctg cattatcgcc agctgggcaa actgcagagc 900

acctatattg aaggcctgct gaaagtggtg cgcccggtga ccctgaaagt gcataccatt 960

tttaaccagg cgctgaccca gaccggccgc ctgagcagca ccgaaccgaa cctgcagaac 1020

attccgattc gcctggaaga aggccgcaaa attcgccagg cgtttgtgcc gagcgaaagc 1080

gattggctga tttttgcggc ggattatagc cagattgaac tgcgcgtgct ggcgcatatt 1140

gcggaagatg ataacctgat ggaagcgttt cgccgcgatc tggatattca taccaaaacc 1200

gcgatggata tttttcaggt gagcgaagat gaagtgaccc cgaacatgcg ccgccaggcg 1260

aaagcggtga actttggcat tgtgtatggc attagcgatt atggcctggc gcagaacctg 1320

aacattagcc gcaaagaagc ggcggaattt attgaacgct attttgaaag ctttccgggc 1380

gtgaaacgct atatggaaaa cattgtgcag gaagcgaaac agaaaggcta tgtgaccacc 1440

ctgctgcatc gccgccgcta tctgccggat attaccagcc gcaactttaa cgtgcgcagc 1500

tttgcggaac gcatggcgat gaacaccccg attcagggca gcgcggcgga tattattaaa 1560

aaagcgatga ttgatctgaa cgcgcgcctg aaagaagaac gcctgcaggc gcgcctgctg 1620

ctgcaggtgc atgatgaact gattctggaa gcgccgaaag aagaaatgga acgcctgtgc 1680

cgcctggtgc cggaagtgat ggaacaggcg gtgaccctgc gcgtgccgct gaaagtggat 1740

tatcattatg gcagcacctg gtatgatgcg aaaggcaccg gcggcggcgg cgtgaccgtg 1800

aaatttaaat ataaaggcga agaactggaa gtggatatta gcaaaattaa aaaagtgtgg 1860

cgcgtgggca aaatgattag ctttacctat gatgataacg gcaaaaccgg ccgcggcgcg 1920

gtgagcgaaa aagatgcgcc gaaagaactg ctgcagatgc tggaaaaaag cggcaaaaaa 1980

<210> 3

<211> 591

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Ser Pro Ser Ser Glu Glu Glu Lys Pro Leu Ala Lys Met Ala Phe

1 5 10 15

Thr Leu Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Met Leu Ala Asp Lys Ala Ala

20 25 30

Leu Val Val Glu Val Val Glu Glu Asn Tyr His Asp Ala Pro Ile Val

35 40 45

Gly Ile Ala Val Val Asn Glu His Gly Arg Phe Phe Leu Arg Pro Glu

50 55 60

Thr Ala Leu Ala Asp Pro Gln Phe Val Ala Trp Leu Gly Asp Glu Thr

65 70 75 80

Lys Lys Lys Ser Met Phe Asp Ser Lys Arg Ala Ala Val Ala Leu Lys

85 90 95

Trp Lys Gly Ile Glu Leu Cys Gly Val Ser Phe Asp Leu Leu Leu Ala

100 105 110

Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ala Gln Gly Val Asp Asp Val Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Lys Met Lys Gln Tyr Glu Ala Val Arg Pro Asp Glu Ala Val Tyr

130 135 140

Gly Lys Gly Ala Lys Arg Ala Val Pro Asp Glu Pro Val Leu Ala Glu

145 150 155 160

His Leu Val Arg Lys Ala Ala Ala Ile Trp Ala Leu Glu Arg Pro Phe

165 170 175

Leu Asp Glu Leu Arg Arg Asn Glu Gln Asp Arg Leu Leu Val Glu Leu

180 185 190

Glu Gln Pro Leu Ser Ser Ile Leu Ala Glu Met Glu Phe Ala Gly Val

195 200 205

Lys Val Asp Thr Lys Arg Leu Glu Gln Met Gly Glu Glu Leu Ala Glu

210 215 220

Gln Leu Arg Thr Val Glu Gln Arg Ile Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu

