CN107828755B - 热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用 - Google Patents

热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用。本发明的热启动Taq DNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，包括如下步骤：(1)重组表达载体的构建及转化；(2)重组菌的诱导表达；(3)粗酶制备和纯化；(4)抗体修饰。本发明提供的热启动Taq DNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。

Description

热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物化学及分子生物学领域，具体地说，涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用。
背景技术
Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌中分离出的一种热稳定聚合酶，该酶基因编码区核苷酸序列为2496个碱基，编码832个氨基酸，是分子量为94KD的热稳定碱性蛋白，具有DNA结合能力。Taq DNA聚合酶良好的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的主要原因，是分子生物学中必不可少的工具酶。
在PCR第一个循环变性之前，升温过程中引物和模板会有一些非特异性配对，如果此时Taq DNA聚合酶发挥活性，则容易产生非特异性扩增，由于循环初期模板量非常少，产生的非特异性条带经后续的指数扩增，将严重干扰目的片段的扩增，甚至导致特异性条带不能扩出。
热启动PCR技术可以用来解决非特异性扩增产物的出现，引物二聚体的形成，目标片段无扩增等问题。热启动PCR技术要通过特定的热启动DNA聚合酶来实现热启动PCR过程，热启动PCR过程中需要封闭反应体系中的组分来保证热启动PCR过程顺利进行。目前实现热启动PCR过程的方法主要包括：手工热启动法、物理隔绝法、化学封闭法及抗体修饰法等。其中手工热启动法操作步骤繁琐；物理隔绝法操作复杂，热启动效果差；化学封闭法需要预加热，易照成DNA损伤；抗体修饰法通过抗体特异性封闭酶活性中心，其中的特异性是基于抗原决定簇与抗体超变区的沟槽分子表面的结构互性与亲合性，高温加热前，抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶结合抑制了Taq DNA聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物和模板DNA引起的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增，提高了PCR扩增的特异性，该方法是目前商业化生产热启动Taq DNA聚合酶最为理想的方法之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种热启动Taq DNA聚合酶及其应用，该Taq DNA聚合酶特异性高、灵敏度高，操作方便，可以用于常规PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆。
本发明的另一目的是提供上述热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，即抗体修饰法。
为了实现本发明目的，本发明提供的热启动Taq DNA聚合酶，是经抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCRanti-Taq high，商品编号：TCP-101。
本发明的热启动Taq DNA聚合酶是利用抗体修饰法制备得到，根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列(D32013.1)，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组工程菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析等方式，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶。
本发明中，优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
前述方法包括：(1)重组表达载体的构建及转化；(2)重组菌的诱导表达；(3)粗酶制备和纯化；(4)抗体修饰。
在本发明的一个具体实施方式中，重组表达载体的构建方法如下：人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和Not I限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和Not I双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达Taq DNA聚合酶的重组菌。
鉴定方法如下：挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和Not I进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出2500bp左右片段的，为正确的阳性克隆。
重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：
①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时。
②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心10-15min，收集上清。
粗酶制备和纯化：
③梯度盐析：本发明采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶。具体如下：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析。
④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液。具体操作如下：
先用平衡缓冲液平衡色谱柱(如Bio-ScaleTM Mini UNOsphere Q阴离子交换预装柱)5个色谱柱柱体积(CV)，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5CV的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱5CV，最后用60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱5CV，回收目的蛋白酶液。
⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存。
(4)抗体修饰：
将纯化的Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动Taq DNA聚合酶。具体方法如下：
⑥将纯化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按体积比2:1混合孵育。优选地，将Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体于25℃孵育30min。
