CN117187210B - 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种Bst DNA聚合酶突变体的截短体的制备方法和应用。本申请中提供了Bst DNA聚合酶突变体的截短体，其耐热性良好，能够在大肠杆菌体系中稳定表达；本申请中提供的Bst DNA聚合酶突变体的截短体的制备方法，能够大量表达可溶性Bst DNA聚合酶，纯化成本低，产物活性好，适宜工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及Bst DNA聚合酶突变体的截短体及其制备方法和应用。
背景技术
Bst DNA聚合酶是一种来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillusstearothermophilus)DNA聚合酶，基因全长2631bp，氨基酸序列全长876aa，蛋白分子量大小为99kDa，等电点为5.32。完整的Bst DNA聚合酶具备四种活性：5 '-3 '外切酶活性、5 '-3 'DNA聚合酶活性、3 '-5 '外切酶活性（校正活性）、链置换活性，C端肽链由291-876位氨基酸组成，执行除5 '-3 '外切酶活性外的其余3种酶活性，称为Bst DNA聚合酶大片段。BstDNA聚合酶最适反应温度为65℃，在温度高于80℃时失活，因此不能用于热循环测序或PCR，具有抗逆性强，热稳定好，对非离子表面活性剂和高盐耐受性高等特点。
基于Bst DNA聚合酶的上述特性，该酶应用于富含GC碱基对的DNA测序、低含量模板DNA的快速测序、DNA的等温扩增、多重链置换扩增和全基因组扩增。此外，Bst DNA聚合酶还能启动模板依赖的DNA合成，在3 '末端随机添加核苷酸。近年来，核酸等温扩增技术发展迅猛，主要包括滚环扩增（rolling circle amplifi-cation，RCA）技术和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，Bst DNA聚合酶是这两种技术的基础用酶。由于Bst DNA聚合酶在恒温条件下就可以进行扩增反应，因此普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，相较于常规PCR检测，不依赖昂贵的PCR仪和专业实验室，检测时间短（仅为PCR技术的1/3-1/5），优势明显，因此广泛应用于医学检测、病原微生物的检验检疫，食品检疫等各个领域。Bst DNA聚合酶应用的另一个方向为二代测序，同样由于其可在恒温条件下扩增的优势，减少了文库扩增过程中循环升降温的步骤，提升了扩增效率，减少了测序时间，现有采用Bst DNA聚合酶的测序平台包括Roche、Illumina、Solexa等。
目前虽然Bst DNA聚合酶已经商业化，相较于国外商品酶，国内市场Bst DNA聚合酶质量参差不齐，国产化进程缓慢，主要从国外各个生物公司购置，虽然该方法操作简单、快捷，但价格昂贵。若能构建Bst DNA聚合酶基因表达工程菌，自行合成Bst DNA聚合酶，可大幅降低科研及生产成本，也有利于Bst DNA聚合酶的国产化。现有技术中，制备Bst DNA聚合酶的方法无法上清表达，纯化成本高，且产物活性较差。因此本领域亟需开发低成本的有利于上清表达产物活性高的Bst DNA聚合酶制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Bst DNA聚合酶突变体的截短体。
本发明的另一目的在于提供一种Bst DNA聚合酶突变体的截短体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供编码Bst DNA聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列。
本发明的另一目的在于提供与编码Bst DNA聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列适配的载体。
本发明的另一目的在于提供含有编码Bst DNA聚合酶突变体的截短体的多核苷酸序列的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供了Bst DNA聚合酶突变体的截短体，所述Bst DNA聚合酶突变体的截短体的氨基酸序列选自以下任一种：
（i）如SEQ ID NO.2所示序列的氨基酸序列；和
（ii）与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95%的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种编码Bst DNA聚合酶突变体的截短体的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：
（i）如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；
（ii）与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95%的多核苷酸；和
（iii）与（i）或（ii）中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第二方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，更优选为pET-28a(+)。