225 230 235 240

Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys

245 250 255

Leu Gln Leu Pro Val Leu Lys Lys Thr Lys Thr Gly Tyr Ser Thr Ser

260 265 270

Ala Asp Val Leu Glu Lys Leu Ala Pro Tyr His Glu Ile Val Glu Asn

275 280 285

Ile Leu His Tyr Arg Gln Leu Gly Lys Leu Gln Ser Thr Tyr Ile Glu

290 295 300

Gly Leu Leu Lys Val Val Arg Pro Asp Thr Lys Lys Val His Thr Ile

305 310 315 320

Phe Asn Gln Ala Leu Thr Gln Thr Gly Arg Leu Ser Ser Thr Glu Pro

325 330 335

Asn Leu Gln Asn Ile Pro Ile Arg Leu Glu Glu Gly Arg Lys Ile Arg

340 345 350

Gln Ala Phe Val Pro Ser Glu Ser Asp Trp Leu Ile Phe Ala Ala Asp

355 360 365

Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Ile Ala Glu Asp Asp

370 375 380

Asn Leu Met Glu Ala Phe Arg Arg Asp Leu Asp Ile His Thr Lys Thr

385 390 395 400

Ala Met Asp Ile Phe Gln Val Ser Glu Asp Glu Val Thr Pro Asn Met

405 410 415

Arg Arg Gln Ala Lys Ala Val Asn Phe Gly Ile Val Tyr Gly Ile Ser

420 425 430

Asp Tyr Gly Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu Ala Ala

435 440 445

Glu Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Glu Ser Phe Pro Gly Val Lys Arg Tyr

450 455 460

Met Glu Asn Ile Val Gln Glu Ala Lys Gln Lys Gly Tyr Val Thr Thr

465 470 475 480

Leu Leu His Arg Arg Arg Tyr Leu Pro Asp Ile Thr Ser Arg Asn Phe

485 490 495

Asn Val Arg Ser Phe Ala Glu Arg Met Ala Met Asn Thr Pro Ile Gln

500 505 510

Gly Ser Ala Ala Asp Ile Ile Lys Lys Ala Met Ile Asp Leu Asn Ala

515 520 525

Arg Leu Lys Glu Glu Arg Leu Gln Ala Arg Leu Leu Leu Gln Val His

530 535 540

Asp Glu Leu Ile Leu Glu Ala Pro Lys Glu Glu Met Glu Arg Leu Cys

545 550 555 560

Arg Leu Val Pro Glu Val Met Glu Gln Ala Val Thr Leu Arg Val Pro

565 570 575

Leu Lys Val Asp Tyr His Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Asp Ala Lys

580 585 590

Claims

1.一种重组DNA聚合酶，包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述重组DNA聚合酶的基因序列，包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.一种重组载体，含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的一种重组载体，其特征在于：该载体选自pET-30a(+)或pET-28a的任意一种。

5.一种宿主细胞，包含权利要求3或4所述的重组载体。

6.一种重组DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的基因序列连接至表达载体中获得重组载体，将所述重组载体转入感受态宿主细胞获得克隆菌株，经诱导培养、破碎、纯化后获得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述基因序列是将野生型DNA聚合酶I的氨基酸序列进行定点突变，再连接一段亲和序列后经密码子优化获得；

所述定点突变是将野生型DNA聚合酶I的第313位氨基酸从D突变为V，第315位氨基酸从K突变为L。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述DNA聚合酶的N端添加组氨酸纯化标签，并以镍离子亲和层析法为纯化方法。

9.根据权利要求6-8任意一项所述的制备方法，其特征在于：所述诱导培养条件为16-40℃，IPTG浓度0.2-5 mM。

10.权利要求1所述一种重组DNA聚合酶在核酸恒温扩增方法上的应用。

11.根据权利要求10所述一种重组DNA聚合酶在核酸恒温扩增方法上的应用，其特征在于：所述重组DNA聚合酶与保存液制备用于进行核酸恒温扩增的试剂盒，所述保存液包括2-100 mM Tris-HCl、20-500 mM KCl、0.1-10 mM DTT、0.1-5 v/v % Tween 20、0.1-5 v/v %NP40、0.01-5mM EDTA、5-70 v/v %甘油；其中，Tris-HCl的pH值为7-11。