⑦向上述混合体系中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液，即得热启动Taq DNA聚合酶，于-20℃以下贮存。
优选地，本发明的三步盐析法为：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm(优选4℃，13500rpm)离心15-20min，收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液溶解，得到粗酶液；将粗酶液加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液。
本发明中，预裂解缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/ml溶菌酶(lysozyme)，pH＝8.0。
裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40(乙基苯基聚乙二醇)，pH＝8.0。
透析缓冲液和平衡缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl pH＝8.0。
洗脱缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
用抗体修饰Taq DNA聚合酶时所用的酶稀释液的配方为：20mM Tris-HCl，50mMKCl，0.1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，0.5％吐温20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0。
第三步盐析中用于溶解沉淀的悬浮缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖(dertrose)，1mM EDTA，pH＝8.0。
贮存缓冲液的配方为：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫苏糖醇(DTT)，1％吐温20，1％Nonidet P40，pH＝8.0。
本发明进一步提供所述热启动Taq DNA聚合酶在PCR扩增、实时荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR及TA克隆中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供的热启动Taq DNA聚合酶是通过抗体修饰法得到的，高温加热前，特异地结合在酶活性中心的抗体抑制了Taq DNA聚合酶的活性，从而抑制低温条件下由引物和模板DNA引起的非特异性杂交或引物二聚体引起的非特异性扩增。高温加热后，抗体失活，酶活性中心暴露，使之高效催化特异性结合的引物延伸，提高了目的片段的产量，PCR反应灵敏度和特异性大大提高。
(一)本发明采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶，可以有效地去除杂蛋白，提高粗酶纯度2-2.5倍。
(二)抗体修饰Taq DNA聚合酶时所用的酶稀释液为改良配方，能有效提高PCR扩增反应的特异性。
(三)抗体修饰在25℃下进行，更有利于抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶发生特异性结合，所形成的复合物更稳定。
(四)在蛋白表达过程中，大肠杆菌宿主菌存在着对密码子的偏爱性，富含大肠杆菌不常用密码子的外源基因有可能在宿主菌中得不到有效表达。本发明采用如SEQ ID NO:1所示经密码子优化后的Taq DNA聚合酶基因片段可有效提高Taq DNA聚合酶基因在大肠杆菌中的表达水平。
(五)本发明中使用的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体，是从若干抗体中优选出的，用其修饰的Taq DNA聚合酶可有效避免扩增反应中非特异性扩增产物的出现。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的热启动Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE纯度检测电泳图。其中，泳道1为Prestained Protein Ladder(美国Thermo Scientific公司产品，货号：26616)；泳道2为梯度盐析第一步盐析后粗酶液；泳道3为梯度盐析第一步盐析后粗酶液透析产物；泳道4为梯度盐析第二步盐析后粗酶液；泳道5为梯度盐析第二步盐析后粗酶液透析产物；泳道6为梯度盐析第三步盐析后粗酶液；泳道7为梯度盐析第三步盐析后酶液透析浓缩产物，泳道8为常规一步盐析法盐析后酶液透析浓缩产物。
图2为本发明实施例1中制备的热启动Taq DNA聚合酶的SDS-PAGE纯度检测电泳图。其中，泳道1为梯度盐析后酶液透析产物；泳道2为梯度盐析后粗酶液；泳道3为Prestained Protein Ladder；泳道4为抗体修饰后Taq DNA聚合酶；泳道5为层析后Taq DNA聚合酶。
图3为本发明实施例2中利用荧光定量PCR法对制备的热启动Taq DNA聚合酶成品酶进行酶活性标定的线性拟合方程。以Hot Start Taq酶(5U/μl)为标准。
图4为本发明实施例2中将热启动Taq DNA聚合酶用于实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸(DNA)的结果图。
图5为本发明实施例3中将热启动Taq DNA聚合酶应用于实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒(HCV)核酸(RNA)的结果图。
图6-图8分别为本发明实施例4中抗体修饰时宝生物工程(大连)有限公司的TaqAntibody在20℃、25℃、30℃时的实时荧光PCR检测结果图。
图9-图11分别为本发明实施例4中抗体修饰时日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high在20℃、25℃、30℃时的实时荧光PCR检测结果图。
图12-图14分别为本发明实施例4中抗体修饰时南京诺唯赞生物科技有限公司的Champagne Taq antibody在20℃、25℃、30℃时的实时荧光PCR检测结果图。
图15-图17分别为本发明实施例4中抗体修饰时北京傲锐东源生物科技有限公司的Mouse monoclonal anti-Taq antibody for Hot start PCR在20℃、25℃、30℃时的实时荧光PCR检测结果图。
图18-图20分别为本发明实施例4中，0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml的日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high按照体积比为1:1进行抗体修饰时，在25℃温度条件下温育10min、30min、60min的实时荧光PCR检测结果图。
图21-图23分别为本发明实施例4中，0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml的日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high按照体积比为2:1进行抗体修饰时，在25℃温度条件下温育10min、30min、60min的实时荧光PCR检测结果图。