本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第三方面提供的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第二方面提供的多核苷酸。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌（Escherichia coli）。
在一些优选的方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明第五方面提供了一种制备Bst DNA聚合酶突变体的截短体的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和
分离所述目的蛋白，即得所述Bst DNA聚合酶突变体的截短体；
在一些优选的方案中，所述宿主细胞通过含有本发明第二方面所述多核苷酸的质粒转化大肠杆菌获得。
在一些优选的方案中，使用SB、TB、LB、SOC培养基培养所述的宿主细胞，更优选为使用TB或LB培养基培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在振荡的环境中培养所述的宿主细胞。
在一些优选的方案中，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，培养所述的宿主细胞时，培养至OD600在0.6至0.8，后使用IPTG进行诱导，以表达出目的蛋白。
在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：
将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。
在一些优选的方案中，所述层析柱为Ni-柱亲和层析柱（Ni-NTA）。
在一些优选的方案中，所述流动相包括Buffer A、Buffer B和Buffer C，每个Buffer中均包含磷酸钠、NaCl和咪唑。
在一些优选的方案中，所述Buffer A中包含20mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM咪唑。
在一些优选的方案中，所述Buffer B中包含20mM磷酸钠，500mM NaCl，500mM咪唑。
在一些优选的方案中，所述Buffer A中包含20mM磷酸钠，1M NaCl。
在一些优选的方案中，所述Buffer A、Buffer B和Buffer C的pH值均为7.4。
在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤还包括：
使用离子交换柱处理收集的洗脱液，得到处理液。
在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤还包括：对处理液进行透析。
本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的Bst DNA聚合酶突变体的截短体；或者
如本发明第二方面提供的多核苷酸；或者
如本发明第三方面提供的表达载体；或者
如本发明第四方面所述的宿主细胞。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
（1）本发明提供了Bst DNA聚合酶突变体的截短体，其耐热性良好，能够在大肠杆菌体系中稳定表达；
（2）本发明提供的Bst DNA聚合酶突变体的截短体的制备方法，能够大量表达可溶性Bst DNA聚合酶，纯化成本低，产物活性好，适宜工业化生产。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中Bst DNA聚合酶突变体的截短体产物SDS-PAGE鉴定图；
图2是根据本发明实施例中Bst DNA聚合酶突变体的截短体镍柱纯化结果图；
图3根据本发明实施例中Bst DNA聚合酶突变体的截短体离子交换纯化图；
图4根据本发明实施例中Bst DNA聚合酶突变体的截短体酶活测试标准曲线图。
具体实施方式
现有技术中，制备的Bst DNA聚合酶活性差，产量低活性差。本发明人经过广泛而深入的研究，通过对Bst DNA聚合酶进行突变和截短处理，得到其突变体和突变体的截短体，然后再基于突变和/或截短的Bst DNA聚合酶进行分析，得到编码其的目的基因序列，对该目的基因序列进行优化，使其适配本发明载体和宿主细胞表达体系，成功表达出酶活良好的Bst DNA聚合酶。
Bst DNA聚合酶突变体
本发明中涉及Bst DNA聚合酶突变体，其在Bst DNA聚合酶原始序列基础上在选自以下的至少一个位点进行突变得到：K369、A464和S619。进一步地，其在Bst DNA聚合酶原始序列基础上在K369、A464和S619三个位点进行突变得到。此处突变的方式可以是氨基酸的取代、增加或缺失。
在本发明的一些优选的实施方式中，Bst DNA聚合酶突变体在Bst DNA聚合酶原始序列基础上发生选自以下的至少一种突变获得：K369G、A464G和S619G。进一步地，其BstDNA聚合酶突变体在Bst DNA聚合酶原始序列基础上发生K369G、A464G和S619G突变，即将位于369位的K突变为G，将位于464位的A突变为G，将位于619位的S突变为G，得到Bst DNA聚合酶突变体。前述突变体可通过本领域常规的体外定点突变方法得到，例如通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变。
