CN114921436A - 末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、重组表达质粒和基因工程菌 - Google Patents

末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、重组表达质粒和基因工程菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的末端脱氧核苷酸转移酶突变体，对如SEQ ID NO.1所示的野生型末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列的位点进行突变，获得N135P、S138H、Q229D、K232D、L234R、V366M六位点突变的突变体。还公开了其编码基因、重组表达质粒和基因工程菌。本发明的末端脱氧核苷酸转移酶突变体，可以显著提高末端脱氧核苷酸转移酶的热稳定性，提高了其与3’‑OH端修饰的核苷酸的结合效率，该突变体可以取代野生型TdT发挥作用，可以应用在基因合成和信息存储领域。

Description

末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、重组表达质粒和 基因工程菌
技术领域
本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、 重组表达质粒和基因工程菌。
背景技术
DNA聚合酶在核酸的复制，修复和重组中起着至关重要的作用。末端脱氧核苷酸转移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)是一种特殊的DNA聚合酶，无需模板就可以将 脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’-OH端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子 均可作为TdT的底物，加尾长度可达5～300nt。以RNA为模板时，TdT性能严格依赖于受体 RNA 3’-末端的三级结构和核苷酸的种类。一般TdT对RNA模板的作用效率比DNA模板 低。TdT广泛用于DNA的3’末端添加同聚物、利用修饰碱基(如ddNTP，DIGdUTP)标 记DNA的3’末端、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(细胞凋亡的原位检测)等试验。 TdT通常在胸腺细胞(未成熟T细胞)和骨髓前体B细胞中表达，不仅在免疫系统中具有重 要作用，而且对某些淋巴瘤的诊断也具有重要应用，是诊断淋巴母细胞淋巴瘤/白血病的重要 依据之一。
由于空间位阻的影响，野生型TdT不能将体积较大的3’-末端修饰的核苷酸结合到DNA 分子上。因为在测序领域的应用，我们容易获得一些可逆封闭的核苷酸，TdT可以识别可逆 封闭的核苷酸，但是存在一定的困难。这是因为TdT是一种中温聚合酶，Tm值约为40℃， 并且具有边际稳定性。通常认为赋予酶所需活性的突变是不稳定的。因此，为了获得更稳定 的蛋白结构，需要首先提高TdT的热稳定性。
另外，TdT的优选底物是具有3’突出端的DNA，TdT也可以把核苷酸添加至双链DNA的钝末端(blunt end)或凹陷的3’末端(recessed 3’end)，但这类DNA不是TdT的最佳 底物，一种可能的解决方案是提高反应温度，使双链DNA末端瞬间分离，此时TdT可以结 合并发生功能。然而，野生型TdT的最佳反应温度约为37℃，Tm值约为40℃。因此，设计 热稳定性的TdT将有助于解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定性提高的末端脱氧核苷酸转移酶突变体，对如SEQ ID No.1所示的野生型末端脱氧核苷酸转移酶的氨基酸序列的位点进行突变，获得N135P、 S138H、Q229D、K232D、L234R、V366M六位点突变的突变体，氨基酸序列如SEQ IDNo.2 所示。
本发明还公开了上述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体的编码基因，其DNA序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还公开了包含上述的末端脱氧核苷酸转移酶编码基因的重组表达质粒。
优选的，质粒载体为pET-15b。
本发明还公开了表达上述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体的基因工程菌。
优选的，所述工程菌为将上述的重组表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中挑选出的阳性克 隆。
本发明的末端脱氧核苷酸转移酶突变体，可以显著提高末端脱氧核苷酸转移酶的热稳定 性，提高了其与3’-OH端修饰的核苷酸的结合效率，该突变体可以取代野生型TdT发挥作 用，可以应用在基因合成和信息存储领域。
附图说明
图1：TdT编码基因序列构建至表达载体pET-15b的质粒图谱。
图2：TdT突变体蛋白表达纯化SDS-PAGE图；从左至右依次是蛋白Marker，破碎全菌， 破菌上清，破菌沉淀，流穿液，洗杂液，20mM咪唑洗脱液，30mM咪唑洗脱液，40mM咪 唑洗脱液，50mM咪唑洗脱液。
图3：TdT突变体的结构预测图。
图4：野生型TdT与TdT突变体的thermal shift图；圆形表示野生型TdT的Tm值，正方形表示TdT突变体的Tm值。
图5：野生型TdT与TdT突变体的掺入反应核酸胶图；从左至右依次是核酸Marker，空 白对照，野生型TdT掺入反应结果，TdT突变体掺入反应结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地 说明。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内 容。
实施例1野生型TdT蛋白与TdT突变体蛋白的获得
1.TdT蛋白的氨基酸序列
野生型TdT蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，TdT蛋白突变体的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示，TdT蛋白突变体为在野生型TdT蛋白氨基酸的基础上进行N135P，S138H， Q229D，K232D，L234R及V366M的六位点突变。