图24-图26分别为本发明实施例4中，0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml的日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high按照体积比为3:1进行抗体修饰时，在25℃温度条件下温育10min、30min、60min的实时荧光PCR检测结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1热启动Taq DNA聚合酶的制备方法
本实施例中利用抗体修饰法制备热启动Taq DNA聚合酶。根据GenBank公布的TaqDNA聚合酶基因序列(D32013.1)，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组工程菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析等方式，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶。
1、重组表达载体pET-28a/Taq的构建
人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和Not I限制性内切酶对上述片段(SEQ ID NO:1)进行双酶切，然后将其连入经NcoI和Not I双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和Not I进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出2500bp左右片段的，为正确的阳性克隆。
2、重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性
①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养11小时。
②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液(20mMTris-HCl(pH＝8.0)，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/ml lysozyme)10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液(10mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40)，于75℃热变性60min，然后4℃，13500rpm离心10min，收集上清。
3、粗酶制备和纯化
包括梯度盐析、层析和透析，具体如下：
①第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度为15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，4℃，13500rpm离心15min收集上清，将盐析后的上清加入到透析袋中，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液。
②第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度为15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，4℃，13500rpm离心15min收集上清，将盐析后的上清加入到透析袋中，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液。
③第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度为25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，4℃，13500rpm离心15min收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM dertrose，1mM EDTA)溶解，即得到粗酶液。将粗酶液加入到透析袋中，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液。
④层析：先用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))平衡色谱柱5个色谱柱柱体积(CV)，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液样本上样，上样后先用5CV的平衡缓冲液(20mMTris-HCl(pH＝8.0))冲洗色谱柱，然后用40％的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，1MNaCl)洗脱色谱柱5CV，最后用60％的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，1M NaCl)洗脱色谱柱5CV，回收目的蛋白酶液。
⑤透析：将层析得到的目的蛋白酶液加入到透析袋中，使用贮存缓冲液(40mMTris-HCl(pH＝8.0)，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM DTT，1％Tween 20，1％Nonidet P40)，于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得Taq DNA聚合酶，-20℃以下贮存。
采用常规一步盐析法制备粗酶(对照实验)，具体方法如下：
①盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度为30％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，4℃，13500rpm离心15min收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mMdertrose，1mM EDTA)溶解，即得到粗酶液。将粗酶液加入到透析袋中，使用透析缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液。
②层析：先用平衡缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0))平衡色谱柱5个色谱柱柱体积(CV)，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液样本上样，上样后先用5CV的平衡缓冲液(20mMTris-HCl(pH＝8.0))冲洗色谱柱，然后用40％的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，1MNaCl)洗脱色谱柱5CV，最后用60％的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，1M NaCl)洗脱色谱柱5CV，回收目的蛋白酶液。
③透析：将层析得到的目的蛋白酶液加入到透析袋中，使用贮存缓冲液(40mMTris-HCl(pH＝8.0)，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM DTT，1％Tween 20，1％Nonidet P40)，于4℃下透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得Taq DNA聚合酶，-20℃以下贮存。
4、抗体修饰
①将纯化得到的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mMKCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按照体积比2:1混合，25℃恒温30min。