Bst DNA聚合酶突变体的截短体
本发明中涉及Bst DNA聚合酶突变体的截短体，Bst DNA聚合酶突变体的截短体在Bst DNA聚合酶原始序列基础上发生突变然后再截短得到。具体地，Bst DNA聚合酶突变体在Bst DNA聚合酶原始序列的基础上先发生选自以下的至少一种突变获得：K369G、A464G和S619G；优选地，发生K369G、A464G和S619G的突变，即将位于369位的K突变为G，将位于464位的A突变为G，将位于619位的S突变为G，得到Bst DNA聚合酶突变体。然后再对Bst DNA聚合酶突变体进行截短，截去N端的1-290个氨基酸得到，Bst DNA聚合酶突变体的截短体，具体氨基酸序选自以下任一种：（i）如SEQ ID NO.2所示序列的氨基酸序列；和（ii）与如SEQ IDNO.2所示序列的同源性大于95%的氨基酸序列。可理解地，先对Bst DNA聚合酶原始序列进行截短然后再进行相同方式的突变，也能够得到如前所述的Bst DNA聚合酶突变体的截短体。
编码目的基因多核苷酸序列
本发明中还涉及编码目的基因（编码Bst DNA聚合酶突变体以及Bst DNA聚合酶突变体的截短体）的多核苷酸序列。
本发明中，克服同义密码子偏好性优化在大肠杆菌中表达异源蛋白时产量降低的问题，本发明涉及经同义密码子偏好性优化的多核苷酸序列。对获取的目的基因序列进行同义密码子偏好性优化，经同义密码子偏好性优化的目的基因序列可表达与目的蛋白相同的氨基酸序列。在本发明的实施方式中，编码目的基因的多核苷酸序列选自以下任一种：（i）如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；（ii）与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于80%的多核苷酸（更优选大于85%，更优选大于90%，更优选大于95%）；和（iii）与（i）或（ii）中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。
本发明中Bst DNA聚合酶突变体、Bst DNA聚合酶突变体的截短体或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
含有目的基因的表达载体
本发明中还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。本发明中“载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。本发明的一个实施例中选择pET-28a(+)作为载体，以获取更高效的表达效率。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用DNA内切酶将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源DNA片段的插入。
含有目的基因的宿主细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。含有经密码子优化的目的基因的载体可以通过已知的方法插入、转染或以其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明经密码子优化的目的基因并能够表达目的蛋白的转化体。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是细菌，并且优选是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌ROSETTA(DE3)菌种（Escherichia coli Rosetta(DE3) strain）。
制备目的蛋白的方法
本发明还涉及制备目的蛋白的方法，可利用本发明的多核苷酸序列表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
其中，步骤（1）含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞可通过本领域技术人员熟知的常规技术进行，当宿主是大肠杆菌时，可选用热击法和电转化法等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，优选为SB、TB、LB或SOC培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。为促进目的蛋白的表达并提升可溶蛋白的表达量，本发明的一个优选的实施方式，使用TB或LB培养基培养的宿主细胞，且所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。使用TB培养基上清表达目的蛋白的产量略高于LB培养基。
为进一步促进目的蛋白的可溶性表达，在本发明的一个优选的实施方式中，培养宿主细胞至OD600在0.6-0.8之间后，采用IPTG进行诱导，并在17至19℃下或35至39℃下继续培养约8至12小时。在低温范围例如17至19℃下可溶性表达量高。