2.构建表达载体
将野生型TdT蛋白的基因(如SEQ ID No.3所示)及TdT蛋白突变体的基因(如SEQID No.4所示)序列构建至表达载体pET-15b(Amp抗性，见图1)，酶切位点为Xho1和Nco1， 构建得到野生型TdT蛋白重组质粒以及TdT突变体蛋白重组质粒。
3.蛋白的表达
蛋白表达使用的宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
将上述重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态中，涂布于具有Amp抗性的平板，37℃ 过夜培养。
挑取单克隆至10mL LB(Amp 100μg/mL)中，37℃过夜培养，然后转移至1L LB(Amp100μg/mL)中，培养至OD值在0.8-1.0之间，加入0.5mM IPTG，37℃培养4h。
将培养菌液收集至广口瓶中，6000rpm，离心15min。
弃去上清，将沉淀收集至封口袋中，-80℃保存。
4.蛋白的分离与纯化
(1)分离
a.将菌体从-80℃冰箱中取出，加入lysis buffer(20mM Tris，300mM NaCl，0.02％Triton X-100，10％glycerol，pH 8.0)，搅拌溶解。
b.在菌液中加入终浓度为2mM的PMSF，超声破菌，破菌条件为：超声3s，暂停3s， 每次超声10min，共超声3次。
c.将超声完成的菌液收集至离心管中，10000rpm，离心40min。
(2)纯化
a.柱平衡：用5个柱体积的lysis buffer平衡填料。
b.上样：将离心的上清液用0.45μm的滤膜过滤，然后将上清液以5mL/min的流速经过NI亲和层析柱，并收集流穿液。
c.洗杂：用10个柱体积的lysis buffer洗杂。
d.洗脱：用20个柱体积的elution buffer(20mM Tris，300mM NaCl，0.02％TritonX-100， 500mM的imidazole，10％glycerol，pH 8.0)将目的蛋白梯度洗脱下来。
(3)测定浓度
a.将目的蛋白离心浓缩，离心速度为5000rpm，每20min取出轻晃一次。
b.用BSA作为标准蛋白，测定目的蛋白的浓度。
TdT突变体蛋白表达纯化结果如图2所示，最终得到纯度大于90％的蛋白质。
实施例2TdT突变体的结构预测
TdT突变体的结构由Phyre2网站在线预测得出。
1.将TdT突变体的氨基酸序列输入Phyre2主页的氨基酸序列框中，选择Normal(普通) 模式，提交任务。
2.下载预测结果的PDB文件，用Pymol软件分析。
TdT突变体的结构预测如图3所示，结构中的α螺旋和β折叠用cartoon形式表示，整体 为紧密的球形结构。
实施例3热稳定性实验
将蛋白质配成20μL的thermal shift实验体系。
表1：thermal shift实验体系
Figure BDA0003529273920000041
将配置好的溶液加入PCR管中，将PCR管放入定量PCR仪中，设置从20℃开始，以0.05℃/s的速度增加温度至90℃，在加热的过程中检测体系的荧光强度。
反应结束后，用QuantStudioTMReal-Time PCR Software分析实验结果。
实验结果如图4所示：圆形表示野生型TdT的Tm值，约为40.12℃，正方形表示TdT突变体的Tm值，约为48.54℃，TdT突变体的Tm值比野生型TdT的Tm值高约8℃，说明 TdT突变体的热稳定性有了显著的提高。
实施例4功能验证
本实施例采用的核苷酸是以3’-OH端磷酸修饰的核苷酸。
(1)PCR扩增质粒片段
表2：PCR扩增所用引物
引物名称 序列
pUC18-F 5’-CGTAAAAAGGCCGCGTTG-3’
pUC18-R 5’-CTGTCGGGTTTCGCCACCA-3’
以上合成引物使用1x TE buffer稀释至10μM，储存备用。
表3：PCR扩增体系
Figure BDA0003529273920000042
Figure BDA0003529273920000051
将上述体系混匀，进行PCR扩增。
表4：PCR扩增程序
Figure BDA0003529273920000052
PCR反应结束后，利用核酸电泳和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收扩增的目的片段。
(2)TdT反应
表5：TdT反应体系
pUC18-PCR片段 100ng
核苷酸(10mM) 1μL
TdT 8U
5x reaction buffer 10μL
ddH2O to 50μL
上表中采用的核苷酸是以3’-OH端磷酸修饰的核苷酸。
将反应液混匀，置于PCR仪中，37℃反应1h。然后加入0.5M EDTA，70℃，加热10min。
(3)TdT活性检测：使用1％的琼脂糖凝胶分析。预先制备琼脂糖凝胶，取琼脂糖粉末， 加入1x TAE buffer，微波炉高温融化，加入核酸染料，倒入插有梳子的胶板中，待凝固后， 在反应产物中加入DNA loading buffer，样品加样到凝胶上。然后用160V的电压跑胶30min， 跑胶结束后，在凝胶成像仪上拍照，并分析结果。结果如图5所示：条带4(突变型TdT掺 入反应的核酸条带)的核酸分子量比条带3(野生型TdT掺入反应的核酸条带)的核酸分子 量高，说明，突变型TdT在结合3’-OH端修饰的核苷酸时的效率更高。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本 发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
<120> 末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、重组表达质粒和基因工程菌
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 461
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser
20 25 30
Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu
35 40 45
Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg
50 55 60
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Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile
85 90 95
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100 105 110
Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu
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Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg
130 135 140
Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys
145 150 155 160
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165 170 175
Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu
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Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg
245 250 255
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260 265 270
Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly
275 280 285
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305 310 315 320
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ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggccaagga 300
tcctcccaat atgcttgcca gcgaagaacc acattaaaca attacaacca actattcacg 360
gatgcccttg atatcctggc tgaaaatgat gagcttagag agcctgaagg tcattgcctg 420
gcattcatgc gagcatcctc tgtactgaaa tctctgccat tccccatcac cagcatgaaa 480
gacacagagg ggattccttg cctaggggac aaggtgaaga gtatcataga gggaattatt 540
gaagatggag aaagttctga agctaaagct gtgttaaatg atgagcgata taaatccttc 600
aaactcttta cctctgtgtt tggtgtggga ctgaagacag ctgagaaatg gttcaggatg 660
ggtttcagaa ctctcagcaa aatagattca gacgacagcc ggaggtttac acaaatgcag 720
aaagcaggat tcctctacta cgaagacctc gttagctgtg tgaacaggcc agaagccgag 780
gctgtcagca tgctagttaa ggaggcggtt gtgacatttc ttccagatgc cttggtcacc 840
atgactgggg ggttccgcag gggtaagatg actggacatg acgtagactt tctaattacc 900
agcccagaag ccacagagga tgaagagcag cagctcttgc ataaagtgac agacttttgg 960
aagcagcagg ggttgctttt gtactgcgac atcttagagt caacctttga aaagttcaag 1020
cagcccagca ggaaggtgga tgctctcgac catttccaga aatgcttcct gattctgaag 1080
ctggaccacg ggagaatgca cagcgagaag agcggccagc aggaaggaaa gggctggaag 1140
gccatccgtg tagatctggt catgtgcccc tatgatcgcc gggccttcgc cctgctcgga 1200
tggaccggct ccagacagtt tgagagagac ttgcggcgct atgccacaca tgagaggaag 1260
atgatgctgg acaaccacgc cctgtatgac aggactaaga gggtgtttct tgaagcagaa 1320
agtgaagaag agatctttgc ccatctggga ctggactaca ttgaaccatg ggaaagaaat 1380
gcctaa 1386

Claims (6)

1.一种末端脱氧核苷酸转移酶突变体，其特征在于其序列为在SEQ ID No.2的基础上进行N135P、S138H、Q229D、K232D、L234R及V366M六个位点的突变。
2.权利要求1所述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体的编码基因，其特征在于：其DNA序列如SEQ ID No.4所示。
3.包含权利要求2所述的末端脱氧核苷酸转移酶编码基因的重组表达质粒。
4.根据权利要求3所述的重组表达质粒，其特征在于：质粒载体为pET-15b。
5.表达权利要求1所述的末端脱氧核苷酸转移酶突变体的基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：为将权利要求3或4所述的重组表达质粒转化到E.coliBL21(DE3)中挑选出的阳性克隆。
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