②向抗体修饰后的酶液中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)，即得热启动Taq DNA聚合酶，-20℃以下贮存。
纯度检测：采用SDS-PAGE电泳检测热启动Taq DNA聚合酶成品酶的纯度，SDS-PAGE电泳检测结果如图1、图2所示。
实施例2热启动Taq DNA聚合酶在DNA荧光定量检测中的应用
1.酶活性标定
以大连宝生物公司Hot Start Taq酶(5U/μl)为标准，应用荧光定量PCR法，对制备的Taq DNA聚合酶成品酶进行酶活性标定。将Taq DNA聚合酶成品酶的检测均值与大连宝生物公司Hot Start Taq酶的检测均值进行双对数拟合，要求线性相关系数R＞0.97。
1.1样本制备
以卫生部临床检验中心HBV DNA血清标准物质(浓度为1.2×106IU/ml)，用阴性血清进行10倍梯度稀释，共稀释4个浓度(1.2×105IU/ml、1.2×104IU/ml、1.2×103IU/ml、1.2×102IU/ml)，将1.2×105IU/ml～1.2×102IU/ml 4个浓度分别作3次平行重复检测。
1.2HBV DNA提取
使用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取试剂盒(磁珠法)”进行乙型肝炎病毒核酸的提取和纯化工作。具体操作参照产品说明书进行。
1.3加样和检测
按照表1制备HBV PCR反应液，然后取HBV DNA样本各30μl加入到PCR反应液中，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行检测。扩增程序如表2所示。
表1 HBV PCR反应液组成
组分 体积
10×PCR buffer 5μl
dNTPs(2mM) 4μl
热启动Taq DNA聚合酶 1μl
UNG酶(1U/μl) 0.2μl
HBV上游引物(20μM) 0.5μl
HBV下游引物(20μM) 0.5μl
HBV探针(20μM) 0.2μl
H<sub>2</sub>O 8.6μl
总体积 20μl
表2实时荧光PCR扩增程序
Figure BDA0001487531570000121
*：荧光采集检测通道选择：选择FAM通道检测HBV DNA。
1.4结果分析
线性拟合方程见图3，Y为Taq DNA聚合酶成品酶的检测值(Log)，X为大连宝生物公司Hot Start Taq酶的检测值(Log)。从图3中可以看出：线性相关系数R＞0.97，由此可见Taq DNA聚合酶成品酶与大连宝生物公司Hot Start Taq酶活性无差别。
2.DNA样本的检测
2.1DNA病毒样本制备
乙型肝炎病毒(HBV)是典型的DNA双链病毒。以中国食品药品检定研究院HBV定量参考品L0为初始样本(浓度为1×107IU/ml)，用阴性血清进行10倍梯度稀释，共稀释5个浓度(1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml)。
2.2HBV DNA提取
使用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取试剂盒(磁珠法)”进行乙型肝炎病毒核酸的提取和纯化工作。具体操作参照产品说明书进行。
2.3加样和检测
按照表1制备HBV PCR反应液，然后取HBV DNA样本各30μl加入到PCR反应液中，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行检测。扩增程序如表2所示。
2.4结果分析
热启动Taq DNA聚合酶活性检测结果如图4所示，其中从左至右分别为1×107IU/ml、1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml等6个浓度的扩增曲线，从图4中可以看出：6个浓度的HBV阳性样本在含有抗体修饰法制备的热启动Taq DNA聚合酶与在市售大连宝生物公司Hot Start Taq酶的反应体系中的扩增曲线相比基本无差别，线性良好。
实施例3热启动Taq DNA聚合酶在RNA荧光定量检测中的应用
1.RNA病毒样本制备
丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒。以中国食品药品检定研究院HCV最低检出限参考品为初始样本(浓度为6×106IU/ml)，用阴性血清进行10倍梯度稀释，共稀释5个浓度(6×105IU/ml、6×104IU/ml、6×103IU/ml、6×102IU/ml、6×101IU/ml)。
2.HCV RNA提取
使用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取试剂盒(磁珠法)”进行丙型肝炎病毒核酸的提取和纯化工作。具体操作参照产品说明书进行。
3.加样和检测
按照表3制备HCV RT-PCR反应液，然后取HCV RNA样本各20μl加入到PCR反应液中，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行检测。扩增程序如表4。
表3 HCV RT-PCR反应液组成
组分 体积
10×PCR buffer 5μl
dNTPs(2mM) 4μl
热启动Taq DNA聚合酶(5U/μl) 0.6μl
逆转录酶M-MLV(200U/μl) 0.5μl
RNase抑制剂(40U/μl) 0.2μl
HCV上游引物(20μM) 0.5μl
HCV下游引物(20μM) 0.5μl
HCV探针(20μM) 0.2μl
H<sub>2</sub>O 18.5μl
总体积 30μl
表4实时荧光PCR扩增程序
Figure BDA0001487531570000141
*：荧光采集检测通道选择：选择FAM通道检测HCV RNA。
4.结果分析
热启动Taq DNA聚合酶活性检测结果如图5，其中从左至右分别为6×106IU/ml、6×105IU/ml、6×104IU/ml、6×103IU/ml、6×102IU/ml、6×101IU/ml等6个浓度的扩增曲线，从图5中可以看出：6个浓度的HCV阳性样本在含有抗体修饰法制备的热启动Taq DNA聚合酶与在市售大连宝生物公司Hot Start Taq酶的反应体系中的扩增曲线相比基本无差别，线性良好。
实施例4修饰抗体的优化实验
1.抗体筛选
1.1将纯化得到的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液分别与表5中1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按照体积比1:1混合，每种混合液各3份，将4种混合液分别在20℃、25℃、30℃温度下恒温孵育10min。
表5修饰用抗体筛选表
Figure BDA0001487531570000151
1.2向抗体修饰后的酶液中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)，即得热启动Taq DNA聚合酶。
1.3将1.2中的得到的热启动Taq DNA聚合酶应用于DNA荧光定量检测中。
1.3.1DNA病毒样本制备
乙型肝炎病毒(HBV)是典型的DNA双链病毒。以中国食品药品检定研究院HBV定量参考品L0为初始样本(浓度为1×107IU/ml)，用阴性血清进行10倍梯度稀释，共稀释5个浓度(1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml)。
1.3.2HBV DNA提取