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。因此本发明中，在成功培养得到目的蛋白后，还涉及对其进行分离和纯化的步骤，例如从培养基中分离和纯化蛋白质以获得高纯度的目的蛋白。虽纯化目的蛋白的方法可是本领域技术人员熟知的常规手段，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的优选的实施方式，使用Ni柱亲和层析法和离子交换法对表达产物进行纯化处理。亲和层析法中，所用的溶液成分影响层析效果，本发明优选的实施方式中，所用Buffer A溶液组成如下：Buffer A: 20mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM Imidazole，pH 7.4；Buffer B: 20mM磷酸钠，500mM NaCl，500mMImidazole，pH 7.4和Buffer C：20mM磷酸钠，1M NaCl，pH 7.4。本发明的优选的实施方式，在Ni柱亲和层析法和离子交换法后还包括透析步骤，透析液组成如下：1x PBS，10 %Glycerol，pH 7.4。
在本发明中，使用针对本文中的某些实施例提供的任何示例性或示例性措辞（例如，“”）只是为了更好地呈现本发明，而不限制以其它方式要求权利的本发明的范围。本文中的任何措辞都不应被解释为表示本发明实施中不可缺少的权利要求中未描述的要素。
如果引用文献中的术语的定义或使用与本文中描述的术语的定义不一致或不一致，则使用本文中描述的术语的定义，而不使用引用文献中的术语的定义。
本文中使用的各种术语如下所示。如果权利要求中使用的术语未在下文中定义，则应给出本领域技术人员给出的该术语的最广泛定义，以反映在申请时印刷的出版物或所发布的专利中。
如本文中所用的，术语“分离的”是指与核酸或多肽在其天然来源中存在的至少一种其它组分（例如核酸或多肽）分离的核酸或多肽。 在一个实施方案中，发现核酸或多肽仅存在（如果有的话）通常存在于其溶液中的溶剂，缓冲液，离子或其它组分。 术语“分离的”和“纯化的”不包括存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文中所用的，术语“多核苷酸”和“多核苷酸序列”可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
如本文中所用的，术语“密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物（包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等）表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。
如本文中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同（即相同）核苷酸或氨基酸的百分比。 可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸（即，替换或变异）或核苷酸的缺失（即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸）。多肽可以例如通过含有氨基酸（即，取代或变异）或氨基酸的缺失（即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失）在一个位置上不同。 可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。
如本文中所用的，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。 例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。
如本文中所用的，术语“表达”包括涉及宿主细胞中多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录，翻译，翻译后修饰和分泌。表达后可收获，即回收宿主细胞或表达产物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1
本实施例中，制备得到了含有编码目的蛋白的质粒。具体步骤如下：
以NCBI提供的嗜热脂肪土芽孢杆菌Bst DNA聚合酶的全长氨基酸序列（WP_042379932.1）为参考，如SEQ ID NO:3所示，截去N端的1-290个氨基酸，并突变3个氨基酸位点（K/369/G, A/464/G, S/619/G）形成截短序列（SEQ ID NO:2），结合本发明的试验设计要求，经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后，连接载体为pET-28a(+)，C端融合表达(His)6标签，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
SEQ ID NO:2
SSEEEKPLAKMAFTLADRVTEEMLADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKGKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRSDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAGAIWALERPFLDELRRNEQDRLLVELEQPLSSILAEMEFAGVKVDTKRLEQMGEELAEQLRTVEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPYHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTKKVHTIFNQALTQTGRLGSTEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSESDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLMEAFRRDLDIHTKTAMDIFQVSEDEVTPNMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNISRKEAAEFIERYFESFPGVKRYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERMAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLNARLKEERLQARLLLQVHDELILEAPKEEMERLCRLVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGSTWYDAK
SEQ ID NO:3
>WP_042379932.1 DNA polymerase I
MRLKKKLVLIDGSSVAYRAFFALPLLHNDKGIHTNAVYGFTMMLNKILAEEEPTHMLVAFDAGKTTFRHEAFQEYKGGRQQTPPELSEQFPLLRELLRAYRIPAYELENYEADDIIGTLAARAEQEGFEVKVISGDRDLTQLASPHVTVDITKKGITDIEPYTPETVREKYGLTPEQIVDLKGLMGDKSDNIPGVPGIGEKTAVKLLRQFGTVENVLASIDEIKGEKLKETLRQHREMALLSKKLAAIRRDAPVELSLDDIAYQGEDREKVVALFKELGFQSFLEKMESPSSEEEKPLAKMAFTLADRVTEEMLADKAALVVEVVEENYHDAPIVGIAVVNEHGRFFLRPETALADPQFVAWLGDETKKKSMFDSKRAAVALKWKGIELCGVSFDLLLAAYLLDPAQGVDDVAAAAKMKQYEAVRSDEAVYGKGAKRAVPDEPVLAEHLVRKAAAIWALERPFLDELRRNEQDRLLVELEQPLSSILAEMEFAGVKVDTKRLEQMGEELAEQLRTVEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPYHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTKKVHTIFNQALTQTGRLSSTEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSESDWLIFAADYSQIELRVLAHIAEDDNLMEAFRRDLDIHTKTAMDIFQVSEDEVTPNMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNISRKEAAEFIERYFESFPGVKRYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERMAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLNARLKEERLQARLLLQVHDELILEAPKEEMERLCRLVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGSTWYDAK
实施例2
本实施例中，用实施例1中制备得到的质粒转化宿主细胞，得到含有编码目的蛋白的宿主细胞。具体步骤如下：
取1 μL质粒，通过热激法转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，加入不含抗生素的SOC 培养基，37℃振荡培养50 min。取菌液均匀涂布到含卡那抗性的LB平板上，37℃培养箱培养过夜。
SEQ ID NO.1
AGCTCTGAAGAAGAAAAACCGCTGGCAAAAATGGCGTTCACCCTGGCCGACCGTGTCACTGAAGAAATGCTGGCCGACAAAGCGGCTCTGGTGGTGGAAGTTGTGGAGGAAAACTACCACGATGCTCCGATCGTGGGCATCGCTGTTGTGAATGAGCACGGTCGCTTTTTTCTGCGTCCAGAAACCGCGCTGGCTGACCCGCAGTTCGTGGCATGGCTGGGTGATGAAACTAAAGGTAAGTCCATGTTCGATTCCAAACGTGCAGCCGTTGCCCTGAAGTGGAAAGGTATCGAACTGTGCGGTGTAAGCTTCGATCTGCTGCTGGCTGCATACCTGCTGGACCCAGCTCAGGGTGTTGATGACGTTGCTGCAGCGGCTAAGATGAAGCAATATGAAGCGGTACGCTCTGACGAGGCAGTATATGGCAAAGGTGCGAAACGTGCGGTGCCGGATGAGCCGGTCCTGGCGGAACACCTGGTTCGTAAAGCCGGTGCAATCTGGGCGCTGGAACGTCCATTTCTGGACGAACTGCGTCGTAACGAACAGGACCGCCTGCTGGTAGAACTGGAACAGCCGCTGAGCTCTATTCTGGCGGAGATGGAATTCGCGGGTGTAAAAGTTGACACCAAACGTCTGGAACAGATGGGTGAAGAACTGGCGGAACAGCTGCGTACTGTAGAGCAGCGTATCTACGAGCTGGCCGGCCAGGAATTTAACATTAACAGCCCGAAACAGCTGGGCGTGATCCTGTTCGAAAAACTGCAGCTGCCGGTTCTGAAAAAAACCAAAACCGGTTACTCCACCTCCGCCGACGTACTGGAAAAACTGGCTCCGTACCACGAGATTGTAGAAAACATCCTGCACTACCGTCAACTGGGTAAACTGCAGTCCACCTATATTGAAGGCCTGCTGAAGGTTGTCCGTCCGGATACCAAAAAAGTGCACACCATTTTCAACCAAGCGCTGACCCAGACCGGTCGTCTGGGCTCTACTGAACCTAACCTGCAGAACATTCCGATCCGTCTGGAAGAAGGCCGTAAAATCCGCCAGGCTTTCGTTCCGAGCGAATCTGACTGGCTGATTTTTGCCGCTGACTATTCCCAGATTGAACTGCGTGTTCTGGCCCACATCGCTGAAGACGATAACCTGATGGAAGCATTCCGCCGTGATCTGGACATCCATACTAAAACCGCTATGGACATCTTCCAGGTTAGCGAAGACGAAGTTACGCCGAACATGCGCCGTCAGGCGAAAGCTGTGAACTTTGGTATTGTTTACGGTATCAGCGATTATGGCCTGGCGCAGAACCTGAACATCAGCCGCAAAGAAGCAGCTGAATTCATTGAGCGCTACTTCGAATCCTTCCCGGGCGTGAAGCGCTACATGGAGAACATTGTTCAGGAAGCTAAACAGAAGGGTTACGTCACCACCCTGCTGCATCGTCGTCGTTACCTGCCAGATATCACCTCTCGCAACTTTAATGTGCGTTCTTTCGCCGAACGCATGGCAATGAATACCCCTATCCAGGGTTCCGCCGCAGACATCATCAAAAAAGCTATGATTGACCTGAACGCCCGTCTGAAGGAAGAGCGTCTGCAGGCACGTCTGCTGCTGCAGGTACATGACGAACTGATTCTGGAGGCACCGAAAGAGGAGATGGAACGCCTGTGCCGTCTGGTACCGGAAGTTATGGAGCAGGCTGTTACTCTGCGTGTTCCGCTGAAGGTAGATTACCATTACGGTTCCACTTGGTACGACGCAAAA
实施例3
本实施例中，制备获得了可溶表达的Bst DNA聚合酶。
挑取实施例2中的单克隆，接种于TB、LB培养基中，37℃ 振荡培养至OD600在0.6-0.8之间，IPTG进行诱导，18℃振荡培养过夜，不加IPTG组作为对照，每组实验重复一次。取样超声破碎进行SDS-PAGE鉴定，结果见图1。结果显示18℃诱导条件下，在LB、TB培养基中均可实现Bst DNA聚合酶在上清液中可溶性表达，TB培养基上清目的蛋白的产量高于LB培养基。蛋白分子量约为70Kda,于Expasy网站预测蛋白大小（70Kda）基本一致。
实施例4
本实施例中，将实施例3制备得到的Bst DNA聚合酶进行纯化。
TB培养基摇瓶培养1.5 L菌液，离心收集菌体。取称取约18 g菌体，加入裂解液冰上重悬，超声破碎细胞，低温高速30min，取上清，滤膜过滤，取上清液过Ni-柱亲和层析和离子交换柱，收集穿透50 mL，过夜透析，纯化电泳图如下图2和3所示。BCA法计算目的蛋白浓度为2 mg/mL，总蛋白量约100 mg，得率5.56 mg/g菌。亲和层析过程中缓冲液配制方法如下：
Buffer A: 20mM磷酸钠，500mM NaCl，20mM Imidazole，pH 7.4
Buffer B: 20mM磷酸钠，500mM NaCl，500mM Imidazole，pH 7.4
Buffer C：20mM磷酸钠，1M NaCl，pH 7.4
透析液：1x PBS，10 %Glycerol，pH 7.4。
实施例5
本实施例中，对上述实施例4中纯化得到的Bst DNA聚合酶的活性进行检测。具体步骤如下：
（1）实验材料
样品：Bst DNA聚合酶
器材和试剂：实时荧光定量PCR系统、Picogreen、λDNA（默克）。
底物T2：
5'-tagcgtacgatgtgaacctaatccTGCTCCCGCGGCCGattgcCGGCCGCGGGAGCA-3'
合成上述底物，HPLC纯化，按实验要求配置成100 pmol/μL的母液。
Bst酶稀释液配制：
10X PBS pH 7.4：10 mL、甘油：10mL ，以上原料混合，加超纯水至100 mL，0.22 μm膜过滤一次，121℃高温高压灭菌30 min，-20℃保存。
（2）实验步骤
10×PCR Buffer按下表1配置：
表1
| 1M Tris（pH8.5） | 2.5ml |
| 1M （NH4）2SO4 | 0.5ml |
| 1M KCl | 5ml |
| 10%TritonX-100 | 1ml |
| ddH2O | 1ml |
λDNA预染液按下表2配置：
表2
| 10×PCR Buffer | 30ul |
| picogreen | 15ul |
| ddH2O | 255ul |
对λDNA进行梯度稀释，共设置10个梯度，浓度（ng/μL）由高到低分别为100、25、20、15、10、7.5、5、2.5、1.25、0.625。
待测样品稀释：Bst酶样品用Bst酶稀释液稀释。稀释倍数为1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200。可根据实际情况调整稀释倍数。
反应体系配置（单反应体系）：下表3配置：
表3. 待测聚合酶体系
| 10×PCR Buffer | 2ul |
| 25mM MgCl2 | 2ul |
| T2（100p） | 0.1ul |
| 25mM dNTP | 0.2ul |
| picogreen | 0.5ul |
| 水 | 13.9ul |
| 待测聚合酶样品 | 1.3ul |
每个稀释梯度的λDNA和λDNA预染液按1:1的比例混合均匀。0ug/ml λDNA组作为对照组，NTC组添加1.3 μL Bst DNA聚合酶稀释液。λDNA组不用添加样品酶。设置好反应程序，将96孔板放入qPCR仪，实时监测荧光值。
（3）实验结果
λDNA标准曲线的绘制
以投入的λDNA量为横坐标，扣除NTC组平均值后的净荧光值为纵坐标，绘制线性标准曲线，使其R2＞0.99，标准曲线图如图4所示：
将上机数据导出，选取各个梯度 Bst DNA聚合酶实验组和实验组NTC组第25个循环时的荧光值，计算各个梯度 Bst DNA聚合酶的平均值，减去NTC组的平均值，得到净荧光值。将净荧光值带入λDNA标准曲线中，计算得到生成的DNA量A1。A1/649得到反应消耗的dNTPs量A2，单位为nmol。最后通过公式（A2*稀释倍数）/1.29计算出Bst DNA聚合酶的活性。
酶活定义：以合成的发夹型寡核苷酸序列作为模板，在65℃，1min掺入1.29nmoldNTP所需的酶量定义为1U。其计算结果如下表4所示：
表4
| Bst-1 | 荧光均值 | 减去NTC | 25cycle生成DNA量(ng) | 消耗dNTP量(nnmol) | 酶活计算(U/uL) | 标准差 | CV值 |
| 1/1600 | 2961889.333 | 2436806.448 | 188.7853034 | 0.290886446 | 360.7893902 | ||
| 1/3200 | 2422432.417 | 1897349.531 | 146.6928473 | 0.226029041 | 560.6921936 | 42.15609913 | 7.518581426 |
| 1/6400 | 1390854.333 | 865771.4479 | 66.20142384 | 0.102005276 | 506.072685 | 42.15609913 | 8.330048308 |
| 1/12800 | 942901.6667 | 417818.7813 | 31.24881252 | 0.048149172 | 477.7592244 | 42.15609913 | 8.823712234 |
结果：λDNA浓度标准曲线R2＞0.99、自产Bst DNA聚合酶活性为514U/μL。根据批间酶测试结果，当CV值在10%以内，消耗dNTPs量在0.03~0.25nnmol时，Bst DNA聚合酶各个梯度区间测活结果接近。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种Bst DNA聚合酶突变体的截短体，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶突变体的截短体的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列的氨基酸序列。
2.一种编码Bst DNA聚合酶突变体的截短体的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸为如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3或4所述的表达载体；或者
所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求2所述的多核苷酸。
6.一种制备Bst DNA聚合酶突变体的截短体的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
使含有如权利要求2所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；
培养所述宿主细胞，以表达所述Bst DNA聚合酶突变体的截短体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用TB培养基或LB培养基培养所述的宿主细胞；
和/或，在温度为16至19℃下培养所述宿主细胞；
和/或，培养所述宿主细胞时，所用培养基中含有卡那霉素抗性基因。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，培养所述宿主细胞时，通过IPTG诱导以表达出目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：分离所述目的蛋白，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的Bst DNA聚合酶突变体的截短体；或者
如权利要求2所述的多核苷酸；或者
如权利要求3或4所述的表达载体；或者
如权利要求5所述的宿主细胞。
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