使用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取试剂盒(磁珠法)”进行乙型肝炎病毒核酸的提取和纯化工作。具体操作参照产品说明书进行。
1.3.3加样和检测
按照表1制备HBV PCR反应液，然后取HBV DNA样本各30μl加入到PCR反应液中，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行检测。扩增程序如表2所示。
1.3.4结果分析
热启动Taq DNA聚合酶检测结果如图6-图17所示，其中从左至右分别为1×107IU/ml、1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml等6个浓度的扩增曲线，从图10中可以看出：用日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibodyfor Hot Start PCR anti-Taq high抗体修饰制备得到的热启动Taq DNA聚合酶的扩增曲线线性要优于其他3种，其在25℃下表现更好。
2.抗体修饰条件优化
2.1将纯化得到的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液分别与日本东洋纺株式会社生命科学事业部的monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high抗体按照1:1、2:1、3:1三种体积比混合，每种混合液各3份，将3种混合液分别在25℃下恒温孵育10min、30min、60min。
2.2向抗体修饰后的酶液中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液(20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20，0.5％Nonidet P40，50％Glycerol)，即得热启动Taq DNA聚合酶。
2.3将2.2中的得到的热启动Taq DNA聚合酶应用于DNA荧光定量检测中。
2.3.1DNA病毒样本制备
乙型肝炎病毒(HBV)是典型的DNA双链病毒。以中国食品药品检定研究院HBV定量参考品L0为初始样本(浓度为1×107IU/ml)，用阴性血清进行10倍梯度稀释，共稀释5个浓度(1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml)。
2.3.2HBV DNA提取
使用东北制药集团辽宁生物医药有限公司生产的“核酸提取试剂盒(磁珠法)”进行乙型肝炎病毒核酸的提取和纯化工作。具体操作参照产品说明书进行。
2.3.3加样和检测
按照表1制备HBV PCR反应液，然后取HBV DNA样本各30μl加入到PCR反应液中，盖紧管盖，置于实时荧光PCR仪上进行检测。扩增程序如表2所示。
2.3.4结果分析
热启动Taq DNA聚合酶检测结果如图18-图26所示，其中从左至右分别为1×107IU/ml、1×106IU/ml、1×105IU/ml、1×104IU/ml、1×103IU/ml、1×102IU/ml等6个浓度的扩增曲线，从图22中可以看出：monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high抗体在25℃，30min温育条件下修饰制备得到的热启动Taq DNA聚合酶的扩增曲线线性表现更好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 东北制药集团辽宁生物医药有限公司
<120> 热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法与应用
<130> KHP171117937.7
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2517
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atccatggat gcgcgggatg ctgccgctct ttgagccgaa gggccgcgtc ctcctggtgg 60
acggccacca cctggcctac cgcaccttcc acgccctgaa gggcctcacc accagccgcg 120
gggagccggt gcaggcggtc tacggcttcg ccaagagcct cctcaaggcc ctcaaggagg 180
acggggacgc ggtgatcgtg gtctttgacg ccaaggcccc gtccttccgc cacgaggcct 240
acggggggta caaggcgggc cgcgccccga cgccggagga ctttccgcgc caactcgccc 300
tcatcaagga gctggtggac ctcctggggc tggcgcgcct cgaggtcccg ggctacgagg 360
cggacgacgt cctggccagc ctggccaaga aggcggaaaa ggagggctac gaggtccgca 420
tcctcaccgc cgacaaagac ctttaccagc tcctttccga ccgcatccac gccctccacc 480
cggaggggta cctcatcacc ccggcctggc tttgggaaaa gtacggcctg cgcccggacc 540
agtgggccga ctaccgcgcc ctgaccgggg acgagtccga caaccttccg ggggtcaagg 600
gcatcgggga gaagacggcg cgcaagcttc tggaggagtg ggggagcctg gaagccctcc 660
tcaagaacct ggaccgcctg aagccggcca tccgcgagaa gatcctggcc cacatggacg 720
atctgaagct ctcctgggac ctggccaagg tgcgcaccga cctgccgctg gaggtggact 780
tcgccaaacg ccgcgagccg gaccgcgagc gccttcgcgc ctttctggag cgccttgagt 840
ttggcagcct cctccacgag ttcggccttc tggaaagccc gaaggccctg gaggaggccc 900
cgtggccgcc gccggaaggg gccttcgtgg gctttgtgct ttcccgcaag gagccgatgt 960
gggccgatct tctggccctg gccgccgccc gcgggggccg cgtccaccgc gccccggagc 1020
cttataaagc cctccgcgac ctgaaggagg cgcgcgggct tctcgccaaa gacctgagcg 1080
ttctggccct gcgcgaaggc cttggcctcc cgccgggcga cgacccgatg ctcctcgcct 1140
acctcctgga cccttccaac accaccccgg agggggtggc ccgccgctac ggcggggagt 1200
ggacggagga ggcgggggag cgcgccgccc tttccgagcg cctcttcgcc aacctgtggg 1260
ggcgccttga gggggaggag cgcctccttt ggctttaccg cgaggtggag cgcccgcttt 1320
ccgctgtcct ggcccacatg gaggccacgg gggtgcgcct ggacgtggcc tatctccgcg 1380
ccttgtccct ggaggtggcc gaggagatcg cccgcctcga ggccgaggtc ttccgcctgg 1440
ccggccaccc gttcaacctc aactcccgcg accagctgga acgcgtcctc tttgacgagc 1500
tggggcttcc ggccatcggc aagacggaga agaccggcaa gcgctccacc agcgccgccg 1560
tcctggaggc cctccgcgag gcccacccga tcgtggagaa gatcctgcag taccgcgagc 1620
tcaccaagct gaagagcacc tacattgacc cgttgccgga cctcatccac ccgcgcacgg 1680
gccgcctcca cacccgcttc aaccagacgg ccacggccac gggccgcctg agtagctccg 1740
atccgaacct ccagaacatc ccggtccgca ccccgcttgg gcagcgcatc cgccgcgcct 1800
tcatcgccga ggaggggtgg ctgttggtgg ccctggacta tagccagatt gagctccgcg 1860
tgctggccca cctctccggc gacgagaacc tgatccgcgt cttccaggag gggcgcgaca 1920
tccacacgga gaccgccagc tggatgttcg gcgtcccgcg cgaggccgtg gacccgctga 1980
tgcgccgcgc ggccaagacc atcaacttcg gggtcctcta cggcatgtcg gcccaccgcc 2040
tctcccagga gctggccatc ccttacgagg aggcccaggc cttcattgag cgctactttc 2100
agagcttccc gaaggtgcgc gcctggattg agaagaccct ggaggagggc cgccgccgcg 2160
ggtacgtgga gaccctcttc ggccgccgcc gctacgtgcc agacctggag gcccgcgtga 2220
agagcgtgcg cgaggcggcc gagcgcatgg ccttcaacat gccggtccag ggcaccgccg 2280
ccgacctcat gaagctggct atggtgaagc tcttcccgcg cctggaggaa atgggggccc 2340
gcatgctcct tcaggtccac gacgagctgg tcctcgaggc cccaaaagag cgcgcggagg 2400
ccgtggcccg cctggccaag gaggtcatgg agggggtgta tccgctggcc gtgccgctgg 2460
aggtggaggt ggggattggg gaggactggc tctccgccaa ggagtgagcg gccgcat 2517
<210> 2
<211> 832
<212> PRT
<213> 水生栖热菌(Thermus aquaticus)
<400> 2
Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val
50 55 60
Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu
85 90 95
Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu
100 105 110
Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys
115 120 125
Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp
130 135 140
Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Ala Leu His Pro Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro
165 170 175
Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn
180 185 190
Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu
195 200 205
Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu
210 215 220
Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys
225 230 235 240
Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val
245 250 255
Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu
275 280 285
Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly
290 295 300
Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp
305 310 315 320
Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro
325 330 335
Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu
340 345 350
Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro
355 360 365
Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn
370 375 380
Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu
385 390 395 400
Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu
405 410 415
Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu
420 425 430
Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly
435 440 445
Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala
450 455 460
Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His
465 470 475 480
Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp
485 490 495
Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg
500 505 510
Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile
515 520 525
Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr
530 535 540
Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu
545 550 555 560
His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser
565 570 575
Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln
580 585 590
Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala
595 600 605
Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly
610 615 620
Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr
625 630 635 640
Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro
645 650 655
Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly
660 665 670
Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
675 680 685
Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg
690 695 700
Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val
705 710 715 720
Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg
725 730 735
Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro
740 745 750
Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu
755 760 765
Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His
770 775 780
Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala
785 790 795 800
Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro
805 810 815
Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu
820 825 830

Claims (2)

1.一种热启动Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述热启动Taq DNA聚合酶是经抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体修饰的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCRanti-Taq high，商品编号：TCP-101；
其中，所述Taq DNA聚合酶由GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1编码；
抗体修饰方法如下：
根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶；
优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)重组表达载体的构建及转化：
人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和Not I双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达Taq DNA聚合酶的重组菌；
(2)重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：
①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时；
②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心10-15min，收集上清；
其中，所述预裂解缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；
所述裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；
(3)粗酶制备和纯化：
③梯度盐析：采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶，具体如下：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析；
④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液；
⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存；
其中，所述贮存缓冲液的配方为：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫苏糖醇，1％吐温20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；
(4)抗体修饰：
将纯化的Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动Taq DNA聚合酶；
步骤(3)中三步盐析法具体如下：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清转移到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液溶解，得到粗酶液；将粗酶液加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
其中，所述透析缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；
第三步盐析中用于溶解沉淀的悬浮缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；
步骤(3)中层析的具体操作如下：先用平衡缓冲液平衡色谱柱5个色谱柱柱体积，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5个色谱柱柱体积的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用5个色谱柱柱体积的浓度40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，最后用5个色谱柱柱体积的浓度60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，回收目的蛋白酶液；
其中，所述平衡缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；
所述洗脱缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；步骤(4)具体如下：
⑥将纯化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀释液稀释，将0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液与1mg/ml抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体按体积比2:1混合孵育；
⑦向上述混合体系中加入与0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等体积的酶稀释液，即得热启动Taq DNA聚合酶，于-20℃以下贮存；
所述酶稀释液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM二硫苏糖醇，0.5％吐温20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0；
步骤(4)将Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体于25℃孵育30min。
2.权利要求1所述热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，根据GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大肠杆菌偏好密码子，人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后将优化的Taq DNA聚合酶基因片段构建到原核表达载体上，进行大肠杆菌转化和筛选，获得表达Taq DNA聚合酶的重组菌；然后依次进行诱导表达、细胞破壁、热变性、梯度盐析、透析和层析，完成Taq DNA聚合酶的浓缩和纯化；最后，将抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体与Taq DNA聚合酶进行特异性结合，完成Taq DNA聚合酶的配基修饰，即为热启动Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体购自日本东洋纺株式会社生命科学事业部，抗体名称：monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high，商品编号：TCP-101；
优化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)重组表达载体的构建及转化：
人工合成优化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性内切酶对上述片段进行双酶切，然后将其连入经NcoI和NotI双酶切后的pET-28a载体中，得到重组表达载体pET-28a/Taq；将pET-28a/Taq转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取阳性克隆进行培养及鉴定，鉴定正确的阳性克隆即为表达Taq DNA聚合酶的重组菌；
(2)重组菌的诱导表达、细胞破壁及热变性：
①挑取阳性克隆用LB液体培养基悬浮培养，37℃过夜培养后，转接到相同的LB液体培养基中，37℃培养10小时至菌液OD600＝0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM～1.5mM的IPTG诱导剂，37℃诱导培养10-12小时；
②将诱导培养得到的200mL菌液离心收集菌体，向菌体中加入预裂解缓冲液10mL，室温静置15min破菌；再加入等体积裂解缓冲液，于75℃热变性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心10-15min，收集上清；
其中，所述预裂解缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；
所述裂解缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；
(3)粗酶制备和纯化：
③梯度盐析：采用三步盐析法沉淀Taq DNA聚合酶，具体如下：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入硫酸铵进行盐析，然后离心，收集上清，进行透析；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入硫酸铵，盐析沉淀目的蛋白，然后离心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，对粗酶液进行透析；
④层析：采用阴离子交换法进行层析，回收目的蛋白酶液；
⑤透析：将目的蛋白酶液加入到透析袋中，用贮存缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液，透析后加入等体积甘油，即得纯化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下贮存；
其中，所述贮存缓冲液的配方为：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫苏糖醇，1％吐温20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；
(4)抗体修饰：
将纯化的Taq DNA聚合酶酶液与抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体混合孵育，即得热启动Taq DNA聚合酶；
步骤(3)中三步盐析法具体如下：
第一步盐析：向热变性得到的上清中加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清转移到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第二步盐析：向透析后的溶液中再次加入终浓度15％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集上清，将上清加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
第三步盐析：向两次盐析透析后的溶液中加入终浓度25％的硫酸铵，冰浴盐析1小时，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm离心15-20min，收集沉淀，将沉淀用悬浮缓冲液溶解，得到粗酶液；将粗酶液加入到透析袋中，用透析缓冲液于4℃透析24小时，期间更换两次透析液；
其中，所述透析缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；
第三步盐析中用于溶解沉淀的悬浮缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；
步骤(3)中层析的具体操作如下：先用平衡缓冲液平衡色谱柱5个色谱柱柱体积，取0.45μm滤膜过滤后的粗酶液上样，上样后先用5个色谱柱柱体积的平衡缓冲液冲洗色谱柱，然后用5个色谱柱柱体积的浓度40％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，最后用5个色谱柱柱体积的浓度60％的洗脱缓冲液洗脱色谱柱，回收目的蛋白酶液；
其中，所述平衡缓冲液的配方为：20mM Tris-HClpH＝8.0；
所述洗脱缓冲液的配方为：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；
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